Bài 2: PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

I/Mục đích thí nghiệm:

II/Quá trình thực hiện:

1.Dụng cụ:

STT Tên dụng cụ, thiết bị Số lượng1 Giá ống nghiệm 12 ống nghiệm 103 Erlen 14 Phễu thủy tinh 15 Đũa khuấy thủy tinh 16 Becher 500 ml 17 Đĩa petri 58 Đĩa cân nhựa 19 Bình tia 110 Bếp điện 111 Cân kỹ thuật 112 Nồi hấp cao áp13 Tủ sấy 1

2.Môi trường nuôi cấy vi khuẩn:

Môi trường cao thịt-peptone:

Cao thịt:

Peptone:

Agar:

Thêm nước cất cho đủ 500 ml

Lắc đều, chỉnh pH 7.0 ± 0.2

Nấu sôi nhẹ để agar tan hoàn toàn, phân phối môi trường vào dụng cụ để khử trùng ở 121ºC trong 30 phút

3.Tiến hành thí nghiệm:

Chuẩn bị dụng cụ:

Các dụng cụ phải được rửa sạch, sấy khô trước khi sử dụng

Cân đong hóa chất pha chế môi trường:

Cân đong chính xác từng thành phần của môi trường và pha chế theo dung trình tự

Phối chế tạo môi trường nuôi cấy:

Phối trộn các thành phần theo trình tự bậc thang

Điều chỉnh độ pH của môi trường:

Để điều chỉnh độ pH của môi trường có thể dung HCl 10% hay NaCl 10

Trong phòng thí nghiệm để kiểm tra đô pH của môi trường ta dùng giấy quỳ tím.

Phân phối môi trường vào dụng cụ chứa:

Môi trường sau khi pha chế được phân phối vào ống nghiệm, erlen. Trình tự phân phối như sau:

- Môi trường cần được dun cho hóa chất lỏng rồi đổ qua phễu thủy tinh vào các dụng cụ- Một tay cầm dụng cụ chứa môi trường, một tay kẹp nút bông và kéo ra- Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ qua phễu, tránh để môi trường dính vào thành

dụng cụ. nếu dính phải dùng bông tẩm cồn để lau sạch trước khi đậy nút bông hoặc nắp ống nghiệm

Đối với ống nghiệm: dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trường cần được phân phối chiếm ¼ thể tích ống nghiệm

Đối với erlen: lượng môi trường được phân phối chiếm 1/3 thể tích của bình

Đối với đĩa petri: môi trường được phân phối vào đĩa sau khi đã hấp tiệt trùng. Thể tích môi trường khoảng 12-15 ml mỗi đĩa, lo8p1 môi trường thạch dày khoảng 2mm

Viết nhãn: tên môi trường, ngày khử trùng, nhóm pha chế trên dụng cụ chứa

Khử trùng môi trường:

Môi trường được hấp tiệt trùng bằng nồi hấp cao áp. Thời gian hấp tiệt trùng môi trường ở nhiệt độ 121ºC phụ thuộc vào lượng môi trường được phân phối vào dụng cụ, thời gian hấp là 30 phút.

Làm thạch nghiêng, đổ thạch vào đĩa petri:

Làm thạch nghiêng: làm ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và môi trường chưa đông đặc. ống nghiệm được đặt nghiêng cố định trên giá đỡ. Phần đỉnh nghiêng phải cách nút đậy 3-5 cm. phần đấy phải có 1 lớp thạch đứng 0.5-1cm

Đổ thạch vào đĩa petri:

- Sát trùng tay và mặt bàn bằng cồn 70º- Đốt đèn cồn để khử trùng không khí

- Mở bao giấy gói các đĩa petri

- Tay trái cầm đĩa petri hơ mép qua ngọn lửa đèn cồn, Tay còn lại mở nút bông và hơ

miệng bình trên ngọn lửa đền cồn. - Mở hé nắp đĩa petri. Nghiêng bình và rót môi trường vào đĩa petri ,tránh làm dính thạch

trên miệng đĩa (quá trình đổ thạch phải được giữ một khoảnh cách an toàn với đèn cồn, để vsv ko xâm nhập vào thạch)

- Đậy nắp đĩa lại, để đĩa petri ở mép bàn và đẩy vào trong mục đích để lớp thạch không bị đổ và dính lên thành đĩa

- Để yên cho môi trường đông đặc. - Lật ngược đĩa lại và bảo quản.

