9

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat

Penelitian dilaksanakan sejak Februari 2011 sampai Agustus 2011.

Penelitian dilaksanakan di rumah kaca Institut Pertanian Bogor di Cikabayan,

Dramaga dan Laboratorium Virologi Tumbuhan, Departemen Proteksi Tanaman,

Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor.

Survei dan Identifikasi Virus yang Menginfeksi Mentimun

Pengambilan Sampel Sampel berasal dari pertanaman mentimun milik petani di desa Situgede,

Kecamatan Dramaga, Kabupaten Bogor. Daun mentimun yang dikumpulkan

sebagai sampel adalah daun yang menunjukkan gejala terserang virus. Sampel

daun dibedakan berdasarkan tipe gejalanya yaitu bintik kuning, mosaik kuning,

mosaik hijau, mosaik hijau-kuning, mosaik hijau keriting, mosaik kuning-hijau-

keriting, dan keriting.

Deteksi Virus pada Sampel Daun dari Lapangan

Infeksi virus diidentifikasi dengan metode ELISA tidak langsung (indirect

ELISA) dengan menggunakan beberapa antiserum yaitu antiserum untuk CMV,

ZYMV, SqMV, WMV, dan TRSV. Penggunaan beberapa jenis antiserum

tersebut bertujuan untuk mengetahui jenis-jenis virus yang menyerang tanaman

mentimun di lapangan. Pengujian ini juga untuk menentukan isolat SqMV yang

akan digunakan untuk penelitian lebih lanjut.

Perbanyakan Inokulum SqMV

Inokulum SqMV diperbanyak pada tanaman mentimun dengan cara

penularan mekanis. Isolat SqMV diperoleh dari sampel daun yang positif

terinfeksi SqMV dan memiliki titer virus paling tinggi. Cairan perasan tanaman

(sap) ditularkan pada tanaman mentimun yang berumur tujuh hari setelah tanam.

10 Sap tanaman dipersiapkan dengan menggerus sebanyak 0.2 g daun dalam bufer

fosfat dengan perbandingan 1:10 (b/v). Inokulasi dilakukan pada kotiledon

tanaman yang telah ditaburi dengan karborundum (600 mesh) dengan cara

mengoleskan sap tanaman sakit pada permukaan kotiledon dengan menggunakan

jari. Setelah pengolesan, kotiledon tersebut dibilas dengan aquades mengalir (Bos

1990). Tanaman yang telah diinokulasi dipelihara dan diamati gejala yang timbul.

Setelah empat belas hari, daun yang menunjukkan gejala dipanen dan diawetkan

menggunakan nitrogen cair lalu disimpan pada suhu -80 0C.

Penanaman dan Pemeliharaan Tanaman Mentimun

Penanaman Benih

Media tanam disiapkan yaitu berupa campuran tanah dan pupuk kandang

(1:1) yang telah disterilkan dengan mengunakan otoklaf. Polybag berukuran 35

cm x 35 cm diisi dengan media sebanyak tiga per empat bagian. Benih mentimun

yang akan ditanam terlebih dahulu direndam dalam fungisida selama 1 jam lalu

ditiriskan. Benih lalu ditanam pada polibag yang telah disiapkan dalam kondisi

basah. Benih ditanam pada kedalaman 3 cm dengan letak calon akar (bagian yang

runcing) berada di bagian bawah.

Benih mentimun yang digunakan berasal dari toko pertanian, terdiri dari

lima varietas yaitu Vario F1, Calista F1, Venus, Yupiter, dan Japan file.

Penggunaan varietas-varietas tersebut didasarkan pada varietas yang banyak

digunakan oleh petani, mudah diperoleh, dan banyak dikonsumsi masyarakat.

Pemupukan dan Penyiraman

Pupuk NPK 15:15:15 diberikan dua tahap. Tahap pertama diberikan 1

minggu setelah inokulasi. Pemupukan tahap kedua diberikan ketika tanaman

memulai masa generatif yaitu ketika terjadi pemunculan bunga pertama. Pada

masa pengisian buah, tanaman disemprot dengan pupuk Gandasil B. Penyiraman

dilakukan setiap pagi hari. Air diberikan pada tanaman di dalam polibag sehingga

air tidak dapat tersimpan. Penyiraman harus diberikan sesuai kebutuhan tanaman

dan memenuhi standar waktu, cara, dan jumlah yang tepat.

11 Pengikatan dan Pemangkasan

Tanaman mulai diikat pada umur 2 minggu setelah tanam (MST). Batang

mentimun diikat pada tali sehingga tanaman dapat merambat (Gambar 2a).

Pemangkasan dilakukan terhadap wiwilan (kuncup daun yang hanya

menghasilkan daun). Cabang anakan diatur agar tidak mengganggu tanaman di

dekatnya, caranya adalah dengan memangkas bagian pucuk cabang anakan

sehingga pertumbuhan diarahkan pada pembesaran buah.

Pemanenan

Mentimun yang ditanam dapat berbuah pada usia 32 sampai 50 hari

tergantung varietas (Lampiran 1). Buah yang dipanen untuk kepentingan

konsumsi adalah buah yang telah matang penuh ditandai dengan warna hijau yang

seragam (Gambar 2b). Pemetikan dapat dilakukan dengan memotong sebagian

tangkai atas. Pemetikan dapat dilakukan dengan bantuan gunting atau pisau

sehingga bidang potong rata dan beraturan. Pemetikan dapat dilakukan setiap hari,

karena proses pematangan buah berlangsung 7 sampai 10 hari setelah bunga

mekar. Buah yang dipanen dengan kepentingan sebagai benih adalah buah

mentimun yang tua, ditandai dengan warna kulit buah sudah putih atau kuning

tergantung varietas.

Gambar 2 Tanaman merambat pada tali yang disediakan (a) ; Buah mentimun siap

panen (b)

b a

12

Jumlah tanaman terserang

Jumlah tanaman

Inokulasi SqMV pada Lima Varietas Mentimun

Inokulasi dilakukan pada tanaman berusia 7 hari setelah tanam. Sumber

inokulum adalah daun sampel tanaman yang telah diuji dan positif terinfeksi

SqMV. Tahapan inokulasi diawali dengan persiapan sap tanaman. Sebanyak 0.2 g

daun digerus dalam bufer fosfat dengan perbandingan 1:10 (b/v). Inokulasi

dilakukan pada kotiledon tanaman yang telah ditaburi dengan karborundum (600

mesh) dengan cara mengoleskan sap tanaman sakit pada permukaan kotiledon

dengan menggunakan jari. Setelah pengolesan, kotiledon tersebut dibilas dengan

aquades mengalir (Bos 1990). Tahapan inokulasi dilakukan terhadap lima

varietas tanaman. Jumlah tanaman yang diinokulasi adalah 10 tanaman untuk

setiap varietas.

Pengamatan dilakukan terhadap masa inkubasi dan kejadian penyakit. Masa

inkubasi adalah waktu gejala pertama kali muncul setelah tanaman diinokulasi.

Kejadian penyakit untuk setiap varietas dihitung dengan menggunakan rumus

sebagai berikut:

% kejadian penyakit = x 100%

Pengamatan terhadap perkembangan penyakit mosaik dilakukan dengan

mengamati perkembangan gejala yang muncul dan pengukuran titer virus pada

masa vegetatif, masa berbunga, dan masa berbuah. Pengukuran titer virus

dilakukan dengan metode indirect-ELISA.

Deteksi SqMV Terbawa Benih

SqMV dilaporkan sebagai patogen terbawa benih. Pada penelitian ini

dilakukan pengujian untuk mengetahui jumlah benih yang membawa SqMV.

Pengujian terhadap benih dibedakan menjadi dua bagian yaitu pengujian terhadap

benih yang dibeli dari toko pertanian (F1) dan pengujian terhadap benih dari

tanaman percobaan di rumah kaca (F2). Benih diuji dengan metode growing-on

test yaitu benih ditumbuhkan pada media tanam di tempat pembibitan hingga

berusia 7 hari setelah tanam (Gambar 3). Bagian tanaman (bibit) yang digunakan

untuk pengujian adalah daun pertama yang muncul.

13

Jumlah benih terinfeksi

Jumlah benih yang ditanaman

Total benih yang diuji untuk setiap varietas mentimun berjumlah 30 benih.

Deteksi SqMV dilakukan dengan metode DIBA (Dot Immunobinding Assay).

Persentase virus terbawa benih dihitung dengan rumus sebagai berikut:

% virus terbawa benih = x 100%

Gambar 3 Benih ditanam pada baki persemaian (growing on test)

Metode Indirect-ELISA

Metode ELISA tidak langsung dilakukan berdasarkan prosedur umum

Indirect ELISA (Agdia Inc, Indiana USA). Teknik deteksi diawali dengan tahapan

persiapan antigen. Antigen disiapkan dengan menggerus 0.2 g daun mentimun

dalam plastik tebal dan ditambah GEB (General Extract Buffer) pH 7.4.

Perbandingan daun dengan GEB adalah 1:10 (b/v). Sebanyak 100 µl antigen

diisikan pada sumuran plat mikrotiter, kemudian diinkubasi semalaman pada suhu

4 0C. Setelah inkubasi, cairan dalam plat mikrotiter dibuang dan diisi dengan 100

µl bloking solution yaitu skim milk 2%. Penggunaan bloking solution berfungsi

untuk menutupi bagian sumuran yang tidak berikatan dengan antigen virus. Plat

mikrotiter lalu diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 0C kemudian dicuci

menggunakan 200 µl PBST (phosphate buffer saline tween-20) sebanyak lima

kali.

Tahap deteksi selanjutnya adalah menyiapkan antiserum SqMV yaitu

dengan mengencerkan antiserum SqMV dalam conjugate buffer dengan

perbandingan 1:200. Sebanyak 100 µl antiserum diisikan ke dalam setiap

sumuran plat mikrotiter lalu diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 0C. Plat

mikrotiter dicuci kembali dengan PBST sebanyak lima kali. Masing-masing

14 sumuran lalu diisi dengan 100 µl campuran antibodi kedua (goat anti rabbit-IgG,

Agdia). Antibodi ini telah dilabel dengan phosphatase dan diencerkan dalam

conjugate buffer dengan perbandingan 1:5000. Plat mikrotiter diinkubasi kembali

selama 2 jam pada suhu 37 0C lalu dicuci dengan PBST.

Tahap deteksi selanjutnya adalah mengisi plat mikrotiter dengan 100 µl

substrat PNP (paranitrophenyl phosphate) dan diinkubasi selama 30 sampai 60

menit pada suhu ruang. Apabila warna berubah kuning, maka reaksi segera

dihentikan dengan 50 µl NaOH 3 M. Hasil ELISA diukur dengan menggunakan

ELISA reader (Bio-rad model 550 microplate reader) pada panjang gelombang

405 nm. Hasil ELISA dinyatakan positif jika nilai absorbans sampel yang diuji 2

kali lebih besar dari nilai kontrol negatif tanaman sehat (Matthews 1993).

Metode DIBA (Dot Immunobinding Assay)

Metode DIBA dilakukan berdasarkan Mahmood et al. 1997 dalam Opriana

2009. Membran nitroselulosa (HybondTM –P, Amersham Bioscience UK)

sebelum digunakan direndam dalam metanol 100% selama 10 detik dan dikering

anginkan. Jaringan daun tanaman yang diduga terinfeksi SqMV digerus dalam

tris buffer saline (TBS) dengan perbandingan 1:10 (b/v) (TBS: Tris-HCl 0.02 M

dan NaCl 0.15 M, pH 7.5). Cairan perasan tanaman tersebut selanjutnya

diteteskan ke atas membran nitroselulosa sebanyak 10 µl. Setelah tetesan sampel

kering, membran direndam di dalam 10 ml larutan blocking non fat milk 2%

dalam TBS yang mengandung Triton X-100 dengan konsentrasi akhir 2%.

Membran kemudian diinkubasi pada suhu ruang sambil digoyang dengan

kecepatan 50 rpm selama 2 jam dengan menggunakan shaker (EYELA multi

shaker MMS). Membran kemudian dicuci 5 kali dengan dH2O, tiap pencucian

berlangsung 5 menit sambil digoyang dengan kecepatan 100 rpm. Membran

selanjutnya direndam dalam 5 ml TBS yang mengandung antibodi SqMV 5 µl

ditambah non fat milk dengan konsentrasi akhir 2% dan kemudian membran

diinkubasi semalam pada suhu kamar sambil digoyang dengan kecepatan 50 rpm.

Membran kemudian dicuci sebanyak 5 kali dengan Tween 0,05% dalam TBS

(TBST). Membran selanjutnya direndam dalam 5 ml TBS yang mengandung

15 konjugat 5 µl (goat anti rabbit-IgG, Agdia) ditambah non fat milk dengan

konsentrasi akhir 2% dan kemudian membran diinkubasi selama 60 menit sambil

digoyang dengan kecepatan 50 rpm. Membran selanjutnya dicuci kembali dengan

TBST, kemudian membran direndam selama 5 menit dalam substrate buffer

(Tris-HCl 0.1 M, NaCl 0.1 M dan MgCl 5 mM) yang mengandung nitro blue

tetrazolium (NBT) 66 µl dan bromo chloro indolit phosphate (BCIP) 30 µl. Bila

reaksi positif akan terjadi perubahan warna putih menjadi ungu pada membran

nitroselulosa yang telah ditetesi cairan perasan tanaman dan reaksi dapat

dihentikan dengan merendam membran dengan dH2O.