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Bactérias para controle de insetos
Rose Monnerat
EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia
Goiânia-GO
Agosto 2018
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Coleção de Bactérias de Invertebrados
2.700 Bacillus spp.
Primeira coleção de microrganismos brasileira a ser avaliada e reconhecida segundo as normas para funcionamento de um Centro de Recursos Biológicos -CRB
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Objetivos
Novas estirpes
Novos biopesticidas
Novos genes
Bacteriocinas (antibioticos, antifungicos)
Promotores de crescimento
Estudos de interações toxina – inseto - planta
Uso sistêmico
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Saúde pública
Culex spp. Aedes aegypti Simulium spp.Anopheles spp.
Agrícola
Prospecção
Plutella xylostella Anticarsia gemmatalis Spodoptera frugiperda
Veterinária
Stomoxys calcitrans Haematobia irritansAlphitobius diaperinus
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Estirpes Spodopterafrugiperda
LC50 ng/cm2
genes cry Outras características
A 936.1 (460.1-2832.3) cry1Aa, cry1Ab, cry1C, cry1D, cry1I
B 13.3 (10.4-29.4) cry1Aa, cry1Ab, cry1B, cry1D, cry1I
C 6.3 (1.4-9.3) cry1Aa, cry1B, cry1D, cry1I, cry2 Produção de Thuricina17
D 12.9 (1.5-32.2) cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac cry1Ad, cry1B, cry1D, cry1I, cry2cry1D, cry1I, cry2
E 1923.9 (1072.6-6058.4) cry1Aa, cry1Ac, cry1Ad, cry1C, cry1D, cry1I
F 358.2 (233.7-597.6) cry1Ab, cry1Ac, cry1B, cry1E, cry1G, cry1I, cry2
G 22.9 (10.5-30.9) cry1Aa, cry1B, cry1C, cry1D
H 349.7 (123.9 – 456.7) Cry1B Produção de melanina
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Gene cry1Ia Proteína tóxica a lepidópteros e coleópteros (patente)
Gene cry10 Proteína tóxica a coleópteros (patente)
Novos genes
(patente)
Gene cry1B Proteína tóxica a coleópteros
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Bioinseticidas desenvolvidos pela Embrapa Cenargen com instituições privadas à base de Bacillus thuringiensis e Lysinibacillus sphaericus da Coleção.
Ponto Final (Bthek Biotecnologia Ltda.), Inova Bti (Instituto Matogrossense do Algodão-IMAmt), Strike Bio Bti SC (STRIKE Indústria e Comércio), Bt-horus SC (Bthek Biotecnologia Ltda.), Sphaerico (Geratec do Brasil) e Sphaerus-SC (Bthek Biotecnologia Ltda.).
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Trabalho social
Educação
Reordenação ambiental
Uso de produtos biológicos
Cidadania
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Bactérias esporulantes
aeróbicas como as pertencentes ao gênero Bacilluse correlatos
anaeróbicas que pertencem ao gênero Clostridium
Bactérias não esporulantesBactérias não esporulantes
Serratia, Pseudomonas, Streptococus, Xenorhabdus Chromobacterium.
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Pseudomonas entomophila
Patogênica para três ordens de insetos: Diptera (Anopheles gambiae
e D. melanogaster), Lepidoptera (Bombyx mori e Galleria mellonella)
e Coleoptera (Sitophilus oryzae).e Coleoptera (Sitophilus oryzae).
Ação é devido a produção de metabolitos
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Chromobacterium subtsugae
Bacteria Gram-negativa apresenta pigmentação violeta e a mobilidade flagelar.
Essa é uma bactéria com atividade tóxica quando ingerida oralmente por larvas de coleópteros Leptinotarsa decemlineata e Aethina tumida e de lepidópteros como Diabrotica spp. e Plutella xylostella
Apresenta crescimento ótimo a 25 C, em pH 6,5-8,0 com 0-1,5% de NaCl adicionado ao meio.
A maior mortalidade de insetos seguiu o tratamento com uma A maior mortalidade de insetos seguiu o tratamento com uma combinação de células vivas com toxinas inseticidas produzidas na fase estacionária de crescimento
Além do pigmento violeta, denominado violaceína, que tem atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, C. subtsugae contém um gene que codifica uma proteína inseticida semelhante ao encontrado em P. luminescense Xenorhabdus nematophilia
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Gênero Bacillus e correlatos• Bacillus cereus• Bacillus thuringiensis• Lysinibacillus sphaericus• Paenibacillus popilliae• Paenibacillus lentimorbus• Paenibacillus lentimorbus• Bacillus larvae• Bacillus alvei• Brevibacillus laterosporus
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Produzem esporos – Forma de resistência
- Resiste a altas temperaturas
- Vantagem no processo fermentativo
Den
sidad
e óp
tica
t0Célula mãeσE σK
Den
sidad
e óp
tica
t0Célula mãeσE σK
TempoDen
sidad
e óp
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t0 t1 t2
t0
Fase vegetativa Esporulação
Esporo
σA
σH σF σG
EI EII EIII EIV EV-VI EVII
TempoDen
sidad
e óp
tica
t0 t1 t2
t0
Fase vegetativa Esporulação
Esporo
σA
σH σF σG
EI EII EIII EIV EV-VI EVII
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Paenibacillus popilliae e P. lentimorbus
doença leitosa dos tipos A e B em coleopteros
O primeiro programa bem sucedido de controle de insetos foi o uso de P. popilliae para
controlar larvas do besouro japonês (Popillia japonica).
Programa foi frustrado pois a produção continuada de esporos in vitro não era viável
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Lysinibacillus sphaericus
- Tóxica a insetos da Ordem Diptera (larvas de mosqui tos)
- aplicações ambientais e industriais além do controle biológico como, por exemplo,
na biorremediação de metais tóxicos, solubilização de fósforo
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Brevibacillus laterosporus
Patogênica a insetos das Ordens Coleoptera, Diptera e Lepidoptera
Utilizado como probiótico humano.
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Bacillus thuringiensis
Bactéria que causa doença em alguns organismos
Isolado: 1901
1983: Coleoptera1983: Coleoptera
1960: Lepidoptera1977: Diptera
50.000 estirpes conhecidas
Pode ser encontrada nos solos, ambientes aquáticos, cadáveres de insetos, etc.
Alto nível de especificidade
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Microscopia eletrônica de varredura de B.thuringiensis mostrando: (c) cristais; (e)esporos (20.000x).
Microscopia de contraste de fases de B.thuringiensis mostrando: (c) cristais; (e)esporos (2.000x).
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Diferentes formas
• Bioinseticidas
• Estirpes nativas
• Estirpes modificadas
• Plantas transgênicas• Plantas transgênicas
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Toxinas produzidas pelo B. thuringiensis
α-exotoxinaAtividade citolíticaTermolábilToxicidade a insetos, ratos e outros vertebrados
β-exotoxinas (Thuringiensina)Fase vegetativaEfeito teratogênico e mutagênicoTermoestáveisToxicidade a várias ordens de insetos e vertebrados
VipVipFase vegetativa;Ativa principalmente contra lepdópteros;Não forma cristais.
SipFase vegetativa;Ativa principalmente contra coleopteros;Não forma cristais.
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Proteínas Cry
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Vip e Sip
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Cry1
Cry2
Cry1A
Cry2A
Cry1Aa
Cry2Aa
Cry1Aa1
Cry2Aa1
Cry1B
Cry2B
Cry1Ab
Cry2Ab
Cry1Aa2
Cry2Aa2
As proteínas Cry estão classificadas em 75 grupos e diferentes subgrupos e são codificadas por mais de 840genes cry já sequenciados
95%78%45% 98%
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Modo de ação de Bacillus spp.
• Composto de várias etapas:
• Ingestão
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• Solubilização
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• Ativação e ligação aos receptores
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• Inserção na membrana, agregação e formação do poro
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• Alteração da permeabilidade e morte celular
• Bomba de Na+/K+;
• H2O.
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• Morte do inseto
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Epitélio intestinal de Aedes aegypti
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Receptores Moleculares da proteína Cry1A. CADR, receptor caderina; APN, receptoraminopeptidase-N; ALP, receptor fosfatase alcalina; GCR, receptor glicoconjugado de270 kDa (Bravo et al., 2007).
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S. cosmioides S. eridania S. frugiperda
Proteínas Cry CL50 (µg/mL) Intervalo de confiança (95%)
Cry1Aa 0,58 (0,14 – 1,52) ab 74,74 (42,83 – 121,4) c 0,32 (0,14 – 0,72 ) a
Susceptibilidade entre espécies
Cry1Ab 0,37 (0,12 – 0,82) a 62,33 (37,34 – 188,22) c 0,88 (0,40 – 1,74) a
Cry1Ac 2,77 (1,20 – 6,26) b 21,34 (14,29 – 33,97) b 10,90 (4,78 – 30,65) b
Cry2A 23,98 (8,91– 171,1) c 1,00 (0,42 – 2,36) a 1,87 (0,70 – 5,30) ab
(Santos et al., 2009)
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1. Brasil
2. MéxicoCry1Ba
Cry1Ca
- + - + -+
Mexico Colombia Brasil
Variabilidade Genética x susceptibilidade x receptoresem S.frugiperda
3. Colombia
Toxina México Colombia Brasil
LC50 ng/cm2
Cry1B > 2000 74 (31-148) 403 (198 - 690)
Cry1C 42 (27 - 55) 21 (6-48) 84 (61 - 129)
Cry1D 80 (66 - 128) 7 (2 - 22) >2000
Cry1Ca
Cry1Da
Monnerat et al., 2006
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Modos de ação diferentes para a protoxina e toxina
Bioinseticida – ação da protoxina e da toxina
Planta Bt – ação da toxina
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Toxicidade das diferentes produtos biológicos para larvas de S. frugiperdadas populações susceptível e resistente a plantas Bt (Cry1F, Cry1Aa,Cry1Ab, Cry1Ac)
Produto
LC50 ng/cm2
Susceptivel Resistente
Formulado 1 31,74 (26,26 - 62,29) 15,97 (9,4 – 53,88)
Formulado 2 395,16 (206,57 - 632) 335,42 (145,97 – 889,48)
Formulado 3 2175,21 (1518,01-2923,03) 2283,02 (1172,84 - 3486,7)
Produtos à base de B. thuringiensis podem ser utilizados em insetos resistentes a toxinas de plantas Bt
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Produção de microrganismos
Fermentação
Inóculo
Meio de Cultura
Controle de
qualidade
Envase
Concentração
Formulação
qualidade
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Fatores limitantes ao processo de produção
1- Meio de Cultura
É uma das chaves do sucesso da produção.
Na composição básica deve conter carbono,
nitrogênio e minerais
Composição variável conforme a espécie e a cepaComposição variável conforme a espécie e a cepa
Deve ser sempre esterilizado
2- Inóculo – puro – só a bactéria
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Fatores limitantes ao processo de produção
3- Condições fermentativaspH - neutroOxigenação - altaAgitaçãotemperatura – aproximadamente 30º C
4- Controle de qualidade4- Controle de qualidadeNormalmente as bactérias usadas em controle biológi co não são boas competidoras Precisa ser realizado em todas as fases do processo
---- Nunca produzir dois microrganismos juntos....
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Produção em reator
Controle de:- pH - temperatura- oxigenação- agitação
Meio de cultura - autoclavado
Ar estéril
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Peso Seso S1450
3
4
5
6
7
8
9
Pes
o S
eco
g/L
NYSM S1450
Bt I S1450
Bt II S1450
0
1
2
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 72
Tempo (horas)
Pes
o S
eco
g/L
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Formulação
Objetivos
1) Estabilizar o agente microbiano durante a distri buição e estocagem;
2) Melhorar o manuseio e a aplicação do produto;
3) Proteger o agente de fatores ambientais adversos ;
4) Melhorar a eficiência do agente microbiano no ca mpo
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Processo fermentação e recuperação do complexo espo ro-cristal
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Tipos de Formulações
Suspensão Concentrada;
Concentrado Emulsionável;
Pó Molhável;
Granulado;
Grânulos Dispersíveis em Grânulos Dispersíveis em
água;
Pastilhas ou Tabletes;
“Gelo”.
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Produção “on farm”
•Decreto 4074, alterado pelo Decreto 6.913 em 2009:
•“Art. 10-D.
•§ 8º Ficam isentos de registro os produtos fitossanitários com
uso aprovado para a agricultura orgânica produzidos
exclusivamente para uso próprio.
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Produção de microrganismos
Concentração
Fermentação
Inóculo
Meio de Cultura
comercial
On farm
Envase
Concentração
Formulação
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•Produção caseira de Bt
- Qualidade do produto (instalações inadequadas, inoculo de má
qualidade, falta de controle de qualidade)
≠≠
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Ações da Embrapa
- Manual para controle de qualidade
- Prestação de serviços em controle de qualidade
- Treinamentos em produção e controle de qualidade- Treinamentos em produção e controle de qualidade
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Produção de bioinseticidas à base de Bacillus thuringiensis: da bactéria ao produto
Outubro-2017
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Produção em baldes x fermentador
x
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Controle de qualidade de produtos à base de Bacillus thuringiensis
Manual em redação
1- Introdução
2. Objetivo2. Objetivo
3. A Bactéria Bacillus thuringiensis
4- Produção e formulação de produtos à base de Bacillus thuringiensis
5- Controle de qualidade dos produtos
6- Estrutura mínima para produção
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1- Procedimento para determinação de pH de produtosbiológicos a base de Bacillus thuringiensis
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2- Procedimento para determinação do teor de ingrediente ativo de produtos
biológicos a base de Bacillus thuringiensis
Determinação de UFC- unidades formadoras de colônias
Células- direto Esporos- choque térmico (80ºC-12 min, gelo- 5 min.)% esporulação- numero de células : número de esporos
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3- Procedimento para avaliação da eficácia de produtosbiológicos a base de Bacillus thuringiensis para o controle delarvas de lepidopteros
- Aplicar 100 µL de cada suspensão sobre a dieta
- Deixar secar
- Colocar a lagarta de segundo instar
- Incubar o bioensaio em sala com condições
controladas
- Efetuar leitura após 48 horas
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4- Procedimento para determinação de contaminantes em produtos biológicosa base de Bacillus thuringiensis
- Semear em cada placa de Petri, 0,1mL de cada uma das amostras- Espalhar com alça de Drigalsky a suspensão sobre toda a superfície do meio de cultura;- Colocar as placas em estufa incubadora;- Após 24 horas de incubação, contar o número de colônias - Utilizar a média de colônias obtidas nas duas placas
Microrganismo Especificação Meio de cultura
B. thuringiensis Controle Ágar nutritivo
Coliformes termotolerantes
≤500 UFC Ágar Bile Cristal-Violeta Vermelho Neutrotermotolerantes
Escherichia coli ≤400 UFC Ágar Macconkey
Enterecocos ≤ 50 UFC Ágar Confirmatório para Enterococos
Estreptococos 0 Agar Seletivo para Estreptococos
Salmonella 0 Ágar Verde-Brilhante
Fungos 0 Ágar Sabouraud 4%
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Meios
Ágar Macconkey
Agar Bile verde-
brilhante
Ágar Confirmatório
para Enterococos
Agar Seletivo para
Estreptococos
Ágar Verde-Brilhante
Ágar Sabouraud
4%celulas esporos
Escherichia coli Coliformes termotolerantes
Enterecocos Estreptococos Salmonella Fungos
≤400 UFC ≤500 UFC ≤ 50 UFC 0 0 0
A-Fermentador
0 0 0 0 0 0 8 x 1010 8 x 1010
A- balde >400 >500 >50 >500 >500 >500 24 x 108 0,5 x 105A- balde >400 >500 >50 >500 >500 >500 24 x 10 0,5 x 10
B- balde >400 >500 0 >500 >500 >500 27,5 x 106 0,5 x 105
C- balde >400 >500 0 >500 >500 >500 89 x 108 1,1 x 107
T- balde >400 >500 >50 >500 >500 >500 300 x 108 0
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1- Área de utilidades: A área de utilidades pode-se restringir a uma cobertura sob aqual se disponham um gerador de vapor, compressor de ar e sistema deresfriamento (torre de resfriamento e/ou água gelada).
2- Laboratório de controle de qualidade e processo: Este espaço deve contercapela de fluxo laminar, sistema de inoculação, microscópio de contraste de fases,placa aquecedora ou banho-maria, autoclave pequena, estufa de secagem, estufade crescimento, pipetas de precisão.
3- Salão de fermentação: neste ambiente serão colocados reatores esterilizáveis insito.
4- Sala de estoque de insumos: nesta sala deverão ser colocados todos os
Estrutura mínima
4- Sala de estoque de insumos: nesta sala deverão ser colocados todos osmateriais que serão empregados no processo de fermentação.
5- Sala de armazenamento de produto acabado: nesta sala será estocado oproduto acabado e de preferencia deverá estar refrigerada.
• Todas as áreas deverão ser passíveis de limpeza e de sinfecção, com acabamento impermeável.
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Sugestões para produção “on farm”
• Uso próprio
• Cooperativas, associações
• Cepas limitadas (especificação de referência do MAPA, ou material próprio)
• Obrigatoriedade de estrutura mínima• Obrigatoriedade de estrutura mínima
• Responsável Técnico
• Controle de qualidade (Manual)
• Cadastramento no MAPA
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01 – Cotesia flavipes
02 – Trichogramma galloi
03 – Neoseiulus californicus
04 – Isca vegetal à base de Tephrosia cândida
05 – Baculovírus Anticarsia gemmatalis
06 – Baculovírus Condylorrhiza vestigialis
07 – Metarhizium anisopliae , isolado IBCB 425
08 – Trichoderma stromaticum , isolado CEPLAC 3550
09 – Azadirachta indica
16– Stratiolaelaps scimitus
17 – Deladenus (=Beddingia) siricidicola
18 – Cryptolaemus montrouzieri
19– Trichoderma asperellum , isolado URM-5911
20– Baculovírus Spodoptera frugiperda
21 – Chrysoperla externa
22 – Trissolcus basalis
23 – Orius insidiosus
24 – Trichoderma asperellum , isolado CBMAI 840 (T -211)
30 especificações de referência
09 – Azadirachta indica
10 - Beauveria bassiana , IBCB 66
11 – Phytoseiulus macropilis
12– Trichogramma pretiosum
13 – Regulador de crescimento à base de Ecklonia maxima
14 – Terra de Diatomácea (Dióxido de Silício)
15 – Paecilomyces lilacinus , isolado UEL Pae 10
24 – Trichoderma asperellum , isolado CBMAI 840 (T -211)
25 – Bacillus subtilis , isolado UFPEDA 764
26 – Trichoderma harzianum , isolado IBLF006
27 – Bacillus methylotrophicus , isolado UFPEDA 20
28 – Bacillus thuringiensis var. Kurstaki, isolado HD-1 (S1450) (CCT1306)
29 – Beauveria bassiana , isolado CBMAI 1306
30 - Beauveria bassiana , isolado IBCB 66 + Metarhizium anisopliae , isolado
IBCB 425