Kiểm tra độ vô trùng và bảo quản:

Môi trường sau khi pha chế xong được đặt ở nhiệt độ phòng 24h. sau thời gian này kiểm tra độ vô trùng của môi trường bằng cách quan sát trạng thái mội trường

Loại bỏ các ống có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm và đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu

III/Trả lời câu hỏi:

1. Trình bày khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Khái niệm môi trường dinh dưỡng

Môi  trường  dinh  dưỡng  là  hỗn  hợp  các  chất  dinh  dưỡng  và  các  chất  này  có nhiệm vụ

duy trì thế oxy hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định của pH trong môi trường.

trong đó các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào.

Phân loại môi trường dinh dưỡng

Theo nguồn gốc

Môi trường tự nhiên: có thành phần là các sản phẩm tự nhiên như: trứng, sữa, khoai tây,

dịch chiết nấm men, đường, cám.

Môi trường tổng hợp: chứa các chất hóa học mà thành phần của chúng được xác định và

định lượng một cách cụ thể và chính xác. Ví dụ như: Czapeck, Hansen, EMB

Môi trường bán tổng hợp: chứa cả các chất hóa học lẫn các sản phẩm tự nhiên, ví dụ như:

PGA, giá đậu đường

Theo trạng thái vật lý

Môi trường lỏng: thành phần môi trường này không chứa agar và thường được sử dụng

để nghiên cứu quá trình tổng hợp của vi sinh vật.

Môi  trường  đặc:  cứ 1000ml môi trường có 15 – 20 Agar

Môi trường bán lỏng: chứa khoảng 0,3 – 0,7% agar

Theo công dụng

Môi trường phân lập

Môi trường tăng sinh

Môi trường nuôi giữ  giống: nghèo dinh dưỡng

Môi trường thử nghiệm sinh hóa

2. Trình bày qui trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Bao gồm các bước sau:

Chuẩn bị dụng cụ

Cân hóa chất

Phối chế tạo môi trường nuôi cấy

Điều chỉnh độ pH của môi trường

Phân phối môi trường vào dụng cụ

Khử trùng môi trường

Làm thạch nghiên, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri

Kiển tra độ vô trùng và bảo quản

3. Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch đứng

Làm  thạch  nghiêng:

Cần  tiến  hành  ngay  sau  khi  khử  trùng  môi  trường  và môi trường chưa đông đặc.

- Đặt  ống  nghiệm  có  môi  trường  lên  giá  đặt  nghiêng và  không  được  để môi

trường chạm vào nút bông.

- Để yên cho đến khi môi trường đông đặc. Yêu cầu mặt thạch phải thẳng, nhẵn và

liên tục

Đổ môi trường vào đĩa petri:

Toàn bộ quá trình đổ thạch vào đĩa petri được thực hiện trong tủ cấy vô trùng và gồm

các thao tác sau: - Sát trùng tay và mặt bàn bằng cồn 70º- Đốt đèn cồn để khử trùng không khí

- Mở bao giấy gói các đĩa petri

- Tay trái cầm đĩa petri hơ mép qua ngọn lửa đèn cồn, Tay còn lại mở nút bông và hơ

miệng bình trên ngọn lửa đền cồn. - Mở hé nắp đĩa petri. Nghiêng bình và rót môi trường vào đĩa petri ,tránh làm dính thạch

trên miệng đĩa (quá trình đổ thạch phải được giữ một khoảnh cách an toàn với đèn cồn, để vsv ko xâm nhập vào thạch)

- Đậy nắp đĩa lại, để đĩa petri ở mép bàn và đẩy vào trong mục đích để lớp thạch không bị đổ và dính lên thành đĩa

- Để yên cho môi trường đông đặc. - Lật ngược đĩa lại và bảo quản.

- .

4. Giải thích tại sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng

Vì sẽ làm nhiễm các vi sinh vật không mong muốn, có thể nhiễm một số tạp chất vì vậy

sau quá trình nuôi cấy khó có thể xác định được kết quả. Có thể tránh được hơi nước tiếp xúc

vào môi trường nuôi cấy và vì sau khi cấy phải để yên môi trường để cứng môi trường

5. Đĩa petri chứa môi trường trước khi cấy vi sinh vật nên úp hay ngửa? Tại sao?

Đĩa petri chứa môi trường trước khi nuôi cấy vi sinh vật nên đặt úp.vì:

Trong quá trình sử dụng dễ cấm nắm

Khi đặt úp, đĩa petri và nắp đãi kín hơn khi để ngửa, tránh được hơi nước do đó tránh

được tạp nhiễm những vi sinh vật không mong muốn

IV/Kết quả và giải thích: