bactériocines d’entérocoques isolés de lait cru et beurre...

Thèse de Doctorat en Sciences

Option Biotechnologie

Spécialité Intérêt des micro-organismes

Intitulée

Présentée par

LAZREG Louiza

Devant le Jury :

Président : Pr KARAM Nour Eddine Université d’Oran 1

Examinateurs : Pr BELLAHCENE Miloud CU de Ain Témouchent

Pr DRISSI Mourad Université de Tlemcen

Pr AOUES Abdelkader Université d’Oran 1

Directeur de thèse : Pr ZADI KARAM Halima Université d’Oran 1

Co-directeur de thèse : Pr DALACHE Fatiha Université de Mostaganem

Année Universitaire 2016/2017

Bactériocines d’entérocoques

isolés de lait cru et beurre de l’Ouest algérien

Dédicaces

Je dédie cette thèse ;

A mes parents qui m’ont donné l’exemple d’une règle de vie basée sur des principes très

simples : l’honnêteté et la satisfaction du travail bien fait.

La plus belle marque de reconnaissance que je puisse leur offrir est ma réussite.

A ma sœur Sara ;

A mon frère Abd el Wahid

A ma sœur Hassiba et sa petite famille, Nazim, Amir et Lina

A la famille Lazreg et la famille Gargat

Louiza

Remerciement

Je tiens tout d’abord à remercier Madame Zadi- Karam Halima, Professeur à l’Université

d’Oran 1 Ahmed Ben Bella, mon directeur de thèse pour m’avoir accueilli dans son

laboratoire. Ma profonde reconnaissance pour vos encouragements votre patience et vos

conseils. Mes remerciements aussi à Madame Dalache Fatiha, Professeur à l’Université

de Mostaganem, mon co-directeur de thèse pour son soutient et ses conseils tout au long

de ce travail.

Je remercie également les membres du Jury d’avoir bien voulu examiner ce travail. Mes

vifs remerciements vont à Mr Karam Nour Eddine, Pr à l’Université d’Oran 1, pour avoir

honoré par sa présence la présidence du jury, Mr Aoues Abdelkader, Pr à l’Université

d’Oran 1, Mr Bellahcene Miloud Pr au Centre Universitaire de Ain Témouchent et Mr

Drissi Mourad, Pr à l’Université de Tlemcen, pour avoir acceptés d’examiner cette thèse.

Lesquels commentaires, me seront immensément précieux lors de la soutenance.

Mes remerciements vont aussi à tous les chercheurs, doctorants, étudiants et techniciens

du laboratoire de Biologie des Microorganismes et Biotechnologie.

Mes remerciements à mes collègues et mes amis de l’université d’Oran 1, l’Université

Hassiba ben Bouali de Chlef et l’université de l’USTO-Mohamed Boudiaf.

Publication et communication Scientifiques

Publication :

Louiza Lazreg, Fatiha Dalache, Halima Zadi-Karam, Nour-Eddine Karam.

Bacteriocinogenic potential and genotypic characterization of three Enterococcus

faecium isolates from Algerian raw milk and traditional butter. African Journal of

Biotechnology, Volume 14 (32), pp. 2517-2524, 12 August,2015.

Communications:

Louiza Lazreg, Fatiha Dalache, Halima Zadi-Karam, Nour-Eddine Karam. Bactériocines

produites par Enterococcus sp ». 2ème colloque international en biotechnologie,

Université d’Oran, Algérie, 26-29 Avril 2010

Louiza Lazreg, Fatiha Dalache, Halima Zadi-Karam, Nour-Eddine Karam. Inhibitor

Potential of Lactic Acid Bacteria Isolated from Algerian Food. Balkan Agriculture

Congress, 08-11 Septembre 2014

Louiza Lazreg, Fatiha Dalache, Halima Zadi-Karam, Nour-Eddine Karam.

Caractérisation Génotypique de souches d’Enterococcus faecium à Potentiel

bactéricinogène isolées d’aliments algériens..1er Colloque International de la Biologie

Appliquée USTO_MB, 29 Novembre- 01 Décembre 2015

Sommaire Page

Introduction……………………………….……………………………….…………………… 1

1- Synthèse Bibliographique

1-1 Lait et Beurre traditionnel……………………………….………………………………….. 4

1-1-1 Lait……………………………….……………………………….………………………. 4

1-1-2 Microbiologie du lait cru……………………………….…………………………………. 5

1-1-3 Beurre traditionnel……………………………….……………………………….……… 6

1-1-4 Microbiologie du beurre……………………………….……………………………….…. 7

1-2 Bactéries lactiques…………………………………….……………………………….……. 8

1-2-1 Définition……………………………….……………………………….………………... 8

1-2-2 Caractéristiques générales……………………………….………………………………... 9

1-2-3 Habitat……………………………….……………………………….…………………… 9

1-2-4 Taxonomie et habitats des lactocoques et entérocoques …………………………………. 10

1-2-4-1 Lactococcus ……………………………….……………………………….…………... 12

1-2-4-2 Enterococcus …………………………………………………………………………… 13

1-2-5 Propriétés métaboliques d’intérêt technologie des entérocoques………………………… 15

1-2-5-1 Production d’acide……………………………….……………………………….…….. 16

1-2-5-2 Activité Protéolytique……………………………….………………………………….. 17

1-2-5-3 Activité lipolytique et estérasique ……………………………….…………………….. 17

1-2-5-4 Métabolisme du citrate et pyruvate……………………………….…………………….. 18

1-2-6 Application des entérocoques comme probiotiques………………………………………. 19

1-3 Activité antimicrobienne……………………………….……………………………….…... 20

1-3-1 Acides organiques………………………………….……………………………….…….. 20

1-3-2 Peroxyde d’hydrogène……………………………….…………………………………… 21

1-3-3 Diacétyle, acétaldéyde et acétoïne ……………………………….……………………… 22

1-3-4 Dioxyde de carbone……………………………….……………………………….……... 22

1-4 Bactéricocines et Entérocines ……………………………….……………………………… 23

1-4-1 Classification ……………………………….……………………………….……………. 24

1-4-2 Biosynthèse ……………………………….……………………………….……………... 29

1-4-3 Génétique et régulation ……………………………….……………………………….…. 31

1-4-4 Immunité ……………………………….……………………………….………………... 34

1-4-5 Mécanisme d’action ……………………………….……………………………….…….. 35

1-4-6 Spectre d’activité……………………………….……………………………….………… 37

1-5 Facteurs influençant la production de bactériocines ……………………………….……… 38

1-5-1 Souche bactérienne……………………………….……………………………….……… 39

1-5-2 Influence du pH……………………………….……………………………….………….. 39

1-5-3 Influence de la température ……………………………….……………………………… 40

1-5-4 Influence des milieux de culture……………………………….………………………… 40

1-6 Application des bactériocines dans l’industrie alimentaire ………………………………… 43

2 Matériel et Méthodes

2-1 Bactéries……………………………….……………………………….…………………… 45

2-2 Milieux de culture, conditions de croissance et conservation des bactéries……………… 45

2-3 Isolement des bactéries lactiques……………………………….…………………………... 46

2-3-1 Isolement de bactéries lactiques à partir du beurre traditionnel………………………… 46

2-3-2 Isolement des entérocoques à partir des échantillons de laits crus……………………… 46

2-4 Identification phénotypique des bactéries lactiques……………………………….………... 47

2-4-1 Caractérisation morphologique……………………………….…………………………... 47

2-4-2 Caractérisation physiologique……………………………….……………………………. 48

2-4-3 Caractérisation biochimique……………………………….……………………………... 49

2-5 Caractérisation moléculaire des bactéries……………………………….………………….. 49

2-5-1 Extraction de l’ADN……………………………….……………………………………... 50

2-5-2 Amplification de l’ADN des entérocoques par PCR…………………………………… 50

2-5-3 Electrophorèse sur gel d’agarose des produits de la PCR………………………………. 51

2-5-4 Analyse phylogénétique des bactéries……………………………….…………………… 52

2-6 Potentiel inhibiteur des bactéries lactiques……………………………….………………… 53

2-7 Détection de bactéries potentiellement bactériocinogenes………………………………….. 54

2-8 Caractérisation de la nature biochimique des métabolites antibactériens ………………….. 54

2-8-1 Sensibilité aux enzymes……………………………….……………………………….… 55

2-8-2 Effet de la chaleur……………………………….……………………………….……….. 56

2-8-3 Effet au pH……………………………….……………………………….………………. 56

2-9 Influence des milieux de cultures sur la production de métabolites antibactériens………… 56

2-9-1 Influence du tampon du milieu M17 ……………………………….……………………. 56

2-9-2 Influence de différentes concentrations de lait écrémé ajoutées au bouillon M17……….. 57

2-9-3 Influence des sucres ……………………………….……………………………….…….. 57

2-9-4 Influence des milieux M17 et MRS modifiés……………………………….…………… 57

2-10 Cinétique de croissance et de production de métabolites antibactériens………………… 58

2-11 Purification des bactériocines……………………………….……………………………... 58

2-11-1 Précipitation par le sulfate d’ammonium ……………………………….……………… 58

2-11-2 Chromatographie par filtration sur gel de sephadex G-25………………………………. 59

2-11-3 Chromatographie échangeuse d’ions……………………………….…………………… 60

2-11-4 Electrophorèse SDS-PAGE……………………………….……………………………... 61

3-Résultats et discussion

3-1 Isolement des bactéries lactiques……………………………….………………………… 64

3-2 Identification phénotypique des bactéries lactiques……………………………….……….. 65

3-3 Potentiel inhibiteur des bactéries lactiques……………………………….………………… 70

3-4 Détection de bactéries potentiellement bactériocinogènes………………………………….. 76

3-5 Caractérisation moléculaire des bactéries ……………………………….…………………. 82

3-5-1 Amplification de l’ADN des entérocoques……………………………….………………. 82

3-5-2 Analyse phylogénétique……………………………….……………………………….…. 83

3-6 Caractérisation de la nature biochimique des métabolites antibactériens………………… 89

3-6-1 Mise en évidence de l’activité inhibitrice dans le surnageant de culture ………………… 89

3-6-2 Sensibilité aux enzymes ……………………………….…………………………………. 93

3-6-3 Traitement par la chaleur……………………………….………………………………... 95

3-6-4 Effet de différents pH……………………………….……………………………….……. 97

3-7 Influence des milieux de culture sur la production de métabolites antibactériens………….. 103

3-7-1 Influence du tampon du milieu de culture……………………………….………………. 103

3-7-2 Influence de différentes concentrations de lait écrémé ajoutées au bouillon M17………. 107

3-7-3 Influence des sucres ……………………………….……………………………….…….. 111

3-7-4 Influence des milieux M17 et MRS modifiés……………………………….……………. 114

3-8 Cinétique de croissance et de production de bactériocines ………………………………… 117

3-9 Purification des bactériocines ………………………………………………………………. 125

3-9-1 Précipitation par le sulfate d’ammonium…………………………………………………. 125

3-9-2 Chromatographie par filtration sur gel de sephadex G-25………………………………. 126

3-9 -3 Chromatographie par échanges d’ions ……………………………….………………… 129

3-9-4 Détermination de la taille moléculaire des bactériocine par SDS-PAGE………………… 132

4 Conclusion……………………………….……………………………….…………………... 138

5 Références Bibliographiques

Annexe I

Annexe II

Liste des tableaux Page

Tableau 1: Classification de bactéries lactiques couramment utilisées dans le beurre et le

yaourt (Drain, 2016)

7

Tableau 2: Enterococcus et leur répartition en groupes d'espèces (Franz et al., 2006) 15

Tableau 3 : Classification des entérocines (Nes et al., 2007) 28

Tableau 4: Souches cibles utilisées 45

Tableau 5 : Echantillons utilisés et leurs origines 46

Tableau 6 : Composition du mélange réactionnel pour chaque réaction PCR 51

Tableau 7 : composition du gel d’agarose 52

Tableau 8 : Composition des gels de polyacrylamide 62

Tableau 9 : Composition du tampon de migration 62

Tableau 10 : Code des bactéries lactiques isolées à partir du beurre 64

Tableau 11: Code des bactéries lactiques isolées à partir du lait cru 63

Tableau 12 : Identification des bactéries lactiques à l’aide de galerie API 20 Strep 66

Tableau 13 : Identification des bactéries lactiques par caractérisation physiologique et à

l’aide de galeries d’identification API 20 Strep

67

Tableau 14: Inhibitions par les bactéries lactiques 77

Tableau 14 suite : Inhibitions par les bactéries lactiques 78

Tableau 15 : Diamètres des zones d’inhibition des bactéries-tests par les souches d’E

faecium

90

Tableau 16 : Diamètre d’inhibition de bactéries cibles par les extraits concentrés (EC) par

lyophilisation

91

Tableau 17: Effet des enzymes sur l’activité inhibitrice 94

Tableau 18: Diamètre d’inhibition des précipités de surnageant de culture d’Enterococcus

faecium BRO2 et LO12.

125

Liste des figures

Page

Figure 1: Position des genres Enterococcus, Lactococcus et Leuconostoc dans

l’arbre phylogénique des bactéries lactiques sur la base de séquences du gène de

l'ARNr 16S. (Holzapfel et al., 2001).

11

Figure 2 : Voie schématique montrant la relation métabolique entre citrate et

glucose (Cabral et al., 2007)

18

Figure 3: Classification universelle de bactériocines construite sur la base de (a)

système de classification originale pour les bactériocines de bactéries lactiques par

Klaenhammer (1993), et incorporant des éléments (b) de la classification révisée de

Cotter et al (2005)

25

Figure 4 : Présentation schématique de la biosynthèse de l’entérocine A. ( Ennahar

et al., 2000; Martínez et al., 2000; Drider et al., 2006)

30

Figure 5: Organisation des déterminants génétiques impliqués dans la synthèse des

bactériocines d’après Skaugen et al., (2003), Drider et al., (2006) et Franz et al.,

(2007).

32

Figure 6: Mode d’action des bactériocines produites par des bactéries lactiques

(Martínez et al.,2000; Cotter et al., (2005); Breukink et De Kruijff., 2006).

36

Figure 7: Effet inhibiteur des isolats du beurre vis-à-vis de la souche Enterococcus

faecium H3 selon la méthode de Fleming et al. (1975)

70

Figure 8: Inhibition des bactéries cibles par les isolats de lait cru 71

Figure 9: Inhibition de bactéries cibles par les souches isolées du beurre et de la

collection du laboratoire

73

Figure 10 : Inhibition d’E. faecium H3 par les ouches E.feacium BRO2, LO4 et

LO12

76

Figure 11 : Inhibition d’Pseudomonas sp par les ouches E. feacium BRO2, LO4 et 76

LO12

Figure 12 : Interactions des souches de L. lactis ssp lactis vis-à-vis des bactéries

cibles

79

Figure 13 : Interaction des souches d’Enterococcus vis-à-vis des bactéries cibles 79

Figure 14 :Gel d’électrophorèse des produits PCR. 83

Figure 15 : Alignement de la séquence partielle de l’ARN 16S de la souche BRO2

sur la séquence de l’ARN 16S de la souche de référence d’E. faecium JCM 5804

84

Figure 16 : Alignement de la séquence partielle de l’ARN 16S de la souche LO4


85

Figure 17 : Alignement de la séquence partielle de l’ARN 16S de la souche LO12


86

Figure 18: Arbre phylogénétique construit par la méthode Neighbor-joining

utilisant des séquences 16SrRNA des souches (LO4, LO12 et BRO2) et des

séquences 16SrRNA de 12 souches d’espèces connues d’Enterococcus. L’arbre a

été répété 100 fois.

87

Figure 19 : Effet des enzymes sur le surnageant de culture d’ E faecium LO12. 94

Figure 20 : Activité inhibitrice résiduelle des substances des souches E feacium

BRO2, LO4 et LO12 vis-à-vis d’ E faecium H3.

96

Figure 21: Effet du pH sur l’activité inhibitrice des souches d’E faecium vis-à-vis

d’E.

faecium H3

98

Figure 22: Influence du tampon du milieu de culture sur la production de

métabolites antibactériennes par E. faecium BRO2.

104


métabolites antibactériennes par E. faecium LO4.

104


métabolites antibactériennes par E. faecium LO12.

105

Figure 25 :Influence de la concentration de lait écrémé additionné au milieu de

culture sur la production de métabolites antibactériennes par E.faecium BRO2.

108


culture sur la production de métabolites antibactériennes par E.faecium LO4.

108


culture sur la production de métabolites antibactériennes par E.faecium LO12.

109

Figure 28 : Influence des sucres du milieu de culture sur la production de

métabolites antibactériens par E. faecium BRO2

111


métabolites antibactériens par E. faecium LO4

112


métabolites antibactériens par E. faecium LO12

112

Figure 31 : Influence du M17 et du MRS modifiés sur la production de métabolites

antibactériennes par E.faecium BRO2

114


antibactériennes par E.faecium BRO2

115

Figure 33 : Cinétique de croissance et de production de bactériocines d’E. faeciu

BRO2

118

Figure 34 : Cinétique de croissance et de production de bactériocines d’E. faecium

LO12

118

Figure 35 : Vitesse spécifique de croissance et de production de bactériocines

d’E.faecium BRO2

119

Figure 36 : Vitesse spécifique de croissance et de production de bactériocines

d’E.faecium LO12

120

Figure 37 : Chromatographie gel filtration de la fraction active FA1 BRO2 sur 127

Séphadex G-25

Figure 38 : Chromatographie gel filtration de la fraction active FA1 LO12 sur

Séphadex G-25

127

Figure 39 : Activité antibactérienne des fractions collectées après filtration sur

chromatographie gel filtration (Sephadex G-25)

128

Figure 40: Chromatographie échangeuse d’ions de la fraction active FA2 BRO2 sur

DEAE-cellulose éluée par divers tampons.

129

Figure 41: Chromatographie échangeuse d’ions de la fraction active FA2 LO12 sur

CM-Séphadex C-25 éluée par un gradient continu de NaCl 0 M à 0,1 M et de 0,1 M

à 1 M.

130

Figure 42 : Activité inhibitrice des fractions obtenues par chromatographie

échangeuse de cations (CM-SéphadexC-25)

131

Figure 43 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide des fractions actives BRO2. 132

Figure 44 : Courbe de calibration SDS PAGE 133

Figure 45 : Analyse électrophorétiques des fractions actives LO12. 134

Abréviations

ADN : Acide désoxyribonucléique

ARN Acide ribonucléique

BLIS : Bacteriocin Like Inhibitory substances

°C: Degré celsius

CM:CarboxyMethyl

D : Dextrogyre

Da : Dalton

DEAE: DiEthylAminoEthyl

DO : Densité Optique

E: Enterococcus

EDTA: Acide Éthylène Diamine Tétracétique

FAO: Food Agriculture Organisation (Organisation des nations Unies pour l’agriculture et

l’alimentation)

g: Gramme

h : heure

HCl: Acide Chloridrique

ICMSF : International Commision on Microbiological Specification for Food

(Commission internationale pour la définition des caractéristiques microbiologiques

des aliments)

kDa Kilodalton

L: Lactococcus

L : Levogyre

nm : Nanomètre

PCR: Polymerase Chain reaction

pH: Potentiel Hydronium

Tr/min : Tours par minute

UA/ml Unité Arbitraire /ml

µl microlitre

µm : micromètre

UFC : Unité Formant Colonies

Résumé

Les bactéries lactiques sont impliquées dans de nombreux processus de transformation

alimentaire grâce à leurs propriétés technologiques. Elles produisent aussi différentes

substances à activité antimicrobienne exploitées comme conservateurs biologiques. Ce

travail a porté sur l’étude du potentiel bactériocinogène de souches isolées d’aliments

locaux. Les souches de bactéries lactiques isolées du lait cru et du beurre de fabrication

traditionnelle sont phénotypiquement identifiées à L. lactis, L. cremoris, E. faecium, E.

faecalis, L. garviae, E. durans et Enterococcus sp. L’évaluation du potentiel inhibiteur de

ces bactéries lactiques montre que les souches E. faecium BRO2, LO4 et LO12 sont

bactériocinogènes vis-à-vis de Pseudomonas sp, Proteus mirabilis et E. faecium. L’analyse

phylogénétique des souches bactériocinogènes confirme leur identification à E. faecium.

La sensibilité des métabolites antibactériens aux enzymes protéolytiques et leur résistance

à la chaleur et aux différents pH confirme le potentiel bactériocinogène d’E. faecium

BRO2, LO4 et LO12. La production de ces bactériocines nommées entérocines (BRO2,

LO4, LO12) est significativement améliorée en bouillon M17 tamponnée par du tampon

phosphate de sodium par comparaison aux autres tampons testés. L’ajout de lait écrémé au

bouillon M17 augmente significativement la production de l’entérocine LO12. Dans ce

bouillon, la production des entérocines BRO2 et LO4 est aussi améliorée sans être

statistiquement significative. Le glucose par comparaison aux autres sucres testés est le

sucre le plus approprié à la production de ces bactériocines. Le bouillon M17 modifié

permet de produire plus de bactériocines BRO2 et LO12 que le bouillon M17 ou MRS ou

Lait. Les entérocines BRO2 et LO12 sont des métabolites secondaires, thermostables et

cationiques. L’analyse par électrophorèse SDS-PAGE a révélé que l’entérocine BRO2 a

une taille moléculaire comprise entre 5700 à 6900 Da.

Mots clés : Bactéries lactiques, potentiel inhibiteur, bactériocinogène, phylogénétique,

E. faecium, entérocines, M17 modifié, cationiques, métabolite, taille moléculaire.

ABSTRACT

The lactic acid bacteria are involved in numerous processes of food transformation thanks

to their technological properties. They produce so various substances with antimicrobial

activity exploited as bio-preservatives. This work concerned the study of the

bacteriocinogenic potential of isolates from local food. The lactic acid bacteria isolated

from raw milk and traditional manufacturing butter are phenotypically identified as L.

lactis, L. cremoris, E. faecium, E. faecalis, L. garviae, E. durans and Enterococcus sp. The

evaluation of the inhibitory potential of these lactic acid bacteria shows that E. faecium

BRO2, LO4 and LO12 strains are bacteriocinogenic towards Pseudomonas sp, Proteus

mirabilis and E. faecium. The phylogenetic analysis of bacteriocinogenic strains confirms

their identification to E. faecium. The sensibility of the antibacterial metabolites to

proteolytic enzymes and their resistance at various pH and heat treatment confirms the

bacteriocinogenic potential of E. faecium BRO2, LO4 and LO12. The production of

enterocins (BRO2, LO4, LO12) is significantly improved in broth M17 buffered with

sodium phosphate. The addition of skimmed milk to the M17 broth increases significantly

the production of the enterocin LO12. In this broth, the production of enterocins BRO2 and

LO4 is also improved without being statistically significant. The glucose seems to be the

most suitable sugar to improve the production of these bacteriocins. The modified M17

broth allows to produce more of bacteriocins BRO2 and LO12 than the M17 or MRS broth

or Milk. Enterocins BRO2 and LO12 are secondary metabolites, thermosatbles and

cationics. The analysis by SDS-PAGE revealed that the enterocin BRO2 has a molecular

size between 5700 to 6900 Da.

Keywords: Lactic acid bacteria, Inhibitory potential, bacteriocinogenic, phylogenetic, E.

faecium, enterocin.

الملخص

في العديد من عمليات تحويل األغذية بفضل خصائصها التكنولوجية. وهي تنتج مواد اللبنتشارك بكتيريا حمض

سالالت ات عزليإمكان كمواد حافظة حيوية. تناول هذا البحث دراسة تستعملمختلفة جدا ذات نشاط مضاد للميكروبات

المعزولة من الحليب الخام والزبدة التقليدية في اللبن كتريا حمضاألغذية المحلية. تم تحديد ب من لبكتريوسين منتجة

التصنيع

L. lactis, L. cremoris, E. faecium, E. faecalis, L. garviae, E. durans and Enterococcus sp.

E. faecium BRO2 ،LO4 E. faeciumبإختيار لنا سمح مثبطة مواد إنتاج اللبن . تقييم إمكانية بكتيريا حمض

L012 E. faecium

. .Pseudomonas sp, Proteus mirabilis and E. faecium مثبطة لبكتريوسين منتجة السالالت هذه

ت الحموضة والمعالجة امختلف درجل ةلالنزيمات ومقاومل حساسة أنها على المنتجة المواد المثبطة تحاليل أثبتت

مع فوسفات M17( بشكل ملحوظ في مرق BRO2 ،LO4 ،LO12) بكتريوسين الحرارية . تم تحسين إنتاج

في هذا المرق، إنتيروسين. LO12يزيد بشكل كبير من إنتاج M17الصوديوم. إضافة الحليب منزوع الدسم إلى مرق

أيضا دون أن تكون ذات داللة إحصائية. ويبدو أن الجلوكوز هو السكر LO4و BRO2بكتريوسينيتم تحسين إنتاج

من LO12و BRO2بكتيريوسين إنتاج لزيادت المعدلة M17. يسمح مرق بكتريوسين لتحسين إنتاج هذهاألنسب

موجبة. كشف شحنة ذات هي األيض الثانوية، LO12و BRO2 بكتريوسين . أو الحليب MRSأو M17مرق

Da 6900حتي 5700جزيئي بين لديه حجم BRO2 األنتيروسين SDS-PAGEالتحليل

: ئيسيهر كلمات ; اللبنبكتيريا حمض ; مضاد للميكروبات سالالت ;بكتريوسين; Enterococcus ; األغذية مرق

M17 المعدلة

Introduction

Introduction

1

De nos jours les aliments de fabrication traditionnelle sont toujours appréciés par quelques

consommateurs. L’excès d’aliments et la nécessité de les consommer pour survivre

pendant l’hiver et les périodes de sécheresse menèrent l’homme à utiliser depuis longtemps

et empiriquement des procédés de conservation. Ces aliments transformés par nos ancêtres

sont à l’origine des produits des industries alimentaires actuelles. La fermentation avec les

procédés de séchage et de salage, est la plus ancienne des méthodes de conservation des

aliments, elle est ancrée dans les cultures traditionnelles et la vie des villageois (Marshall

et Meijia, 2012).

Certains micro-organismes comme les bactéries lactiques, les moisissures et les levures ont

largement été exploités dans les fermentations alimentaires (Giraffa, 2004). Ils sont

responsables de nombreuses propriétés d’aliments fermentés tels que la flaveur, la durée de

vie, la texture et les effets bénéfiques sur la santé (Giraffa, 2004). La production

d’aliments fermentés est basée sur l’utilisation de ferments, par exemple les bactéries

lactiques qui initient rapidement l’acidification de matières premières (Leroy et DeVuyst,

2004). Ces bactéries acidifient les aliments, générant un goût d’acide lactique piquant,

exerçant des activités protéolytiques et lipolytiques et produisant des composés

arômatiques, par exemple à partir d’acides aminés, en plus de la bioconversion (Van

Kranenburg et al., 2002). Ces ferments ont été isolés et caractérisés à partir d’aliments

transformés par des procédés ancestraux.

Les bactéries lactiques sont économiquement importantes car elles sont largement utilisées

dans les denrées alimentaires et les aliments fermentés. Elles produisent différentes

substances à activité antimicrobienne qui peuvent être utilisées comme bio-conservateurs

(Centeno et al., 1996). L’effet antimicrobien de ces bactéries à travers le processus de

fermentation a été apprécié par l’homme et lui a permis de prolonger la durée de vie de

plusieurs aliments (Savadogo et al., 2004). Les bactéries lactiques sont présentes dans de

nombreux produits alimentaires et elles sont essentielles dans de nombreux processus de

transformation alimentaire conduisant à des changements dans la texture, la saveur et la

conservation des produits fermentés. La capacité de ces bactéries à inhiber la croissance

d'autres bactéries est connue depuis de nombreuses années. Les substances responsables de

cette activité inhibitrice comprennent des acides organiques, le diacétyle, le peroxyde

Introduction

2

d'hydrogène, des agents lytiques, et les bactériocines (Tagg et al .,1976).

Les deux dernières décennies ont connu une recherche intensive sur les produits

antimicrobiens naturels synthétisés par des bactéries lactiques qui peuvent être utilisés

comme conservateurs alimentaires à la place de conservateurs chimiques (Gautam et al.,

2014). Le principal effet antimicrobien de ferments lactiques responsable de bio-

conservation est le taux d’acidification. Cependant pour les produits légèrement acidifiés,

l’activité bactériocinogène peut jouer un rôle crucial pour éliminer les micro-organismes

indésirables qui montrent une tolérance à l’acidité (Šušković et al., 2010).

Actuellement, les bactériocines ont attiré l'attention en tant que substituts potentiels, ou en

tant que thérapie combinée utilisant des composés antimicrobiens en raison de leur

puissante activité, leur stabilité et une faible toxicité pour les humains (Joerger, 2003 ;

Hassan et al., 2012; Amer Eglal et al., 2014). Plusieurs bactériocines de bactéries à Gram

positif ont moyennement un large spectre et ont un grand potentiel comme agents

antimicrobiens dans les aliments et production de nourriture (Nigutova et al., 2005). Elles

sont fréquemment retrouvées comme métabolites secondaires, produits par une variété de

micro-organismes tels que les bactéries à Gram-positif du genre Streptomyces, bactéries

lactiques et Bacillus (Klaenhammer, 1988). Les bactériocines sont largement utilisées en

sciences alimentaires pour prolonger la durée de conservation (Ghrairi et al., 2012). Elles

inhibent les infections par les pathogènes chez les animaux (Van Heel et al., 2011). Les

industries pharmaceutiques et les sociétés médicales tentent de les utiliser comme

traitement de cancers malins (Lancaster et al., 2007).

Dans cette étude nous nous sommes intéressés à étudier le potentiel bactérioicinogène des

entérocoques. En effet, les entérocoques connaissent un intérêt croissant quant à leur

utilisation comme producteurs de bactériocines et aussi en tant que probiotiques. Dans

certains fromages, la croissance des entérocoques contribue à la maturation et le

développement de la saveur des aliments (Konings et al., 2000). Les entérocoques sont

souvent utilisés comme probiotiques améliorant l'équilibre microbien de l'intestin ou

comme un agent bénéfique dans le traitement de la gastro-entérite chez les humains et les

animaux (Stiles et Holzapfel, 1997). Plusieurs entérocoques d'origine alimentaire

produisent des bactériocines qui exercent une activité anti Listeria (Laukov et Marekova,

2001).

Introduction

3

L’utilisation de substances antimicrobiennes produites par les bactéries traditionnellement

utilisées dans la fabrication d’aliments a été intensément étudiée comme moyen

d’amélioration des barrières microbiennes dans les aliments formulés et peu transformés

(Garver et Muriana, 1993). L’aliment fermenté a été identifié comme l’une des sources

importantes de souches productrices de bactériocines (Noojaree Sonsa-Arda et al ., 2015).

De nombreux travaux s’intéressent à la caractérisation de ferments lactiques des produits

dérivés du lait tel que le fromage traditionnel. Cependant le beurre ne fait l’objet que de

peu de travaux en raison de la recrudescence de sa consommation dans les régions

mondaines dont les populations sont en quête de manger moins gras. En région rurales le

beurre de fabrication traditionnelle est très apprécié par les consommateurs. Au beurre

s’ajoute le lait cru qui est la matière première du beurre. Ce dernier est obtenu par

fermentation spontanée du lait cru. Les bactéries lactiques du beurre ou du lait cru (la

matière première des aliments dérivés du lait) sont des ferments empiriques. Il est

intéressant d’étudier ces bactéries lactiques indigènes et de caractériser leur bactériocines.

Dans ce contexte, le Laboratoire de Biologie des Micro-organismes et Biotechnologie

s’intéresse à caractériser des souches isolées de lait de chamelle collecté dans la région de

Timimoun (Karam, 1995 ; Zadi-Karam, 1998) et à étudier le potentiel bactériocinogène

ainsi que la caractérisation de bactériocines de bactéries lactiques isolées d’aliments locaux

(Dalache, 2006 ; Merzoug et al., 2016).

Ce travail de thèse est orienté vers le potentiel bactériocinogène de bactéries lactiques

indigènes isolées de beurre de fabrication traditionnelle et de lait cru. Dans ce contexte,

notre travail à consister à isoler à partir d’échantillons locaux de beurre et de lait cru des

souches de bactéries lactiques indigènes particulièrement les lactocoques et les

entérocoques. Parmi ces derniers, les souches à potentiel bactériocinogène ont été

caractérisées à l’échelle moléculaire. Les métabolites antibactériens ont été caractérisés par

détermination de leur nature et propriétés biochimiques. L’influence de la composition du

milieu de production a été aussi étudiée.

Synthèse Bibliographique


4

1-1 Lait et Beurre traditionnel

1-1-1 Lait

Le lait est le produit élaboré par les glandes mammaires des femelles de mammifères après

la naissance du jeune. En 1909, le congrès international de la répression des fraudes défini

le lait comme étant le produit intégral de la traite totale et interrompue d’une femelle

laitière bien portante, bien nourrie et non surmenée. Il doit être recueilli proprement et ne

pas contenir de colostrum.

Selon le CODEX STAN 206 (1999), le lait est la sécrétion mammaire normale d’animaux

de traite obtenue à partir d’une ou de plusieurs traites, sans rien y ajouter ou en soustraire,

destiné à la consommation comme lait liquide ou à un traitement ultérieur. Il est décrit

comme étant un liquide opaque blanc mat, légèrement bleuté ou plus au moins jaunâtre à

l’odeur peu marquée et au gout douceâtre, secrété après parturition par la glande

mammaire des animaux mammifères femelles pour nourrir leur nouveau-né.

Le lait est un aliment riche et complet. C’est le premier aliment que consomme un

nouveau-né chez les mammifères. En raison de ses propriétés nutritives, de sa teneur en

vitamines et en minéraux en particulier le calcium le lait ainsi que ses dérivés, ont toujours

été appréciés et largement consommés dans le monde. Selon la FAO 2016, la

consommation moyenne de lait par habitant en Afrique du Nord est de 30 à 150 kg/

habitant/ an. Le lait de vache est de tous le plus connu et les données qui le caractérisent

sont sans doute les plus exactes. La vache assure de loin la plus grande part de la

production mondiale (90 pour cent) même en pays tropicaux (70 pour cent) (FAO, 1990).

Il est logiquement aussi le produit laitier le plus consommé et étudié en nutrition humaine.

En Algérie, le lait occupe une place importante dans la ration alimentaire de chacun, quel

que soit son revenu. Ainsi, pour 1990, on estime que le lait a compté pour 65,5 % dans la

consommation de protéines d’origine animale, devançant largement la viande (22,4 %) et

les œufs (12,1 %) (Amellal, 1995). En 2014, la consommation moyenne de lait en Algérie

est de 130 litres par personne par an, se classant parmi les plus gros consommateurs de lait

au monde. D’après Souki (2009), l’Algérie est le deuxième importateur de lait et dérivés

après le Mexique (la croissance des importations laitières s’élève à 57 % en moyenne par

an entre 1996 et 2004.


5

1-1-2 Microbiologie du lait cru

La riche composition du lait fait de lui un milieu de culture favorable à la croissance de

nombreux micro-organismes. L’activité d’eau élevée, le pH modéré (pH 6,4 - 6,6) et

l’approvisionnement suffisant en nutriments font du lait un excellent milieu.

La composition de la flore microbienne du lait cru est fonction des conditions d’hygiène

lors de la traite, et de l’état de santé de l’animal. La flore du lait cru est composée

d’espèces de contamination provenant de l'étable, de l’alimentation, la surface du trayon ou

de l’équipement laitier (Cousin, 1982). Trois sources contribuent à la présence de micro-

organismes dans le lait : le pis intérieur du trayon extérieur, son environnement immédiat

et l'équipement de traite et de la manutention du lait (Adams et Moss, 2008).

La prise aseptique de lait à partir d’une vache saine contient normalement un faible nombre

de micro-organismes, typiquement moins 102_103 UFC/ml (Adams et Moss, 2008).

Généralement, un nombre élevé de bactéries lactiques peuvent être trouvées dans le lait

cru. Elles appartiennent aux genres Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,

Enterococcus, Streptococcus (Richter et al., 1992).

Les microorganismes couramment isolés sont les microcoques, streptocoques et

diphteroides. Les dénombrements de Corynebacterium bovis sont fréquemment élevés due

à la mammite, maladie inflammatoire du tissu mammaire lequel est la cause majeure de la

perte économique en industrie laitière (Adams et Moss, 2008). D’autres bactéries à Gram

positif comme Bacillus, Microbacterium, Micrococcus, Staphylococcus et des bactéries à

Gram négatif telles que Pseudomonas, Aeromonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas et

Chryseobacterium ainsi que plusieurs entérobactéries tel Enterobacter, Hafnia et

Klebsiella sont aussi fréquemment trouvés dans le lait cru. Entre les bactéries, quelques

genres de levures comme Candida, Kluyveromyces et Pichia ont aussi été isolés (Fleet;

1990; Delavenne et al., 2011; Quigley et al., 2011).

Petersen et al (2002), ont montré que les levures et les moisissures peuvent contaminer le

lait et le fromage et contribuent à la maturation de fromages.


6

1-1-3 Beurre traditionnel

Le beurre est un produit gras dérivé exclusivement du lait et/ou de produits obtenus à partir

du lait, principalement sous forme d’une émulsion du type eau-dans-huile (FAO, 2011).

La FAO décrit le beurre comme étant un produit gras dérivé exclusivement de la crème, du

lait, ou sous-produits laitiers. En plus de la graisse du lait, le beurre contient des solides

non gras du lait, de l'eau et, parfois, des additifs. A la différence du lait et de la crème, où

les globules de graisse sont dispersés dans la phase aqueuse, le beurre bien travaillé est

constitué d'eau dispersée dans la graisse.

La phase continue est constituée de matière grasse du lait dans lequel des gouttelettes

aqueuse, certains globules gras et de minuscules bulles d'air sont répartis uniformément. En

termes plus pratiques, le beurre est une pâte grasse. Il est doux et tartinable à température

ambiante et plus difficile si elle est froide. Il a une saveur douce légèrement acide.

Le beurre traditionnel est un produit ancestral, connu depuis la nuit des temps dans de

nombreuses civilisations. Parmi les dérivés du lait, le beurre est le moins consommé. Sa

riche teneur en matières grasses en est la cause. En Algérie, le beurre de fabrication

traditionnelle est appelé Zebda et est obtenu à partir de lait fermenté appelé ‘’Raib’’. Les

étapes d’obtention de ce beurre se résument en :

-fermentation spontanée du lait cru : le lait cru est transformé en petit lait (‘’Raib’’) à une

température ambiante. En hiver la fermentation se déroule pendant 2 à 3 jours, alors qu’elle

ne dure qu’une journée en été.

-le barattage : le petit lait est agité fortement dans un contenant (auparavant ‘’chakwa’’)

jusqu’à formation de globules gras. Ces globules étant de faible densité sont récupérés à la

surface.

On distingue deux sortes de beurres, le beurre frais qui correspond à la matière grasse

récupérée après barattage dont la structure est molle en raison de la forte concentration en

eau et le beurre conservé appelé ‘’smen’’ qui a été additionné de sel afin de pouvoir le

conserver.


7

1-1-4 Microbiologie du beurre

La composition de la flore du beurre traditionnel, dépend non seulement de la qualité

microbiologique du lait cru, mais aussi des ustensiles utilisées lors de la fermentation du

lait et lors du barattage. Il peut contenir des bactéries lactiques, des levures et des

moisissures.

Les genres et espèces de bactéries lactiques participant dans la fabrication du beurre sont

des bactéries mésophiles par comparaison aux ferments utilisés en fromagerie (Tableau 1).

Tableau 1: Classification de bactéries lactiques couramment utilisées dans le beurre

et le yaourt (Drain, 2016)

Mésophiles (Croissance à 25-30°C)

Utilisées pour fabriquer par exemple le beurre

et les fromages

Thermophiles (Croissance à 38°C- 45°C)

Utilisées pour fabriquer par exemple le

yaourt ou fromages durs

Types de ferments

• -Type O :

• L. lactis ssp. lactis

• L. lactis ssp. Cremoris

• Produisent principalement de l'acide

lactique à partir du lactose

• Type D

• Plus Type O ;

• L. lactis ssp. lactis biovar

diacetylactis comme producteur

flaveur (ex : diacétyle)

• Type L

• Plus Type O ;

• Ln mesenteroides ssp.

mesenteroides comme producteur de

flaveur (ex : diacetyl, acide acetique)

• Type LD

• Combinaison de type L et D

Exemples :

• Str. salivarius ssp. thermophilus

(Produit de l'acide lactique à partir

du lactose)

• Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus

(produit l’acide lactique, aussi bien

que des composés de flaveur

donnant au yaourt son goût et son

arôme

• Lb. acidophilus

• Bifidobacterium animalis


8

En Europe continentale la plupart des beurres traditionnels sont fabriqués à partir de crème

fraîche en utilisant des cultures de démarrage et une phase aqueuse à pH avoisinant 4,6. La

microflore du beurre dérive principalement de la crème utilisée (ICMSF).

La qualité microbiologique de la crème séparée dans la ferme diffère considérablement de

la crème fraîche séparée dans une usine de produits laitiers. Par exemple lorsque la crème

est maintenue dans une ferme pendant une semaine dans des conditions d'hygiène

déplorables et sans réfrigération, l’acidification (la croissance de Lactococcus lactis et

d'autres micro-organismes indésirables) peut avoir eu lieu, la croissance des levures et

moisissures (Geotrichum candidum) peut être abondante et des bactéries à Gram négatif

aérobies (membres des genres Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter / Moraxella et

Flavobacterium) peuvent avoir proliféré, entraînant des changements protéolytiques et

lipolytiques (Foster et al., 1957).

1-2 Bactéries lactiques

1-2-1 Définition

Les bactéries lactiques constituent un groupe hétérogène de microorganismes transformant

les hydrates de carbone en acide lactique, d’où leur nom de bactéries. Elles ont été

découvertes en 1782 par le chimiste suédois Scheele (in Thonart, 1997). C’était en 1919

qu’Orla-Jensen a défini pour la première fois le groupe des bactéries lactiques.

Ce groupe réunit plusieurs genres de différentes morphologies ayant pour caractère

commun leur capacité à fermenter le lactose en produisant de l’acide lactique. Ces

bactéries ont été l’un des groupes bactériens les plus utilisés en raison de leurs larges

applications industrielles. Le groupe de bactéries lactiques contient principalement des

souches de Lactobacillus, Weissella, Carnobacterium, Streptococcus, Enterococcus,

Lactococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, et Tetragenococcus.

Elles sont impliquées dans un grand nombre de fermentations spontanées de produits

alimentaires (Stiles et Holzapfel, 1997).


9

1-2-2 Caractéristiques générales

Les bactéries lactiques sont des procaryotes hétérotrophes et chimio organotrophes (in De

Roissart, 1986). Elles sont à Gram positif, non sporulantes, non mobiles, anaérobies mais

aérotolérantes et ne possèdent pas de catalase (certaines souches possèdent une

pseudocatalase), de nitrate réductase, ni de cytochrome oxydase.

Toutes les bactéries lactiques possèdent un métabolisme fermentaire leur permettant, en

utilisant des sucres fermentescibles, de produire principalement de l’acide lactique mais

aussi d’autres acides organiques (acide acétique, acide formique.). Certaines espèces ou

certaines souches peuvent en outre produire de l’acide formique ou de l’acide succinique

(De Roissart et Luquet., 1994).

Toutes les bactéries lactiques en utilisant les glucides, peuvent produire soit de :

- l’acide lactique exclusivement (bactéries homolactiques strictes),

- l’acide lactique et de l’acide acétique (bactéries hétérolactiques facultatives),

- l’acide lactique, de l’acide acétique ou de l’éthanol et du CO2 (bactéries hétérolactiques

strictes).

La plupart des bactéries lactiques sont mésophiles; certaines sont psychrotolérantes ou

thermotolérantes. Elles se développent majoritairement à des pH compris entre 4 et 6,5 et

certaines sont encore actives à pH 9,6 ou à pH 3,2. Elles ont des tolérances très variables

vis-à-vis du sel (Dalie-Doguiet, 2010).

1-2-3 Habitat

Les bactéries lactiques sont ubiquistes, Elles colonisent de nombreux produits alimentaires

comme les produits laitiers, la viande, le poisson, les végétaux et les céréales (Drouault et

al., 2001 ; Dortu, 2008). Ces bactéries vivent en association avec un hôte, tel que

l’Homme ou l’animal, dans un écosystème bactérien comme le tractus gastro-intestinal ou

génital des mammifères (Klein et al., 1998). Elles peuvent être isolées de nombreuses

sources, elles sont largement retrouvées à la surface de nombreux aliments crus et sont par

conséquent retrouvées aussi comme contaminants environnementaux lors de la fabrication

d’aliments et donc régulièrement dans les aliments produits. Elles sont aussi présentes dans

le tractus intestinal de l’homme et des animaux et par conséquents dans les fèces, par

lesquelles ces bactéries sont véhiculées et distribuées.


10

1-2-4 Taxonomie et habitats des lactocoques et entérocoques

Depuis la découverte des bactéries lactiques, leur classification a connu plusieurs

modifications. En 1919 Orla Jensen rassembla les membres des bactéries lactiques dans un

même groupe. Les caractères considérés étaient le type de Gram, l’immobilité, l’absence

de spores, la forme allongée ou sphérique et la fermentation des sucres en acide lactique

(Stiles et Holzapfel, 1997). Lancefield en 1933, proposa une classification basée sur la

différentiation sérologique entre les bactéries du groupe. En 1937, Sherman classa les

bactéries lactiques en fonction de leurs caractéristiques physiologiques.

Dans la pratique, les caractéristiques phénotypiques et biochimiques de l'identification

systématique des isolats peuvent ne pas être suffisantes pour attribuer définitivement une

souche à une espèce particulière. Actuellement avec la disponibilité de la technologie

rapide et automatique du séquençage de l'ADN, le séquençage direct du gène ARNr 16S a

émergé comme une méthode puissante et relativement facile permettant en une seule étape

la classification (Axelsson, 2004).

La classification s’appuie sur des données moléculaires comme la comparaison des

séquences codant pour les ARN16S ribosomiques. Carl Woese a montré que la séquence

de l'ARNr 16S est un marqueur phylogénétique utile présent chez tous les procaryotes du

monde (Woese et Fox, 1977). Le gène de l'ARNr 16S est fortement conservé, mais

contient également des régions variables avec des séquences de signature spécifiques à

l'espèce. Les bases de données publiques offrent une énorme quantité de données sur les

séquences du gène ARNr 16S ainsi que des données de qualité contrôlée qui sont

disponibles dans plusieurs bases de données (De Santis et al., 2006 ; Pruesse et al., 2007;

McDonald et al., 2012).

Parmi les bactéries largement étudiées et exploitées les bactéries lactiques se trouvent dans

deux embranchements distincts, à savoir le phylum des Firmicutes et Actinobactéries.

Dans le phylum des Firmicutes les genres les plus importants de bactéries lactiques sont

Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus et

Weissella. Ces genres appartiennent à l'ordre des Lactobacillales et ont un contenu en GC

faible (31-49%). au sein du phylum des Actinobactéries, les bactéries lactiques appartenant

au genre Bifidobacterium ont une teneur élevée en GC (58- 61%) (Klaenhammer et al.,

2005).


11

En plus des genres Enterococcus, Lactococcus et Leuconostoc (Figure 1), les bactéries

lactiques importantes dans les aliments appartiennent aux genres Carnobacterium,

Lactobacillus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et

Weissella (Doyle et al., 2013).

Figure 1: Position des genres Enterococcus, Lactococcus et Leuconostoc dans l’arbre

phylogénique des bactéries lactiques sur la base de séquences du gène de l'ARNr 16S.

(Holzapfel et al., 2001).

Les nouveaux outils pour l’identification et la classification des bactéries lactiques

remettent couramment et/ou complètent en cause les méthodologies traditionnelles basées

sur les caractères phénotypiques. Ainsi, l'ancien genre Streptococcus a été divisé en trois

genres: Enterococcus (E.), Lactococcus (L.) et Streptococcus sensu stricto (Alexander et

al., 2001; Zongzhi et al., 2008). Par la suite, certaines bactéries lactiques, ressemblant à

des lactocoques, ont été suggérées pour former un genre distinct, Vagococcus (V.) (Aly et

al., 2004).


12

Les genres Lactobacillus, Leuconostoc et Pediococcus sont restés largement inchangés,

mais certaines bactéries lactiques en forme de bâtonnets, auparavant incluses dans

Lactobacillus, forment le genre Carnobacterium (C.) (Elliot et al., 1991), et les anciennes

espèces Pediococcus halophilus ont été hissées au niveau du genre, formant le genre

Tetragenococcus (T.) (Facklam et al., 1998).

Dans ce travail nous nous sommes intéressés à l’étude de deux genres à savoir Lactococcus

et Enterococcus.

1-2-4-1 Lactococcus

Les lactococoques sont des cocci en paires ou en chaînes, Gram+, non mobiles, catalase

négative, non sporulés et anaérobies facultatifs appartenant au groupe des bactéries

lactiques. Ils ont une température optimale de croissance de 30°C et peuvent survivre à

10°C mais ne peuvent pas croitre à 45°C. Ce genre comprend 5 espèces ; L. lactis, L.

garvieae, L. piscium, L. plantarum et L. raffinolactis et une nouvelle espèce nommée L.

chungangensis (Cho et al., 2008 ; Tanigawa et al., 2010). Cette dernière a été isolée pour

la première fois à partir de mousse de boue (Cho et al., 2008).

Dans l’industrie alimentaire, certaines souches de Streptococcus et Lactococcus sont

utilisées notamment comme agent d’acidification et de coagulation lactique en fromagerie,

en salaison et dans la fabrication de yaourts (Thu, 2008). Les lactocoques sont étroitement

associés aux produits laitiers, mais seul Lactococcus lactis est actuellement utilisé dans la

technologie laitière (Thu, 2008). Lactococcus lactis est le principal constituant de

beaucoup de cultures starter industrielles et artisanales utilisées pour la fabrication d'une

large gamme de produits laitiers fermentés, y compris le lait acidifié et les fromages frais et

doux (Vlieg et al., 2006).

Cette espèce est subdivisée en L. lactis ssp. cremoris, L. lactis ssp. hordniae, L. lactis ssp.

lactis et L. lactis ssp. lactis biovar diacetylactis (Schleifer et al., 1987; Vlieg et al., 2006).

Parmi les espèces de Lactococcus, L. lactis ssp lactis et L. lactis ssp cremoris sont

fréquemment utilisées comme souches starters dans les industries laitières, notamment en

technologie fromagère (Cogan et Hill, 1993).


13

1-2-4-2 Enterococcus

Les entérocoques sont des bactéries lactiques coccoïdes dont les cellules sont ovoïdes et se

présentent sous forme de cellules isolées, ou en paires ou encore sous forme de chaînettes

(Schleifer et Kilpper-Balz, 1984). Ces bactéries produisent des colonies de couleur

blanchâtre. Elles sont généralement catalase négative, oxydase positive, anaérobies

facultatives, non mobiles et non sporulées.

Les entérocoques ont été isolés et caractérisés il y a 113 ans (Mac Callum et Hastings,

1899). Ces bactéries commensales hautement évoluées ont été largement utilisées en

industries alimentaires et comme probiotiques pour prévenir les maladies (Ramsey et al.,

2014). Ils sont omniprésents dans la nature (Franzetti et al., 2004), et se retrouvent en

grand nombre dans les légumes, le matériel végétal, et dans la nourriture, en particulier

celle d'origine animale tels que les produits laitiers (Giraffa, 2003). Les entérocoques

peuvent contaminer le lait soit directement par les fèces d’animaux soit indirectement par

une source d’eau contaminée ou par l’équipement laitier ou par les tanks de stockage

(Giraffa, 2003).

Des souches d’Enterococcus ont été isolées de l’eau (Oliveira et Pinhata, 2008), de

plantes (Svec et al., 2011), d’animaux (Jung et al., 2007), d’aliments (Gomes et al., 2008)

et du sol probablement comme résultat de la dissémination de sources fécales et de leur

tolérance naturelle aux conditions environnementales (Giraffa, 2002). Leur statut est

considéré généralement comme ambigu quant à la procédure d’évaluation de sa sécurité

(Ogier et Serror, 2008). D’une part les entérocoques sont considérés utiles en

technologies fromagères avec quelques souches utilisées comme culture starter (Giraffa,

2003). D’autre part ils sont considérés comme des pathogènes humains émergeants

(Moellering, 1992).

La majorité des entérocoques sont positifs au test de Voges-Proskauer qui relie la

production d'acétoine à la fermentation du ribose. Ce test est largement utilisé dans la

discrimination entre Enterococcus et Streptococcus. Les entérocoques sont des micro-

organismes mésophiles qui se développent dans une gamme de températures allant de 10 à

45°C, avec une température optimale de 35°C (Higashide et al., 2005). Ces bactéries sont

homofermentaires. Elles produisent essentiellement de l'acide lactique et en quantité

moindre, de l'acétate, du formiate et de l'éthanol ; en anaérobiose, le lactate est le principal


14

produit du métabolisme du glucose, tandis qu'en condition d'aérobiose, les produits du

métabolisme sont l'acétate et le CO2 (Schleifer et al., 1984 ; LeBlanc, 2006).

Les entérocoques tolèrent les pH extrêmes, les radiations ionisantes, le stress osmotique et

oxydatif, de fortes concentrations de métaux lourds et d’antibiotiques (Ramsey et al.,

2014).

La diversité phénotypique des entérocoques rend leur identification par des tests

physiologiques difficile (Devriese et al., 1993; Park et al., 1999). Sur la base de caractères

phénotypiques, les entérocoques étaient classés par Lancefield dans le groupe des

streptocoques D. En 1984 la classification de ces bactéries a connu des modifications

significatives grâce aux hybridations ADN-ADN et ADN-ARN. Les résultats des

hybridations démontrèrent que les entérocoques sont éloignés des streptocoques. La

plupart des membres du groupe D des Streptococci, y compris Streptococcus faecalis et

Streptococcus faecium ont été inclus dans le nouveau genre Enterococcus (Schleifer et

Kilpper-Balz, 1984).

Le genre Enterococcus appartient à la famille des Enterococcaceae avec le genre

Atopobacter, Catellicoccus, Melissococcus, Pilibacter, Tetragenococcus et Vagococcus

(Devriese et al., 2006, Euzéby, 2010). Les deux espèces les plus fréquemment isolées de

produits laitiers sont E. faecalis et E. faecium (Franz et al., 1999; Gelsomino et al., 2001).

E. durans est rencontré à moindre étendue dans le lait et produits fromagers alors que E.

hirae et E. casseliflavus sont aussi occasionnellement rencontrés (Franz et al., 1999). Il a

été démontré qu’E. durans est aussi fréquemment isolé de produits laitiers (Andrighetto et

al., 2001).

Les entérocoques sont phylogénétiquement plus étroitement apparentés aux genres

Vagococcus, Tetragenococcus et Carnobacterium que les espèces du genre Streptococcus.

Au cours des dix dernières années, le genre a été élargi et 54 espèces d'entérocoques sont

actuellement reconnues (Euzeby, 1997; dernière mise à jour totale 7 Novembre 2014).


15

Sur la base de l'analyse de la séquence du gène d'ARNr 16S, plusieurs groupes

phylogénétiques ont été distingués (Tableau 2) (Enterococcus faecium, Enterococcus

faecalis, Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus dispar,

Enterococcus saccharolyticus et Enterococcus caecorum) (Williams et al., 1991 ; Klein,

2003).

Tableau 2: Enterococcus et leur répartition en groupes d'espèces (Franz et al., 2006)

Groupe d'espèces basé sur

la similarité du gène de

l'ARNr 16S

Espèces

Groupe E. avium E. avium, E. devriesei, E. gilvus, E. malodoratus, E. pseudoavium.

E. raffinosus

Groupe E. caecorum E. caecorum, E columbae

Groupe E. dispar E. dispar, E. asini, E. canintestini, E. hermanniensis, E. pallens

Groupe E. faecalis E. faecalis, E. caccae, E. haemoperoxidus, E. moraviensis,

E. silesiacus, E. termitis, E. ureasiticus, E. quebecensis

Groupe E. faecium

E. faecium, E. canis, E. durans, E. hirae, E. mundtii,

E. phoeniculicola, E. ratti, E. villorum, E. thailandicus

Groupe E. gallinarum E. gallinarum, E. casseliflavus

Groupe E. saccharolyticus

E. saccharolyticus, E. acquimarinus, E. camelliae,

E. italicus, E. sulfurous

1-2-5 Propriétés métaboliques d’intérêt technologique des entérocoques

Les bactéries lactiques sont impliquées dans la production d'une multitude d'aliments

fermentés (Lasagno et al., 2002), y compris les entérocoques qui grâce à la versatilité de

leur métabolisme et à leur résistance intrinsèque aux conditions hostiles ont la capacité de

coloniser une variété de niches. Ils possèdent de nombreux caractères technologiques et

contribuent aux propriétés organoleptiques de produits fermentés (Ramakrishnan, 2012).

Leur importance, soit comme starters ou culture additive en industrie, est très importante,

ils peuvent produire plusieurs enzymes impliquées dans les transformations biochimiques

tels que l’acidification, l’activité protéolytique/peptidolytique, l’activité

lipolytique/estérolytique, le métabolisme du citrate/pyruvate et la production de

bactériocines (Giraffa, 2003). Les entérocoques produisent une variété de produits tels que

les produits aromatiques (Centeno et al., 1999), des enzymes (Sarantinopoulous et al.,

2001; Ghrairi et al., 2008) et des bactériocines (Cleveland et al., 2001).


16

Ils contribuent à la texture, la flaveur, l’arôme et la sécurité de différents aliments tels que

le fromage (Handmade) (Andrighetto et al., 2001), les saucisses (Sabia et al., 2002;

Tanasupawat et al., 2008) et d’autres produits fermentés (Gardini et al., 2001; Gomes et

al., 2008).

Dans la région méditerranéenne, les souches d’Enterococcus spp. a joué un rôle important

dans la préparation de divers produits laitiers et carnés fermentés pendant des siècles, et ils

sont essentiels pour la maturation des produits fromagers et au développement de leur

arôme (Foulquié-Moreno et al., 2006; Franz et al., 2011) en raison de la protéolyse, la

lipolyse, et la production de diacétyle (Giraffa, 2003). L’utilisation d’entérocoques dans

les fromages est très controversée. Elle est considérée comme essentielle pour la flaveur

des fromages dans la plupart des pays du sud de l’Europe, alors que les pays du nord de

l’Europe ne considèrent que les aspects négatifs (Ogier et Serror, 2008). Ces bactéries

contribuent à la maturation et au développement d’arôme des fromages tels que Cheddar,

Feta, Water-buffalo, Mozarella, Cebreiro, Venaco et Hispanico par leurs activités

protéolytique et estérolytique, leur production de diacétyl et le métabolisme du citrate

(Centeno et al., 1999). Des études rapportèrent l’influence positive de souches

d’Enterococccus d’aliments dérivés de lait sur la maturation de fromage traditionnel

(Franz et al., 1999; Giraffa, 2003; Foulquié-Moreno et al., 2006).

1-2-5-1 Production d’acide

La production d’acide est une propriété métabolique très appréciée chez les bactéries

lactiques. Elle est la conséquence de la transformation des hydrates de carbone en acide

lactique au cours de la croissance bactérienne (Monnet et al., 2008). Généralement les

entérocoques présentent une faible capacité d’acidification au moins dans le lait

(Sarantinopoulos et al., 2001 ; Giraffa, 2003). Une bonne culture starter productrice

d’acide peut réduire le pH du lait de sa valeur normale d'environ 6,6 à 5,3 en 6 heures

d’incubation en utilisant un inoculum de 10%, généralement les entérocoques présentent

une faible capacité d’acidification du lait. Schirru et al., (2012) ont montré que l’activité

acidifiante de E. faecium isolé à partir de lait de chèvre (de Sardaigne, Italie) est

généralement faible. Récemment Subramanian et al. (2015) rapportèrent que E. faecalis

CBRD01 possède un potentiel élevé pour la production d’acide lactique L(+) à partir de

glucose avec des rendements élevés, des titres et de la productivité avec un minimum de

formation de sous-produits même à l’échelle de bioréacteur.


17

Santos et al. (2015) ont observé que E. faecium EM485 et EM925 se développent dans le

lait et sont capables de changer le pH du lait après 6, 24 et 48 heures d’incubation sans

diminution de la charge bactérienne quand E. faecium EM485 et E. faecium EM925 sont

maintenues dans le lait acidifié à pH 4 ou à pH 5 à 5°C pendant 30 jours. Ces

caractéristiques technologiques sont intéressantes pour une utilisation postérieure dans les

produits tels que le yaourt et le lait acidifié.

1-2-5-2 Activité protéolytique

L’activité protéolytique et peptidolytique est importante pour le développement des

bactéries lactiques dans le lait et pour la maturation du fromage. Cependant la majorité des

souches d'entérocoques présentent une faible activité protéolytique extracellulaire

(Giraffa, 2003), conformément à plusieurs études effectuées par Arizcun et al. (1997),

Tsakalidou et al. (1993), Andrighetto et al. (2001) et Sarantinopoulos et al. (2001). Les

souches les plus actives appartiennent généralement à l'espèce E. faecalis, notamment

d'origine alimentaire (Sarantinopoulos et al., 2001), et à moindre degré des souches d’E.

durans. Une plus faible activité protéolytique est observée chez les souches d’E. faecium

(Sarantinopoulos et al., 2001 ; Giraffa, 2003). Une étude de Schirru et al. (2012) a

montré une faible activité protéolytique dans 2 des 4 souches testées d’E. faecium isolées à

partir de lait de chèvre (de Sardaigne, Italie).

1-2-5-3 Activité lipolytique et estérasique

Les lipides ont un effet majeur sur la saveur et la texture du fromage. Les premiers travaux

concernant les activités lipolytiques et estérolytiques d'entérocoques ont été réalisés par

Lund (1965), qui a déterminé par électrophorèse la présence d'estérases dans les extraits de

surnageant de culture de E. faecalis, E. faecium et E. durans. Sur la base de l'intensité des

bandes estérolytiques, les souches d’E. faecalis ont montré une activité estérolytiques

élevée. Sarantinopoulos et al. (2001) ont montré que toutes les souches d’E. faecalis, E.

faecium et E. durans sont actives indépendamment de l'origine. E. faecium comme étant

l’espèce la plus estérolytique de tous les entérocoques avec une plus large spécificité de

substrat.


18

1-2-5-4 Métabolisme du citrate et pyruvate

Outre la saveur produite par le biais de la conversion des acides aminés et de la lipolyse

bactérienne, le métabolisme du citrate du lait contribue aux propriétés sensorielles de

produits laitiers fermentés (Hugenholtz, 1993). Le citrate est présent dans de nombreuses

matières premières qui sont utilisées dans les fermentations alimentaires tels que les fruits,

les légumes et le lait, et il est également utilisé comme additif pour la fabrication de

saucisses fermentées (Foulquié Moreno et al., 2006).

La glycolyse et le métabolisme du citrate d’E. faecium, E. faecalis et E. durans conduisent

à la formation de l'acétate, l'acétaldéhyde, le diacétyle, l'acétoïne, le 2,3-butanediol et le

pyruvate (Figure 2) et sont donc importants dans la formation de la saveur pendant la

fermentation du lait et de l'affinage des produits laitiers fermentés (Sarantinopoulos et al.,

2001; Rea et Cogan, 2003).

Figure 2 : Voie schématique montrant la relation métabolique entre citrate et glucose

(Cabral et al., 2007) 1 : citrate lyase ; 2 : Oxaloacétate décarboxylase ; 3 : lactate

déhydrogénase ; 4 : α-acétolactate synthase ; 5 : α-acétolactate décarboxylase ; 6 : diacétyl

et/ou acetoine réductase ; 7 : complexe pyruvate déhydrogénase ; 8 : pyruvate formate

lyase ; 9 : acétate kinase ; 10 : alcool déhydrogénase.


19

L’acétate et le diacétyle produits par des souches starters ont un effet marquant sur la

qualité du beurre, le babeurre, et certains fromages tels que le cheddar et emmental; en

particulier, le diacétyle qui contribue principalement à la saveur des produits laitiers

fermentés (Marshall, 1987; Yvon et Rijnen, 2001 ; Tunick, 2007).

Le métabolisme du citrate et la lipolyse par les entérocoques sont supposés être

responsables du développement de l'arôme et de la saveur dans les fromages

méditerranéens (Tsakalidou, 1993 ;Centeno et al., 1996 ; Gardiner et al ; 1999 ;

Giraffa, 2003 ).

En l'absence de glucose E. faecium FAIR-E 198, un isolat de fromage grecque Feta, était

capable de métaboliser le citrate dans une gamme de pH constant (5,0 à 7,0). A pH 8,0, le

citrate n’a pas été métabolisé, bien que la croissance a eu lieu. Les principaux produits

finaux du métabolisme du citrate sont l'acétate, le formate, l'acétoïne et le dioxyde de

carbone, tandis que l'éthanol et le diacétyle étaient présents en petites quantités. En

présence de glucose, le citrate a été co-metabolisé, mais il n’a pas contribué à la croissance.

En outre, plus d'acétate et moins d’acétoïne ont été produits par rapport à la croissance

dans un milieu MRS et en l'absence de glucose. La majeure partie du citrate a été

consommé pendant la phase stationnaire, ce qui indique que l'énergie produite par le

métabolisme du citrate a été utilisé pour l'entretien (Vaningelgem et al., 2006).

1-2-6 Application des entérocoques comme probiotiques

La plupart des cultures probiotiques sont d'origine intestinale et appartiennent aux genres

Lactobacillus et Bifidobacterium, tandis que des espèces d’Enterococcus ne sont

qu’occasionnellement utilisés comme probiotiques (Temmerman et al., 2003). Les

caractéristiques associées aux probiotiques comprennent le maintien de l'équilibre du

microbiote intestinal (Arvola et al., 1999), le contrôle de la diarrhée (Arvola et al., 1999),

la stimulation du système immunitaire (Isolauri et al., 2004), ce qui réduit

l'hypersensibilité aux allergènes et l'eczéma chez les enfants (Kalliomäki et al., 2001), la

prévention des inflammations intestinales (Isolauri et al., 2000; Kalliomäki et al., 2001),

et la modulation des effets indésirables du lactose chez les individus ayant une intolérance

au lactose (Griffin et al., 2002).


20

La résistance au suc gastrique et aux sels biliaires et la production de composés

antimicrobiens tels que les entérocines (Franz et al., 1999; Saarela et al., 2000) font des

entérocoques de bon candidats probiotiques. Beaucoup de ces souches ont fait l’objet

d’étude et sont commercialisées comme probiotiques (Franz et al., 1999).

Par exemple un lait fermenté Gaio contenant un probiotique E. faecium est commercialisé

au Danemark (Tamime, 2002). La souche E. faecium SF68 a été utilisée pour traiter la

diarrhée comme alternative aux traitement par des antibiotiques (Bellomo et al., 1980).

Une autre application comme probiotique des entérocoques est la culture Causido qui

consiste en une souche de Streptococcus thermophilus et une souche d’E. faecium (Franz

et al., 2003).

Des souches de E. faecium et E. faecalis ont été appliquées chez l'homme, des suppléments

de probiotiques, E. faecalis ont été largement utilisés comme compléments alimentaires à

usage vétérinaire (Foulquié Moreno et al., 2006). Les souches probiotiques

d’Enterococcus sont utilisées comme supplément dans les aliments et l’alimentation des

volailles pour remplacer l’utilisation d’antibiotiques (Araujo et de Luces Rortes

Ferreira, 2013). L’utilisation de souches probiotiques E faecium (Cylacin ME 20 Plus R

50g/ T) dans l’alimentation de poulet est efficace pour contrôler et réduire le nombre de

Salmonella minnesota. Il a été démontré que ces probiotiques sont une alternative pour

remplacer l’utilisation d’antibiotiques pour contrôler les pathogènes (Kuritza et al., 2011).

1-3 Activité antimicrobienne

L'effet conservateur exercé par les bactéries lactiques est principalement du à la production

d'acides organiques (tels que l'acide lactique) qui aboutissent à des valeurs de pH

abaissées. Les bactéries lactiques produisent également des composés antimicrobiens, y

compris le peroxyde d'hydrogène, le CO2, le diacétyle, l'acétaldéhyde, des isomères D

d'acides aminés, les bactériocines et la reutérine (Cintas et al., 2001).

1-3-1 Acides organiques

Les métabolites antimicrobiens les plus importants et les mieux caractérisés produits par

les bactéries lactiques sont l'acide lactique et l’acide acétique. La conversion des sucres en


21

acides organiques et la réduction du pH sont les actions de conservation primaires que les

bactéries lactiques fournissent aux aliments fermentés. La quantité et le type des acides

produits durant la fermentation influencent l'activité microbienne. Par exemple, l'acide

acétique est plus antagoniste contre les levures par rapport à l'acide lactique (Suskovic et

al., 2010).

L'effet inhibiteur des acides organiques est principalement causé par la forme de la

molécule non dissociée, qui diffuse à travers la membrane cellulaire vers le cytosol plus

alcalin et interfère avec les fonctions métaboliques essentielles. Les effets toxiques de

l'acide lactique et de l'acide acétique comprennent la réduction du pH intracellulaire et la

dissipation du potentiel de membrane (Lorca et de Valdez, 2009). Dalie-Doguiet et al.

(2010) ont émis l'hypothèse que les acides organiques agissent sur la membrane

cytoplasmique en neutralisant son potentiel électrochimique et en augmentant sa

perméabilité, conduisant ainsi à l’effet bactériostatique et une éventuelle mort de bactéries

sensibles.

1-3-2 Peroxyde d’hydrogène

Dans le lait cru, le peroxyde d'hydrogène produit par des bactéries lactiques peut, après

avoir été catalysée par la lactoperoxydase, oxyder le thiocyanate endogène. Les produits

intermédiaires oxydés sont toxiques pour les différentes bactéries (Daechel, 1989). La

production de peroxyde d'hydrogène a été considérée comme le principal métabolite de

bactéries lactiques qui pourrait protéger contre les infections urogénitales, en particulier

dans le cas de vaginose bactérienne (Reid, 2008).

Moy et al. (2004) ont montré que E. faecium est capable d’éliminer Caenorhabditis

elegans par une toxine diffusible produite après croissance des bactéries dans des

conditions d’anaérobies. La mort du nématode est due au peroxyde d’hydrogène d’E.

faecium libéré en quantités importantes.

L'activité antimicrobienne du peroxyde d'hydrogène est attribuée à son fort effet oxydant

sur la cellule bactérienne et à la destruction des structures moléculaires cellulaire de base

(Lindgren et Dobrogosz, 1990). Son effet inhibiteur consiste en l’oxydation des lipides

membranaires ayant pour conséquence l’augmentation de la perméabilité membranaire. Il


22

est aussi responsable de l’oxydation des groupes sulfhydrile et donc de la dénaturation de

de plusieurs enzymes (Lindgren et Dobrogosz, 1990).

1-3-3 Diacétyle, acétaldéhyde et acétoïne

Les bactéries lactiques hétérofermentaires produisent de l'acétaldéhyde actif par

décarboxylation du pyruvate. Ce produit se condense avec le pyruvate, formant l’α

acétolactate puis il est converti par l’α acétolactate-synthases en diacétyle. Le produit de

décarboxylation de l’α-acétolactate et la réduction de diacétyle est l’acétoïne (Jyoti et al.,

2003 ; Collins et al., 2009 ).

L'utilisation de diacétyle comme conservateur alimentaire est limitée puisqu’elle nécessite

d’importantes concentrations pour assurer la conservation des aliments. Cependant il peut

inhiber la croissance des bactéries à Gram négatif en affectant l’utilisation de l’arginine

(Jay, 1986). Les bactéries à Gram négatif, les levures et les moisissures sont plus sensibles

au diacétyle que les bactéries à Gram positif (Jay, 1986 ; Motlagh et al., 1991 ; De Vuyst

et Vandamme, 1994).

De même, un acétaldéhyde est habituellement présent dans les produits laitiers fermentés à

des concentrations plus faibles que nécessaire pour l'inhibition des micro-organismes

indésirables et joue donc également un rôle dans le contrôle de la croissance de

contaminants, ainsi que d'autres métabolites antimicrobiens de bactéries lactiques

(Vanderbergh, 1993). L’acétaldéhyde inhibe la croissance de Staphylococcus aureus, de

Salmonella typhimurium et E. coli dans les produits laitiers (Piard et Desmazeaud, 1991).

1-3-4 Dioxyde de carbone

L'influence du dioxyde de carbone sur la conservation des produits est double. A

l'exception de sa propre activité antimicrobienne, elle crée un environnement anaérobie en

remplaçant l'oxygène moléculaire existant. L'activité antifongique du CO2 est due à

l'inhibition de décarboxylations enzymatiques et à son accumulation dans la bicouche

lipidique de la membrane entraînant un dysfonctionnement de la perméabilité (Lindgren

et Dobrogosz, 1990). La croissance de nombreux micro-organismes responsables de la

détérioration des aliments peut être inhibée efficacement par le dioxyde de carbone : c’est


23

le cas de bactéries à Gram négatif psychrotrophes ou encore des espèces de Pseudomonas

contaminants des laits crus (Farber, 1991 ; Hotchkiss, 1999).

1-4 Bactériocines et Entérocines

La sécrétion de peptides antimicrobiens (bactériocines) connus pour leur effet inhibiteur

dirigé contre des virus enveloppés, bactéries, champignons, parasites ainsi que des cellules

cancéreuses a été observée chez quelques bactéries, champignons, plantes, insectes et des

vertébrés (Pálffy et al., 2009). Chez de nombreuses espèces de bactéries à Gram négatif ou

positif, des bactériocines ont été caractérisées mais les plus étudiées sont celles des

bactéries lactiques (Klaenhammer, 1993). Ces bactériocines sont d'un intérêt particulier

pour l'industrie alimentaire (Nettles et Barefoot, 1993), étant donné qu’elles sont produites

par des bactéries lactiques ayant le statut GRAS.

Rodriguez et al. (2000) ont montré que les bactéries lactiques issues de laits crus de

brebis, de chèvres ou de vaches produisent de nombreuses et diverses bactériocines. En

effet les bactériocines des bactéries lactiques offrent des potentielles pour des applications

biotechnologiques puisqu’elles sont (i) exempt d'effets indésirables, (ii) stables à faibles

valeurs de pH, (iii) faciles à produire et (iv) sensibles aux protéases (Todorov, 2009). Elles

peuvent être distinguées des antibiotiques par leur synthèse dans les ribosomes plutôt que

des métabolites secondaires (Hurst, 1981).

Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens synthétisés par voie ribosomale

présentant un antagonisme principalement contre des espèces apparentées de bactéries à

Gram positif (Jack et al., 1995). Elles sont produites dans le cadre de leur mécanisme de

défense et sont dans la plupart du temps thermostables (Klaenhammer, 1988 ;

Klaenhammer, 1993 ; Cotter et al., 2005).

A cette définition des bactériocines s’ajoutent d’autres caractéristiques telles que leurs

sensibilités aux protéases dans le tube digestif humain (Cheng et al., 2003) et la présence

de plusieurs résidus de lysine et d'arginine et des molécules amphipathiques qui sont

composées de 10 à 45 acides aminés (Van Belkum et al., 2000) conférant aux peptides le

caractère cationique.


24

En plus de leurs propriétés technologiques et antagonistes citées ci-dessus, beaucoup de

souches d’entérocoques, principalement E faecalis et E faecium, peuvent produire une

variété de bactériocines actives contre Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus,

Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, et Vibrio cholerae (Ogier et Serror,

2008).

Depuis la découverte de bactériocines chez les entérocoques par Kjem (1955), un grand

nombre de bactériocines produites par des entérocoques ont été décrites et ont été

complètement caractérisées au niveau biochimique et génétique (Franz et al., 2007).

Les bactériocines produites par les entérocoques et appelées entérocines, peuvent être

appliquées comme conservateurs dans les produits laitiers ou la viande de fermentation

(Franz et al., 2007). Les entérocines sont de petits peptides ou protéines antibactériens

extracellulaires de synthèse ribosomale, qui présentent un spectre d’inhibition limité à des

bactéries à Gram positif (en particulier des souches étroitement apparentées), des agents

pathogènes d'origine alimentaire, et des bactéries d'altération (Leroy et al., 2003).

Des souches bactériocinogènes d’Enterococcus faecium ont été isolées à partir d'une

variété d'aliments comme le saumon fumé (Tomé et al., 2009), la viande et les produits

carnés (Callewaert et al., 2000 ; Strompfová et Laukova, 2007), les olives (Franz et al,

1996), du fromage et du lait (Ennahar et al., 2001;. Sarantinopoulos et al., 2002; Leroy

et de Vuyst, 2002; Cocolin et al, 2007), du nuka (pâte de son de riz japonais) (Losteinkit

et al., 2001) et du chungkuk-jang (produit de soja fermenté) (Yoon et al., 2008).

1-4-1 Classification

Les bactériocines diffèrent entre elles par leur structure primaire, leur structure

tridimensionnelle, leur mode d’export et leur mécanisme d’action. Cette forte divergence a

rendu leur classification assez difficile et plusieurs classifications ont été successivement

proposées (Makhloufi, 2011). Plusieurs classes ont été proposées pour les bactériocines,

mais la majorité sont classées dans les catégories I et II (Klaenhammer, 1993 ; Nes et al.,

1996 ; Cotter et al., 2005).


25

La figure 3 résume la classification proposée par Cotter et al. (2005).

Figure 3: Classification universelle de bactériocines construite sur la base de (a)

système de classification originale pour les bactériocines de bactéries lactiques par

Klaenhammer (1993), et incorporant des éléments (b) de la classification révisée de

Cotter et al (2005)

Les bactériocines de bactéries lactiques ont été classées par Klaenhammer (1993) en 4

classes sur la base des caractéristiques communes, notamment structurelles. La plupart des

bactériocines isolées jusqu'à présent appartiennent aux classes I ou II (Batdorj et al.,

2006).

➢ Bactériocines de classe I : nommées lantibiotiques, sont de petits peptides (<5

kDa), qui contiennent des résidus d'acides aminés de modifications post-

traductionnelles comme la lanthionine. Ces substances contiennent des acides

aminés tels que la lanthionine et la β-méthyle lanthionine, et de nombreux acides

aminés déshydratés (Sahl et Bierbaum, 1998). Les Nisines sont les lantibiotiques

III. Grosses protéines thermolabiles

I. lantibiotiques (pas de sous typage)

II. pepetides non modifiés IIa Pediocine –like IIb Deux composant IIc Thiol activé

I. lantibiotiques (jusqu’à 11 sous classes)

II. pepetides non modifiés IIa Pediocine –like IIb Deux composant IIc peptides cycliques IId Miscellaneous

Elimination de classes IIc, III et IV et restructuration de la classe II

IV. complexe (+ lipide ou carbohydrate)

I. lantibiotiques Ia lineaire Ib globulaire Ic multi-composant

II. pepetides non modifiés IIa Pediocine –like IIb Miscellaneous IIc Ic multi-composant

III. Grosses IIIa Bactériolytique IIIb Non lytique

IV. peptides cycliques

Classe IV devient peptides cycliques

Mise à niveau des peptides cycliques

Officialiser les subdivisions des lantibiotiques et réorganiser la classe II

A. Schéma Original de Klaenhammer B. Schéma de Cotter et al


26

les plus connus et étudiés (Sahl et Bierbaum 1998). Les entérocines de classe I

sont cationiques, hydrophobes et stables à la chaleur dont l’exemple de la

cytolysine à deux composants (bactériocine / hémolysine) produite par E. faecalis

(Booth et al., 1996). Sur la base des caractéristiques structurelles et le mode

d'action, les lantibiotiques ont été subdivisés en deux sous-groupes : A et B.

• Lantibiotiques de Type A inhibent les cellules sensibles par

dépolarisation de la membrane cytoplasmique (Van Belkum et al., 1989). Ces

bactériocines sont de taille plus grande que les lantibiotiques de type B et varie

entre 21 et 38 acides aminés. Elles sont les plus étudiées des bactériocines des

bactéries à Gram positif (Gross et Morell, 1971).

• Les lantibiotiques de type B sont de structure secondaire plus globulaire

et de taille ne dépassant pas les 19 acides aminés. Les lantibiotiques type B

fonctionnent par inhibition de l'enzyme. Un exemple est la mersacidine, qui

interfère avec la biosynthèse de la paroi cellulaire (Brotz et al., 1995). L'autre

lantibiotique bien étudié, la lacticine 3147, consiste en deux peptides qui affichent

une activité antimicrobienne synergique (Ryan et al., 1998 ; Wiedemann et al.,

2006).

➢ Bactériocines de classe II : ce sont de petits peptides, stables à la chaleur, ne

contenant pas de lanthionine (Nes et al., 1996). Elles sont cationiques,

hydrophobes, thermostables et ne subissent pas de modifications post-

traductionnelles, à l’exception du clivage du peptide leader à partir de la

pré-bactériocine. Ces bactériocines sont subdivisées en trois différentes

sous classes (Nes et al., 1996 ; Ennahar et al., 2000; Cleveland et al.,

2001).

• Classe IIa : ces bactériocines sont caractérisées par des peptides actifs contre

Listeria avec une séquence consensus (YGNGVXaaC) dans l’extrémité N-

terminale (Nes et al., 1996). Elle regroupe les bactériocines pédiocine-

like. Elle comprennent l’entérocine A (Aymerich et al., 1996),

l’entérocine P (Cintas et al., 1997) et l’entérocine CRL35 (Farı'as et al.,

1996) à partir de E. faecium, la bactériocine 31 (Tomita et al., 1996) à

partir de E. faecalis et mundticine à partir d’ E. mundtii (Bennik et al.,

1998).


27

• Classe IIb : petits peptides cationiques sans homologie de séquence spécifique.

Les bactériocines de cette sous classe sont composées de deux chaînes

polypeptidiques soit l’un des deux peptides est actif soit les deux mais les

deux peptides sont nécessaires pour une activité biologique complète

(Foulquié Moreno et al., 2003).

• Classe IIc a été proposé pour contenir les bactériocines sécrétées via la voie de

sécrétion Sec (Nes et al., 1996). Cette sous classe contient des

bactériocines qui ne peuvent pas être classées dans les autres sous classes

(Nes et al., 1996; Moll et al., 1999), par exemple l’ entérocine AS-48

(Gàlvez et al., 1989), l’entérocine 1071A et 1071B d’ E. faecalis (Balla

et al., 2000), l’entérocine B (Casaus et al., 1997), les entérocines L50A et

L50B (Cintas et al., 1998), et l’entérocine Q d’ E. faecium (Cintas et al.,

2000).

Selon la classification des bactériocines décrites par Diep et al. (2002) et Cotter et al.,

(2005), les bactériocines de classe II sont subdivisées en 6 sous classes. Classe IIa: sont des

inhibiteurs puissants des espèces de Listeria, montrant une activité à faibles concentrations

(nanomolaires). Ces bactériocines sont stables à la chaleur et non post-traductionnellement

modifiées au-delà du retrait protéolytique d'un peptide leader et la formation d'un pont

disulfure N-terminal conservé (bien que certains membres contiennent un pont

supplémentaire C-terminal disulfure). La région N-terminale contient une séquence

d'acides aminés YGNGV caractéristiques, bien que des variantes avec la séquence de

YGNGL alternative ont été classées dans la classe IIa. Les bactériocines de classe II b,

agissent en formant des pores dans les membranes de leurs cellules cibles et se composent

de deux protéines qui fonctionnent de façon complémentaire. Le sous-groupe IIc est

constitué de bactériocines qui sont secrétées via la voie de sécrétion Sec. Les bactériocines

de sous-groupe IId n’ont pas de peptide leader et les systèmes de transport utilisés sont

typiques de la bactériocine (spécifique). Le sous-groupe IIe comprend les bactériocines

cycliques et enfin le sous-groupe IIf constitué de bactériocines ne pouvant être classées

dans aucun des groupes ci-dessus.

➢ Bactériocines de classe III sont de grosses protéines sensibles à la chaleur

(Urbizu et al., 2013).


28

➢ Bactériocines de classe IV se caractérisent par l'incorporation de groupes tels

que des glucides ou des lipides dans la molécule active. On sait peu sur la structure

et la fonction de cette classe, quelques exemples comprennent la leuconocine S

(Bruno et Montville, 1993) et la lactocine 27 (Upreti et Hinsdill, 1975).

Les entérocines les plus caractérisées sont présentées dans le Tableau 3.

Tableau 3 : Classification des entérocines (Nes et al., 2007)

Bactéries Bactériocines Type Masse (Da) (acides

aminés)

E. faecalis Cytolysine Classe l à 2 peptides 3,458(38 ),2,032 (21)

E. faecium Entérocine A Classe lla Pediocin-like 4,829 (47)

E. faecium Entérocine P Classe lla Pediocin-like 4 , 829 (44)

E. faecium Bac 32 Classe lla Pediocin-like 7,998 (70)

E. faecium Bactériocine GM-1 Classe lla Pediocin-like 4,630 (44)

E. faecalis Bac 31 Classe lla Pediocin-like (43)

E. mundtii Mundticine ATO6, Mundticine

KS

Classe lla Pediocin-like 4,287 (43)

E. faecalis Entérocine SE-K4 Classe lla Pediocin-like 5,356.2

E. faecium Bactériocine T8 Classe lla Pediocin-like 5,090 (44)

E. faecium Entérocin B Classe lla 5,479 (53)

E. faecalis Entérocine 1071A, Entérocine

1071B

Classe llb à 2 peptides 4,285 (39, 3,897 (35))

E. faecalis MR10A MR10B Classe llc, sans peptide leader 5,202(44),5,208 (43)

E. faecium Entérocine L50 ;L50A, L50B Classe llc, sans peptide leader 5,190 (44), 5,178(43)

E. faecium Entérocine Q Classe llc, sans peptide leader 3,980(34)

E. faecalis Entérocine EJ97 Classe llc, sans peptide leader 5,328 (44)

E. faecium Entérocine RJ-11 Classe llc, sans peptide leader 5,049 (44)

E. faecalis AS-48 Classe lld bactériocine

circulaire

7,166 (70)


29

1-4-2 Biosynthèse

La synthèse des bactériocines est associée à la croissance: elle se déroule pendant toute la

phase de croissance et s’arrête à la fin de la phase exponentielle (Parente et al., 1997;

Lejeune et al., 1998). Le mécanisme de biosynthèse des bactériocines est relativement

simple, car les peptides antibactériens sont des métabolites primaires (codés par le gène et

synthétisés par le ribosome) alors que les antibiotiques classiques sont des métabolites

secondaires (Rodney et al., 2015).

Les bactériocines sont synthétisées sous forme de peptides précurseurs biologiquement

inactifs qui contiennent des peptides leader N-terminal fixés aux pro-peptides C-terminal.

Ces peptides inactifs (peptide leader) seront soumis à des processus enzymatiques pour

donner des bactériocines actives (matures) (Klaenhammer, 1993; Diep et Nes, 2002;

Riley et Wertz, 2002).

La plupart des bactériocines sont d'abord produites avec une extension N-terminale,

appelée peptide leader. Au cours de la maturation de ces bactériocines, le peptide leader est

clivé par une protéase spécifique (Oman et Donk, 2010). Le peptide leader (i) fonctionne

comme un site de reconnaissance pour les enzymes de biosynthèse impliquées dans le

processus de maturation et le transport vers le milieu extracellulaire, (ii) protège la souche

productrice de l'activité inhibitrice de la bactériocine en gardant la bactériocine dans un

état inactif, lorsque la bactériocine est à l'intérieur de la cellule productrice, et (iii) interagit

avec le domaine du pro-peptide du peptide précurseur afin d'assurer une conformation

appropriée essentielle pour l'interaction enzyme-substrat (précurseur de peptide et l'enzyme

biosynthétique (Klaenhammer, 1993; Van der Meer et al., 1994; Van Belkum et al.,

1997; Oman et Donk, 2009).

Parmi les modifications post-traductionnelles contrôlées par les peptides leader sont la

formation de ponts de lanthionine et méthyl lanthionine dans le lantibiotique (Patton et al.,

2008), et le cas échéant, la cyclisation du N- à C-terminale de bactériocines circulaires

(Van Belkum et al., 2011). Les bactériocines sans peptide leader se distinguent par

l'absence de cette extension N-terminale commune retrouvée dans les gènes de structure de

la plupart des peptides antimicrobiens des bactéries (Masuda et al., 2012). En

conséquence, les bactériocines sans peptide leader ne subissent pas d'autres modifications

post-traductionnelles, et l'exportation est probablement assurée par un transporteur ABC

dédié (Masuda et al., 2012).


30

La figure 4 résume les étapes de production des entérocines.

Figure 4 : Présentation schématique de la biosynthèse de l’entérocine A. ( Ennahar et

al., 2000; Martínez et al., 2000; Drider et al., 2006)

(1) protéines impliquées dans la synthèse de l’entérocine A (Enta); (2) la protéine

d'immunité (ENTI) protège la cellule de Ent A; (3) traitement, transport et la sécrétion de

Ent A et peptide inducteur (ENTF) par le transporteur ABC (EntT) et sa protéine

accessoire (ENTD); (4) la régulation de synthèse de EntA par un système de régulation à

trois composants: un facteur d'induction (ENTF), capteur de la protéine l'histidine kinase

(EntK) et la protéine régulatrice de réponse (ENTR). La présence de ENTF dans le milieu

extracellulaire résulte en la phosphorylation de EntK, qui transfère son groupe phosphate à

ENTR pour activer la transcription des opérons impliqués dans la synthèse de EntA.

Activation de la

transcription de

l’opéron

bactériocine

Peptide leader Bactériocine mature Pré-bactériocine Peptide inducteur mature Peptide pré-inducteur

(1)Biosynthèse

(2)Immunité


31

1-4-3 Génétique et régulation

Les gènes qui codent pour les bactériocines et l'immunité envers ces peptides

antimicrobiens sont généralement organisés en groupes d’opéron situés sur le chromosome

ou sur des plasmides (Chen et Hoover, 2003 ; Yin et al., 2003 ; Drider et al., 2006). Les

gènes responsables de la production de bactériocines sont fréquemment associées à des

éléments mobiles par exemple sur le chromosome en association avec des transposons ou

sur les plasmides (Deegan et al., 2006).

La localisation sur le chromosome des opérons de bactériocines de classe II est la plus

répandue. Les cas typiques sont ceux des entérocines A et B produites par E. faecium

(Franz et al., 1999 ; O’Keeffe et al., 1999).

La plupart des opérons de bactériocines sont situés sur des plasmides, ce qui permet de

suggérer que cet emplacement aide la diffusion phylogénétique des bactériocines intra et

inter-espèces chez les bactéries lactiques (Dimov et al., 2005). De nombreuses

bactériocines non lantibiotiques ont des gènes de structure situés sur des plasmides. C’est

le cas des deux composants entérocine P synthétisés par E. faecium (Cintas et al., 2000).

Les déterminants génétiques de la nisine produite par Lactococcus lactis sont situés sur le

transposon conjugatif Tn5276 au sein du chromosome bactérien (Van der Meer et al.,

1993).La localisation sur un élément génétique mobile, le transposon Tn5721, a également

été démontrée pour le lantibiotique lacticine 481 produit aussi par Lactococcus lactis mais

dans ce cas le transposon est situé sur un plasmide de 70 kb (Dufour et al., 2000). Dans les

deux derniers cas, les gènes des bactériocines sont flanquées par des séquences d'insertion

intactes (IS) ou de séquences répétées inverses (IR) (Dimov et al., 2005).

Généralement, les opérons des lantibiotiques sont plus complexes que ceux codant pour les

non-lantibiotiques parce qu'ils ont besoin d'autres gènes qui codent pour des enzymes

impliquées dans les modifications post-traductionnelles.


32

Au moins quatre gènes sont nécessaires pour la production de bactériocines de classe II

(Figure 5): le gène de structure de la pré-bactériocine, le gène d'immunité, les gènes

codant pour le système de sécrétion ABC et d'induction (Nes et al., 2002). Les

bactériocines de classe IIa qui ont été génétiquement caractérisées sont formés par un ou

quatre gènes dans un opéron. Par exemple, l’opéron de la pédiocine PA-1 contient quatre

gènes nécessaires pour la production et l'excrétion de la bactériocine. Dans certains cas, les

gènes sont répartis dans les différents opérons, où un opéron a les gènes de structure et de

l'immunité, un deuxième opéron contient le gène de la sécrétion de la bactériocine et un

troisième opéron contient les gènes nécessaires à la régulation de la production de

bactériocine (Franz et al., 2007).

Figure 5: Organisation des déterminants génétiques impliqués dans la synthèse des

bactériocines d’après Skaugen et al., (2003), Drider et al., (2006) et Franz et al.,

(2007).

La structure des bactériocines de classe IIa est plus complexe. Elles contiennent un peptide

leader à double glycine dont la sécrétion est assurée par un transporteur spécifique, ATP-

binding cassette (ABC). L’exemple de la pédiocine AcH dont les gènes sont situés sur le

plasmide et sont disposés dans un groupe de gènes (cluster) de 3500 pb partageant un

promoteur commun. Les quatre gènes, chacun avec des sites indépendants de liaison au

ribosome (rbs) et de terminaison de codons d'initiation et des séquences d'espacement entre

Nisine

Lactococine A

Entérocine A

Divergicine A

Lactosine S

Lactacine 3147


33

les deux, ont été désignés comme papA, papB, papC et papD (Motlagh et al., 1994).

papA est le gène de structure pour la pré-pédiocine, tandis que papB code pour la protéine

d'immunité.

papC et papD forment le mécanisme d'exportation, et sont nécessaires pour la translocation

de la membrane et l'élimination du peptide leader. papD partage un domaine double

glycine protéase avec d'autres protéines ABC à l'exportation actives dans le transport de

bactériocines (Dimov et al., 2005).

Certains opérons de bactériocines sont composés de deux gènes, c’est le cas des

bactériocines de classe IIc. L’exemple typique est l’opéron de la bactériocine 31 d’E.

faecalis qui est situé sur 57,5 kb du plasmide conjugatif (Tomita et al., 1996). Cet opéron

est composé de deux gènes : le gène de structure de la bactériocine suivi immédiatement en

aval du gène de la protéine d'immunité (Dimov et al., 2005).

L'expression des gènes de bactériocines est généralement soumise à une régulation par des

facteurs d’induction externes (IF), dans la plupart des cas, les petits peptides sécrétés par la

souche productrice elle-même ou par ses concurrents occupant les mêmes niches

écologiques (Dimov et al., 2005). La biosynthèse des bactériocines n’est pas constitutive et

se trouve régulée soit par la bactériocine elle-même qui joue le rôle de phéromone soit par

une phéromone spécifique (Diţu et al., 2009). Cependant, dans certains cas, la production

de bactériocines dépend des conditions environnementales (température, pH, etc.) ou peut

même être constitutive (Dimov et al., 2005). L’entérocine B (Franz et al., 1999) produite

par E. faecium est un exemple de production constitutive de bactériocines, par contre il a

été démontré que l'expression des entérocines L50A, L50B et Q produites par une autre

souche de E. faecium sont affectées par les changements de l’environnement tels que la

température, la force ionique, et les milieux (Cintas et al., 2000). Toutefois, les conditions

environnementales n’affectent souvent que la biosynthèse des bactériocines, tandis que la

régulation primaire est affectée par un facteur d’induction (IF) approprié (Dimov et al.,

2005).

Certaines bactériocines sont produites sur des milieux de cultures solides, mais pas en

milieux de cultures liquides (Qi et al., 2001). Il a aussi été démontré que les températures

de croissance ont une influence sur la production de bactériocines chez E. faecium. La

souche E. faecium L50 produit au moins trois bactériocines, et il a été démontré que


34

différentes bactériocines ont été produites à des températures différentes et ont des

températures différentes pour une production optimale (Cintas et al., 2000).

Le mécanisme de la biosynthèse des bactériocines par les bactéries est généralement réglé

par un système de quorum sensing, un mécanisme permettant à certains gènes d’être

exprimés en fonction de la densité de la population bactérienne (Todorov, 2009

Le système de régulation des bactériocines de classe IIa est formé de trois composants: le

peptide inducteur, ou phéromone, une protéine senseur histidine kinase transmembranaire

(PHK) et une protéine effectrice régulatrice (PR) (Kleerebezem et Quadri, 2001). La

phéromone produite à faible concentration sous forme de précurseur est clivée pour

acquérir sa forme active lors de son export via le transporteur ABC. Une fois dans le

milieu extracellulaire, elle se fixe sur la PHK de la bactérie cible qui, activée,

autophosphoryle un résidu histidine présent du côté cytosolique (Nes et Eijsink, 1999). La

PHK activée, interagit alors avec la PR en transférant le phosphate de son résidu histidine

sur un résidu aspartate. Une fois phosphorylée, la PR est activée et joue le rôle d’activateur

transcriptionnel en stimulant les gènes impliqués dans la production de la bactériocine (Nes

et al., 1996 ; Nes et Eijsink, 1999).

La production des bactériocines de classe IIb est soit constitutive soit inductible par une

phéromone. La régulation de la production des bactériocines de classe IIb répond au même

mode de régulation (quorum sensing) que celui utilisé par les lantibiotiques et les

bactériocines de classe IIa (Kleerebezem et Quadri, 2001). La production d’un grand

nombre de bactériocines de classe IIb est régulée au niveau transcriptionnel via un système

de régulation à trois composants comportant un peptide phéromone, une protéine histidine

kinase membranaire ainsi qu’une ou plusieurs protéines régulatrices (Quadri, 2001 ; Diep

et al., 2009).

1-4-4 Immunité

Chez les bactéries lactiques productrices de bactériocines, l’immunité est assurée par un

mécanisme spécifique qui leur confère une protection contre la toxicité de leur propre

bactériocine (Tagg et al., 1976 ; Klaenhammer, 1993 ; Jack et al., 1995). Selon Nes et al

(1996) ce mécanisme dépend d’une protéine d’immunité spécifique exprimée en même

temps que la bactériocine. D’autres auteurs (Abee, 1995 ; Jack et al., 1995, Allison et

Klaenhammer, 1996) suggérèrent que l’immunité peut être assurée par des protéases

intracellulaires qui dégradent la bactériocine.


35

Pour les bactériocines de classe I et de classe II deux systèmes distincts sont impliqués

dans l'immunité, bien qu'il existe quelques exceptions (Gajic et al., 2003). La protection

peut être assurée par une protéine d'immunité dédiée et / ou un système transporteur ABC

spécialisé impliquant deux ou trois sous-unités qui probablement pompent la bactériocine à

partir de la membrane de la bactérie productrice (Peschel, et Gotz, 1996 ; Otto et al.,

1998 ; Guder et al., 2002). Pour les bactériocines de classe I, l'immunité est assurée par

l’un ou les deux systèmes (Stein et al., 2005). Dans le cas des bactériocines de classe IIa,

IIb et Ild, l'immunité est assurée par la protéine d'immunité seule. Alors que l’immunité

des bactériocines de classe IIc repose sur un système transporteur ABC (Diaz et al., 2003).

Bien que les protéines d'immunité se ressemblent rarement, le mécanisme général par

lequel elles fonctionnent est probablement similaire, impliquant soit la séquestration de la

protéine de structure ou une compétition antagoniste pour un récepteur (Venema et al.,

1994 ; Hoffmann et al., 2004;). De tels mécanismes d'immunité sont très spécifiques et ne

fournissent généralement pas de protection contre les autres bactériocines (Stein et al.,

2005).

1-4-5 Mécanisme d’action

Les bactériocines agissent par la formation de pores au niveau des parois des micro-

organismes sensibles, dont la première étape consiste en une attraction électrostatique entre

la cible cellulaire et la bactériocine conduisant ensuite à d’autres étapes (Deegan et al.,

2006).

Les entérocines sont classées en classe I, IIa, IIc et III, tel que déterminé par

Klaenhammer (1993) et Nes et al (1996). Elles ont la membrane cytoplasmique comme

cible principale, comme la plupart des bactériocines, où elles forment des pores,

appauvrissant ainsi le potentiel transmembranaire et ou le gradient de pH, ce qui entraîne la

mort cellulaire (Cleveland et al., 2001).

Divers mécanismes ont été proposés pour décrire l'action bactéricide des bactériocines. La

formation de pores est le mécanisme le mieux décrit. Le spectre d’action relativement

faible de certaines bactériocines suggère la présence de récepteurs moléculaires dans la

membrane de la cellule cible, même si cela n'a pas été démontrée (Van Belkum et Stiles,

2000).


36

Quelques bactériocines membres de la classe I (lantibiotiques), tels que la nisine ont un

double mode d'action: elles peuvent se lier au lipide II, un récepteur universel et la

principale sous-unité du transporteur du peptidoglycane du cytoplasme vers la paroi

cellulaire, bloquant ainsi la synthèse appropriée de la paroi cellulaire et contribuant à la

mort cellulaire. En outre, la nisine se lie au lipide II par deux de ses anneaux amino

terminaux formant un complexe de huit bactériocines lantibiotiques et quatre lipide II (2

bactériocines: 1 lipide II) pour initier le processus d'insertion membranaire et de formation

de pores, ce qui conduit à une mort rapide de la cellule (Cotter et al., 2005, Breukink et

De Kruijff., 2006).

Figure 6: Mode d’action des bactériocines produites par des bactéries lactiques

(Martínez et al.,2000; Cotter et al., (2005); Breukink et De Kruijff., 2006).

D'une manière générale, les peptides de classe II ont une structure hélicoïdale amphiphile

qui leur permet d'être insérés dans la membrane de la cellule cible (Figure 6), ce qui

conduit à la dépolarisation et la mort (Cotter et al., 2005 ; Drider et al., 2006).

L'interaction initiale avec les têtes des phospholipides membranaires anioniques a lieu à

l'extrémité N-terminale hydrophile des peptides. L'extrémité C-terminale du peptide est


37

plus hydrophobe que l'extrémité N-terminale et l'on pense être impliqués dans des

interactions hydrophobes avec la membrane.

D’après Lohans et Vederas (2012), les bactériocines de classe IIa tuent les bactéries

sensibles en formant des pores dans leurs membranes. Dans un premier temps, les

bactériocines sont attirés par une interaction électrostatique et ensuite insérés dans la

membrane formant des pores. Ce mécanisme d'action dépend d'une protéine complexe

Mannose Phospho transférase (MPT) trouvée dans les membranes des micro-organismes

sensibles.

De grosses protéines ou bactériolytiques (bacteriolysines bactériocines de classe III) tels

que la lysostaphine peut agir directement sur la paroi cellulaire des cellules cibles Gram-

positives, ce qui conduit à la mort et la lyse cellulaire (Cotter et al., 2005).

1-4-6 Spectre d’activité

Certaines bactériocines ne tuent que les bactéries appartenant à la même espèce que la

bactérie productrice, tandis que d'autres bactériocines tuent un large éventail de bactéries à

Gram positif (Conventry et al., 1997; Ennahar et al., 2000; Mc Auliffe et al., 2001;.

Garneau et al., 2002). Elles sont aussi actives contre les espèces se trouvant dans la même

niche écologique que la bactérie productrice (Klaenhammer, 1993 ; Jack et al., 1995).

Sous des conditions normales les bactéries à Gram négatif sont insensibles à l’activité

inhibitrice des bactériocines des bactéries lactiques. Leur utilisation en tant qu'agents

antimicrobiens contre les bactéries à Gram négatif ont donné de bons résultats lorsqu'elles

sont combinées avec d'autres substances, tels que l'EDTA (Tu et Mustapha, 2002), ou des

acides organiques (Mustapha et al., 2002).

Le spectre antibactérien inclut fréquemment des organismes d’altération et des bactéries

pathogènes d'origine alimentaire telles que Listeria monocytogenes et Staphylococcus

aureus (De Vuyst et Leroy, 2007). Outre leur action antimicrobienne contre les bactéries

indésirables, les bactériocines sont censées contribuer à la compétitivité des cellules

productrices (Vogel et al., 1993). Une activité contre les bactéries à Gram négatif telles

que E. coli et Salmonella a été observée, mais uniquement lorsque l'intégrité de la

membrane externe a été compromise, par exemple après un choc osmotique ou un


38

traitement à faible pH, en présence d'un agent détergent ou chélatant, ou après traitement

avec un champ électrique pulsé ou sous haute pression (Stevens et al., 1991).

L’hétérogénéité dans les spectres antimicrobiens des bactériocines a permis de les classer

en trois groupes en fonction de leur activité (Cintas et al., 2001 ; Chen et al., 2003 ;

Cotter et al., 2005).

a) Bactériocines à spectre d'action réduit: comprend des bactériocines qui inhibent la

croissance des bactéries appartenant au même genre.

b) Bactériocines à spectre d'action intermédiaire: comprend des bactériocines qui inhibent

également d'autres genres de bactéries lactiques et d'autres bactéries à Gram positif, y

compris les agents pathogènes présents dans les aliments (L. monocytogenes, S. aureus, C.

botulinum).

c) Bactériocines à large spectre d'action: comprend des bactériocines qui agissent contre

ceux-ci et d'autres (Propionibacterium sp et Bacillus sp).

1-5 Facteurs influençant la production de bactériocines

La détermination des paramètres optimaux pour la production de bactériocines est l’une

des conditions préalables à leur utilisation dans l'industrie alimentaire. L'effet des facteurs

environnementaux sur la croissance et la production de bactériocines par différentes

bactéries lactiques a fait l’objet de nombreuses études (De Vuyst et al.,. 1996; Krier et

al.,. 1998; Leroy et De Vuyst, 1999 ; Aymerich et al.,. 2000). La production de

bactériocines est associée à la croissance. Le rendement de bactériocines par unité de

biomasse est affecté par les conditions de croissance telles que le pH, la température,

l'agitation et l'aération. La production de bactériocines est également dépendante de la

composition et de la concentration du milieu de culture (des sources d’hydrates de carbone

et d'azote et entre autres des cations et des anions) (Garcia-Almendárez et al., 2002;.. Li

et al., 2002;. Zannini et al., 2005 ).

D’après Nel et al. (2001), la production de bactériocine peut être stimulée dans des

conditions de croissance non optimales, tels que le pH et / ou la température ou des

conditions de croissance défavorables.

La détermination des conditions optimales de production de bactériocines pour chaque

organisme producteur est indispensable. Elle permet de réduire le coût de production des


39

bactériocines (Aguilar-Galvez et al., 2011). Ces auteurs ont montré que la cinétique de la

production de BLIS chez E. faecium CWBI-B1430 et E. mundtii CWBI-B1431 est associée

à la croissance. La production de BLIS suit la cinétique de métabolites primaires, comme

la plupart des bactériocines produites par les bactéries lactiques (Callewaert et De Vuyst,

2000; Van Belkum et Stiles 2000; Cabo et al., 2001;. Criado et al., 2006).

1-5-1 Souche bactérienne

Une bactériocine donnée peut être produite par plusieurs souches ou espèces (Bhunia et

al., 1994; Jack et al., 1995; Rodriguez et al.,1995). Yang et Ray(1994), ont montré que

la production de nisine et leuconocine Lcm1 varient parmi différentes souches, alors que la

pédiocine AcH montre moins de variation dans sa production. Dans le cas de la nisine, la

différence de production entre les souches a été attribuée aux taux d’expression et l'activité

des enzymes de maturation et dans une moindre mesure à l'immunité de la nisine (Parente

et Ricciardi, 1999).

1-5-2 Influence du pH

La fermentation par les bactéries lactiques implique la production des acides organiques

tels que l’acide lactique, l’acide acétique et l’acide formique ayant pour conséquence une

diminution du pH. La variation du pH du milieu de fermentation peut ralentir ou arrêter

complètement la croissance bactérienne. Ainsi le contrôle du pH améliore la croissance de

bactéries lactiques et permet aussi d’améliorer la production des bactériocines. Cette

dernière est influencée par le pH de la culture initiale (Cabo et al., 2001) et la chute du pH

(différence entre le pH initial et le pH final) généré dans les milieux de culture (Biswas et

al., 1991 ; Cabo et al., 2001 ; Guerra et Pastrana , 2003; Liu et al.., 2010), ainsi que les

valeurs de pH final atteintes dans les fermentations (Yang et Ray, 1994 ; Guerra et

Pastrana, 2002). Toutefois, ces effets dépendent du milieu de culture et la souche

produisant des bactériocines (Guerra et al., 2001, Guerra et Pastrana, 2002).

Le pH optimal de production de bactériocines est souvent de 5,5 à 6,0 (Chinachoti et al.,

1997). De nombreuse études ont montré que la production de bactériocines est optimale à

un pH contrôlé qui est inférieur à celui d’une croissance optimale (Krier et al., 1998;..

Leroy et Vuyst 1999).


40

Quelques bactériocines ne sont produites qu’à faible pH ( 5,0 ) (Biswas et al., .1991; Yang

et Ray, 1994; Barcena et al,.1998). Dans le cas de la pédiocine AcH, ceci a été attribué au

faible pH nécessaire à la transformation post-traductionnelle de la bactériocine. Cependant,

cet effet peut dépendre de la souche ou de l’espèce (Ennahar et al., 1996). La valeur de

pH du bouillon de culture peut influencer la disponibilité de bactériocines dans le

surnageant de culture (Yang et al., 1992). E. faecium P13 croit et produit l’entérocine P

dans un fermenteur sous conditions contrôlées à intervalle de pH 4,7 à 8,5. La croissance

est optimale à pH 7.0. L’activité antimicrobienne volumétrique maximale obtenue à pH 6,0

représente une augmentation de quatre fois par rapport à celle des cultures cultivées sans

régulation de pH (Herranz et al., 2001).

1-5-3 Influence de la température

La température est un paramètre important dans les fermentations car elle peut améliorer la

croissance bactérienne et raccourcir le temps de fermentation. La croissance à la

température optimale se traduit généralement par une production optimale de bactériocines

(Chinachoti et al., 1997 ; Lejeune et al., 1998) mais le stress provoqué par la température

peut entraîner une augmentation du rendement en bactériocines (Lejeune et al.,1998).

Par exemple Enterococcus faecium RZS a une meilleure production de bactériocines entre

25 et 35 °C qu’à 20°C (Leroy et DeVuyst., 1999) alors que Lactobacillus plantarum

ST194BZ a une meilleure production de bactériocines à 30 °C. La température de

croissance et la production de bactériocines sont corrélées. C’est le cas de la lactocine A

(Parente et al., 1994) et l’entérocine 1146 (Parente et Ricciardi, 1994).

1-5-4 Influence des milieux de culture

La production de bactériocine est également fortement dépendante de la composition et de

la concentration du milieu de culture (sources hydrates de carbone et d'azote, des cations et

des anions) (Garcia-Almendárez et al, 2002;.Li et al, 2002;. Zannini et al., 2005).

Puisque les bactéries lactiques sont des microorganismes exigeants sur le plan nutritionnel,

la croissance et la production de bactériocine sont souvent limitées par des sources d'azote

organiques. Kim et al (1997) ont constaté que la concentration maximale de nisine

augmente avec la teneur en azote organique.


41

En général, les milieux de culture complexes avec de sources d'azote riches sont optimaux

pour l'augmentation de la production d'un grand nombre de bactériocines (Muñoz-

Rojas2008). Les sources d'azote complexes (par exemple tryptones, peptones, l'extrait de

levure et extrait de viande) ont été reconnues comme de bonnes sources pour la production

de différentes bactériocines (Parente et Hill 1992). Cependant, des sources faibles d'azote

métabolisables (farine de graines de coton, farine de sang et farine de poisson) se sont

révélées être de bonnes sources d'azote pour la production de nisine (Ruben et al., 2014).

Le type de source d'azote affecte également la production de bactériocine. De Vuyst et

Vandamme (1993) ont comparé l'effet des sources d'azote organique sur la production de

nisine dans un milieu complexe: les meilleurs résultats (2500 IU/ml), ont été obtenus avec

de la farine de graines de coton, mais les rendements élevés de nisine (> 2000 UI/ml) ont

été obtenus avec l'extrait de levure et farine de poissons (Parente et Ricciardi , 1999).

Le lait bovin est un milieu naturellement complexe avec une teneur nutritive élevée,

fournissant un excellent substrat pour la croissance de L. lactis et la libération de nisine

dans le milieu extracellulaire (de Arauz et al., 2012).

Nascimento et al.. (2010) ont évalué la production de bactériocines par E. faecium FAIR-E

198 dans le bouillon MRS et dans le lait. Sarantinopoulos et al.. (2002) ont également

évalué la production de bactériocines chez cette même souche et trouvèrent un résultat

similaire en utilisant du lait additionné de l'hydrolysat de caséine (1,4%).

Selon Moreno et al.. (2002) les entérocoques ont montré une activité protéolytique faible

et par conséquent, le métabolisme plus lent. Ce fait est peut -être la raison pour laquelle la

production de bactériocines dans le lait est plus faible que dans le bouillon. Cette faible

production peut être aussi expliquée par une faible activité des entérocines dans le lait qui

se trouvent en interactions avec les composants du lait, tels que les graisses et la caséine

(Nascimento et al.., 2010)

Bien que le glucose soit la meilleure source de carbone pour la production de bactériocines

par les lactocoques, les lactobacilles et les pédiocoques, d'autres sucres (saccharose,

lactose, xylose) ont été reconnus comme étant une bonne source de carbone (Ruben et al.,

2014).

Les bactériocines peuvent être produites à partir des milieux contenant différentes sources

de glucides. La nisine Z peut être produite à partir du glucose, du saccharose et du xylose


42

par Lc.lactis IO-1 (Matsusaki et al., 1996; Chinachoti et al., 1997), mais de meilleurs

résultats ont été obtenus avec le glucose (4000 UI/ml/1) par rapport au xylose (3000

UI/ml/1).

Le glucose (suivi par le saccharose, le xylose et le galactose) est la meilleure source de

carbone pour la production de pédiocine AcH dans un milieu non tamponné (Biswas et al.,

1991). Le saccharose peut être une source de carbone, meilleur que le glucose, pour la

production de l’entérocine 1146; le fructose ou le lactose donnèrent des niveaux de

biomasse comparables, mais de faibles niveaux de bactériocine (Parente et Ricciardi,

1994).

La répression catabolique a été utilisée pour expliquer la production de plantaricine C à des

taux de dilution élevé (0,1±0,12/ h ) avec le saccharose et le fructose par comparaison au

glucose (0,055 /h) en culture continue (Barcena et al.,1998).

Le glucose et le lactose sont les meilleures source de carbone pour une production

maximale de pédiocine ACH et de salivaricine CRL1384 (Parente et Hill., 1992 ). Cheigh

et al. (2002) trouvèrent que le saccharose et le lactose sont deux sources de carbone qui

conviennent pour la croissance de Lactococcus lactis ssp lactis A164. Le niveau de

production de la nisine par cette souche est multiplié par huit lors de l’utilisation du lactose

par rapport au saccharose. Le glucose et le raffinose également aboutissent à une bonne

croissance.

Sharma et al. (2010) ont montré que le niveau de biomasse et la production chez

Lactococcus lactis CCSULAC1 sont maximaux dans un milieu MRS additionné de 1.5%

de Tween 80. Ainsi l’utilisation d’un milieu avec l’extrait de soja donne une meilleure

production de bactériocine. L’addition de NaCl et d’éthanol inhibe la production de

l’entérocine A et B mais stimule celle de la sakacine P produite par Lactobacillus sakei

CCUG 42687 (Moretro et al., 2000).

Les anions (phosphate) et les cations (Mg 2+, Ca2 +) affectent la production des

bactériocines, mais leurs effets peuvent être spécifiques à l’espèce. Le phosphate

inorganique améliore la production de nisine avec L. lactis ssp. lactic NIZO22186 (De

Vuyst et Vandamme, 1993). Cependant, l'effet stimulateur du phosphate n'a pas été


43

confirmé pour la souche IO-1 (Matsusaki et al.,1996). En présence de Mg2 + la

production de pédiocine AcH a augmenté (Biswas et al., 1991), la production de la nisine a

été améliorée et a réduit de manière significative l’adhérence de la nisine aux cellules de L.

lactis ssp. lactis ATCC11454 (Meghrous et al., 1992).

1-6 Applications des bactériocines dans l’industrie alimentaire

De nos jours, les consommateurs sont exigeants en matière de sécurité, le bon goût et la

durée de vie des aliments. Les bactéries lactiques sont largement utilisées dans les aliments

fermentés, et beaucoup d'entre eux ont le statut GRAS. Par conséquence, les bactériocines

et autres métabolites produits par les bactéries lactiques sont généralement considérés

comme sûrs avec des propriétés intéressantes (par exemple, la stabilité, l’activité

antimicrobienne, le manque de toxicité, aucune saveur d’altération) (Carr et al., 2002;

Cotter et al., 2005). L'incorporation des composés antimicrobiens comme ingrédient de

conservation dans le modèle alimentaire a montré son efficacité dans le contrôle des micro-

organismes pathogènes et d'altération (O'Sullivan et al., 2002).

L’utilisation des bactériocines dans le domaine alimentaire est avantageuse non seulement

à cause de leur large spectre d’activité, mais aussi parce qu’elles sont non toxiques et

facilement dégradables par les enzymes digestives (Biswas et al., 1991).

L'ajout d'une culture pure viable de bactéries lactiques productrices de bactériocines

représente un exemple de bio-conservation. Il s’agit d’une façon indirecte d’incorporer des

bactériocines dans des produits alimentaires et le succès de l'opération dépend de la

capacité de la souche ajoutée à croître et à produire la bactériocine dans les conditions de

fermentation (Cocolin et al., 2007).

Plusieurs bactériocines montrent des effets synergiques ou additionnels lorsqu’elles sont

utilisées en combinaison avec d’autres agents antimicrobiens. L’utilisation combinée de

différentes bactériocines, peut être aussi une approche attirante pour éviter le

développement des souches résistantes (Gálvez et al., 2007). Les bactériocines peuvent

être appliquées sous une forme purifiée ou semi-purifiée. Les bactéries productrices

peuvent également être appliquées dans les produits alimentaires, la bactériocine sera alors

produite in situ (Chen et Hoover, 2003 ; Dortu et Thonart, 2009).


44

Jusqu'à présent, seule la nisine et la pédiocine PA-1 ont été commercialisées comme

additifs alimentaires. Cependant, d'autres bactériocines de bactéries lactiques offrent

également des perspectives prometteuses pour être utilisées comme bio-conservateurs dans

les aliments comme par exemple l'entérocine AS-48 (Sánchez-Hidalgo et al., 2011) ou

lacticine 3147 (Suda et al.,2012).

En outre, certaines bactériocines telles que l’entérocine CCM 4231 a été

expérimentalement appliquée dans différents écosystèmes tels que les produits laitiers, le

salami fermenté, (Lauková et al., 1998). Il a également été démontré que l’entérocine A

et B peuvent être utilisées pour protéger les aliments contre les contaminants bactériens

(Aymerich et al., 2000a, b). Un autre exemple est celui des souches E. faecium CWBI-

B1430 et E. mundtii CWBI-B1431 isolées de fromages artisanaux qui ont démontré un

large potentiel d’application comme conservateurs alimentaires des aliments traités par la

chaleur (Aguilar et al ., 2011).

Matériel et Méthodes


45

2-1 Bactéries

Au cours de cette étude, nous avons utilisé 04 souches d’Enterococcus sp codées BRO2

(isolée à partir de beurre traditionnel), LO4 et LO12 (isolées à partir de lait cru) et H3 (isolée

à partir du blé fermenté naturellement durant le stockage en silos souterrains « Hamoume »).

Elles proviennent de la collection de bactéries du Laboratoire de Biologie des

Microorganismes et Biotechnologie (LBMB).

Nous avons aussi utilisé des bactéries à Gram positif et à Gram négatif comme bactéries

cibles pour étudier l’activité inhibitrice des bactéries lactiques. Quatre souches bactériennes

sont des souches de références (ATCC). Les autres souches sont des bactéries isolées d’eaux

contaminées et de viandes rouges provenant de la collection du laboratoire LBMB. Quant aux

autres souches, elles sont isolées d’échantillons biologiques humains et proviennent de

l’hôpital de Chlef. Le Tableau 4 indique le genre, l’espèce ainsi que l’origine et le code de

ces bactéries.

Tableau 4: Souches cibles utilisées

Genre et espèce Code Origine

E coli ATCC 25922 American Type

Culture

Collection Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Staphylococcus aureus ATCC 25925

Staphylococcus aureus ATCC 43300

E coli HB4 Echantillons

biologiques

humains

(hôpital de Chlef)

Proteus mirabilis HB3

Proteus vulgaris HB10

Pseudomonas aeruginosa HB5

Pseudomonas sp HB2

Staphylococcus aureus HB1

E coli EC3 Eaux usées

(LBMB) Citrobacter freundi EC2

Staphylococcus sp V3

Viandes rouges

(LBMB)

Enterococcus sp H3

Hamoume

(LBMB)

2-2 Milieux de culture, conditions de croissance et conservation des bactéries

Les milieux de culture utilisés au cours de cette étude sont présentés en Annexe I. Les

bactéries ensemencées en milieu solide ou liquide ont été incubées à 30°C ou à 37°C pendant

24 ou 48 heures.


46

Les bactéries sont ensemencées en double dans des tubes de gélose M17 inclinée pour les

bactéries lactiques et de gélose nutritive inclinée pour les bactéries non lactiques. Après

incubation à 30 °C ou 37°C pendant 24 à 48 heures selon la croissance des bactéries, les

cultures sont mises à 4 °C où elles peuvent être conservées pendant plusieurs semaines.

Pour une conservation de longue durée elles sont congelées à -20°C dans leur propre milieu

de culture dilué de moitié avec une solution stérile de 40% de glycérol.

2-3 Isolement des bactéries lactiques

Au cours de cette étude, nous avons isolé des bactéries lactiques à partir de 2 échantillons de

beurre de fabrication traditionnelle et de 12 échantillons de lait cru (Tableau 5).

Tableau 5 : Echantillons utilisés et leurs origines

Echantillons Nombre d’échantillons Régions

Beurre traditionnel 1 Ain Defla

1 Chlef

Lait cru 12 Misserghine

2-3-1 Isolement des bactéries lactiques à partir du beurre traditionnel

A partir de chaque échantillon de beurre, une quantité de 5 g a été prélevée aseptiquement

puis chauffée à une température de 45°C jusqu'à fusion. La séparation de la phase aqueuse de

la phase grasse a été réalisée par centrifugation pendant 10 minutes à 3000 trs/min. 1ml de la

phase aqueuse de chaque échantillon est dilué dans 9 ml d’eau physiologique et des dilutions

décimales ont été préparées pour chaque échantillon.

Nous avons prélevé 100 µl des dilutions 10-5 ou 10-6 et ensemencé en surface des boites de

Pétri contenant du M17 agar. Les cultures ont été incubées à 30°C pendant 48 heures à 72

heures.

Après incubation différentes colonies ont été sélectionnées puis purifiées sur M17 agar.

2-3-2 Isolement des entérocoques à partir des échantillons de laits crus

La traite du lait a été faite par des fermiers à 7 heures du matin. Elle a été effectuée

manuellement en respectant les règles d’hygiène et d’asepsie recommandées en microbiologie


47

(se laver les mains et les avant-bras, vérifier l’état et la propreté du matériel, lavage et rinçage

des pis des vaches à l’eau javellisée suivie d’une élimination des premiers jets de laits et

maintenir une atmosphère calme et sans stress durant la traite). Les échantillons ont été

récupérés dans des flacons stériles et transportés à température ambiante au laboratoire.

Pour l’isolement des entérocoques nous avons utilisé la technique décrite par Guiraud et

Galzy (1980). Nous avons procédé à l’isolement de la manière suivante :

On prépare 3 séries de tubes dont une série de 3 tubes contenant 10 ml de bouillon de Rothe

(double concentration) et 2 séries de 3 tubes contenant 10 ml de bouillon de Rothe (simple

concentration). Dans les 3 premiers tubes (double concentration), on rajoute 10 ml de lait cru.

On réalise la même opération avec les 2 autres séries en ajoutant aux 3 premiers 1 ml de lait

cru et aux 3 autres 0,1 ml de lait cru. Les cultures ainsi préparées sont incubées à 37° C

pendant 24 à 48 heures. Les tubes présentant un trouble bactérien sont considérés comme

positif. L’isolement des entérocoques est ensuite réalisé à partir des tubes positifs sur milieu

M17 solide par la technique des quadrants après incubation à 37°C pendant 24 heures.

Les colonies sélectionnées lors de l’isolement ont été purifiées par repiquages successifs sur

M17 agar.

2-4 Identification phénotypique des bactéries lactiques

Après purification des bactéries isolées, nous les avons identifiées par des méthodes

d’identification classiques basées sur l’étude des critères phénotypiques.

2-4-1 Caractérisation morphologique

L’identification de bactéries passe par plusieurs étapes. L’étude de critères macroscopiques de

culture sur gélose (description de colonies) et l’observation microscopique sont les premiers

tests d’identification des bactéries.

➢ Critères macroscopiques

Cette étude consiste à décrire la forme, l’aspect, la couleur et le diamètre des colonies

obtenues sur gélosé M17.

➢ Critères microscopiques


48

➢ L’observation microscopique des bactéries a été faite après coloration de Gram. Elle

permet de déterminer la morphologie des cellules bactériennes (la taille, la forme, la

disposition des cellules et le Gram). Les bactéries lactiques sont à Gram positif.

2-4-2 Caractérisation physiologique

Le groupe de bactéries lactiques étant hétérogène, il nécessite pour son identification, l’étude

des critères physiologiques. Ce type de caractérisation permet d’orienter l’identification de

souches lactiques vers un genre précis.

➢ Recherche de la catalase

Ce test permet de mettre en évidence la présence d’une enzyme dont le rôle est de

décomposer le peroxyde d’hydrogène qui est produit par certaines bactéries en réponse à un

stress oxydatif.

Pour chaque souche une colonie a été prélevée à partir du milieu gélosé et a été émulsionnée

sur une lame contenant une goutte d’eau oxygénée. Un dégagement immédiat de bulles

gazeuses révèle la présence de catalase (catalase +). En cas de non dégagement de bulles

gazeuses les souches sont à catalase négative, caractéristique des bactéries lactiques.

Les bactéries lactiques sont des bactéries catalase négative, à l’exception de la souche

Lactobacillus plantarum ATCC 14431 (Ebel, 2012).

➢ Croissance à 45°C

Les souches isolées et purifiées ont été ensemencées dans du bouillon M17 puis incubées à

45°C pendant 24 heures à 48 heures. Après incubation, la croissance bactérienne s’est

manifestée par un trouble du bouillon de culture que nous avons noté pour chaque souche

bactérienne. Ce test permet de révéler le caractère thermophile des souches étudiées.

➢ Croissance à pH 9,6

Ce test permet de caractériser le genre Enterococcus parmi les autres genres de bactéries

lactiques. Le bouillon M17 utilisé dans ce test a été ajusté à pH 9,6, en rajoutant au bouillon

de culture le tampon glycine-NaOH (Annexe 2). Après ensemencement et incubation à 30°C

pendant 24 heures ou plus, le trouble bactérien obtenu révèle la croissance de la bactérie.

➢ Croissance à 6,5% de NaCl


49

Nous avons ensemencé les bactéries lactiques dans du bouillon M17 contenant 6,5% de NaCl.

Les cultures ont été incubées à 30°C pendant 24 heures ou plus. La croissance bactérienne qui

se manifeste par un trouble du bouillon de culture a été notée pour chaque bactérie.

➢ Test de thermo-résistance

Ce test a pour but d’identifier les souches thermorésistantes. Chaque souche purifiée a été

ensemencée dans du bouillon M17 puis traitée à 60°C pendant 30 mn. Après traitement

thermique, les souches ont été incubées à 30°C pendant 24 heures ou plus. Après incubation,

seules les bactéries thermorésistantes présentent une croissance.

➢ Croissance en présence de bile

Ce test permet d’identifier les souches du genre Enterococcus des autres genres de bactéries

lactiques. Pour déterminer l’effet de la bile (40%) sur la croissance des souches lactiques,

nous avons ensemencé chaque bactérie dans du bouillon M17 additionné de 40% de bile.

Après une incubation à 30°C pendant 24 heures ou plus, la croissance bactérienne qui se

manifeste par un trouble du bouillon de culture a été notée pour chaque bactérie.

2-4-3 Caractérisation biochimique

Afin de compléter l’identification phénotypique, nous avons utilisé des tests biochimiques

(API 20 STREP). A partir de chaque culture pure sur gélose M17, des colonies sont mises en

suspension pour inoculer des galeries API 20 STREP (Bio Mérieux, France). La préparation

de suspension bactérienne et l’inoculation de galeries ont été réalisées selon les

recommandations du fabricant de galeries.

Après inoculation de la galerie, les cupules sont recouvertes d’huile de paraffine puis la

galerie est incubée à 30°C. La lecture des résultats se fait au bout 4 heures puis au bout de 24

heures. Les résultats sont exploités pour identification grâce au logiciel APIWEB.

2-5 Caractérisation moléculaire des bactéries

Afin de confirmer la caractérisation phénotypique des isolats d’Enterococcus, nous avons

procédé à une caractérisation moléculaire. Ce type d’identification nécessite une extraction

d’ADN, suivi d’une amplification d’une région spécifique du génome et d’une analyse des

séquences par comparaison dans une base de données.


50

2-5-1 Extraction de l’ADN

Dans la littérature plusieurs méthodes d’extraction d’ADN bactérien ont été décrites.

L’enveloppe cellulaire constituant une barrière doit être rompue. Pour la plupart des

protocoles la lyse cellulaire de bactéries à Gram positif se fait par des méthodes chimiques.

Dans cette étude, nous avons adopté une méthode simple. C’est une combinaison de 2

méthodes de lyse, une lyse thermique et une lyse chimique. Le principe de l’extraction utilisée

est basé sur la lyse par choc thermique de cellules d’une suspension bactérienne dans un

tampon de lyse. Les étapes de la méthode ont été reprises telles qu’elles ont été décrites par

Reischl et al. (1994).

Deux colonies ont été prélevées à partir de culture d’entérocoques sur gélose M17. Elles ont

été homogénéisées dans 1 ml d’eau pure. Cette suspension bactérienne a été centrifugée à

12000 trs/min pendant 10 minutes. Le culot bactérien a été suspendu dans 200µl de tampon de

lyse (1% Triton X 100, 0, 5% Tween 20, 10 mM Tris-HCl pH8, 1 mM EDTA) (Reischl et al.,

1994). La suspension bactérienne est mise dans un bain marie à 100°C pendant 10 min. Les

débris cellulaires sont éliminés par centrifugation (12 000 trs/min pendant 3 minutes).

Le surnageant contenant de l’ADN a été directement utilisé pour les réactions de PCR.

2-5-2 Amplification de l’ADN des entérocoques par PCR

Le choix d’amorces spécifiques s’est fait sur la base des résultats de l’identification

phénotypique. Une séquence du gène ARNr 16S a fait l’objet d’une amplification par PCR à

l’aide d’amorces spécifiques aux entérocoques conçues par Deasy et al. (2000). Ces auteurs, à

l’aide d’alignement des séquences d’ADNr 16S des genres Enterococcus et Lactococcus,

montrèrent qu’il existe une différence au niveau d’une région de ce gène. L’amplification de

cette région et son séquençage permettent l’identification des entérocoques.

L’amplification de l’ADN se fait par PCR (Polymerase Chain Reaction), cette technique se

résume en la répétition n fois d’un cycle qui se compose de 3 étapes : dénaturation par la

température permettant la séparation des deux brins, hybridation des amorces et élongation.

Une paire d’amorces E1 (5’TCAACCGGGGAGGGT3’) et E2

(5’ATTACTAGCGATTCCGG3’) conçues par Deasy et al. (2000) a été utilisée pour

amplifier l’ADN des entérocoques. Une paire d’amorces universelles U1

(5’AAYATGATTACIGCIGCICARARATGGA’3) et U2 (5’-

AYRTTITCICCIGGCATIACCAT-’3) a été utilisée comme témoin.


51

La composition du mélange réactionnel pour chaque réaction de PCR est donnée en Tableau

6.

Tableau 6 : Composition du mélange réactionnel pour chaque réaction PCR

Ingrédients Concentration initiale Volume (µl)

Tampon PCR 10X 5 µl

Mélange dNTP 25 mM 0,4 µl

MgCl2 50 mM 2,5 µl

Chaque amorce 10 µM 1,25 µl

Echantillon d’ADN 10 µl

Taq DNA polymerase (5U/µl) 0,4 µl

Eau pure qsp 50µl

La réaction de PCR a été réalisée en utilisant un thermocycleur (Techne TC-412).

Nous avons utilisé le programme d’amplification des entérocoques décrit par Deasy et al.

(2000). Ce programme consiste en une étape de dénaturation à 94°C pendant 1 min, une étape

d’hybridation à 60°C pendant 1 min et une étape de polymérisation à 72°C pendant 1 min.

Nous avons réalisé une amplification de 35 cycles. Ces cycles ont été précédés par une étape

de dénaturation initiale à 95°C pendant 5 min. L’amplification est achevée par l’étape

d’élongation finale à 72°C pendant 5 min.

2-5-3 Electrophorèse sur gel d’agarose des produits de la PCR

Afin de déterminer et de vérifier la taille des produits de PCR, une électrophorèse sur gel

d’agarose a été réalisée. L’électrophorèse horizontale sur gel d’agarose est une technique

permettant de séparer les fragments d’ADN en fonction de leur taille et de les visualiser sous

formes de bandes.


52

Le gel d’agarose utilisé pour analyser les produits de réactions de PCR a été préparé à une

concentration de 1% dans du Tris Acétate EDTA dont la composition est donnée en Tableau

7.

Tableau 7 : Composition du gel d’agarose:

Concentration

Agarose 1% (p/v)

Bleu de Bromophénol 3 mM

Tris Acétate 40 mM

EDTA 1 mM

Bromure d’éthidium 200 ng/ml

A partir de chaque produit de PCR, un volume de 5 µl est mélangé à 2µl de tampon de charge

dont la composition est la suivante :

Saccharose 1,5 M

Tris HCl 10 Mm

Les échantillons ainsi que le marqueur de poids moléculaire 1000 pb sont déposés au niveau

des puits du gel d’agarose à 1%. La migration est effectuée à 135 Volts pendant 40 min en

utilisant le tampon TAE. Le gel a été photographié sur une table UV.

2-5-4 Analyse phylogénétique des bactéries

Le génome bactérien comprend une séquence d’ADN codant pour l’ARNr 16S. L’analyse de

cette séquence chez différentes espèces permet d’évaluer leur parenté évolutive.

Ainsi les produits de PCR ont fait l’objet d’un séquençage suivi d’une analyse par

comparaison des séquences dans une base de données et une construction d’arbre

phylogénétique.

➢ Séquençage

Les produits de PCR visualisés sur gel d’agarose ont fait l’objet d’un séquençage par la

méthode de Sanger. Le principe de cette méthode est basé sur l’interruption aléatoire de


53

l’élongation de l’ADN par des didésoxynucléotides (ddNTP) marqués par un fluorochrome.

Ces derniers excités par un faisceau de laser produiront des signaux fluorescents dont la

collecte au niveau des capillaires permettra de déterminer la séquence en nucléotides. Le

séquençage a été réalisé par un analyseur (96-Capillary Applied Biosystems 3730xl).

Les produits de PCR ont été purifiés à l'aide de colonnes Microcon (Millipore) selon les

instructions du manufacturier. Les produits PCR purifiés sont introduits à une extrémité des

capillaires par électro-injection. Les fragments sont séparés en fonction de leur taille. Les

résultats se présentent sous forme d’un affichage de couleur qui est traduit par un logiciel

d’analyse de séquences.

➢ Analyse phylogénétique

L’analyse des séquences a été réalisée à l’aide du programme BLASTn (Altschul et al., 1990)

du NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ce programme permet de comparer une séquence

nucléique à une banque de séquences nucléiques.

L’alignement des séquences a été réalisé en utilisant le logiciel Clustal X2.1 (Thompson et

al., 1997). L’arbre phylogénétique a été établie à l’aide du logiciel Mega 6.06 (Tamura et al.,

2013).

2-6 Potentiel inhibiteur des bactéries lactiques

Nous avons testé les bactéries vis-à-vis de souches cibles à Gram positif et à Gram négatif

(Tableau 4). Ce test nous permet de sélectionner des souches inhibitrices.

Plusieurs méthodes ont été décrites pour mettre en évidence l’activité inhibitrice. Nous avons

utilisé la méthode de Fleming et al. (1975) dont le principe consiste à mettre en évidence

l’inhibition de croissance d’une souche (souche cible) par une autre souche qui a été cultivée

au préalable sur une gélose (culture de 18 heures de la souche inhibitrice).

Nous avons réalisé des cultures de 18 heures en bouillon M17. A partir de chacune de ces

cultures, nous avons prélevé 5 µl pour les déposer en touche sur gélose M17. Les boites ainsi

ensemencées ont été incubées à 30°C pendant 18 heures. Cette première étape qui correspond

à la croissance des bactéries considérées potentiellement inhibitrices est suivie d’une étape de

révélation des inhibitions.

Pour révéler les inhibitions, nous avons réalisé des cultures de souches cibles en bouillon

nutritif pendant 4 ou 5 heures (DO600nm 0,3 à 0,5), à l’exception de la bactérie Enterococcus

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


54

sp H3 qui a été cultivée en bouillon M17. A partir de ces pré-cultures, nous avons prélevé 250

µl pour inoculer 7 ml de gélose molle nutritive ou de gélose molle M17 (0,75% (m/v) d’agar-

agar,). Ces géloses ensemencées sont coulées sur les cultures en touches. Les boites ont été

conservées à 5°C pendant 4 heures avant de les incuber à 30°C pendant 24 heures.

L’inhibition se manifeste par la formation d’une zone claire autour des touches. Les diamètres

de ces zones sont mesurés.

2-7 Détection de bactéries potentiellement bactériocinogène

Parmi les activités inhibitrices des bactéries lactiques, nous nous sommes intéressés à

l’activité bactériocinogène. Nous nous sommes inspirés de la méthode de Spelhaug et

Harlander (1989), qui consiste à détecter les bactéries potentiellement bactériocinogènes en

milieu tamponné à l’aide du β glycérophosphate.

Nous avons apporté une modification au milieu de culture. La gélose M17 a été tamponnée

avec du tampon phosphate de sodium Na/Na2 (0,1 M; pH 7,2) (Annexe 2) au lieu du ß

glycérophosphate (1%) utilisé par Spelhaug et Harlander (1989).

A partir des pré-cultures, les souches inhibitrices ont été ensemencées en touches (5µl)

comme décrit précédemment (paragraphe 2-6) sur gélose M17 non tamponnée et sur gélose

M17 tamponnée. Ces cultures ont été incubées à 30°C pendant 18 heures.

Les souches cibles sont cultivées en bouillon nutritif pendant 4 ou 5 heures (DO600nm 0,3 à

0.5), à l’exception de la bactérie Enterococcus sp H3 qui a été cultivée en bouillon M17. Ces

souches cibles ont été ensemencées comme décrit précédemment.

Les zones d’inhibition de souches cibles formées sur gélose tamponnée révèlent l’activité

potentiellement bactériocinogène des bactéries.

2-8 Caractérisation de la nature biochimique des métabolites antibactériens

Dans le but de déterminer la nature biochimique des métabolites antibactériens, nous avons

réalisé des cultures des bactéries inhibitrices sélectionnées dans deux bouillons M17. L’un des

bouillons est non tamponné et l’autre bouillon est tamponné par du tampon phosphate de

sodium Na/Na2 (0,1 M; pH 7,2) (Annexe II). Chacun de ces bouillons (200 ml) a été inoculé

par des pré-cultures de 18 heures à raison de 4% d’inoculum. Au bout de 18 heures

d’incubation à 30°C, le surnageant de chaque culture a été récupéré par centrifugation à

12000 trs/min pendant 15 min. Les surnageants de cultures ont été filtrés à travers une

membrane millipore 0,22-µm.


55

Pour mettre en évidence l’activité antibactérienne de ces filtrats, nous avons adopté la

méthode de Tagg et McGiven (1971). Cette méthode consiste à déposer le filtrat dans des

puits creusés dans de la gélose molle ensemencée par la souche cible.

Nous avons testé l’activité en déposant 50 µl de chaque surnageant filtré aux niveaux de puits

que nous avons creusés dans la gélose molle (30ml) inoculée par 500 µl d’une culture de 5

heures de la souche cible.

Les cultures ont été entreposées à 5°C pendant 4 heures. Pour mettre en évidence l’activité

inhibitrice, ces boites ont été incubées pendant 24 heures à 30°C. La lecture des résultats a été

réalisée par mesure du diamètre des halos d’inhibition.

Afin d’étudier la sensibilité des métabolites antibactériens, nous avons concentré les filtrats

actifs par lyophilisation. Ces filtrats concentrés ont été utilisés pour étudier la sensibilité des

métabolites antibactériens aux enzymes protéolytiques, aux pH et à la chaleur.

2-8-1 Sensibilité aux enzymes

Afin de déterminer la nature des substances responsables de l’activité antibactérienne, les

extraits concentrés par lyophilisation (EC) ont été traités par des enzymes protéolytiques et

par la catalase :

Des aliquots de 200 µl des EC ont été incubés à 37°C pendant 2 heures (Todorov et al., 2011)

en présence de 1mg/ml de catalase, de trypsine, de pronase E, de protéinase K, de pepsine ou

d’α-chymotrypsine (Aktypis et Kalantzopoulos, 2003). Toutes ces enzymes ont été

préparées dans du tampon phosphate de sodium Na/Na2 (0,01 M pH 7) à l’exception de la

pepsine qui a été dissoute dans du HCl 0,02 M.

La sensibilité de l’activité antibactérienne vis à vis des enzymes a été appréciée par la

méthode de diffusion (Tagg et McGiven, 1971).

Pour la suite de la caractérisation de la nature biochimique de métabolites antibactériens nous

avons déterminé le titre de cette activité de la manière suivante :

Nous avons réalisé des dilutions au demi en cascade des filtrats en tubes Eppendorf.

Le premier tube Eppendorf est rempli de 500µl du surnageant de culture, les autres tubes

Eppendorf sont remplis de surnageant de culture dilué au demi en cascade avec du bouillon

stérile. Un volume de 50µl de chaque dilution est déposé au niveau de puits faits dans de la

gélose molle préalablement ensemencée par la souche cible (paragraphe 2-8). Les cultures ont

été incubées à 5°C pendant 4 heures ensuite à 30°C pendant 24 heures.


56

Après incubation, les diamètres d’inhibitions ont été mesurés et l’activité a été exprimée en

unité arbitraire par ml (UA/ml) en prenant l’inverse de la plus grande dilution pour laquelle

une inhibition est observée (2 mm de diamètre et plus) (Graciela et al., 1995).

2-8-2 Effet de la chaleur

Des aliquots de 200 µl des EC ont été chauffés à 60°C (30 et 60 min), à 100°C (30 et 60 min)

et à 121°C (20 min). L’activité résiduelle a été évaluée vis-à-vis de la souche cible et

exprimée par unité arbitraire (UA) par millilitre (Graciela et al., 1995).

2-8-3 Effet du pH

Le pH peut avoir une influence sur l’activité antibactérienne. Cette activité a été estimée pour

différentes valeurs de pH :

Des aliquots de 200 µl des EC ont été ajustés à différents pH de 2 à 12 avec HCl (1 mole l-1)

ou NaOH (1 mole l-1). Après une incubation de 4 heures à 30°C (Hernandez et al., 2005) et

une filtration à travers une membrane millipore 0,22 µm, l’activité résiduelle a été évaluée

comme décrit précédemment.

2-9 Influence des milieux de cultures sur la production de métabolites antibactériens

Nous nous sommes intéressés à l’étude de l’influence des milieux de culture sur la production

de métabolites antibactériens. Les résultats obtenus ont été analysés à l’aide du logiciel

XLSTAT.

2-9-1 Influence du tampon du milieu M17

Nous avons tamponné le bouillon M17 à pH 7 à l’aide des tampons suivants : le β

glycérophosphate à 2% (v/v), le phosphate de sodium à 0,2 M, le citrate phosphate à 0,2 M ou

le Tris amino-méthane maleate à 0,2 M.

Ces milieux tamponnés ont été inoculés par des pré-cultures de souches inhibitrices à 4%.

Après une incubation de 18 heures à 30°C, l’activité antibactérienne a été dosée comme décrit

précédemment. Nous avons réalisé 3 essais. Les résultats obtenus permettent de retenir le

tampon (T1) qui a donné la meilleure activité antibactérienne.


57

2-9-2 Influence des différentes concentrations de lait écrémé ajoutées aux bouillons M17

L’effet de différentes concentrations de lait écrémé additionné au milieu M17 tamponné avec

le tampon T1 sur l’activité antibactérienne des bactéries inhibitrices a été étudié. Nous avons

testé différentes concentrations de lait écrémé 5%, 15%, 25%, 35%, 45%, 55%, ou 65% (v/v).

Ces milieux de culture ont été ensemencés à raison de 4% par des pré-cultures de souches

inhibitrices. Après incubation à 30°C pendant 18 heures, les surnageants de culture obtenus

par centrifugation à 12000 trs/mn (15 min) ont été testés pour leur activité bactériocinogène.

Le titre de l’activité antibactérienne a également été déterminé pour chaque concentration de

lait écrémé testée. Nous avons réalisé 3 essais. Les résultats obtenus permettent de retenir la

concentration de lait écrémé (L1) qui a donné la meilleure activité antibactérienne.

2-9-3 Influence des sucres

Parmi les composants des milieux de culture, le sucre est un élément important. Il constitue

une source de carbone et d’énergie. Le but de ce test est d’étudier l’influence que peut avoir le

sucre sur la production de métabolites antibactériens. Nous avons testé l’influence du glucose,

lactose, fructose, galactose ou du saccharose. Ces sucres ont été ajoutés au milieu M17

tamponné avec le tampon T1 à raison de 0,5% (Simsek et al., 2009).

Nous avons inoculé ces bouillons de culture par des pré-cultures à 4% d’inoculum. Nous

avons également ensemencé un bouillon de culture sans sucre. Après une incubation des

cultures à 30°C pendant 18 heures, l’activité antibactérienne a été déterminée comme décrit

précédemment. Les résultats obtenus permettent de retenir le sucre (S1) qui a donné la

meilleure activité antibactérienne.

2-9-4 Influence des milieux M17 et MRS modifiés :

L’activité antibactérienne des bactéries inhibitrices sélectionnées a été estimée après culture

dans quatre milieux de culture modifiés et dans du lait écrémé. Les 4 milieux de culture

modifiés sont :

- Milieux M17 et MRS tamponné à l’aide du tampon T1, ces milieux sont considérés

comme des milieux témoins.

- Milieux M17 et MRS tamponné à l’aide du tampon T1 et additionnés de L1 et de S1.


58

Ces milieux ont été ensemencés à raison de 4 % par des pré-cultures des souches

inhibitrices. Les cultures ont été incubées à 30°C pendant 18 heures. Nous avons

déterminé le titre de l’activité antibactérienne comme décrit précédemment.

A titre indicatif, et en parallèle, nous avons estimé la croissance bactérienne par mesure de la

densité optique à 600 nm. Pour les cultures en lait et en milieux modifiés contenant du lait, la

croissance a été mesurée selon la méthode décrite par Boutrou et al. (1998) qui consiste à

clarifier le milieu par ajout de l’EDTA à 2%. La croissance est ensuite déterminée par mesure

de la densité optique à 480 nm.

2-10 Cinétique de croissance et de production de métabolites antibactériens

Nous avons étudié la cinétique de croissance et la cinétique de production de métabolites

antibactériens chez les bactéries inhibitrices.

Les bactéries ont été ensemencées à 4% dans les milieux de culture modifiés puis incubées à

30°C. La croissance bactérienne est estimée par mesure de l’absorption (ou densité optique) à

600nm (croissance en absence de lait) et à 480 nm (croissance en présence de lait), toutes les

deux heures pendant 24 heures. En parallèle nous avons déterminé le titre de l’activité

antibactérienne.

2-11 Purification des bactériocines

Plusieurs stratégies ont été décrites afin de purifier les bactériocines. Dans ce travail, les

bactériocines ont été précipités par le sulfate d’ammonium suivi d’une chromatographie gel

filtration et d’une chromatographie échangeuse d’ions.

2-11-1 Précipitation par le sulfate d’ammonium

La précipitation par le sulfate d’ammonium est la première étape des différentes stratégies de

purification de bactériocines. Cette méthode de séparation est basée sur la propriété de

solubilité des protéines et peptides. A une saturation donnée de sulfate d’ammonium, les

bactériocines ne sont plus solubles et peuvent être précipitées.

Le surnageant de culture de chacune des souches bactériocinogènes a été additionné de sulfate

d’ammonium pour trois niveaux de saturations (40%, 60% et 80%) afin d’obtenir trois

fractions.


59

Le sulfate d’ammonium a été ajouté par niveaux :

➢ Niveau 40% de saturation : le surnageant de culture a été additionné de sulfate

d’ammonium progressivement sous une agitation continue jusqu’à atteindre un niveau

de saturation de 40% (226 g/l). L’agitation a été maintenue pendant 4 heures à 4°C.

Afin de récupérer les molécules protéiques insolubles à cette saturation, une

centrifugation a été réalisée à 9000 g/min pendant 30 min. Le précipité obtenu P40 a été

récupéré dans un volume de tampon phosphate (Na/Na2, 0,02M, pH 7) égal au 1/20 du

volume du surnageant utilisé.

➢ Niveau 60% de saturation: le surnageant récupéré après centrifugation a été

additionné de sulfate d’ammonium (120 g/l) pour passer du niveau 40 à 60% de

saturations. Les mêmes étapes décrites ci-dessus ont été reprises pour obtenir le

précipité P60.

➢ Niveau 80% de saturation : le surnageant récupéré après centrifugation du

niveau précédent a été additionné de sulfate d’ammonium (129 g/l) pour passer du

niveau 60% au niveau 80% de saturation pour obtenir le précipité P80.

Afin d’éliminer les sels, les trois précipités obtenus dissouts dans du tampon phosphate de

sodium ont fait l’objet de dialyse pendant une nuit contre un litre du tampon phosphate de

sodium (Na/Na2, 0,02M, pH 7). La membrane utilisée est une membrane de nitrocellulose de

porosité de1000Da.

L’activité antibactérienne de chaque fraction a été testée pour déterminer la saturation en

sulfate d’ammonium permettant de précipiter un maximum d’agent inhibiteur.

2-11-2 Chromatographie par filtration sur gel de Séphadex G-25

Dans ce type de chromatographie, la séparation des protéines sur colonne est fonction de leur

taille et de leur forme. La séparation se base sur l’équilibre de répartition de molécules entre

une phase mobile (le solvant contenant les protéines) et une phase stationnaire (le gel

constitué de billes). Les molécules de grandes tailles sont éluées en premier avec le volume

mort de la colonne alors que les petites molécules vont pénétrer à l’intérieur des pores des

billes et seront retardées.

Un volume de 700 µl de métabolites antibactériens précipités a été déposé sur une colonne de

Séphadex G-25 (longueur 30,5 cm, diamètre 1,2 cm, limite d’exclusion 5000 DA), équilibrée

avec un tampon phosphate (Na/Na2, 0,1M, pH 7) à un débit de 0,5ml/min.


60

Des fractions de 1 ml ont été recueillies à l’aide d’un collecteur de fractions. Chacune de ces

fractions à fait l’objet d’une lecture de la densité optique à 280 nm et d’un test de l’activité

par la méthode de Tagg et McGiven (1971).

Les fractions correspondant à un pic sont rassemblées en une seule fraction. Cette dernière est

concentrée par lyophilisation et testée par la méthode de Tagg et McGiven (1971).

2-11-3 Chromatographie échangeuse d’ions

La séparation des protéines par chromatographie échangeuse d’ions utilise les interactions

électrostatiques qui s’établissent entre les protéines et le support chromatographique. La

chromatographie échangeuse d’ions est de deux types, l’échangeuse d’anion (support chargé

positivement) et l’échangeuse de cations (support chargé négativement).

Le lyophilisat a été repris dans 1 ml de tampon phosphate sodium (Na/Na2, 0,02M, pH 7) et

chargée sur une colonne de chromatographie contenant un gel de DEAE-cellulose

(diéthylaminoéthylcellulose) ou CM-Sephadex C-25 (carboxyméthyl sephadex). Les gels

déshydratés ont été gonflés dans de l’eau distillée contenant 0,05% d’azide de sodium.

L’excès d’eau a été éliminé et chaque gel a été coulé dans une colonne de longueur de 100

mm, et de diamètre de 10 mm.

La séparation a été réalisée comme suit :

➢ Echangeuse d’anions Diéthylaminoethyl-cellulose (DEAE-cellulose)

Nous avons équilibré la colonne de DEAE-cellulose par le passage de 3 volumes de tampon

KH2 PO4 (0,025 M, pH7) additionné de MgCl2 (0,01 M, pH 7). Cette colonne a été chargée

par 700 µl de la fraction concentrée et active obtenue par chromatographie gel filtration

(paragraphe 2-10-2).

L’élution s’est faite par gradient de concentration ionique avec un débit de 0,5 ml/min. Les

concentrations de tampons d’élution sont :

• Tampon 1: 0,025 M KH2PO4 + MgCl2 0,01M pH 7





61

Nous avons récupéré des fractions de 1ml. Chacune de ces fractions a fait l’objet d’une

lecture à 280nm et d’un test d’activité inhibitrice par la méthode de Tagg et McGiven (1971).

➢ Echangeuse de cations CM-Sephadex C-25

La colonne CM-Sephadex C-25 a été équilibrée avec le tampon phosphate (Na/Na2, 0,05 M,

pH7). Nous l’avons chargé avec un volume de 500 µl de la fraction concentrée et active

obtenue par la chromatographie de gel filtration. Après avoir déposé l’échantillon (fraction

active), l’élution s’est faite par passage à un débit de 0,5 ml/min de 5 volumes d’un gradient

continu de NaCl de 0 M à 0,1 M puis de 0,1 M à 1 M. Le gradient de NaCl a été préparé dans

du tampon phosphate (Na/Na2, 0,05 M, pH7).

Nous avons collecté des fractions de 1ml qui ont fait l’objet d’une lecture à 280 nm et d’un

test d’activité antibactérienne.

2-11-4 Electrophorèse SDS-PAGE

Cette technique est utilisée pour séparer les protéines ou peptides en fonction de leur poids

moléculaire par migration dans un gel de polyacrylamide sous l’influence d’un champ

électrique.

L’électrophorèse SDS-PAGE a été utilisée afin de vérifier la pureté des métabolites

antibactériens et de déterminer leurs poids moléculaires. A chaque étape d’extraction et de

purification, des échantillons ont été prélevés et traités pour être analysés par SDS-PAGE.

Avant la migration des échantillons sur gel de polyacrylamide, nous les avons traités par ajout

d’un tampon de charge (V/V) qui est composé de :

Tris 0,15 g

Glycérol 2 g

Dodécylsulfate de Sodium (SDS) 0,4

Bleu de Bromophénol 0,01 g

β-mercaptoéthanol 0,5 g

Eau distillée 100 ml

pH 6, 8


62

Ce traitement d’échantillon est suivi d’un traitement thermique à 100°C pendant 2 min avant

de charger 60 µl de chaque échantillon en duplicata sur un gel de polyacrylamide SDS (gel de

séparation 16% surmonté d’un gel de concentration 5%).

La composition de chaque gel est donnée en Tableau 8. Les échantillons sont déposés sur le

gel de façon à pouvoir récupérer deux parties qui seront traitées différemment. Un mélange de

protéines étalons de poids moléculaires, traité de la même manière que les échantillons a

également été déposé. Les protéines utilisées : Sérum Albumine Bovine (67 kDa), Pepsine

(45kDa), Chymotrypsine (25kDA) et Lysozyme (14 kDa).

Tableau 8 : Composition des gels de polyacrylamide :

Gel de séparation Gel de concentration

Eau distillée 5,9 ml 5,5 ml

Acrylamide mix 30% * 16 ml 1,3 ml

Tris 1,5 M (pH 8,8) 7,5 ml

Tris 1 M (pH 6,8) 1 ml

SDS 10% 0,3 ml 0,08 ml

Persulfate d’ammonium 10% 0,3 ml 0,08 ml

TEMED 0,012 ml 0,006

* le rapport du mélange (P/P) d’acrylamide : bis acrylamide est de 29 :1

La migration a été réalisée à 120 Volts dans un tampon de migration dont la composition est

donnée en Tableau 9.

Tableau 9 : Composition du tampon de migration:

Concentration

Tris 3,03 g/l

Glycine 14,4 g/l

SDS 1 g/l

pH 8,3

Après migration, nous avons délicatement séparé le gel en deux parties dont l’une servira à la

coloration au bleu de Coomassie et l’autre au test antibactérien.


63

La partie du gel destinée à la coloration a été trempée dans une solution de TCA (10%)

pendant 10 mn puis transférée dans une solution de coloration pendant 3 heures. La solution

de coloration est composée de 0,5% de Bleu de Coomassie; 90 ml Méthanol/Eau distillée

(v/v) et 10ml d’acide acétique). Le gel est ensuite décoloré dans un bain de décoloration (900

ml de Méthanol/Eau distillée (v/v) et 100 ml d’acide acétique) jusqu’à ce que les bandes

protéiques au niveau du gel soient visibles.

L’autre partie du gel a été fixée par incubation pendant 20 minutes dans 200 ml d’un mélange

d’isopropanol à 20% (v/v) et d’acide acétique à 10% (v/v) (Todorov et al., 2007). Après

lavage du gel pendant une nuit avec de l’eau distillée stérile à 4°C, le gel a été déposé sur une

gélose molle ensemencée par une souche sensible et incubé à 30°C pendant 24 heures.

Résultats et Discussion

64

3-1 Isolement des bactéries lactiques

A partir des échantillons de beurre, nous avons isolé 20 souches, 10 provenant du beurre

d’Ain Defla (BRA) et 10 provenant du beurre de Chlef (BRC). Le code des bactéries lactiques

isolées ainsi que l’origine sont présentés dans le Tableau 10.

Tableau 10 : Code des bactéries lactiques isolées à partir du beurre

A partir des 12 échantillons de lait cru (LO), nous avons également isolé 52 colonies en

utilisant le bouillon de Rothe comme milieu d’isolement des entérocoques. Après purification

par repiquages successives sur gélose M17, 31 isolats ont présenté une faible et lente

croissance, nous les avons écartés. Le code attribué aux souches retenues est donné dans le

Tableau 11.

Tableau 11 : Code des bactéries lactiques isolées à partir du lait cru

Au total nous avons retenu 45 souches pour la suite de l’étude : 41 souches isolées

précédemment et 4 souches d’Enterococcus sp codées BRO2, LO4, LO12 et H3 appartenant à

Origines Beurre Ain Defla (BRA) Beurre Chlef (BRC)

Cod

es

BRA1, BRA2, BRA3, BRA4,

BRA5, BRA6, BRA7, BRA8,

BRA9, BRA10

BRC2, BRC3, BRC4,

BRC5, BRC6, BRC7, BRC8,

BRC9, BRC10, BRC12

Origine Lait cru Oran (LO)

Cod

es

LO1.5, LO2.1, LO2.2, LO2.4, LO3.1, LO3.2, LO3.4,

LO4.1, LO4.4, LO6.1, LO6.2, LO7.3, LO7.4, LO8.5, LO10.2,

LO10.3, LO10.4, LO12.1, LO12.2,LO12.3, LO12.4


65

la collection de bactéries du Laboratoire de Biologie des Microorganismes et Biotechnologie

(LBMB) comme indiqué dans la partie matériel et méthodes.

L’isolement des bactéries lactiques se fait à partir de leurs niches écologiques. Ces bactéries

sont utilisées depuis des centaines d’années dans la production d’une variété d’aliments

d’origine végétale fermentés et de produits carnés. Elles sont présentes naturellement dans de

nombreux aliments et sont souvent ajoutées sous formes de cultures starter dans les produits

fermentés largement consommés comme le fromage, le yaourt et le babeurre (Nes et

Johnsborg, 2004; Nes et al., 2006). Elles peuvent être isolées à partir de nombreuses sources,

telles qu’elles, sont largement présentes dans l’environnement et facilement trouvées à la

surfaces de nombreux produits alimentaires crus et sont également trouvées comme

contaminants environnementaux au cours de la transformation des aliments et par conséquent

même sur les aliments transformés (Henning et al., 2015).

L’analyse des produits laitiers retrouvés sur le marché montre que les cultures starters ont été

développées à partir de produits qui ont été à l’origine fermentés spontanément. Ces produits

sont maintenant fabriqués en utilisant des cultures starters caractérisées (Lund et al., 2000).

Généralement les bactéries lactiques importantes dans les fermentations de produits

alimentaires ne comprennent que certaines espèces des genres Lactobacillus, Lactococcus,

Streptococcus, Leuconostoc et Pediococcus (Todar, 2012).

Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à l’étude de bactéries lactiques isolées de

produits locaux. L’un obtenu par transformation de lait cru par procédé traditionnel, il s’agit

du beurre. L’autre est le lait cru qui constitue la matière première des produits dérivés du lait.

Les milieux et conditions d’isolement et de cultures favorisent l’isolement de lactocoques et

d’entérocoques.

3-2 Identification phénotypique des bactéries lactiques

L’identification phénotypique révèle que toutes les bactéries lactiques étudiées sont des

cellules à Gram + sous forme de cocci disposées en paires ou en courte chainettes. Leurs

colonies sont circulaires, bombées et de couleur blanchâtre, d’environ 1 à 2 mm et sont à

catalase négative.

Les 21 souches provenant du milieu de Rothe (milieu sélectif pour les entérocoques) ont été

directement identifiées à l’aide de galerie API 20 Strep (Tableau 12) comme indiqué par

Guiraud et Galzy (1980).


66

Tableau 12 : Identification des bactéries lactiques à l’aide de galerie API 20 Strep

Les résultats de la caractérisation physiologique et l’identification à l’aide de galerie API 20

Strep des 24 autres souches sont regroupés dans le Tableau 13.

Le Tableau 13 indique que les souches sont thermophiles (croissance à 45°C) à l’exception

de deux souches (BRC5 et BRC9). 6 souches sur 24 (BRA7, BRC4, BRC5, BRC7, BRC8, et

BRC9) sont incapables de croître à pH 9,6. 3 isolats sur 24 ne poussent pas en présence de

6,5% de NaCl (BRA2, BRA7 et BRO2) et 6 souches sont thermorésistantes (BRC2, BRC3,

BRC6, BRC10, BRC12 BRO2 et H3). Toutes les souches ne poussent pas en présence de 40

% de bile. Les résultats de l’identification à l’aide de galerie API 20 Strep (Tableaux 12 et

13) indiquent que les 45 souches isolées se répartissent comme suit :

• 13 souches (BRA1, BRA2, BRA3, BRA4, BRA5, BRA6 BRA7, BRA9, BRC4,

BRC7, BRC8, BRC9 et LO3 1) sont identifiées à Lactococcus lactis ssp lactis

(L.lactis)

• 02 souches (BRA8 et BRC5) appartiennent à l’espèce à Lactococcus lactis ssp

cremoris (L. cremoris)

• 08 souches (BRO2, LO4, LO12, H3, LO2.1, LO4.4, LO8.5 et LO12.1) appartiennent à

l’espèce Enterococcus faecium (E. faecium)

• 04 souches (BRC2, BRC3, BRC10 et BRC12) sont identifiées à Enterococcus faecalis

(E. faecalis)

• 01 souche (BRA10) appartient à l’espèce Lactococcus garvieae (L. garvieae)

• 03 souches (BRC6, LO1.5 et LO12.4) appartiennent à l’espèce Enterococcus durans

(E. durans)

• 14 souches (LO2.2, LO2.4, LO3.2, LO3.4, LO4.1, LO6.1, LO6.2, LO7.3, LO7.4,

LO10.2, LO10.3, LO10.4, LO12.2 et LO12.3) appartiennent au genre Enterococcus sp

Code des souches Identification

API 20 Strep

LO1.5, LO12.4 Enterococcus durans

LO2.1, LO4.4, LO8.5, LO12.1 Enterococcus faecium

LO2.2, LO2.4, LO3.2,

LO3.4, LO4.1, LO6.1,

LO6.2, LO7.3, LO7.4,

LO10.2, LO10.3, LO10.4,

LO12.2, LO12.3

Enterococcus sp

LO3.1 Lactococcus lactis ssp lactis


67

Tableau 13 : Identification des bactéries lactiques par caractérisation physiologique et à

l’aide de galeries d’identification API 20 Strep

Caractérisation physiologiques Identification

API 20 Strep

Catalase 45°C pH 9,6 6,5%N

aCl

Thermo-

résistance

40% bile

BRA1 - + + + - - Lactococcus lactis ssp lactis

BRA2 - + + - - - Lactococcus lactis ssp lactis





BRA7 - + - - - - Lactococcus lactis ssp lactis

BRA8 - + + + - - Lactococcus lactis ssp cremoris


BRA10 - + + + - - Lactococcus garvieae

BRC2 - + + + + - Enterococcus faecalis


BRC4 - + - + - - Lactococcus lactis ssp lactis

BRC5 - - - + - - Lactococcus lactis ssp cremoris

BRC6 - + + + + - Enterococcus durans

BRC7 - + - + - - Lacctococcus lactis ssp lactis

BRC8 - + - + - - Lactococcus lactis ssp lactis

BRC9 - - - + - - Lactococcus lactis ssp lactis



BRO2 - + + - + - Enterococcus faecium

LO4 - + + + - - Enterococcus faecium

LO12 - + + + - - Enterococcus faecium

H3 - + + + + - Enterococcus faecium


68

Les souches isolées des laits crus appartiennent au genre Enterococcus sauf la souche LO3.1

qui a été identifiée à L. lactis ssp lactis. Cette souche est atypique puis qu’elle a été isolée à

partir d’un milieu sélectif pour les entérocoques (bouillon de Rothe). Les résultats de

l’identification montrent que le lait cru contient parmi sa flore des souches d’Enterococcus

dont deux espèces ont été identifiées à E. durans (2 souches) et E. faecium (4 souches). Le

profil biochimique des autres souches ne nous a pas permis de déterminer l’espèce des isolats

et ont été identifiées à Enterococcus sp. L’intérêt croissant que connait l’étude de quelques

propriétés des souches d’Enterococcus, nous mena à les isoler à partir du lait cru. Nous avons

considéré que le lait cru est la meilleure source d’isolement. Les genres de bactéries lactiques

les plus communs dans le lait sont Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus et

Enterococcus (Quigley et al., 2013). Enterococcus est le troisième grand genre de bactéries

lactiques après Lactobacillus et Streptococcus (Franz et al., 2011). Le lait cru est l’exemple

de niche écologique contenant une population microbienne complexe et diverse

Dans la littérature les ferments utilisés pour l’obtention du beurre sont L. lactis ssp lactis,

L.lactis ssp cremoris, L. lactis ssp lactis boivar diacetylactis et Leuconostoc mesenteroides.

La composition de la flore bactérienne des 2 échantillons de beurre est différente. La majorité

des isolats du beurre BRA sont L. lactis ssp lactis. Quant à l’espèce L. lactis ssp cremoris et

L. garvieae chacune a été représentée par un isolat. Les isolats du beurre BRC se répartissent

à part égale en 4 isolats d’E. faecalis et 4 isolats de L. lactis ssp lactis. Chacune des deux

espèces L. lactis ssp cremoris et E. durans a été représentée par un isolat. L’identification

phénotypique des isolats révèle que dans le cas des beurres de fabrication traditionnelle la

fermentation est spontanée. Par conséquent la composition du microbiote du beurre dépend du

microbiote du lait cru mais aussi des micro-organismes de l’environnement de production.

L’isolement d’entérocoques à partir du beurre BRC résulte certainement de la présence de ces

bactéries dans le lait cru utilisé pour sa fabrication, ou d’une contamination du lait ou du

beurre par les outils de la traite ou de transport du lait, ou par les ustensiles de préparation du

beurre.

Un aliment de fabrication artisanale de par sa composition bactérienne est complexe.

Cependant l’évolution de populations bactérienne est fonction des interactions entre bactéries.

La présence des entérocoques qui sont considérées comme indicateur de contamination fécale

peut avoir plusieurs origines. De par sa riche composition le lait cru peut contenir une grande

variété d’espèces bactériennes et fongiques. Les microorganismes contaminants peuvent

provenir d’animaux en lactation, de l’environnement de la traite ou de l’alimentation des


69

animaux ou même des humains. Les espèces d’Enterococcus sont omniprésentes, elles sont

retrouvées dans le sol, sur les plantes et en grand nombre dans les produits laitiers où, dans

certains cas, ils prévalent sur les lactobacilles et les lactocoques (Franz et al., 1999). Environ

la moitié des espèces d’Enterococcus ont été décrites relativement récemment (Franz et al.,

2011). L. lactis ssp lactis et L. lactis ssp cremoris, présentes naturellement dans le lait cru,

assurent la fermentation spontanée des produits de fabrication traditionnelle. Elles sont

utilisées dans le processus de fabrication du beurre. Des ferments du genre Lactococcus sont

ajoutés à la crème pour la fermenter. Quant à la souche L. garvieae, c’est une espèce de

lactocoque isolée de produits laitiers issus du lait cru. Cette souche s’est retrouvée dans le

beurre par contamination. Fortina et al. (2003) et Alegria et al. (2009) rapportèrent que cette

espèce est retrouvée dans plusieurs produits laitiers de ferme fabriqués à partir de lait cru.

La présence d’entérocoques dans le lait cru et ses dérivés est appréciée. En effet, ces dernières

années les entérocoques ont fait l’objet de plusieurs études. Cet intérêt croissant est dû à

l’importance des propriétés technologiques et antimicrobiennes des entérocoques. Beaucoup

d’aliments contiennent naturellement un nombre variable d’entérocoques, en particulier les

deux espèces E. faecalis et E. faecium. De faibles concentrations de 101 à 103 entérocoques/g

sont généralement retrouvées dans une grande variété d'aliments, et certaines variétés de

fromages et de saucisses fermentées occasionnellement peuvent contenir plus de 106

entérocoques / g (Hartman et al., 2001).


70

3-3 Potentiel inhibiteur des bactéries lactiques

Nous avons évalué l’activité inhibitrice des bactéries lactiques par la méthode de Fleming et

al. (1975). L’activité inhibitrice des 21 bactéries lactiques isolées du lait cru a été évaluée vis-

à-vis de 4 bactéries indicatrices, Staphylococcus aureus ATCC 25925, Staphylococcus aureus

ATCC 43300, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 et E coli ATCC 25922. Les autres

bactéries lactiques ont été testées pour leurs activités inhibitrices vis-à-vis de 6 bactéries

indicatrices, Staphylococcus aureus HB1, Proteus vulgaris HB10, Proteus mirabilis HB3,

Pseudomonas. sp HB2, E coli EC3 et Enterococcus sp H3. Cette dernière H3 est utilisée

comme indicatrice car elle est sensible à l’activité antibactérienne de plusieurs espèces

bactériennes du souchier du laboratoire LBMB.

L’activité inhibitrice des bactéries se manifeste par l’apparition d’un halo d’inhibition autour

des touches. Un exemple de résultats obtenus est montré dans la Figure 7. Les diamètres des

halos d’inhibitions des bactéries cibles inhibées par les isolats du lait cru sont présentés dans

la Figure 8.

On peut faire les remarques suivantes :

Figure 7: Effet inhibiteur des isolats du beurre vis-à-vis de la souche Enterococcus

faecium H3 selon la méthode de Fleming et al. (1975)

BRA6 BRA2

BRA4

BRA3

BRA11 BRA5

5

BRA7

BRA8

BRA9 BRA10


71

Figure 8: Inhibition des bactéries cibles par les isolats de lait cru

• On observe une activité inhibitrice chez 57% des isolats de lait cru vis-à-vis des 4

bactéries indicatrices testées. 43% des isolats ne présentent pas d’inhibition.

• 86% des interactions sont des inhibitions présentant un diamètre du halo clair compris

entre 2 et 12 mm.

• Nous avons réparti les inhibitions en fonction des diamètres des halos clairs. Les

inhibitions obtenues se répartissent en 32% d’inhibition dont le diamètre du halo clair

est ≤ 3 mm et 54% dont le diamètre d’inhibition est ˃ 3 mm. Selon Simsek et al.

(2006), les inhibitions dont les diamètres sont ˃ 3 mm sont qualifiées d’effet inhibiteur

élevé.

• Les cas d’inhibitions dont les diamètres des halos clairs sont ˃ 3 mm sont les suivants :

- Inhibition de Staphylococcus aureus ATCC 25925 par Enterococcus sp

(LO2.2, LO3.2, LO6.1 et LO12.2) et E. faecium (LO2.1, LO4.4) ainsi que L.

lactis LO3.1,

- Inhibition de Staphylococcus aureus ATCC 43300 par E. durans (LO1.5,

LO12.4) et Enterococcus sp (LO2.4, LO3.2, LO3.4, LO7.3, LO7.4, LO10.2,

LO10.3, LO10.4 et LO12.2)


72

- Inhibition de E. coli ATCC 25922 par E. durans (LO1.5, LO12.4) et E.

faecium (LO2.1, LO4.4) ainsi que Enterococcus sp (LO2.2, LO3.2, LO3.4,

LO6.2, LO12.2 et LO12.3)

- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 a été inhibé par tous les isolats du lait

cru à l’exception des souches Enterococcus sp (LO10.2 et LO10.4) qui ont

présenté des diamètres d’inhibition ≤ 3 mm. Cette bactérie a résisté à l’effet

inhibiteur d’E. faecium LO2.1 et Enterococcus sp LO2.4.

• 90% des isolats inhibent Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Staphylococcus

aureus ATCC 25925 et E coli ATCC 25929 sont inhibés par 86% des isolats et

Staphylococcus aureus ATCC 43300 est inhibé par 81% des isolats.

• E. faecium LO12.1 a inhibé Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 est apparue comme la souche la plus sensible

puisqu’elle a été inhibée par 19 bactéries sur 21 testées avec un diamètre d’inhibition

compris entre 2 et 11 mm.

La Figure 9 regroupe les résultats des inhibitions des bactéries cibles par les souches isolées

du beurre et de la collection du laboratoire.

Les remarques suivantes peuvent être faites :

• 13% des bactéries lactiques testées présentent une activité inhibitrice vis-à-vis des 6

bactéries cibles.

• 42% des interactions sont des inhibitions dont les diamètres des halos clairs varient de

2 à 16 mm. Ces cas d’inhibition se répartissent en 18% d’inhibition avec des diamètres

≤ 3 mm et 24% d’inhibition avec des diamètres ˃ 3 mm.

• Les cas d’inhibition dont les diamètres sont ˃ 3 mm sont les suivants :

-inhibition d’E. coli EC3 par E. faecium LO4

-inhibition de Proteus vulgaris HB10 par L. lactis (BRA3, BRA5, BRA7 et BRA9) et

E. faecium (BRO2, LO4 et LO12)

-inhibition de Proteus mirabilis HB3 par E. faecalis BRC2 et L. lactis BRC4 E.

durans BRC6 et E. faecium (BRO2, LO4 et LO12)

-inhibition de Staphylococcus aureus HB 1 par L. lactis (BRA3, BRA5, BRC4)


73

-inhibition de Pseudomonas aeruginosa HB2 par L. cremoris BRC5 et E. faecalis

BRC12 et E. faecium (BRO2, LO4 et LO12)

-inhibition d’E. faecium H3 par L. lactis (BRA1, BRA2, BRA3, BRA4, BRA6, et

BRA7), L. cremoris BRA8, L. garvieae BRA10 et E. faecium (BRO2, LO4 et LO12).

Figure 9: Inhibition de bactéries cibles par les souches isolées du beurre et de la

collection du laboratoire

• Les fréquences d’inhibition des souches cibles se répartissent comme suit :

- 21% des isolats ont inhibé E. coli EC3,

- 47% des isolats ont inhibé Proteus vulgaris HB10,

- 43% des isolats ont inhibé Proteus mirabilis HB3,

- 52% des isolats ont inhibé Staphylococcus aureus HB1,

- 30% des isolats ont inhibé Pseudomonas sp HB2

- 56% des isolats ont inhibé E. faecium H3.

• Certaines bactéries lactiques inhibent une seule bactérie cible sur les 6 testées, comme

par exemple, E. durans BRC6 et L. lactis ssp lactis BRC8 qui n’inhibent que P.

mirabilis HB3 avec un diamètre d’inhibition respectivement de 4 et 3 mm ou L. lactis

ssp lactis BRC9 qui présente un effet inhibiteur contre E. coli avec un diamètre

d’inhibition de 3 mm ou encore E. faecalis BRC10 qui manifeste une activité

inhibitrice vis-à-vis de P. vulgaris HB10 avec un diamètre d’inhibition de 3 mm .


74

• Nous avons remarqué que 10 bactéries lactiques sur les 23 testées n’ont pas inhibé E.

faecium H3. Cette souche H3 est la souche la plus sensible aux inhibitions car elle a

été inhibée par 56% des isolats. Elle est suivie par Staphylococcus aureus HB1 (52%)

et Proteus vulgaris HB10 (47%).

A l’issue de ce test, nous avons retenu les bactéries lactiques présentant des diamètres

d’inhibition ≥ 10 mm. Il a été rapporté par Cardinal et al. (1997) et Tahiri (2007) que les

isolats générant des diamètres d’inhibition ˃ 10 mm sont considérés comme souches

inhibitrices.

Les souches sélectionnées sont L. lactis BRA1, BRA3, BRA6, BRA7, BRA8 et LO3.1 et

Enterococcus sp LO2.2 LO3.2 et LO12.3 ainsi que E. faecium LO12.1, BRO2 et LO4. Nous

avons également retenu les souches E. durans LO1.5, E. faecium (LO4.4, LO12) et

Enterococcus sp LO12.2. Ces bactéries lactiques ont été retenues pour leur pouvoir inhibiteur

(diamètre d’inhibition ˃ 3 mm) vis-à-vis de plus de 50% des bactéries cibles testées. La

souche L. lactis BRA5 a été choisie car elle inhibe Staphylococcus aureus HB1 et Proteus

vulgaris HB 10 (6 mm). Les autres bactéries lactiques inhibitrices n’ont pas été retenues en

raison de leur faible effet inhibiteur (diamètres des halos clairs ≤ 3 mm).

Au final de cette sélection de souches inhibitrices, nous avons retenu pour la suite de l’étude

17 bactéries lactiques.

Les isolats lactiques des échantillons de beurre et de lait cru ainsi que les souches E. faecium

BRO2, LO4 et LO12 montrèrent que les bactéries lactiques sont douées d’activité inhibitrice

vis-à-vis de bactéries à Gram+ et à Gram-. Le potentiel inhibiteur semble varier d’une souche

à une autre par les diamètres d’inhibition, le nombre et le type de Gram des bactéries cibles

testées. Ces bactéries inhibitrices sont des souches de L lactis ssp lactis, L lactis ssp cremoris,

Ces inhibitions peuvent être dues à une variété de produits inhibiteurs. Huttunen et al.

(1995), rapportèrent que les propriétés antibactériennes des bactéries lactiques dépendent de

plusieurs critères: le pH, le milieu de croissance et la production de substances

antibactériennes comme les bactériocines, les acides organiques, les acides gras et le peroxyde

d'hydrogène.

Les bactéries sélectionnées peuvent être utiles pour inhiber des bactéries telles que

Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris et E. faecium. Ces bactéries lactiques sont douées


75

d’activité inhibitrice dirigée contre des bactéries de même groupe, des bactéries à Gram+

et/ou des bactéries à Gram -.

Le métabolite antibactérien que produisent toutes les bactéries lactiques lors de leur

croissance est l’acide lactique. Ce métabolite modifie le pH du milieu et peut avoir une

influence sur la croissance des bactéries cibles testées. Ces dernières sont des bactéries

pathogènes ou indésirables fréquemment rencontrées dans les aliments tels que

Staphylococcus aureus et E coli. D’après Jay et al. (2005), il a été établi que la plupart des

micro-organismes ont une croissance optimale à pH 7. Il a été démontré que l’action

bactéricide des acides organiques est le résultat d’une diminution du pH dans la cellule

bactérienne. Par exemple, Malicki et al.(2004) observèrent que le pH de la farine de poisson

diminue directement après addition d’acide qui résulte en une réduction de la population d’E.

coli O157 :H7. Les inhibitions des souches de Staphylococcus aureus peuvent aussi être

attribuées à la production d’acide lactique. En effet, il a été confirmé par Hicks et Goepfert

(1968) que l'acide lactique et l'acide acétique produits par les bactéries lactiques participent à

l'inhibition de Staphylococcus aureus. L’acide lactique est capable d’inhiber la croissance de

nombreux types de bactéries d’altération d’aliments, y compris des espèces de bactéries

Gram– des familles des Enterobacteriaceae et Pseudomonaceae (Doores, 1993).

L’action antibactérienne de l'acide lactique est en grande partie, mais pas totalement, attribuée

à la capacité de sa forme non dissociée de pénétrer la membrane cytoplasmique, entraînant

une réduction de pH intracellulaire et la perturbation de la force motrice transmembranaire de

protons (Ray et Sandine, 1992). Alakomi et al. (2000) démontrèrent que l'acide lactique

possède une propriété antimicrobienne grâce à l’abaissement du pH, mais aussi comme un

agent perméabilisant de la membrane externe des bactéries Gram négatif.


76

3-4 Détection de bactéries potentiellement bactériocinogènes

Afin de sélectionner les bactéries bactériocinogènes parmi les 17 souches inhibitrices

sélectionnées précédemment, nous nous sommes inspirés de la méthode de Spelhaug et

Harlander (1989) comme décrit dans Matériel et Méthodes. L’activité inhibitrice a été

révélée après la mise en culture de souches cibles en gélose molle additionnée de tampon au

dessus des cultures des inhibitrices sur gélose tamponnée et en gélose molle sans tampon pour

les cultures sur gélose non tamponnée. Les Figures 10 et 11 illustrent un exemple des

résultats obtenus

Les diamètres d’inhibition des souches cibles ont été mesurés et les résultats sont regroupés

dans les tableaux 14 et 14 suite. Les résultats permettent de faire les observations suivantes :

- les souches L. lactis (sauf LO3.1) n’ont pas présenté d’inhibition vis-à-vis d’E.coli (EC3,

HB4), Pseudomonas HB2, P. aeruginosa HB5, C. freundii EC2 et Staphylococcus sp V3

ainsi que S. aureus ATCC 43300.

-L. lactis LO3.1 a présenté une activité inhibitrice avec un diamètre d’inhibition ˃ 3 mm

vis-à-vis de P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25925, P mirabilis HB3. Ces

inhibitions ont été notées en milieu non tamponné.

-les souches L. lactis (sauf LO3.1) ont inhibé E. faecium H3. Les inhibitions ont été notées

en milieu additionné de tampon et en milieu non tamponné.

-les souches L.lactis ssp lactis, BRA3, BRA5 et BRA7 ont inhibé P. vulgaris HB10 sur

gélose non tamponnée.

-les souches L.lactis BRA3, BRA5, BRA6 et BRA8 ont inhibé S. aureus HB1.

Figure 10: inhibition de E. faecium

H3 par les souches E. faecium

BRO2, LO4 et LO12

Figure 11: inhibition de

Pseudomonas sp par les

souches E. faecium BRO2,

LO4 et LO12


77

-la souche Enterococcus sp LO3.2 a inhibé les 4 souches ATCC testées (P. aeruginosa

ATCC 27853, S. aureus ATCC 25925, S. aureus ATCC 43300 et E. coli ATCC 25925) ainsi

que Staphylococcus sp V3, S. aureus HB1, P. aeruginosa HB5 et P. mirabilis HB3.

-la souche Enterococcus sp LO12.2 a inhibé les 4 souches ATCC testées ainsi qu’E. coli

EC3, Staphylococcus sp V3, S. aureus HB1, P. mirabilis HB3 et P. vulgaris HB3.

Tableau 14 : Inhibitions par les bactéries lactiques

SID

SIN

E.coli ATCC

25922

P. aeruginosa

ATCC 27853

S. aureus

ATCC 25925

S. aureus

ATCC 43300

E.coli EC3 C.freundii

EC2

Staphylococcus

sp V3

NTP TP NTP TP NTP TP NTP TP NTP TP NTP TP NTP TP

LO1.5 5 0 6 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0

LO2.2 2 0 4 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0

LO3.1 2 0 7 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0

LO3.2 5 0 8 0 8 0 2 0 6 0 0 0 6 0

LO4.4 5 0 5 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0

LO12.1 0 0 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

LO12.2 6 0 4 0 4 0 4 0 2 0 0 0 2 0

LO12.3 4 0 5 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0

BRA1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

BRA3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

BRA5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

BRA6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

BRA7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

BRA8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

BRO2 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 2 0 2 0

LO4 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 2 0 5 0

LO12 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 5 0 8 0

NTP : non tamponné TP : tamponné

SID : souches indicatrices ; SIN: souches inhibitrices

(le diamètre de la zone d’inhibition est exprimée en mm)

- E. durans LO1.5 et Enterococcus sp LO12.3 ont inhibé les souches P. aeruginosa ATCC

27853, S. aureus ATCC 43300 et E. coli ATCC 25925 ainsi que P. mirabilis HB3. E. durans

LO1.5 a également inhibé P. vulgaris HB3.

- les souches E. faecium LO2.2 et LO4.4 ont inhibé P. aeruginosa ATCC 27853, S.

aureus ATCC 25925. La souche LO4.4 a aussi inhibé P. mirabilis HB3 et P. aeruginosa

HB5.


78

Tableau 14 suite : Inhibitions par les bactéries lactiques

SID

SIN

E.faecium H3 E. coli HB4 P. mirabilis

HB3

P. vulgaris

HB10

P. aeruginosa

HB5

Pseudomonas

sp HB2

S. aureus HB1

NTP TP NTP TP NTP TP NTP TP NTP TP NTP TP NTP TP

LO1.5 0 0 0 0 6 0 2 0 0 0 0 0 0 0

LO2.2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

LO3.1 0 0 0 0 4 0 0 0 2 0 0 0 0 0

LO3.2 0 0 0 0 4 0 0 0 4 0 0 0 6 0

LO4.4 0 0 0 0 2 0 0 0 4 0 0 0 0 0

LO12.1 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0

LO12.2 0 0 0 0 4 0 4 0 0 0 0 0 2 0

LO12.3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0

BRA1 6 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

BRA3 6 16 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 4 0

BRA5 8 10 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 4 0

BRA6 7 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0

BRA7 8 3 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0

BRA8 8 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0

BRO2 14 12 0 0 11 13 0 0 0 0 14 12 0 0

LO4 13 15 0 0 9 12 0 0 0 0 11 14 0 0

LO12 8 6 2 3 8 9 0 0 7 9 18 9 0 0

NTP : non tamponné TP : tamponné

SID : souches indicatrices ; SIN: souches inhibitrices

(le diamètre de la zone d’inhibition est exprimée en mm)

Les tests de l’activité inhibitrice des lactocoques vis-à-vis de toutes les bactéries cibles

montrent 35% d’interactions vis-à-vis de bactéries à Gram positif et 65% d’interactions vis-à-

vis de bactéries à Gram négatif.

Les inhibitions représentent 18% des interactions totales dont 12% sont des inhibitions vis-à-

vis des Gram+ et 6% sont des inhibitions vis-à-vis des Gram- (Figure 12). Nous n’avons pas

observé d’activité inhibitrice des cultures de L. lactis sur gélose tamponnée. Les inhibitions se

répartissent en 3% d’inhibition dont le diamètre ≤ 3 mm et 15% ˃ 3 mm. Aucune inhibition

de diamètre ≥ 10 mm n’a été observée. 6% des inhibitions sont obtenues sur gélose

tamponnée.


79

Figure 12 : Interactions des souches de L. lactis ssp lactis vis-à-vis des bactéries cibles

Les tests de l’activité inhibitrice des souches d’Enterococcus vis-à-vis des Gram- et des

Gram+ représentent respectivement 65% et 35% des interactions.

Les inhibitions représentent 41 % des interactions totales dont 14% vis-à-vis des Gram+ et

27% vis-à-vis des Gram- (Figure 13). 10% sont des inhibitions de diamètres ≤ 3 mm et 27%

des inhibitions ont un diamètre ˃ 3 mm. Les inhibitions dont les diamètres sont ≥ 10 mm

représentent 4%. Les inhibitions en milieu tamponné représentent 18% des inhibitions.

Figure 13 : Interaction des souches d’Enterococcus vis-à-vis des bactéries cibles


80

Nous avons observé que parmi les souches de L. lactis, 3 souches ont présenté un effet

inhibiteur vis-à-vis d’une bactérie à Gram – (P. vulgaris HB10), 4 souches vis-à-vis d’une

bactérie à Gram+ (S. aureus HB1), une souche vis-à-vis de 2 bactéries à Gram- (P.

aeruginosa ATCC 27853, P. mirabilis HB3) et une bactérie à Gram+ (S. aureus ATCC

25925). Les inhibitions par les bactéries d’Enterococcus isolées du lait LO n’ont été

enregistrées que sur milieu non tamponné. L’absence d’inhibition par les bactéries étudiées L.

lactis ssp lactis et Enterococcus en milieu tamponné suggère que ces inhibitions sont dues à

l’effet de la variation du pH du milieu en conséquence de la production de l’acide lactique par

ces bactéries. L’abaissement du pH du milieu de culture peut être à l’origine de l’inhibition de

bactéries testées P. aeruginosa ATCC 27853, S. aureus ATCC 25925, P mirabilis HB3, P.

vulgaris HB10, S. aureus HB1, S. aureus ATCC 43300 et E. coli ATCC 25925

Staphylococcus sp V3, P. aeruginosa HB5 et E. coli EC3, et P. vulgaris HB10.

Les trois souches E. faecium BRO2, E. faecium LO4, E. faecium LO12 sont capables

d’inhiber le développement de Pseudomonas sp HB2, Proteus mirabilis HB3 et E. faecium

H3. La souche E. coli HB4 et Pseudomonas aeruginosa HB5 n’ont été inhibées que par la

souche LO12. Ces inhibitions sont obtenues en milieu tamponné. Ce dernier permet

d’éliminer l’effet de l’acidité en maintenant le pH du milieu à 7. Le tampon phosphate de

sodium assure la neutralisation de l’effet de l’acidité provoqué par les acides organiques

produits par les bactéries lactiques (Mandal et al., 2008). L’activité obtenue en milieu

tamponné confirme que l’inhibition des souches testées résulte d’une substance autre que

l’acide lactique. De Vuyst et Vandamme (1994) rapportèrent que les bactéries lactiques sont

capables de produire et excréter des substances inhibitrices autres que l’acide lactique ou

l’acide acétique. Selon Klaenhammer (1988), les bactéries lactiques inhibent par d’autres

métabolites tels que les bactériocines

Les souches E. faecium BRO2, LO4 et LO12 présentent une activité antibactérienne plus

efficace que les autres entérocoques et lactocoques étudiés. Elles inhibent 2 bactéries à Gram-

en gélose tamponnée. Nous pouvons conclure que ces bactéries sont bactériocinogènes. Selon

Graver et Muriana (1993), la confirmation de la production de bactériocines par la méthode

des touches sur gélose est réalisée avec et sans β glycérophosphate pour permettre de

discerner les inhibitions par l’acide des inhibitions par les bactériocines.

L’inhibition de bactéries à Gram négatif a été rarement rapportée. Certaines études antérieures

rapportèrent que l’activité de bactériocines produites par E. faecium est observée contre

P.aeruginosa (De Kwaadsteniet et al., 2005; Line et al., 2008; Gaaloul et al., 2015), et


81

Proteus mirabilis (Line et al., 2008). En revanche Khay et al (2011), rapportèrent qu’aucune

activité n'a été observée pour E. faecium R111 vis-à-vis de P. aeruginosa , Proteus vulgaris

ou E. coli. L'absence de sensibilité enregistrée pour les souches testées de Staphylococcus et

E. coli peut être expliquée par la variation naturelle de la sensibilité et de la capacité à

développer une résistance aux bactériocines (Nascimento et al., 2010).

Les souches L. lactis BRA1, BRA3, BRA5, BRA6, BRA7 et BRA8 ainsi que les souches E

faecium BRO2, LO4, LO12 ont montré une activité inhibitrice sur gélose non tamponnée et

sur gélose tamponnée vis-à-vis d’E. faecium H3. Selon De Vuyst et Vandamme (1994), les

bactériocines sont des protéines antimicrobiennes ou oligopeptides, affichant un spectre

d’activité plus étroit que les antibiotiques ; elles sont principalement actives contre des

souches bactériennes étroitement liées taxonomiquement à la bactérie productrice qui est

habituellement immunisé à sa propre bactériocine.

A l’issue de ces résultats, nous avons sélectionné les souches E. faecium BRO2, LO4 et LO2

pour leur potentiel bactériocinogène vis-à-vis d’E. faecium H3 et deux agents pathogènes

humains à Gram négatif. Elles se sont avérées les plus efficaces et ont été sélectionnées pour

la suite de l’étude. La souche E. faecium H3 est plus sensible que les autres bactéries tests,

cette bactérie a été sélectionnée comme souche indicatrice.


82

3-5 Caractérisation moléculaire des bactéries

Afin de confirmer l’identité des souches sélectionnées (E. faecium BRO2, LO4 et LO12 et

H3) pour leur activité inhibitrice vis-à-vis de Pseudomonas sp HB2, Proteus mirabilis HB3 et

E. faecium H3, nous les avons identifiées à l’échelle moléculaire. Cette identification a été

réalisée à l’aide d’une paire d’amorces spécifiques utilisées par Deasy et al (2000) pour

différencier entre les deux genres Enterococcus et Lactococcus. Une partie du gène codant

pour l’ARNr 16S a été amplifiée et séquencée pour les 3 souches Enterococcus faecium

BRO2, LO4, LO12. Les séquences ont été comparées à des séquences de souches connues

d’Enterococcus faecium.

3-5-1 Amplification de l’ADN des entérocoques

Les 4 souches E. faecium BRO2, LO4, LO12 et H3 ont fait l’objet d’extraction d’ADN pour

amplification PCR d’une partie du gène codant pour l’ARNr 16S spécifique aux

entérocoques. Nous avons également utilisé des amorces universelles. Les produits

d’amplification des 4 souches ont été analysés par l’électrophorèse sur gel d’agarose à 1%

(Figure 14). Les résultats obtenus montrent que chacune des 4 souches a présenté une bande

de même intensité. Ces bandes correspondent à des fragments d’ADN de 733 pb obtenus par

amplification à l’aide d’amorces spécifiques E1/E2. Les échantillons amplifiés en utilisant les

amorces universelles U1/U2 ont présenté des fragments de taille de 1000 pb. La taille des

fragments de 733 pb confirme que les 4 souches sont du genre Enterococcus telle que décrit

par Deasy et al (2000).


83

Figure 14 :Gel d’électrophorèse des produits PCR. M: marqueur de taille 1000 bp; Lignes

1 à 4: produits de l’amplification par PCR avec des amorces spécifiques aux entérocoques

E1/E2: Ligne 1: BRO2; Ligne 2: LO12; Ligne 3: LO4; Ligne 4: H3; Lignes 5 à 6: produits

d’amplification par PCR avec des amorces universelles U1/U2: Ligne 5: LO12; Ligne 6:

BRO2.

3-5-2 Analyse phylogénétique

Les souches BRO2, LO4 et LO12 ont été caractérisées à l’échelle génotypique par

séquençage de fragments d’ADN après amplification PCR d’une partie du gène 16S rRNA

pour determiner l’espèce d’Enterococcus. Les séquences en nucléotides obtenues ont été

analysées à l’aide du programme Blast du NCBI. Ce programme qui effectue un alignement

local entre séquences nucléiques, nous a permis de rechercher des similarités entre les

séquences des souches bactériennes étudiées et des séquences d’Enterococcus d’une base de

données. La séquence en nucléotides de chaque souche a été comparée aux séquences

nucléotidiques du gène 16S rRNA des espèces connues du genre Enterococcus sur la base de

données GenBank. Nous avons délimité la zone à aligner de 632 à 1369 et utilisé le

programme MEGABLAST. Les résultats obtenus ont montré que les 3 souches sont à 99%

similaires aux souches de références E. faecium.

5 6 4 2 1 M 3

1000 pb 700 pb


84

Un exemple des résultats générés est donné en (Figures 15, 16, 17) montrant que les

séquences des souches BRO2, LO4 et LO12 sont à 99% similaires à la souche E. faecium

JCM 5804. Comme le montrent ces figures, les résultats de l’alignement sont associés à des

grandeurs propres à chaque alignement. Parmi ces grandeurs nous avons noté la « E-value »

qui est égale à 0. Un nombre proche de zéro signifie que la vraisemblance est significative et

n’est pas due au hasard. Cette analyse confirme l’identification phénotypique. Les 3 souches

étudiées appartiennent à E. faecium.

Figure 15 : Alignement de la séquence partielle de l’ARN 16S de la souche BRO2 sur la

séquence de l’ARN 16S de la souche de référence d’E. faecium JCM 5804


85

Figure 16 : Alignement de la séquence partielle de l’ARN 16S de la souche LO4 sur la



86

Figure 17 : Alignement de la séquence partielle de l’ARN 16S de la souche LO12 sur la


Les séquences des 3 souches E.faecium BRO2, LO4 et LO12 et les séquences de 12 souches

de références présentant une similarité ont été utilisées pour construire l’arbre phylogénétique.

L’alignement de ces séquences a été réalisé par le logiciel Clustal X2.1 pour construire un

arbre phylogénétique (répété 100 fois) par la méthode du Neighbor Joining. L’arbre

phylogénétique obtenu représente les relations phylogénétiques entre les séquences

nucléotidiques des souches étudiées et les séquences de 12 souches de références.


87

L’analyse de l’arbre (Figure 18) montre que les souches LO4 et LO12 sont liées ou

apparentées avec une valeur de bootstrap de 56%, indiquant que le sous arbre (LO4, LO12)

est retrouvé dans 56% des arbres produits à partir de l’alignement. Quant à la souche BRO2,

elle est étroitement proche du cluster LO4 et LO12 (100% bootstrap).

Néanmoins les 3 souches forment un cluster, qui est étroitement relié (100% bootstrap) au

cluster comprenant E. faecium JCM 5804 et E. faecium NRRL B 2354.

Figure 18: Arbre phylogénétique construit par la méthode Neighbor-joining utilisant des

séquences 16SrRNA des souches (LO4, LO12 et BRO2) et des séquences 16SrRNA de 12

souches d’espèces connues d’Enterococcus. L’arbre a été répété 100 fois.

Lors de l’isolement, la caractérisation phénotypique a révélé que les souches isolées

appartiennent à deux genres Enterococcus et Lactococcus. Ces deux genres jouent un rôle

significatif dans les procédés d’obtention de fromage et autre aliments fermentés (Deasy et

al., 2000). Le rôle important que jouent ces bactéries en industrie pour transformer les

matières crus en aliments, encourage la recherche de nouvelles souches. La matière première

telle que le lait cru ou les aliments de transformation traditionnelle sont les meilleures sources

pour isoler des souches probablement nouvelles.

Souvent les caractères physiologiques utilisés dans l’identification classique pour différencier

entre Enterococcus et Lactococcus prêtent à confusion entre les deux genres. Par exemple des

isolats peuvent être identifiés sans qu’ils soient conformes aux critères classiques


88

d’identification. Des entérocoques sensibles au sel et/ou à la température ont été identifiés

(Collins et al., 1984)

Dans le cas des souches étudiées, la souche BRO2 ne pousse pas à 6,5% de NaCl et les

souches LO4 et LO12 ne sont pas thermorésistantes. Pour confirmer l’identification

phénotypique et déterminer si les souches étudiées sont de nouvelles souches, une

identification génotypique s’impose. Pour une identification plus fiable et reproductible, il est

nécessaire d’appliquer des méthodes génotypiques (Schleifer et Kilpper-Balz, 1987).

Parmi les nombreux gènes cibles décrits dans la littérature pour identifier les espèces

d’Enterococcus, nous avons choisi une partie du gène 16S rRNA spécifique au genre

Enterococcus (Deasy et al., 2000). Le choix a été fait dans le but de confirmer l’identification

et de déterminer le degré de similarité des souches étudiées avec des souches E. faecium de

références. Les amorces spécifiques du genre Enterococcus utilisées ont permis à Deasy et al.

(2000) d’identifier 18 types de souches de 18 espèces d’Enterococcus y compris le type de

souche d’E. solitarius. Jackson et al (2004) ont également utilisé ces amorces pour

développer une PCR multiplexe identifiant les entérocoques en couplant les amorces

spécifiques au genre à des amorces sod A. Ce dernier est utilisé pour distinguer les genres et

espèces de mycobactéries, streptocoques, staphylocoques et entérocoques (Poyart et al.,

2001). Jackson et al (2004) ont démontré que les amorces spécifiques au genre Enterococcus

sont négatives (non spécifiques) pour les autres genres bactériens.

Les amorces utilisées délimitent une partie des gènes 16S rRNA (632 à 1369) qui correspond

aux régions variables V4, V5, V6, V7 et V8. Ces régions sont associées aux plus courtes

distances géodésiques et peuvent être le meilleur choix pour l’analyse phylogénique et

l’analyse phylogénétique de nouvelles bactéries (Lutzonilab

(http://lutzonilab.org/16s-ribosomal-dna/), Yang et al., 2016).

Les souches étudiées ne sont pas de nouvelles souches. Le degré de similarité aux souches de

références est de 99%. Au niveau phylogénétique nos souches sont liées à la souche E.

faecium NRRL B- 2 354 et E. faecium JCM 5804. La dernière souche produit trois différents

types de bactériocines, enterocine A, enterocine B et enterocine P (Park et al., 2003) .

La souche E. faecium NRRL B- 2 354 connue aussi en tant que NCIB 2699 produit une

bactériocine active contre L. monocytogenes (McKay, 1990 ; Giraffa, 1995;) montrant ainsi

le potentiel pour une utilisation ultérieure de l’organisme dans la fabrication d’aliments sains

Kornacki (2012).

http://lutzonilab.org/16s-ribosomal-dna/


89

3-6 Caractérisation de la nature biochimique des métabolites antibactériens

L’objectif de cette étape de l’étude est de caractériser les agents inhibiteurs produits par E.

faecium BRO2, LO4 et LO12 responsables de l’activité antibactérienne. Afin d’atteindre cet

objectif, il est indispensable de mettre en évidence cette activité dans le surnageant de culture.

L’étude de l’effet des enzymes, de la chaleur et des variations de pH sur l’activité des agents

inhibiteur nous permettra d’identifier leur nature biochimique.

3-6-1 Mise en évidence de l’activité inhibitrice dans le surnageant de culture

La première étape de la caractérisation a été de mettre en évidence l’activité inhibitrice dans le

surnageant de culture en milieu tamponné (phosphate de sodium Na/Na2 0,1 M; pH 7,2) et en

milieu non tamponné. Les surnageants de culture filtrés ont été testés vis-à-vis de toutes les

bactéries cibles utilisées dans cette étude à l’exception des souches de la collection ATCC

puisqu’elles ont été résistantes aux tests d’inhibition précédents. Le but de l’utilisation du

M17 sans tampon et du M17 additionné de tampon est de distinguer entre l’activité inhibitrice

due à l’effet de l’acidité et l’activité inhibitrice qui peut être due à d’autres métabolites

antibactériens.

L’activité inhibitrice s’est manifestée par la formation de zones claires autour des puits. Ces

zones correspondent à l’inhibition de la croissance de la souche sensible. L’activité a été

estimée en mesurant le diamètre de la zone d’inhibition formée autour des puits. Les résultats

obtenus sont regroupés dans le Tableau 15.


90

Tableau 15 : Diamètres des zones d’inhibition des bactéries-tests par les souches d’E

faecium

Surnageant de culture des souches inhibitrices E faecium

BRO2 LO4 LO12

Souches cibles STP TP STP TP STP TP

Citrobacter freundii EC2 0 0 0 0 0 0

Enterococcus faecium H3 4 7 4 7 3 10

E coli EC3 0 0 0 0 0 0

E coli HB4 0 0 0 0 0 0

Proteus mirabilis HB3 0 0 0 0 0 0

Proteus vulgaris HB10 0 0 0 0 0 0

Pseudomonas aeruginosa HB5 0 0 0 0 0 0

Pseudomonas sp HB2 0 0 0 0 0 0

Staphylococcus sp V3 0 0 0 0 0 0

Staphylococcus aureus HB1 0 0 0 0 0 0

STP : Bouillon sans tampon ; TP : Bouillon additionné de tampon

Les résultats obtenus montrent que les souches E. faecium BRO2, LO4 et LO12 ont inhibé E.

faecium H3 en milieu M17 non tamponné et M17 tamponné. Les autres bactéries cibles

testées (Citrobacter freundi EC2, E coli EC 3, E coli HB4, Proteus mirabilis HB3, Proteus

vulgaris HB10, Ps sp HB2, Ps aeruginosa HB5, Staphylococcus sp V3 et Staphylococcus

aureus HB1) n’ont pas été inhibées dans les 2 conditions de milieux (tamponné et non

tamponné).

L’inhibition d’E. faecium H3 a été maintenue à pH 7 (milieu tamponné) suggérant que les

bactéries E. faecium BRO2, LO4 et LO12 produisent des métabolites antibactériens autres

que l’acide lactique. Ces résultats révèlent que l’inhibition est due à des substances

extracellulaires qui diffusent à travers la gélose molle. Le potentiel bactériocinogène des

souches est confirmé par le surnageant de culture active à pH 7 contre E. faecium H3.


91

Les résultats obtenus ne confirment pas les résultats de la mise en évidence du potentiel

inhibiteur sur milieux gélosés. Suite à ces observations, nous supposons que les métabolites

antibactériens sont moins concentrés dans le cas de culture liquide que dans le cas de culture

sur gélose. Un résultat similaire a été rapporté par Nilsen et al (2003) qui ont observé que

l’activité antimicrobienne d’E. faecalis LMG 2333 n’été initialement détectée que sur milieu

solide. Ce qui mena ces auteurs à déterminer les conditions optimales de production de

bactériocines pour obtenir des quantités suffisantes.

Afin de vérifier cette hypothèse, les surnageants de culture ont fait l’objet d’une concentration

par lyophilisation. Les extraits concentrés (EC) ont été testés sous forme d’une préparation de

200 mg/ml (lyophilisat dissout dans du tampon phosphate de sodium (pH 7,2, 0,01M) vis-à-

vis de Citrobacter freundi EC2, E coli EC 3, E coli HB4, Pr mirabilis HB3, Ps sp HB2, E

faecium H3 et Staphylococcus sp V3. Les extraits ont également été testés en appliquant

directement le lyophilisat (200 mg) sur gélose molle. Les résultats obtenus sont regroupés en

Tableau 16.

Tableau 16 : Diamètre d’inhibition de bactéries cibles par les extraits concentrés (EC)

par lyophilisation

EC des surnageants de culture

d’E. faecium (200 mg/ml)

EC

des surnageants E. faecium 200

mg

BRO2 LO4 LO12 BRO2 LO4 LO12

Citrobacter freundii EC2 0 0 0 0 0 0

Enterococcus faecium H3 20 24 20 35 32 32

E coli EC3 0 0 0

10 0 8

E coli HB4

0

0 0

0 0 10

Proteus mirabilis HB3 0 0 0

15 10 10

Proteus vulgaris HB10 0 0 0 0 0 0

Pseudomonas aeruginosa HB5

0 0 0 0 0 10

Pseudomonas sp HB2 0 0 0 20 15 08

Staphylococcus sp V3 0 0 0

0 0 0

Staphylococcus aureus HB1 0 0 0 0 0 0

EC : extrait concentré par lyophilisation


92

Les extraits concentrés à partir des surnageants de culture des 3 souches E faecium BRO2,

LO4 et LO12 testés sous forme de solution (200 mg/ml) ont présenté une activité inhibitrice

vis-à-vis d’E faecium H3. Les autres bactéries cibles n’ont pas été affectées par le potentiel

inhibiteur des bactéries bactériocinogènes.

La sensibilité de la souche E. faecium H3 peut être expliquée par l’étroite relation

phylogénétique entre souches bactériocinogènes et la souche cible E faecium H3. En général,

les bactériocines sont censées présenter une activité antagoniste contre les bactéries

étroitement liées génétiquement à la souche productrice ; cependant, quelques exceptions avec

une activité à large spectre ont été décrits (Line et al., 2008).

Les extraits concentrés par lyophilisation n’ont pas inhibé Citrobacter freundi EC2, E coli

HB4, Proteus mirabilis HB3, Proteus vulgaris HB10, Pseudomonas aeruginosa HB5,

Pseudomonas spHB2, E coli EC 3, E coli HB4, et Staphylococcus sp V3. Par contre lorsque

nous avons testé les lyophilisats (200 mg) par dépôt direct sur la gélose molle inoculée, nous

avons observé une inhibition de E faecium H3, Proteus mirabilis HB3, Pseudomonas sp HB2.

Ces résultats confirment les résultats de la mise en évidence de l’activité antibactérienne sur

gélose. Les souches Proteus mirabilis HB3, Pseudomonas sp HB2 sont sensibles à la

concentration des métabolites antibactériens. Cette observation est aussi valable pour la

souche E coli EC3 qui est sensible aux lyophilisats des agents antibactériens BRO2 et LO12

et P aeruginosa HB5 au lyophilisat LO12.

Les bactéries cibles Staphylococcus sp V3, S. aureus HB1 n’ont été inhibées par aucun des

lyophilisats. La résistance de souches de staphylocoques à l’effet inhibiteur d’E. faecium a

également été rapportée par Tulini et al (2011). Ces auteurs ont observé qu’E. faecium 130 a

inhibé L. monocytogenes et autres bactéries Gram positive, mais pas la souche Staphylococcus

aureus ATCC 29213. Par contre Ghrairi et al (2008) montrèrent que la bactériocine produite

par E. faecium MMT21 inhibe non pas uniquement des bactéries étroitement apparentées aux

bactéries lactiques, mais aussi L. monocytogenes et S. aureus.

Les bactéries cibles Citrobacter freundii EC2 et Proteus vulgaris HB10 n’ont été inhibées par

aucun des lyophilisats. L’inhibition de bactéries Gram négatif a été rarement rapportée.

Ohmomo et al (2000) ont purifié l’entérocine ON 157 produite par E. faecium NIAI 157 qui

inhibe fortement Listeria monocytogenes, mais n’inhibe pas des espèces bactériennes Gram

négatif. Pinto et al (2009) n’ont observé aucune activité contre des bactéries à Gram négatif

(Salmonella typhimurium, Sl enteritidis, Salmonella spp, E.coli, Pseudomonas aeruginosa).


93

Renye et al (2009) rapportèrent que des isolats bactériocinogènes de fromage au lait cru sont

actives contre L. innocua et L. monocytogenes Scott. Aucun des isolats d’entérocoques n’ont

une activité contre d’autres pathogènes potentiels y compris E. coli O157 :H7, Enterobacter

sakazakii, P. fluorescens, S. sonnei, S. infantis et S. epidermidis. Gupta et al (2010)

rapportèrent aussi qu’une souche bactériocinogène d’E. faecium FH 99 ne montre pas

d’activité inhibitrice contre des bactéries Gram négatives (c'est-à-dire E. coli, Shigella sp.,

Salmonella enteridis). Cependant Ramakrishnan et al (2012) rapportèrent que la souche E.

faecium EF-63 a été active contre E. coli MTCC118,

Ainsi à l’issue de ces résultats, nous pouvons conclure que la sensibilité des bactéries cibles

Proteus mirabilis HB3, Pseudomonas sp HB2, E coli EC3, P aeruginosa HB5 dépend de la

concentration des agents inhibiteurs. Parmi les bactéries cibles, nous avons choisi comme

souche indicatrice E faecium H3. Elle est la plus sensible à l’activité inhibitrice des 3 agents

inhibiteurs BRO2, LO4 et LO12 quelle que soit la méthode de mise en évidence de l’activité

inhibitrice. Cette bactérie a été choisie comme souche indicatrice.

3-6-2 Sensibilité aux enzymes

Afin de déterminer la nature biochimique des agents inhibiteurs, les extraits concentrés de

chacune des souches inhibitrices E faecium BRO2, LO4 et LO12 ont été traités par la catalase

et quelques enzymes protéolytiques (α Chymotrypsine, Trypsine, Pronase E, Protéinase K et

Pepsine). L’activité inhibitrice résiduelle a été mise en évidence par la méthode des puits.


94

Les résultats obtenus sont regroupés dans le Tableau 17 et un exemple est donné en Figure

19.

Tableau 17: Effet des enzymes sur l’activité inhibitrice

Diamètres des zones d’inhibition d’ E faecium H3 (mm)

Enzymes BRO2 LO4 LO12

Catalase 10 10 13

α Chymotrypsine 0 0 0

Trypsine 0 0 0

Pronase E 0 0 0

Protéinase K 0 0 0

Pepsine 10 9 11

Figure 19 : Effet des enzymes sur le surnageant de culture d’ E faecium LO12.

1: α-Chymotrypsine; 2: catalase; 3: surnageant native; 4: trypsine;

5: Pronase E; 6: pepsine; 7: proteinase K.

Les extraits concentrés produits par E faecium BRO2, LO4 et LO12 ont été sensibles à toutes

les enzymes protéolytiques testées à l’exception de la pepsine. L’activité inhibitrice a été

maintenue après traitement avec la catalase, permettant d’exclure l’inhibition par le peroxyde

d’hydrogène. Ces résultats suggèrent que l’activité inhibitrice des souches E faecium BRO2,

LO4 et LO12 est due à des substances de nature protéique. La sensibilité aux enzymes

protéolytiques met en évidence le caractère protéique des bactériocines (De Martinis et al.,

LO12

1

4

3 2

5 6

7


95

2003). Cette sensibilité des extraits concentrés aux enzymes protéolytique confirme que les

souches E. faecium BRO2, LO4 et LO12 sont bactériocinogènes.

Des résultats similaires ont été rapportés pour les entérocines. L’activité inhibitrice de la

bactériocine produite par E. faecium JCM 5804 T a été éliminée complètement par traitement

avec la protéinase K, trypsine, α-chymotrypsine, et papaïne (Park et al., 2003).

L’entérocine ON 157 produite par E. faecium NIAI a été complètement inhibée par les

enzymes protéolytiques (Ohmomo et al., 2000). La substance antimicrobienne produite par E.

faecium FH 99 n’a pas été sensible à la catalase, amylase, lipase, tandis qu’elle a été

complètement inactivée par les enzymes protéolytiques (protéinase K, pepsine, papaïne,

trypsine, pronase-E, ficine, protéase XIII, chymotrypsine et protéase I (Gupta et al., 2010).

L’activité antibactérienne observée chez les souches E. faecium (H41B, H41D, H41K,

H51Ca, H51Cb) et E. durans (H51Cc) a été inactivée par la pepsine, trypsine, pronase,

protéinase K, et α-chymotrypsine (Renye et al., 2009)

3-6-3 Traitement par la chaleur

Afin de caractériser les agents inhibiteurs, les extraits concentrés ont été traités à 60°C, 80°C,

100°C et à 121°C. L’activité antibactérienne résiduelle exprimée en UA/ml a été notée pour

chaque traitement. Les résultats obtenus représentés en Figure 20 montrent que les agents

antibactériens des souches BRO2, LO4 et LO12 résistent aux traitements thermiques.

Nous avons observé que le titre de l’activité antibactérienne varie d’un traitement à un autre.

L’agent antibactérien de la souche E faecium LO4 est plus stable au traitement thermique par

rapport aux autres agents antibactériens des souches E faecium BRO2 et LO12. L’activité

antibactérienne d’ E faecium LO4 vis à vis d’E. faecium H3 a été maintenue stable après un

traitement thermique à 60°C (pendant 30 et 60 minutes) et à 100°C pendant 30 minutes.

Quant à l’activité antibactérienne des agents BRO2 et LO12, elle n’a été maintenue stable

qu’à 60°C pendant 30 minutes. Cependant cette activité a diminuée de moitié après un

traitement de 60°C pendant 60 min et 100°C (pendant 30 et 60 min). Nous avons noté une

faible activité antibactérienne après un traitement à 121°C pendant 20 min pour les trois

agents antibactériens.


96

Figure 20 : Activité inhibitrice résiduelle des substances des souches E feacium BRO2,

LO4 et LO12 vis-à-vis d’ E faecium H3.

La sensibilité des substances antibactériennes aux enzymes protéolytiques et leur résistance à

la chaleur, nous permettent de confirmer que ces substances sont des bactériocines. Les agents

antibactériens issus d’E. faecium BRO2, LO4, LO12 sont nommés respectivement entérocine

BRO2, entérocine LO4 et entérocine LO12.

0

2000

4000

6000

Contrôle 60 100 121

Act

ivit

é in

hib

itri

ce

rési

du

elle

(A

U/m

l)

Température (°C)

30 min

60 min

20 min

En faecium LO4

0

200

400

600

800


Aa

ctiv

ité

in

hib

itri

ce

rési

du

ell

e (

UA

/ml)

Température °C

30 min

60 min

20 min

En faecium LO12

0

2000

4000

6000


Act

ivit

é in

hib

itri

ce

rési

du

elle

(A

U/m

l)

Température (°C)

30 min

60 min

20 min

En faecium BRO2


97

La résistance des bactériocines à la chaleur a été rapportée par plusieurs auteurs. Par exemple,

Cintas et al (1997) ont étudié l’activité antibactérienne du surnageant d’E. faecium P13 dont

la résistance à la chaleur été observée à 100°C pendant 60 min ou à 121°C pendant 15 min. Il

a été également rapporté que l’entérocine de la souche E. faecium EF-63 maintenait son

activité même après un traitement à la chaleur (100°C, 15 min et 121°C, 20 min), indiquant

qu’elle est thermostable (Ramakrishnan et al., 2012). Lee et Kim (2010) ont observé que

l’activité antimicrobienne de l’entérocine DB1 n’a pas été affectée par la température à 60,

80, et 100°C pendant 15 et 30 min, et l’activité été même détectée après autoclavage.

Dans le cas des entérocines étudiées (BRO2, LO4 et LO12), nous avons observé que leur

stabilité à la chaleur est relative puisque leur activité antibactérienne été maintenue même à

100°C pendant 60 min, et à 121°C pendant 15 min avec une diminution de l’activité. Des

résultats qui se rapprochent des nôtres ont été rapportés dans le cas de l’entérocine d’E.

faecium JCM 5804 T (Park et al, 2003). L’activité inhibitrice était relativement stable contre

la chaleur, l’activité était perdue quand l’entérocine est incubée à 100°C pendant 60 min, et à

121°C pendant 15 min ((Park et al, 2003).

3-6-4 Effet de différents pH

Pour compléter la caractérisation, l’activité inhibitrice des souches E faecium BRO2, LO4 et

LO12 a été dosée après traitement à différents pH. Les résultats obtenus regroupés dans la

Figure 21 montrent que l’activité antibactérienne des 3 souches a été maintenue pour les

différents pH. L’activité antibactérienne de la souche E. faecium BRO2 est maximale à pH 7

(20480 AU/ml). Elle est instable puisqu’elle diminue pour des pH acides et basiques, sans que

les entérocines ne soient complètement inactivées. L’agent antibactérien LO4 présente une

activité maximale (2560 AU/ml) à des pH 6 et 7, alors que pour des pH acides (pH 4 et 2) et

basiques (pH 8, 10 et 12) l’activité inhibitrice diminue. Quant à l’entérocine LO12, son

activité antibactérienne est stable pour une large gamme de pH (2 à 12).

Nos résultats sont en désaccord avec ceux de Cintas et al (1997) qui ont rapporté une perte de

l’activité antimicrobienne du surnageant de culture de E. faecium P13 après une exposition à

pH compris entre 2 et 11 pour 24 heures à 25°C.

La stabilité de l’entérocine LO12 aux différents pH a été rapportée par Park et al (2003) pour

l’entérocine d’E. faecium JCM 5804T dont l’activité était maintenue pour une fourche de pH

de 2 à 10. Gupta et al (2010) a aussi observé cette caractéristique chez l’entérocine FH 99.


98

Lee et Kim (2010) en étudiant l’activité de l’entérocine DB1, ont rapporté que cette

bactériocine reste stable après une incubation à des pH compris entre 2 et 10, cependant elle

est inactivée à pH 12.

Figure 21: Effet du pH sur l’activité inhibitrice des souches d’E faecium vis-à-vis d’E

faecium H3

L’étude de l’effet des enzymes, du pH et de la chaleur, nous a permis de conclure que les

métabolites antibactériens (BRO2, LO4 et LO12) sont de nature protéique résistants à la

chaleur et aux pH. Nous suggérons que ces métabolites sont des entérocines. Cette

supposition doit être confirmée par l’étude des conditions optimales de production de ces

métabolites par E. faecium ainsi que leur purification.

Discussion :

Parmi les nombreuses propriétés bénéfiques attribuées aux bactéries lactiques sur la santé

humaine et les caractéristiques technologiques qui font d’elles d’excellents ferments, s’ajoute

le potentiel inhibiteur. En effet, l’activité antimicrobienne des bactéries lactiques à travers le

processus de fermentation a été apprécié par l’homme et lui a permis de prolonger la durée de

vie de nombreux aliments (Savadogo et al., 2004). Gautam et al (2014) rapportèrent que ces

deux dernières décennies, la recherche de produits antimicrobiens naturels synthétisés par des

bactéries lactiques pouvant être utilisées comme des conservateurs alimentaires à la place des

conservateurs chimiques s’est intensifiée. Selon Šušković et al (2010), le principal effet

antimicrobien des bactéries lactiques starters responsable de la bio-conservation est le taux

0

5000

10000

15000

20000

25000

2 4 6 7 8 10 12

Act

ivit

é I

nh

ibit

rice

Rési

du

ell

e

(UA

/ml)

pH

BRO2

LO4

LO12


99

d’acidification, cependant dans les produits légèrement acidifiés l’activité bactériocinogène

peut jouer un rôle crucial en éliminant les micro-organismes indésirables présentant une

tolérance à l’acidité. Ainsi de nombreuses études s’intéressent à la caractérisation de l’activité

bactériocinogène de bactéries lactiques en vue d’utiliser des bactériocines comme bio-

conservateur pour remplacer les conservateurs chimiques et prolonger la demi-vie des

aliments. En effet les bactériocines sont utilisées dans les sciences alimentaires pour prolonger

la durée de conservation des aliments (Ghrairi et al., 2012). Deux bactériocines sont utilisées

dans la technologie alimentaire: la nisine produite par Lactococcus lactis qui est le premier

peptide antibactérien découvert chez les bactéries lactiques (Rogers, 1928), et la Pédiocine

PA-1 marquée Alta ® 2341 qui inhibe la croissance de Listeria monocytogenes dans les

produits carnés (Settanni et Corsetti, 2008).

Dans notre étude nous nous sommes intéressés à la caractérisation de l’activité

bactériocinogène d’E faecium. Les bactéries de ce genre font l’objet de nombreuses études ces

dernières années. L’étude de son potentiel bactériocinogène semble intéressant, puisque le

caractère ubiquitaire de ces bactéries de par sa résistance à la température de pasteurisation

(Alvarez-Cisneros, 2011), sa capacité à coloniser différents habitats (Fracalanzza et al.,

2007) et sa résistance aux conditions de croissance tels que de hautes et de basses

températures des pH et des concentrations de sels extrêmes supposent que ces bactéries

peuvent être utilisées dans n’importe quel produit alimentaire (Alvarez-Cisneros, 2011).

L’activité inhibitrice de trois souches d’E faecium isolées de beurre de fabrication

traditionnelle, BRO2, et de lait cru, LO4 et LO12, fait l’objet d’une caractérisation qui s’est

déroulée sur plusieurs étapes. La première étape était de mettre en évidence l’activité

inhibitrice des surnageants de culture d’E faecium BRO2, LO4 et LO12 en milieu liquide. Ces

derniers présentèrent une activité inhibitrice vis-à-vis d’E faecium H3 dans les deux bouillons

M17 (sans et avec tampon). La détection d’activité inhibitrice dans le surnageant de culture à

pH 7 peut être attribuée à des molécules extracellulaires douées d’activité inhibitrice qui sont

probablement des bactériocines. Cette conclusion sera confirmée par une caractérisation de

ces molécules.

L’activité inhibitrice vis-à-vis de ces souches cibles (Citrobacter freundi EC2, E coli EC 3, E

coli HB4, Proteus mirabilis HB3, Proteus vulgaris HB10, Ps sp HB2, Ps aeruginosa HB5,

Staphylococcus sp V3 et Staphylococcus aureus HB1) n’est pas détectable, qu’elle soit due à

l’acidité ou aux bactériocines puisque elle ne présente pas d’inhibition dans les milieux M17

liquides (tamponné et non tamponné). L’insensibilité des bactéries cibles testées à ces


100

molécules extracellulaires semble être due à leurs faibles concentrations en les comparants

aux résultats obtenus sur milieu solide. Selon De Vuyst et Vandamme (1994) et Jack et al

(1995), la production d’activité antimicrobienne exclusivement sur milieu solide a été

observée chez plusieurs bactéries lactiques. Mayr-Harting et al (1972) rapportèrent que dans

certains cas, soit aucune bactériocine n’est produite dans un milieu liquide soit le rendement

obtenu à partir de la production sur un support solide est supérieur à celui de la production en

milieux liquides. Chez les entérocoques, Nilsen et al (2003), rapportèrent que l’activité

antimicrobienne d’une bactériocine produite par E. faecalis (Enterolysine A) n’a été observée

initialement que sur milieu solide. Selon Lewus et Montville (1991) et Drider et al (2006),

différents spectres d’inhibition peuvent être obtenus en fonction de la souche productrice de

bactériocines, de la souche indicatrice, et aussi de la méthode utilisée pour la détection de

bactériocines. Chez de nombreuses souches la production de bactériocines ne peut être

détectée qu’en milieu de culture solide, rendant la caractérisation biochimique et génétique

difficile (Barefoot et Klaenhammer, 1984; Cintas; Nilsen et al., 2003).

Afin que nous puissions caractériser l’activité inhibitrice des souches E faecium BRO2, LO4

et LO12, une concentration par lyophilisation a été nécessaire. Les lyophilisats dissouts dans

du tampon phosphate de sodium à 200 mg/ml n’inhibèrent qu’E faecium H3. La concentration

d’agents inhibiteurs influence la détection d’inhibition des bactéries cibles Proteus mirabilis

HB3, Pseudomonas sp HB2 et E coli EC3. Les autres bactéries cibles testées présentent une

résistance en dépit de la concentration des agents inhibiteurs. Les agents inhibiteurs étudiés

présentent une spécificité d’action vis à vis des bactéries cibles testées. Cette spécificité a été

rapportée pour les bactériocines. Klaenhammer (1988) définit ces molécules comme des

protéines ou complexe de protéines avec une activité bactéricide dirigée contre des espèces

qui sont habituellement apparentées aux bactéries productrices. Ce qui expliquera la

sensibilité de la souche E faecium H3. Quant à la sensibilité ou la résistance des autres

bactéries cibles testées, elle peut être expliquée par le fait que chaque bactériocine a un

spectre d’inhibition défini supposant que chaque bactériocine reconnaît une molécule

réceptrice spécifique sur les cellules cibles (Kjos et al., 2009). Selon Klaenhammaer (1993)-

(, les entérocines sont classées en classe I, IIa, IIc et III. Cleveland et al (2001), rapportèrent

q(ue ces bactériocines ont comme cible primaire la membrane cytoplasmique comme la

plupart des bactériocines, lesquelles forment des pores réduisant ainsi le potentiel

transmembranaire et ou le gradient de pH conduisant à la mort cellulaire. Ces récepteurs

cibles sont des précurseurs de la biosynthèse de la paroi cellulaire, lipide II dans le cas de

quelques lantibiotiques (Brotz et al., 1995 ;Wiedemann et al., 2001, 2006). Alors que dans le


101

cas de la plupart des bactériocines de classe II, il a été établi que les cibles sont des protéines

spécifiques (Mozzi et al., 2010). A l’exception de bactériocines de classe IIa et de la

lactococcine A (classe IId) lesquelles démontrèrent qu’elles ciblent spécifiquement des

protéines transmembranaires IIC et IID du système phosphotransférase du mannose (Man

PTS) (Diep et al., 2007).

La nature protéique des agents inhibiteurs et leur résistance aux traitements thermiques

confirment que les inhibitions sont dues à des bactériocines. Selon Klaenhammer (1988), les

bactériocines sont sensibles à au moins une enzyme protéolytique. Poeta et al (2008),

rapportèrent que les entérocoques peuvent produire des bactériocines, nommées entérocines,

avec une activité inhibitrice contre des souches étroitement apparentées aux micro-organismes

producteurs.

L’enterocine produite par E. faecium a un spectre étendu d’activité envers des pathogènes

d’origine alimentaire indiquant leurs applications dans leur processus alimentaire comme co-

culture ou comme additif (Leroy et al., 2003). Settanni et Corsetti (2008), rapportèrent que

l’entérocine CCM 4231 et EJ97 sont utilisées dans le lait de soja et la purée de courgettes

pour éliminer la contamination, tandis que l’entérocine AS-48 semble être un bon candidat

pour une application comme conservateur de jus de fruits (Grande Burgos et al., 2014). La

sensibilité des entérocines étudiées, à la pronase E et à la trypsine suppose que ces

bactériocines peuvent être utilisées comme conservateurs biologiques dans les aliments et

nourritures, sans affecter la flore microbienne du tractus gastro-intestinal (Aktypis et

Kalantzopoulos, 2003). Les bactériocines sont aussi connues pour être résistantes à des

températures élevées (Todorov et al., 2011). L’entérocine LO4 est plus résistante à la chaleur

que l’entérocine BRO2 et l’entérocine LO12. Des résultats similaires ont été rapportés par

Tulini et al (2009) pour les bactériocines d’E. faecium 130. Dans notre étude les entérocines

maintiennent une faible activité à 100°C pendant 60 min et à 121°C pendant 20 min. La

thermostabilité des bactériocines produites par les entérocoques a aussi été rapportée par

Chen et al (2007). La thermorésistance peut être due à la formation de petites structures

complexes, de liaisons transversales stables (cross-linkage) et la génération de fortes portions

hydrophobes (De Vuyst and Vandamme, 1994). Cette caractéristique est importante pour

l’a((pplication de ces substances comme conservateurs naturels d’aliments.

Dans notre étude les entérocines maintiennent leur activité à n’importe quel pH.

Généralement, les bactériocines ne sont pas affectée par le pH. Cependant, le pH semble jouer


102

un important rôle dans l’adsorption de bactériocines aux bactéries cibles. La plupart des

bactériocines décrites sont actives dans une fourche de pH de 2 à 8 et sont partiellement ou

complètement inactivées à pH 10 (Tomé et al., 2009). Pinto et al (2009), rapportèrent que la

bactériocine produite par E. faecium 130 maintient une activité totale dans une fourche de pH

de 2 à 8. La résistance à la chaleur et à une large fourche de pH est une importante

caractéristique pour l’application de ces substances comme conservateurs naturels d’aliments.


103

3-7 Influence des milieux de cultures sur la production de métabolites antibactériens

Comme nous l’avons souligné dans l’étude bibliographique, les bactéries lactiques sont des

micro-organismes exigeants et leur métabolisme est influencé par des facteurs extrinsèques,

notamment la composition du milieu de culture. Dans cette étude, nous nous sommes

intéressés à évaluer l’influence des modifications apportées aux milieux de culture

susceptibles de moduler la production de métabolites antibactériens. L’objectif est de

déterminer le milieu de culture et/ ou les modifications permettant un rendement maximal

d’entérocines. La détermination d’un milieu de production optimale nous permettra d’initier

la purification des entérocines.

3-7-1 Influence du tampon du milieu de culture

Les milieux de culture semi synthétiques MRS ou M17, permettant d’obtenir des cultures

optimales des bactéries lactiques, contiennent des tampons. Les tampons phosphate sont

souvent utilisés lors de culture bactériennes pour éviter des variations de pH. Lors de la

sélection de souches bactériocinogènes et la mise en évidence de leur activité, nous avons

utilisé le tampon phosphate de sodium pour tamponner le milieu M17. Spelhaugh et

Harlander (1989) ont tamponné le milieu de culture par le β-glycérophosphate. Parada et al.

(2007) recommandèrent l’ajout de tampon phosphate au milieu solide pour exclure

l’inhibition par les acides organiques.

Par conséquent, nous nous sommes intéressés à l’étude de l’influence de quelques tampons

sur la production des bactériocines. Nous avons testé les tampons phosphate sodium,

phosphate-citrate ou β glycérophosphate, et le Tris maléate. Ces tampons ont été ajoutés à une

concentration finale de 0,1 M au bouillon M17. La production de bactériocines par E. faecium

BRO2, LO4 et LO12 a été estimée par un dosage au bout de 18 heures d’incubation. La

croissance a été estimée à l’aide d’un spectrophotomètre à 600 nm.


104

Les résultats de l’influence des tampons sur la production d’entérocines sont présentés dans

les Figures 22, 23 et 24. Il s’agit de 3 essais séparés pour chaque souche d’E. faecium BRO2,

LO4, LO12, qui ont ensuite fait l’objet d’une analyse statistique.

Figure 22: Influence du tampon du milieu de culture sur la production de métabolites

antibactériennes par E. faecium BRO2.


antibactériennes par E.faecium LO4


105


antibactériennes par E.faecium LO12.

L’activité antibactérienne de chacune des entérocines étudiées (l’entérocine BRO2,

l’entérocine LO4 et l’entérocine LO12) vis-à-vis d’E. faecium H3 a été observée au niveau

des différents bouillons M17 tamponés ainsi qu’en M17 non tamponné (contrôle).

L’activité de l’entérocine BRO2 obtenue à partir de culture en bouillon M17 tamponnné par le

phosphate sodium est la plus élevée (746 ± 355 UA/ml). Elle est suivie par les cultures en

M17 tamponné par le β-glycérophosphate (266 ± 71 UA/ml) et tamponné par le phosphate

citrate (266 ± 71 UA/ml). Alors que l’activité diminue (80 UA/ml) dans le cas de culture en

bouillon M17 tamponné par le Tris maléate par comparaison au M17 sans tampon (133 ±

35UA/ml).

L’activité de l’entérocine LO4 est élevée pour les culture en bouillon M17 tamponné par le

tampon phosphate sodium (746 ± 355 UA/ml) suivi du β-Glycerophosphate (533 ±142

UA/ml). Une faible activité a été enregistrée en bouillons M17 tamponné par le phosphate-

citrate (66 ± 17 UA/ml) et Tris-maléate (46 ± 22 UA/ml).


106

Dans le cas de l’entérocine LO12, nous avons abservé que l’activité est élevée en bouillon

M17 tamponné par du phosphate sodium (426 ± 142 UA/ml) suivi des cultures tamponnées

par le β-Glycerophosphate (66 ± 17 UA/ml), le phosphate- citrate (66 ± 17 UA/ml) et le Tris-

maléate (66 ± 17 UA/ml).

La variation de l’activité antibactérienne a été déterminée par le test non paramétrique de

Kruskal et Wallis à l’aide du logiciel XLSTAT. Les valeurs de p sont inférieures au niveau de

signification α = 0,05. Ces valeurs sont de 0,021 ; 0,017 et 0,035 respectivement dans le cas

des souches BRO2, LO4 et LO2.

Nous pouvons conclure que le bouillon M17 tamponné par le tampon phosphate sodium par

comparaison au bouillon M17 sans tampon affecte de façon importante et significative

(P<0,05) la production des entérocines BRO2, LO4 et LO12. Ces résultats sont en désaccord

avec ceux de Chandrapati et O’Sullivan (1998) et Cheigh et al (2002) ; les auteurs

démontrent que l’incorporation du sodium ou phosphate potassium au milieu synthétique ne

fait pas augmenter la production de nisine et ne favorise pas sa libération dans le milieu.

Tandis que De Vuyst et Vandamme (1993) observèrent que indépendamment du type de

phosphate utilisé le rendement de cellule et le niveau de production de la nisine sont

hautement stimulés très probablement grâce aux pH favorables obtenu par la capacité tampon

de la source de phosphate ajoutée.

Le bouillon M17 contenant du β-glycérophosphate sodium permet d’obtenir un titre en

activité antibactérienne des entérocines BRO2 et LO4 plus élevé qu’en milieu sans tampon,

mais plus faible qu’en bouillon M17 tamponné par le phosphate sodium, sauf pour

l’entérocine LO12. Le pH de 5,5 des cultures en bouillon M17 tamponné par le β-

glycérophosphate sodium peut être responsable de la faible activité. En effet les résulats

antérieurs de la caractérisation de l’entérocines BRO2 et LO4 montrèrent que l’activité est

influencée par le pH. Comme indiqué par Yang et al., (1992) le pH du milieu de culture peut

influencer les bactériocines disponibles dans le surnageant de culture.

Nous avons observé que le bouillon M17 tamponné par le Tris maléate, présente un titre en

activité inférieur aux autres tampons. Ce tampon a une influence négative sur la production

et/ou l’activité antibactérienne des entérocines étudiées. Nous avons également observé que le

pH des cultures en bouillon M17 tamponné par le Tris maléate a varié. Le pH a diminué après

croissance, il est passé de pH 7 à pH 5. Le Tris maléate est sensible au changement de

température. Le tampon a subi un autoclavage puis une incubation à 30°C. Ce qui pourrait

expliquer la raison de la faible activité antibactérienne obtenue. La production de l’entérocine

LO12 en bouillon M17 contenant le β- glycérophosphate sodium ou le phosphate-citrate ou le


107

tris aminométhane est plus faible qu’en bouillon non tamponné, démontrant que l’influence de

ces éléments dépend des souches productrices de bactériocines. Selon Parente et Ricciardi

(1999), la présence d’éléments variés tels que le phosphore, le magnésium et le calcium

influence la production de bactériocine mais cette action est spécifique à la souche.

Le tampon phosphate-citrate a pu maintenir le pH à 7. En revanche le maintien du pH à 7 n’a

pas permis au tampon phosphate-citrate d’obtenir un titre en activité égal au titre en activité

antibactérienne obtenu en bouillon M17 tamponné par le phosphate sodium. La présence de

citrate peut expliquer cette différence ; il est fort probable que cet élément du tampon soit

responsable de séquestration de calcium. Ce dernier est indispensable puisqu’il joue un rôle

dans la liaison de certaines enzymes à la paroi cellulaire (Boyaval, 1989).

A l’issue de ces résultats, le tampon phosphate sodium est utilisé pour tamponner les

bouillons de culture.

3-7-2 Influence des différentes concentrations de lait écrémé ajoutées aux bouillons M17

Plusieurs travaux sur des souches d’E. faecalis et d’E. faecium ont montré qu’elles sont

capables de produire des bactériocines quand elles sont en croissance dans le lait et le fromage

(Parente et Hill, 1992; Villani et al., 1993; Giraffa et al., 1994; Giraffa et Carminati,

1997; Ennahar et al., 1998). Avant de tester la production des entérocines dans le lait et de la

comparer à celle obtenue en milieu M17 en présence de lait, nous avons testé l’influence de

l’ajout du lait au bouillon M17 tamponné par du tampon phosphate sodium afin de déterminer

la bonne concentration en lait à ajouter dans le but d’augmenter le rendement en

bactériocines. Différentes concentrations de lait écrémé (5%, 15%, 25%, 35%, 45%, 55%, et

65%) ont été testées. Nous avons également déterminé la production en bouillon M17

tamponné par du tampon phosphate sodium (cultures témoins). La moyenne de 3 prises

d’essai est présentée dans les Figure 25, 26 et 27. Le test de normalité a révélé que les

résultats des essais ne suivent pas une loi normale. Nous avons utilisé le test non paramétrique

de Kruskal et Wallis à l’aide du XLSTAT.


108

Figure 25 :Influence de la concentration de lait écrémé additionné au milieu de culture

sur la production de métabolites antibactériennes par E.faecium BRO2.


sur la production de métabolites antibactériennes par E.faecium LO4.


109


sur la production de métabolites antibactériennes par E.faecium LO12.

Les résultats montrent qu’une activité antibactérienne élevée est obtenue à partir de culture en

bouillon M17 tamponné (phosphate sodium, pH7,2) additionné de 25% de lait écrémé.

L’activité antibactérienne est de 1306± 835 UA/ml ; 1333±817 UA/ml et 1706±568 UA/ml

respectivement pour BRO2, LO4 et LO12. Nous avons également enregistré des densités

optiques élevées en bouillon M17-lait écrémé 25% par comparaison aux autres concentrations

de lait écrémé ajouté. Pour les concentrations de 5% et 10% de lait écrémé ajouté au bouillon

M17 tamponné, une faible activité antibactérienne est enregistrée par comparaison à 25% de

lait écrémé ajouté. Le bouillon M17 tamponné présente une activité antibactérienne faible par

comparaison aux bouillons M17 tamponné additionné de différentes concentrations de lait

écrémé. Un résultat similaire a été rapporté par Jozala et al (2005) qui ont observé que les

concentrations recommandées pour les milieux synthétiques ne permettent pas de faire

progresser la libération de nisine par des bactéries.

Pour des concentrations de 35%, 45%, 55% et 65% de lait écrémé ajouté au bouillon M17,

nous avons observé que la production de l’entérocine LO4 et de l’entérocine LO12 diminue

par rapport au bouillon M17- 25% lait écrémé. Nous suggérons que ces concentrations de lait


110

ne sont pas assimilées par les entérocoques. En effet ce genre de bactéries lactiques est

faiblement protéolytique

Nous pouvons conclure que la production de métabolites antibactériens est plus prononcée en

bouillon M17 additionné de 25% de lait écrémé. Ces résultats se rapprochent des résultats

obtenus par Jozala et al (2005) qui montrèrent qu’une concentration de lait de 25% a une

influence positive dans la formation et la libération de nisine par les cellules. Ils ont aussi

rapporté que cette influence positive est observée en milieu M7 ou MRS.

L’analyse statistique des résultats révèle que ces concentrations n’ont aucun effet significatif

sur la production de métabolites antibactériens par E. faecium BRO2 (p=0,27) et E. faecium

LO4 (p=0,181). En revanche l’analyse statistique des résultats de la souche E. faecium LO12

a révélé que ces concentrations de lait écrémé ajoutées au bouillon M17 ont une influence

significative sur la production de métabolites antibactériens (p=0,007).


111

3-7-3 Influence des sucres

La production de métabolites antibactériens pourrait être influencée par les sucres du milieu

de culture. Nous avons étudié cette influence sur la production des métabolites antibactériens

d’E. faecium BRO2, LO4 et LO12. Les sucres testés (glucose, lactose, galactose, saccharose)

ont été ajoutés au bouillon de culture M17 tamponné par du tampon phosphate sodium (0,1M,

pH 7,2) à raison de 0,5% (Simsek et al., 2009). Les résultats obtenus ont été analysés par le

logiciel XLSTAT. Comme la distribution des résultats obtenus ne suit pas une loi normale,

nous avons appliqué le test non paramétrique de Kruskal et Wallis. Les moyennes d’essais

indépendants sont représentées dans les Figures 28, 29 et 30.

Figure 28 : Influence des sucres du milieu de culture sur la production de métabolites

antibactériens par E. faecium BRO2

La culture d’E. faecium LO12 en bouillon M17 contenant 0,5% de glucose a permis de

produire des bactériocines avec une activité antibactérienne de 1920 ± 640 UA/ml. Tandis que

le bouillon M17 contenant du saccharose, lactose et galactose ont produit respectivement 480

± 160 UA/ml, 240 ± 80UA/ml et 80 UA/ml.

La souche E. faecium BRO2 a aussi produit une activité antibactérienne élevée en M17

contenant du glucose (1813 ± 2204 UA/ml) par comparaison au M17 contenant du lactose

(453 ± 248 UA/ml) du saccharose (346 ± 195 UA/ml) ou du galactose (80 UA/ml).


112

Quant à la souche E. faecium LO4, elle a produit une activité antibactérienne élevée en M17

contenant du glucose (1280 ± 853 UA/ml) par comparaison au M17 contenant du saccharose

(780 ± 460 UA/ml) du lactose (586 ± 462 UA/ml) ou du galactose (120 ± 40 UA/ml).

Figure 29: Influence des sucres du milieu de culture sur la production de métabolites

antibactériens par E.faecium LO4.

Figure 30 : Influence des sucres du milieu de culture sur la production de métabolites

antibactériens par E. faecium LO12


113

Les résultats obtenus montrent que les bouillons M17 modifiés (M17-Glucose, M17-Lactose,

M17-Galactose et M17-Saccharose) sont favorables à la croissance bactérienne de E. faecium

BRO2, E. faecium LO4 et E. faecium LO12. Nous avons également observé que les

entérocines BRO2, LO4 et LO12 ont également été produites dans ces bouillons. Une faible

croissance ainsi qu’une faible production de bactériocines ont été observées en bouillon M17

sans sucre (Témoin). En effet, ce dernier présente une faible croissance et une faible activité

antibactérienne produite par E. faecium BRO2 (53,33 ± 71 UA/ml) et LO4 (106,66±

142UA/ml). Dans le cas de la souche E. faecium LO12 aucune activité antibactérienne

détectable n’a été enregistrée. Ces résultats suggèrent que la source de carbone joue un rôle

important dans la croissance des bactéries et la production de bactériocines.

L’analyse statistique a démontré que les sucres testés n’ont aucune influence significative sur

la production de l’entérocine BRO2 (p=0,158), l’entérocine LO4 (p=0,106) et l’entérocine

LO12 (p=0,106). Nous pouvons cependant conclure que sur les 4 sucres testés, le glucose est

la source de carbone la plus appropriée à la production de bactériocines et à la croissance par

comparaison aux autres sucres. Ces résultats sont en accord avec les résultats obtenus par

Matsusaki et al (1996). Ces auteurs ont montré que la nisine Z peut être produite par

Lactococcus lactis IO-1 à partir du glucose, du saccharose et du xylose mais les meilleurs

résultats ont été obtenus avec le glucose par rapport au xylose. Pour la production de la

pédiocine AcH, la meilleure source de carbone est le glucose, suivie par le saccharose, le

xylose et le galactose dans un milieu non tamponné (Biswas et al., 1991).

Nos résultats sont en désaccord avec les résultats obtenus par Aguilar-Galvez et al. (2011)

avec la souche E. faecium CWBI - B1430, dont l'activité antibactérienne la plus élevée a été

obtenue avec du lactose (7111 UA ml-1), et le maximum de biomasse (2,42 g L-1) a été obtenu

avec la maltodextrine. Dans le cas de l’entérocine produite par E. faecium RZS C5,

l'utilisation du lactose au lieu du glucose a augmenté la production d’entérocine (Foulquié

Moreno et al., 2003).

Les faibles titres en activité antibactérienne obtenus par les cultures en M17- saccharose,

M17- lactose et M17-galactose peuvent être expliqués par une lente fermentation de ces

sucres par rapport au glucose qui est le substrat initial de la voie métabolique emprunté par les

lactocoques (voie d’Embden-Meyerhof-Parnas et voie de D-tagatose -6-phosphate).


114

3-7-4 Influence des milieux M17 et MRS modifiés

A l’issue des résultats de l’étude de l’influence de l’ajout du lait écrémé et du tampon ainsi

que l’influence de la source de carbone, nous avons évalué l’influence des modifications du

milieu de culture M17 et MRS sur la production des entérocines. Nous avons modifié les

bouillons M17 et MRS en remplaçant la source de carbone par 0,5% de glucose et en ajoutant

du lait écrémé (75% MRS ou M17 + 25% de lait écrémé). Ces bouillons ont été tamponnés

par du phosphate sodium 0,1 M. Le pH des milieux M17 modifiés et MRS modifiés étaient

respectivement de 7,2 et 6,5. En parallèle nous avons également évalué la production

d’entérocines produites par les souches E. faecium BRO2, LO4 et LO12 en bouillon M17 et

MRS tamponné (Phosphate de sodium) ainsi qu’en lait écrémé (10%). Huit essais par milieu

ont été réalisés. Les résultats obtenus par les souches E. faecium BRO2 et LO12 sont

présentés dans la Figure 31 et 32.


antibactériennes par E.faecium BRO2.


115


antibactériennes par E.faecium LO12.

Les résultats obtenus révèlent que l’activité antibactérienne chez E. faecium BRO2 et E.

faecium LO12 fluctue avec la composition du milieu.

Dans le cas de la souche E. faecium BRO2, la production de bactériocines est faible en

bouillon M17 tamponné (5± 8,75 UA/ml). Elle augmente en MRS tamponné (270 ± 175

UA/ml), en lait (355± 190 UA/ml).en MRS modifié (560± 231 UA/ml). La production de

bactériocines en bouillon en M17 modifié est la plus élevée (1480 ± 1048 UA/ml).

Quant à l’activité antibactérienne d’E. faecium LO12, elle est plus élevée en bouillon M17

modifié (360 ± 124 UA/ml) qu’en MRS tamponné (290 ± 162 UA/ml), MRS modifié

(210±120 UA/ml) ou lait (220± 115 UA/ml. La production de métabolites antibactériens est la

plus faible en bouillon M17 (5 ± 37,5 UA/ml).

Nous avons observé que E. faecium LO4 n’a pas présenté d’activité en dépit de 8 essais par

milieu de culture. La production de bactériocines chez E. faecium LO4 est instable en milieu

liquide. Plusieurs bactéries lactiques ne montrent une activité antibactérienne que sur des

supports solides (De Vuyst et Vandamme, 1994 ; Jack et al., 1995).

D’après Cintas et al. (1995) seulement 12 des 55 isolats de bactéries lactiques qui

présentaient des activités antagonistes dans des tests de recouvrement ont montré une activité

de bactériocine détectables dans le liquide des cultures.


116

L’analyse statistique a montré que la production de métabolites antibactériens est influencée

par la composition du milieu de culture. Le test non paramétrique de Kruskal et Wallis, nous a

donné des valeurs de p=0 dans le cas d’E. faecium BRO2 et LO12.

Nous pouvons conclure que la production de métabolites antibactériens chez E. feacium

BRO2 et E. faecium LO12 est influencée par la composition des milieux de culture. Une

différence significative (p=0,004) a été notée en comparant la production de bactériocines en

milieux M17 tamponné, MRS tamponné et M17-phosphate sodium-glucose-25% lait écrémé,

MRS- phosphate sodium-glucose-25% lait écrémé ou lait écrémé. Pour les deux bactéries

BRO2 et LO12, la production de bactériocines est plus prononcée en M17-phosphate sodium-

glucose-25% lait écrémé par comparaison aux autres milieux. La combinaison M17 ou MRS

avec du lait écrémé stimule la production de bactériocines tel que rapporté par Jozala et al

(2005).

En comparant la production de bactériocines en milieux M17 et MRS, nous avons observé

que pour les deux souches la production est plus élevée en bouillon MRS par rapport au M17.

Nous suggérons que le Tween 80 est responsable de cette différence. Todorov et al (2005),

ont observé que l’ajout de Tween 80 dans le milieu de croissance et de production permet

d’augmenter de plus de 50 % la production de bactériocines ST194BZ. Une observation

similaire a été rapportée pour la plantaricine 423 (Verellen et al., 1998), pédiocine AcH

(Biswas et al., 1991) , lactacin B (Bareffot et al., 1984) et lactocin 705 (Vignolo et al., 1995).

D’après Todorov et al (2005), le Tween 80, qui est un agent tensioactif, peut être responsable

de la décharge de la bactériocine à partir de la surface cellulaire de la souche productrice

Quant à la production de bactériocines en milieu contenant du lait, elle est plus élevée par

comparaison au M17 ou MRS tamponné. Ces résultats sont en désaccord avec les résultats

rapportés par Foulquié Moreno et al (2003), montrant que la production dans le lait écrémé

par comparaison au MRS était faible. Alors que Sarantinopoulos et al (2002) n’ont observé

aucune activité d’entérocine après une fermentation de E. faecium FAIR -E 198 dans le lait

écrémé (10% p / v) à 37 °C et à pH non contrôlé.

La production de bactériocines dans le lait est plus faible par rapport à la combinaison M17-

phosphate sodium-glucose-25% lait écrémé ou MRS-phosphate sodium-glucose-25% lait

écrémé. Ces résultats se rapprochent des résultats de Sarantinopoulos et al (2002). Ces

auteurs ont observé que E. faecium FAIR -E 198 qui ne produit pas de bactériocines dans le

lait pouvait produire l’entérocine dans le lait écrémé supplémenté avec de la peptone (1%, p /

v) et l'extrait de levure (0,5 %, p / v) à 37 ° C et à pH non contrôlé.


117

Le bouillon M17 modifé est retenu comme milieu de production de bactériocines chez E.

faecium BRO2 et E. faecium LO12

3-8 Cinétique de croissance et de production de bactériocines

L’étude de la cinétique de production de métabolites antibactériens produits par E. faecium

BRO2 et LO12 a été réalisée en M17 modifié (Phosphate sodium-glucose-lait écrémé) sur une

période de 24 heures à 30°C. Les figures 33 et 34 montrent l’évolution de la croissance des 2

souches ainsi que l’évolution de la production des bactériocines en fonction du temps

d’incubation. Les courbes de croissance révèlent que les souches E. faecium BRO2 et LO12

présentent le même profil cinétique en début de la croissance. Pour les deux souches

bactériennes E. faecium BRO2 et LO12, nous avons remarqué l’absence de la phase de

latence. Cette phase de la croissance bactérienne correspond à l’adaptation de la bactérie aux

conditions de culture. En effet, la quantité d’inoculum (10% du volume du milieu de

fermentation) et la même composition du milieu de préparation de l’inoculum et le milieu de

fermentation ont permis de réduire la durée d’adaptation des bactéries au milieu de

fermentation. La bactérie E. faecium BRO2 atteint la phase stationnaire au bout de 16 heures

puis une phase stationnaire qui dure environ 6 heures. A partir de 22 heures d’incubation la

densité optique diminue, c’est la phase de déclin. Quant à E. faecium LO12, la phase

exponentielle commence dès les premières heures d’incubation jusqu’à 18 h puis on observe

la phase de déclin.

Les figures 34 et 35 montrent aussi l’évolution de la production de bactériocines par E.

faecium BRO2 et LO12. L’activité des entérocines BRO2 et LO12 a été détectée au bout de 2

heures d’incubation et est respectivement 80 UA/ml et 40 UA/ml. Au bout de 18 heures

d’incubation, l’activité antibactérienne de l’entérocine BRO2 et de l’entérocine LO12

augmente jusqu’ à atteindre respectivement une valeur maximale de 10240 UA/ml et 2560

UA/ml. Une diminution de cette activité a été enregistrée à 20h, 22h et 24h.

En revanche, nous avons constaté également que la sécrétion des bactériocines augmente au

fur et à mesure au cours de la croissance et atteint son niveau maximal vers la fin de la phase

exponentielle et en début de la phase stationnaire. Des résultats similaires ont été rapportés

par Aguilar-Galvez et al (2011), qui ont observé une concentration maximale en bactériocine

produite par E. faecium CWBL B 1430 en fin de la phase exponentielle. Shokri et al (2013)

rapportèrent que chez E. faecium DSH20 la production de BLIS commence en mi phase


118

exponentielle et son niveau maximal est atteint en fin de phase stationnaire. Cette activité est

détectée pendant les premières heures de croissance et elle diminue en phase de déclin.

Figure 33 : Cinétique de croissance et de production de bactériocines d’E. faecium BRO2

Figure 34: Cinétique de croissance et de production de bactériocines d’E. faecium LO12

Afin d’étudier la relation entre la croissance bactérienne et la production de bactériocines,

nous avons évalué la vitesse spécifique de croissance et la vitesse spécifique de production de

bactériocines (Figures 35 et 36).


119

Figure 35 : Vitesse spécifique de croissance et de production de bactériocines d’E.faecium BRO2

La figure 35 montre que la vitese spécifique de croissance augmente a partir des premières

heures de croissance. A partir de 4 heures et jusqu’à 8 heures d’incubation, nous avons

observé que la vitesse spécifique de croissance est constante (environ 0,3 h-1). Cette période

correspond à la phase exponentielle pendant laquelle nous avons observé une production de

bactériocines. La vitesse spécifique de production de l’entérocine BRO2 atteint son maximum

(716,48 UA/ml/DO/h) à 18 heure d’incubation. Ce qui correspend à la phase stationnaire.


120

Figure 36 : Vitesse spécifique de croissance et de production de bactériocines d’E.faecium LO12

Comme le montre la figure 36, la vitesse spécifique de croissance d’E. faecium LO12

augmente des les premères heures de croissance est devient constante de 2 à 4 heures (0,314 à

0,33 h-1). La vitesse spécique de production d’entérocine pendant cette periode est de 104 à

108 UA/ml/DO/h. Cette vitesse atteint sa valeur maximale (199 UA/ml/DO h-1) à 18 heures,

ce qui correspond à la phase stationnaire puisque la vitesse spécifique de croissance diminue

lentement

Nous pouvons conclure que l’entérocine BRO2 et de l’entérocine LO12 sont produites en

phase exponentielle. Cependant la vitesse de production n’est maximale qu’en phase

stationnaire. En effet Foulquié Moreno et al (2003) rapportèrent que la production de

bactériocines commence en début de phase exponentielle et la production maximale est

obtenue en fin de phase stationnaire et aucune diminution de l’activité de bactériocines n’est

observée.

La diminution de la croissance et la production de bactériocines dans cette étape est due à

l’épuisement des éléments nutritifs essentiellement les sources de carbone et d’azote (Leroy

et De Vuyst, 1999).


121

Discussion

La recherche de conditions optimales pour la production de bactériocines stables et en

quantités suffisantes a été abordée par de nombreux auteurs. Chez les bactéries lactiques, le

pH, la température, la taille de l’inoculum et d’autres facteurs environnementaux peuvent

avoir une influence sur la production de bactériocines (Biswas et al., 1991 ; Diep et al.,

1995 ; Mørtvedt-Abildgaard et al., 1995 ; De Vuyst et al., 1996 ; Eijsink et al., 1996 ;

Nilsen et al., 1998). D’autres études évoquèrent la composition du milieu de cultures.

Kanmani et al (2011) rapportèrent que la production de bactériocines et de cellules totales

viables dépendent généralement de facteurs environnementaux et de la composition de milieu

de croissance.

Pour la culture de bactéries lactiques et la production de métabolites, plusieurs milieux de

cultures ont été décrits. La composition de ces milieux doit satisfaire les besoins des bactéries

lactiques en croissance. En plus des hydrates de carbone, les milieux de culture de laboratoire

sont généralement complétés par différents acides aminés libres, des peptides, des dérivés

d'acides nucléiques, des esters d'acides gras, des minéraux, des vitamines et des agents

tampons (Hébert et al., 2004 ). Dans cette étude, nous nous sommes intéressé à évaluer

l’influence du tampon du milieu et des hydrates de carbone.

Une variété de milieux de culture, tels que le CM, M17, M17S et MRS, sont utilisés pour la

croissance de producteurs de bactériocines et tous ces milieux permettent de neutraliser

l’acide lactique et aide à la croissance cellulaire (Li et al., 2002). Nous avons utilisé comme

milieu semi-synthétique le bouillon M17 pour étudier l’influence du tampon, de la source de

carbone et de l’ajout du lait.

Le choix du tampon de milieu de culture s’impose comme un facteur important à étudier. Le

milieu M17 contient en plus des éléments nutritifs et des oligoéléments indispensables à une

croissance optimale, le β glycérophosphate assurant le pouvoir tampon du milieu. Ce tampon

ainsi que d’autres (phosphate sodium, phosphate –citrate et Tris-maléate) ont été testés pour

évaluer leur influence sur la production de bactériocines. Notre étude indique que la

production de bactériocines par les souches d’E. faecium BRO2, LO4 et LO12 est

significativement influencée par le type de tampon. Un maximum d’activité antibactérienne

est obtenu en milieu tamponné par du tampon phosphate sodium à 0,1 M pH 7,2 par

comparaison au bouillon sans tampon ainsi que les autres tampons. Nous suggérons que le

phosphate sodium est le plus approprié des tampons testés en raison de sa capacité à maintenir


122

la neutralité du pH du milieu de culture, ce qui est un élément important dans l’optimisation

de la croissance et de la production de bactériocines. Selon Nilsen et al (2003), il est possible

d'obtenir une bonne production de bactériocines dans un milieu liquide par des cultures à pH

constant. Le pH du milieu de production est lié à l’adsorption de bactériocine aux cellules et

par conséquent à sa biodisponibilité. Ces auteurs ont montré que la production de

bactériocines par E. faecalis LMG 2333 était fortement dépendante du pH du milieu de

croissance. Son pH optimal était de 6,5, la production devenait très faible à des pH inférieurs

à pH 6. En plus de son pouvoir tampon, le phosphate de sodium a été une bonne source de

phosphate. Ce dernier a démontré son influence par l’ augmentation de la production de nisine

(De Vuyst et Vandamme, 1993). Ces auteurs ont pu conclure que le phosphate peut ne pas

avoir un effet régulateur sur la biosynthèse de la nisine. Ils ont également suggéré que le rôle

du phosphate dans la production de la nisine est dû à sa capacité tampon et à la stimulation de

la formation de l'ATP conduisant à une haute charge d’énergie des cellules.

Parmi les facteurs pouvant moduler la production de bactériocine, nous nous sommes

intéressés à étudier l'influence du type de la source de carbone. Dans le cas de la nisine, il est

connu que sa production dans un système de fermentation est influencée par de nombreux

facteurs tels que le type et le niveau de carbone (De Vuyst et Vandamme, 1992 ; De Vuyst

et Vandamme, 1993 ; Matsuasaki et al., 1996 ; Amiali et al., 1998; Pongtharangkul et

Demirci, 2005). Dans cette étude, nous avons testé l’influence du glucose, lactose, galactose

et saccharose sur la production de bactériocines chez E. faecium BRO2, LO4 et LO12. Ces

bactéries se développent en bouillon M17 contenant ces sources de carbones et produisent des

bactériocines. La croissance et la production de bactériocines sont faibles en bouillon M17

sans sucre, montrant le rôle important que jouent les hydrates de carbone dans la croissance et

la production de bactériocines.

Pour les 3 souches E. faecium BRO2, LO4 et LO12, une densité optique et une activité

antibactérienne maximales sont obtenues en bouillon M17- glucose.

D’après De Carvalho et al (2007), plusieurs bactéries lactiques semblent utiliser le glucose

de manière préférentielle pour la production de bactériocine. Des études antérieures ont

indiqué que Lactococcus lactis et Streptococcus pyogenes préfèrent le glucose pour produire

respectivement la nisine Z (Matsusaki et al., 1996 ) et la streptococcine SA- FF22 (Jack et

Tagg, 1992). De Vuyst et Vandamme (1992) ont suggéré qu’il est possible que la source de

carbone régule la production de la nisine par la médiation de la formation d’enzymes

impliquées dans la modification de pré-nisine, l'immunité ou la transduction du signal.


123

Si l’on veut utiliser ces souches en industrie laitière, il est primordial d’évaluer la production

de bactériocines dans le lait. Avant d’évaluer la production de bactériocines et en s’inspirant

des travaux de Jozala et al (2005), nous avons étudié l’influence de l’ajout de différentes

proportions du lait écrémé au bouillon M17-phosphate sodium. Cette étude nous permettra par

la suite de comparer la production de bactériocines dans ce milieu au lait écrémé mais aussi

au M17 et MRS tamponnés. Les 3 souches bactériennes étudiées (E. faecium BRO2, LO4 et

LO12) produisent un maximum de bactériocines en bouillon M17-phosphate sodium-25% de

lait écrémé. Tels que rapportée par Jozala et al (2005) pour la nisine, une combinaison de

M17 ou MRS et 25% de lait écrémé peut influencer la production de bactériocines. L’ajout de

lait au bouillon de culture est l’une des modifications permettant d’améliorer le rendement de

production de bactériocines (Jozala et al., 2007; Mall et al., 2010).

Les modifications apportées au bouillon M17 en remplaçant le tampon par du phosphate

sodium et la source de carbone par du glucose et en ajoutant du lait écrémé ont été également

apportées au bouillon MRS. La comparaison de la production des bactériocines BRO2 et

LO12 dans ces milieux avec la production en M17-phosphate sodium et MRS -phosphate

sodium-ainsi que dans le lait écrémé, a révélé que la production dans le lait est plus élevée

qu’en M17 ou MRS. De Arauz et al (2012) rapportèrent que le lait bovin est un milieu

naturellement complexe avec une teneur nutritive élevée, fournissant un excellent substrat

pour la croissance de L. lactis et la libération extracellulaire de la nisine dans le milieu. Nos

résultats sont prometteurs dans la mesure où E. faecium BRO2 et E. faecium LO12 sont

utilisées dans la fermentation de lait.

Scott et Taylor (1981) et Cleveland et al. (2002) ont émis l'hypothèse que les protéines de

lait dans les préparations commerciales (Nisaplin et nisine pure) se lient à la nisine limitant

ainsi l'activité antimicrobienne. Cette hypothèse pourrait expliquer le fait que l’utilisation de

lait écrémé en tant que milieu de croissance a donné lieu à une production insuffisante des

entérocines BRO2 et LO12 par comparaison au bouillon M17 modifié. Le facteur dilution du

lait écrémé (25% lait écrémé +75% de M17) et l’ajout d’autres sources d’azote peuvent être

responsables de la production de quantités plus élevées en bactériocines dans le M17.

Foulqié Moreno et al. (2003), rapportèrent que la production d’entérocines est élevée quand

des hydrolysats de caséines sont ajoutés au lait montrant l’importance de l’ajout de source de

croissance au lait.


124

L’étude de la cinétique de croissance a révélé que les entérocines BRO2 et LO12 sont

produites en phase exponentielle. Leur vitesse de production n’est maximale qu’en phase

stationnaire (faible vitesse spécifique de croissance). Nilsen et al (2003) ont observé que la

vitesse spécifique de croissance approche une valeur minimale quand le taux de production

est maximal. L’évolution de la production des entérocines en fonction du temps ressemble à la

production de l’entérocine DB1 qui commence en mi phase exponentielle et est maximale en

phase stationnaire suggérant que le peptide antimicrobien est un métabolite secondaire (Lee et

Kim, 2010).

Les bactériocines produites en phase stationnaire peuvent aussi être responsables de la mort

des bactéries se trouvant dans le même environnement que les bactéries productrices de

bactériocines et donc réduire ainsi le nombre de bactéries qui sont en concurrence pour les

éléments nutritifs.

La diminution de l’activité antibactérienne en fin de croissance a été attribuée à plusieurs

mécanismes tels que l’agrégation des protéines, dégradation protéolytique par des enzymes

spécifiques ou non spécifiques et l’adsorption de molécules de bactériocines sur la surface des

cellules productrices (De Vuyst et Vandamme, 1992; Parente et Ricciardi, 1994).


125

3-9 Purification des bactériocines

A l’issue des résultats de l’étude de l’influence des milieux de culture sur la production de

bactériocines, nous avons voulu purifier les bactériocines d’E. faecium BRO2 et LO12. La

production instable de l’entérocine LO4 ne nous a pas permis de purifier cette bactériocine.

Dans un premier temps, les souches E. faecium BRO2 et LO12 ont été mises en culture en

bouillon M17-phosphate sodium, seule E. faecium BRO2 a pu produire des bactériocines.

Puisque nous n’avons pas pu détecter d’activité antibactérienne dans le surnageant de culture

en M17-phosphate sodium, nous avons produit les bactériocines d’E. faecium LO12 en

bouillon M17 modifié (phosphate sodium-glucose-lait écrémé).

Pour la purification, nous avons utilisé des méthodes classiques à savoir la précipitation par le

sulfate d’ammonium, la chromatographie gel filtration et la chromatographie échangeuse

d’ions. La taille moléculaire a été déterminée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

3-9-1 Précipitation par le sulfate d’ammonium

La purification des bactériocines a été entamée par une précipitation au sulfate d’ammonium.

Cette méthode constitue la première étape de purification. Elle permet également de

concentrer les bactériocines. Différents niveaux de saturation par le sulfate d’ammonium ont

été testés, 40%, 60% et 80%, pour précipiter les bactériocines à partir du surnageant de

culture. Après élimination des sels par dialyse, l’activité antibactérienne de chaque précipité

obtenu (P40, P60 et P80) a été testée contre la souche E faecium H3. Les résultats obtenus

sont montrés dans le Tableau 18.

Tableau 18: Diamètre d’inhibition des précipités de surnageant de culture

d’Enterococcus faecium BRO2 et LO12.

Saturation en sulfate d’ammonium

40% (P40) 60% (P60) 80% P(80)

BRO2 0 mm 6 mm 14 mm

LO12 23 mm 6 mm 4 mm

Le diamètre des zones d’inhibition est exprimé en mm

L’activité antibactérienne de la souche E faecium BRO2 a été observée à deux niveaux de

saturation de sulfate d’ammonium (60% et 80%). Nous avons choisi d’utiliser les molécules


126

de bactériocines précipitées à 80% de saturation. A cette saturation, Yamamoto et al. (2003)

ont précipité les bactériocines produites par E. faecalis RJ-1. Quant à la souche E. faecium

LO12, son activité a été observée à 40%, 60% et 80% de saturation. Un maximum d’activité a

été observé à 40% de saturation. Foulquié Moreno et al. (2003) et Morekova (2007) et ont

également précipité des bactériocines d’E. faecium par 40% de saturation. Les molécules

précipitées à 40% pour les entérocines LO12 et à 80% pour les entérocines BRO2 sont

retenues pour les étapes suivantes de la purification. Elles sont désignées FA1 BRO2 et FA1

LO12. Nous n’avons pas retenu la fraction de bactériocines BRO2 obtenues par 60% de

saturation car son activité est faible. Pour les molécules de bactériocines LO12 à 60% et à

80% de saturation également l’activité est faible. Ces précipités peuvent contenir d’autres

protéines du surnageant de culture.

3-9-2 Chromatographie par filtration sur gel de Séphadex G-25

La caractérisation physico-chimique des entérocines BRO2 et LO12 a permis de suggérer que

les bactériocines étudiées sont de classe I ou de classe II. Les bactériocines de ces deux

classes sont des molécules de faibles poids moléculaire, nous les avons séparées sur une

colonne de Séphadex G25. Cette colonne a permis d’une part d’éliminer les traces de sel de

sulfate d’ammonium et d’autre part de fractionner les molécules ayant une taille moléculaire

comprise entre 1000 et 5000 Da. Après l’étape de précipitation par le sulfate d’ammonium,

les molécules de bactériocines précipitées (fraction FA1 BRO2 ou fraction FA1 LO12) ont été

fractionnées par chromatographie gel filtration sur une colonne de Séphadex G-25. Les

courbes d’élution obtenues par lecture des fractions à 280 nm ainsi que l’activité

antibactérienne de chaque pic sont données dans les Figures 37 et 38.

Le chromatogramme obtenu après élution de la fraction FA1 BRO2 sur séphadex G-25

présente un seul pic (Figure 37). Le test d’activité inhibitrice révèle que les fractions

correspondant au pic présentent une activité inhibitrice (6 mm). Cette fraction est désignée

FA2 BRO2. Le volume d’élution de molécules responsables d’activité inhibitrice (6 ml) est

inclu dans le volume mort. Nous suggérons que les molécules de bactériocine BRO2 sont des

molécules de taille moléculaire supérieure à 5000 Da .

Le chromatogramme de fractionnement sur Séphadex G-25 de la fraction active FA1 LO12

révèlent la présence de plusieurs pics d’absorption (Figure 38) et donc de plusieurs familles

de molécules de concentration et de taille différentes. Cependant un seul pic d’absorption


127

présente une activité antibactérienne qui correspond à un volume d’élution de 7 ml (Fraction

active désignée FA2 LO12). Le volume d’élution des molécules d’entérocine LO12 étant dans

le volume mort, nous laisse suggérer que ces bactériocine sont de poids moléculaire supérieur

à 5000 Da.

Figure 37 : Chromatographie gel filtration de la fraction active FA1 BRO2 sur

Séphadex G-25

Figure 38 : Chromatographie gel filtration de la fraction active FA1 LO12 sur Séphadex

G-25


128

La figure 39 est un exemple des résultats de la mise en évidence de l’activité antibactérienne

des fractions éluées.

Figure 39 : Activité antibactérienne des fractions collectées après filtration sur

chromatographie gel filtration (Sephadex G-25)

F : Fraction, PS : précipité à 40% de saturation en sulfate d’ammonium, PA : précipité à 40% traité par l’acide

acétique.

Nous avons remarqué qu’à 40% de saturation en sulfate d’ammonium d’autres molécules ont

été précipitées avec les bactériocines. Ces molécules de faibles poids moléculaires ont été

séparées des bactériocines par filtration sur Séphadex G-25. L’activité antibactérienne de la

fraction FA2 LO12 a diminué par rapport à la fraction FA1 LO12. Cette diminution du

diamètre de la zone est certainement due à la dilution de la fraction FA1 LO12 lors de l’ajout

d’acide acétique pour précipiter les caséines contenues dans le surnageant de culture.

Les résultats de fractionnement des deux fractions actives BRO2 et LO12 sur Séphadex G-25

permettent de déduire que les entérocines étudiées ont un poids moléculaire supérieur à 5 kDa

puisqu’elles ont été exclues dans le volume mort.

Ces résultats suggèrent que les bactériocines BRO2 et LO12 ne sont pas des bactériocines de

classe I.


129

3-9-3 Chromatographie par échanges d’ions

La plupart des bactériocines ont une charge positive à un pH proche de la neutralité,

l’utilisation d’une résine échangeuse de cations est la plus appropriée pour la séparation des

bactériocines (Pingitore et al., 2007). Nous avons utilisé la résine échangeuse de cations

Séphadex C-25 pour analyser la fraction FA2 LO12. Quant aux molécules de bactériocines de

la fraction FA2 BRO2, elles semblent ressembler à l’entérocine 100. Cette bactériocine

anionique a été décrite par Kato et al. (1993). Cette entérocine présentait une activité élevée à

pH neutre (6 et 8) et une plus faible activité à pH 5. Sur la base de cette similarité, nous avons

chargé la fraction FA2 BRO2 sur une résine échangeuse d’anions DEAE cellulose.

Le chromatogramme de la séparation de la fraction active FA2 BRO2 sur DEAE cellulose

présente deux pics d’absorption (Figure 40). Le premier pic présente une absorption plus

élevée par rapport au deuxième pic. L’entérocine BRO2 a été éluée en premier puisque le

premier pic d’absorption présente une activité antibactérienne. L’élution rapide de

l’entérocine BRO2 montre que cette bactériocine est cationique.

Figure 40: Chromatographie échangeuse d’ions de la fraction active FA2 BRO2 sur

DEAE-cellulose éluée par divers tampons.

Tampon 1 (0,025 M KH2PO4 + MgCl2 0,01M pH 7) ; tampon 2 (0,05 M KH2PO4 + MgCl2 0,01M pH 7) ;

tampon 3 (0,1 M KH2PO4 + MgCl2 0,01M pH 7) ; tampon 4 (0,5 M KH2PO4 + MgCl2 0,01M pH 7)

Tampon 1 Tampon 2 Tampon 4 Tampon 3


130

La courbe d’élution de la fraction active FA2 LO12 sur la résine CM-Séphadex C-25,

présente plusieurs pics d’absorption (Figure 41). Cependant un seul pic présente une activité

antibactérienne qui correspond à la 41ème fraction obtenue pour un gradient d’élution de 0,1M

jusqu’à 1M de NaCl.

L’élution de l’entérocine LO12 sur la résine CM-Séphadex C-25, a été tardive indiquant que

la bactériocine est très fortement liée à la résine. Ce résultat suggère que l’entérocine LO12

est cationique. Un résultat similaire a été rapporté par Izquierdo Alegre (2008) qui a montré

que l’activité antibactérienne de la bactériocine produite par Enterococcus faecium IT62 est

éluée par un gradient de 0,1M jusqu’à 1M.

Figure 41: Chromatographie échangeuse d’ions de la fraction active FA2 LO12 sur CM-

Séphadex C-25 éluée par un gradient continu de NaCl 0 M à 0,1 M et de 0,1 M à 1 M.


131

Un exemple de l’activité des fractions éluées est donné dans la Figure 42.

Figure 42 : Activité inhibitrice des fractions obtenues par chromatographie échangeuse

de cations (CM-SéphadexC-25)


132

3-9-4 Détermination de la taille moléculaire des bactériocines par SDS-PAGE

Les molécules de bactériocines des différentes étapes de purification ont été analysées par

électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à la fois pour tester la pureté de l'échantillon et

pour déterminer la taille de la bactériocine. Les résultats de la séparation de la fraction active

FA3 BRO2 (fraction active obtenue après séparation sur DEAE) par SDS- PAGE sont

montrés dans la Figure 43.

Figure 43 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide des fractions actives BRO2.

Puits 1 : surnageant de culture concentré par dialyse ; puits 2 : précipité au sulfate d’ammonium ; puits 3 :

fraction éluée par DEAE-cellulose

Dans le canal 3 on observe seulement un ‘’smear’’ (tache intense) proche du front du gel alors

que pour la fraction FA1 BRO2 (obtenue par précipitation) présente deux bandes protéiques

en plus de ce smear. La position du smear correspond à la zone d’inhibition sur le duplicata

du gel utilisé pour tester l’activité antibactérienne, donc à la bactériocine BRO2.

Ces résultats indiquent que la stratégie adoptée pour la purification nous a permis de purifier

l’entérocine BRO2.

67 kDa

45 kDa

25 kDa

1 2 3


133

La taille moléculaire de l’entérocine BRO2 a pu être estimée graphiquement comparativement

à la migration de marqueurs de taille (Figure44). L’entérocine BRO2 est de faible poids

moléculaire, nous avons estimé que sa taille est comprise entre 5700 à 6900 Da.

Figure 44 : Courbe de calibration SDS PAGE


134

Pour la fraction FA3 LO12, l’analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (Figure

45) montre que la présence de 3 bandes protéiques de faible intensité. Ces protéines sont

observées au niveau du surnageant de culture et la fraction FA2 LO12.

Figure 45 : Analyse électrophorétiques des fractions actives LO12.

Puits1 : fraction active obtenue par chromatographie échangeuse de cations CM-Séphadex C-25.

puits2 : fraction concentrée et active obtenue par chromatographie gel filtration Séphadex G-25,

puits3 : surnageant de culture.

Une autre bande est visualisée en bas du gel qui n’apparait pas au niveau de la fraction FA3

LO12. Il est probable que cette bande corresponde au peptide antibactérien LO12. L’absence

d’activité sur le gel ne nous permet pas de confirmer cette supposition puisque le test

d’activité inhibitrice sur gel est négatif. Ceci ne nous permet pas de déterminer la taille

moléculaire de l’entérocine LO12.

L’analyse de l’entérocine BRO2 et de l’entérocine LO12 par chromatographie cationique

indique que leur taille moléculaire est supérieure à 5000 Da. Le caractère de thermostabilité

nous permet de les classer en classe II.

2 1 3


135

Discussion

Beaucoup de bactériocines d'Enterococcus ont été purifiées et caractérisées ; la plupart d'entre

elles ont été obtenues à partir de E. faecalis ou E. faecium (Izquierdo et al., 2008 ; Birri et

al., 2010 ; Nascimento et al., 2010 ; Yamashita et al., 2011). La caractérisation des

substances antibactériennes étudiées a démontré qu’elles sont de nature protéique et

thermostables.

Nous avons suggéré que les entérocines BRO2 et LO12 sont de classe I ou de classe II. Pour

compléter leur caractérisation, nous avons purifié partiellement les entérocines BRO2 et

LO12 en adoptant les étapes de purification utilisées par Kramer et Brandis (1975) qui leur

ont permis de purifier 2 bactériocines produites par une souche d’E. faecium. Ces étapes

étaient une précipitation au sulfate d’ammonium, une séparation sur colonne de gel filtration

suivi d’une chromatographie échangeuse d’ion.

Généralement la première étape de purification des bactériocines permettant de réduire le

volume de travail est de concentrer les bactériocines par l’utilisation de sulfate d’ammonium.

Cette étape a été rapportée dans de nombreuses stratégies de purification des bactériocines.

Yang et al. (1992) ont utilisé le sulfate d'ammonium. Cette étape est utilisée principalement

pour réduire le volume de travail, elle ne fournit pas un haut degré de purification (Guyonnet

et al., 2000). Différentes saturations de sulfate d’ammonium précipitant les entérocines ont été

rapportées. Sambrook et al. (1989) ont fait précipiter les peptides à partir du surnageant

exempt de cellules avec 70% de saturation de sulfate d'ammonium. Certaines bactériocines

peuvent précipiter à des concentrations de sulfate d'ammonium inférieures, ou même dans une

étroite fourche de saturation. Il est important de déterminer la concentration de sel qui

précipite le peptide d'intérêt (Pingotire et al., 2007). Dans notre étude l’entérocine BRO2 a

été précipitée à 80% de saturation alors que l’entérocine LO12 a été précipitée à 40% de

saturation.

La plupart des protocoles de purification à l’échelle analytique regroupent une étape de

précipitation au sulfate d’ammonium suivie d’une série de chromatographies ioniques ou

hydrophobes et finalement d’une étape de chromatographie à haute pression en phase inverse

(Parente et Ricciard, 1999). L’entérocine ON-157 (Ohmomo et al., 2000), l’entérocine P

(Cintas et al., 1997), l’entérocine LR/6 (Kumar et al., 2010), et l’entérocine FH 99 (Gupta

et al., 2010) ont été purifiées en utilisant plusieurs étapes de purification.


136

Dans cette étude 3 méthodes de purification classiques ont permis de purifier l’entérocine

BRO2 par précipitation à 80% de saturation suivi de la filtration sur gel de Séphadex G-25 et

de la chromatographie échangeuse d’anions DEAE-cellulose. L’analyse électrophorétique de

la fraction obtenue par chromatographie échangeuse d’anions DEAE-cellulose a révélé que la

stratégie de purification adoptée est appropriée à la purification de l’entérocine BRO2. A

chaque séparation par chromatographie un seul pic d’absorption présentait une activité

antibactérienne. Nous suggérons que d’après ces chromatographies E. faecium BRO2 produit

une entérocine cationique.

L’analyse par SDS-PAGE a montré une entérocine de poids moléculaire approximativement

compris entre de 5700 et 6900 Da. Kumar et al. (2010) ont révélé par Tricine-SDS-PAGE

que l’entérocine LR/6 est approximativement de 6,1 kDa. Pinto et al. (2009) ont également

purifié partiellement une bactériocine bac ALP7 d’E. faecium dont la taille moléculaire est en

dessous de 6,5 kDa. Tandis que Line et al. (2008) ont purifié une entérocine E-760 dont

l’analyse par SDS-PAGE a révélé un seul peptide de masse moléculaire d’environ 5 500 Da

produisant une zone d’inhibition de C. jejuni. Tulini et al. (2011) ont observé que la

bactériocine d’ E. faecium130 par SDS-PAGE, donne une bande active entre 3,5 et 6,5 kDa.

L’analyse des bactériocines d’E. faecium LO12 par chromatographie gel filtration et CM-

Sephadex C-25 a montré que l’activité antibactérienne était éluée en un seul pic d’absorption.

Cette observation nous permet de suggérer qu’E. faecium LO12 produit une seule bactériocine

qui est cationique. La perte d’activité après électrophorèse ne nous a pas permis de déterminer

le poids moléculaire de cette bactériocine. L’absence d’activité des différentes bandes

séparées sur SDS-PAGE suppose que l’entérocine LO12 nécessite une certaine concentration

pour inhiber la souche indicatrice puisque la fraction FA3 LO12 a présenté un faible diamètre

d’inhibition de l’ordre de 3 mm. Il est probable que l’entérocine LO12 nécessite pour son

activité d’être en présence d’autres molécules puisque la fraction active présenta plusieurs

bandes protéiques sur gel SDS-PAGE


137

Nous avons noté une diminution de l’activité de l’entérocine après chaque étape de

purification malgré la concentration des fractions après chaque étape de purification. De

nombreux auteurs ont rapporté que la reprise de l'activité antibactérienne était supérieure à

50% après une filtration sur gel et une chromatographie échangeuse de cations de la

bactériocine brute (Herranz et al., 2001). Gupta et al. (2010) n’ont récupéré qu’une activité

antibactérienne inférieure à 1% en terme d’activité totale et de valeurs d'activité spécifiques.

Gänzle et al. (1999) ont démontré que des facteurs écologiques, tels que la teneur en

protéines, le pH, la salinité, et / ou composition en sel du milieu module l'activité des

bactériocines.

Conclusion

Conclusion

138

Dans ce travail de thèse, nous nous sommes intéressés à l’étude de bactéries lactiques isolées

de produits locaux. Nous avons pu isoler 20 souches de bactéries lactiques à partir de 2

échantillons de beurre (BRA et BRC) et 21 souches à partir de 12 échantillons de lait cru

(LO). Nous avons également utilisé pour cette étude 4 souches d’Enterococcus sp codées

BRO2, LO4, LO12 et H3. L’identification phénotypique de ces bactéries à l’aide de galeries

API 20 Strep révéla que 13 souches sont identifiées à L.lactis, 02 souches à L. cremoris, 08

souches à Enterococcus faecium, 04 souches à Enterococcus faecalis, 01 souche à

Lactococcus garvieae, 03 souches à Enterococcus durans, 14 souches à Enterococcus sp. Les

résultats de l’identification montrent que le lait cru contient parmi sa flore des souches

d’Enterococcus dont deux espèces ont été identifiées à E. durans (2 souches) et E. faecium (4

souches).

L’évaluation de l’activité inhibitrice des bactéries lactiques par la méthode de Fleming et al.,

(1975) a montré que 57% des isolats de lait cru sont inhibiteurs de Staphylococcus aureus

ATCC 25925, Staphylococcus aureus ATCC 43300, E. coli ATCC 25922 et de Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853. Quant aux autres souches, seulement 13% des bactéries lactiques

testées présentent une activité inhibitrice vis-à-vis des 6 bactéries cibles. Les isolats lactiques

des échantillons de beurre et de lait cru ainsi que les souches Enterococcus sp BRO2, LO4 et

LO12 ont montré que les bactéries lactiques sont douées d’activité inhibitrice vis-à-vis de

bactéries cibles à Gram+ et à Gram-. Parmi ces bactéries lactiques inhibitrices, nous n’avons

retenu que les bactéries présentant des diamètres d’inhibition ≥ 10 mm. Les souches

sélectionnées sont L.lactis BRA1, BRA3, BRA6, BRA7, BRA8, LO3.1 et Enterococcus sp

LO2.2 LO3.2, LO12.3 ainsi que E. faecium LO12.1, BRO2, LO4, E. durans LO1.5 et E.

faecium LO4.4, LO12 et Enterococcus sp LO12.2.

Le potentiel inhibiteur des bactéries sélectionnées a été évalué sur un milieu de culture gélosé

et tamponné. Parmi les 17 souches inhibitrices sélectionnées les bactéries d’Enterococcus

isolées du lait LO n’ont été inhibitrices que sur milieu non tamponné. Ces résultats laissent

supposer que ces inhibitions sont dues à l’effet de l’acidité produite par les bactéries lors de la

croissance. Les souches de L.lactis ssp lactis (sauf LO3.1) ont inhibé la souche E. faecium H3

en milieu tamponné et en milieu non tamponné. Parmi les souches d’entérocoques étudiées,

nous avons observé une activité antibactérienne sur gélose tamponné. Ces cas d’inhibitions

représentent 18% des inhibitions. Les bactéries sélectionnées après cette étape peuvent être

utiles pour inhiber des bactéries telles que Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris et E.

Conclusion

139

faecium. Ces bactéries lactiques sont douées d’activité inhibitrice dirigée contre des bactéries

de même groupe, des bactéries à Gram+ et/ou des bactéries à Gram -.

Les souches E. faecium BRO2, LO4 et LO12 sont probablement des bactéries

bactériocinogènes. Elles se sont avérées les plus efficaces et ont été sélectionnées pour la suite

de l’étude. La souche E. faecium H3 est plus sensible que les autres bactéries tests, cette

bactérie a été sélectionnée comme souche indicatrice.

Les souches sélectionnées susceptibles d’être des bactériocinogènes (E. faecium BRO2, LO4

et LO12) ont été identifiées par caractérisation moléculaire. Les profils électrophorétiques des

produits de PCR des 3 souches E. faecium BRO2, LO4, LO12 ont présenté une bande de

même intensité de 733 pb. Leur caractérisation à l’échelle génotypique par séquençage et

analyse phénotypique de fragments d’ADN après amplification PCR d’une partie du gène

ARNr 16S a montré que les séquences des souches bactériennes étudiées sont similaires

(99%) aux séquences de souches d’E. faecium d’une base de données.

La caractérisation des agents inhibiteurs produits par E. faecium BRO2, LO4 et LO12

responsables de l’activité antibactérienne a montré qu’elles inhibent E. faecium H3 en milieu

M17 non tamponné et M17 tamponné. Ces résultats ont révélé que l’inhibition est due à des

substances extracellulaires qui diffusent à travers la gélose molle. La sensibilité des bactéries

cibles Proteus mirabilis HB3, Pseudomonas sp HB2, E coli EC3, P aeruginosa HB5 dépend

de la concentration des agents inhibiteurs.

Les extraits concentrés produits par E faecium BRO2, LO4 et LO12 ont été sensibles à toutes

les enzymes protéolytiques testées à l’exception de la pepsine. Ces résultats suggèrent que

l’activité inhibitrice des souches E faecium BRO2, LO4 et LO12 est due à des substances de

nature protéique. L’agent antibactérien de la souche E faecium LO4 est plus stable au

traitement thermique par rapport aux autres agents antibactériens des souches E faecium

BRO2 et LO12. L’activité antibactérienne de la souche E. faecium BRO2 est maximale à pH

7 (20480 AU/ml). Elle diminue pour des pH acides et basiques, sans que les métabolites ne

soient complètement inactivés. L’agent antibactérien LO4 présente une activité maximale

(2560 AU/ml) à des pH 6 et 7, alors que pour des pH acides pH (4 et 2) et basiques pH (8, 10

et 12) l’activité inhibitrice diminue. Quant à l’agent antibactérien LO12, son activité

antibactérienne est stable pour une large fourche de pH (2 à 12).

Conclusion

140

L’étude de l’effet des enzymes, du pH et de la chaleur, nous a permis de conclure que les

métabolites antibactériens (BRO2, LO4 et LO12) sont de nature protéique résistants à la

chaleur et aux pH. Nous suggérons que ces métabolites sont des bactériocines. Cette

supposition doit être confirmée par l’étude des conditions optimales de production de ces

métabolites par E. faecium ainsi que leur purification.

L’étude de l’influence des tampons du milieu de culture sur la production des bactériocines a

révélé que la variation du titre de l’activité antibactérienne en bouillon tamponné par

différents tampons est statistiquement significative chez les 3 souches E. faecium. Le tampon

phosphate de sodium est le tampon pour lequel l’activité antibactérienne est maximale par

comparaison aux autres tampons testés. Ces résultats suggèrent que le type de tampon du

milieu de culture affecte la production de bactériocines d’E. faecium BRO2, LO4 et LO12.

L’étude de l’influence de la concentration de lait écrémé ajouté au bouillon de culture a

montré que l’activité antibactérienne pour les trois souches varie en fonction de la

concentration de lait écrémé. La production de bactériocines est plus prononcée en bouillon

M17 additionné de 25% de lait écrémé. L’analyse statistique des résultats révèle que ces

concentrations n’ont aucun un effet significative sur la production des entérocines par E.

faecium BRO2 (p= 0,27) et E faecium LO4 (p= 0,181). En revanche l’analyse statistique des

résultats de la souche E faecium LO12 a révélé que ces concentrations de lait écrémé ajoutées

au bouillon M17 ont une influence significative sur la production (p= 0,007).

L’analyse statistique a démontré que les sucres testés n’ont aucune influence significative. En

revanche une activité antibactérienne plus prononcée en M17-glucose par comparaison aux

autres sucres, nous laisse suggérer que cette source de carbone et d’énergie est la plus

appropriée à la production de bactériocines étudiées.

La production de bactériocines a été évaluée sur milieu M17 et MRS modifiés (0,5% de

glucose, 25% de lait écrémé et phosphate de sodium). Les résultats obtenus ont révélé que la

production de bactériocines chez E. faecium BRO2 et LO12 est plus élevée en M17 modifié.

L’étude de la cinétique de production des entérocines produites par E. faecium a montré que

l’entérocine BRO2 et l’entérocine LO12 sont produites en phase exponentielle. Leur vitesse

de production n’est maximale qu’en phase stationnaire. Les bactériocines étudiées sont des

métabolites secondaires.

Conclusion

141

Les résultats du fractionnement des deux fractions actives BRO2 et LO12 sur séphadex G-25

permettent de déduire que les entérocines étudiées ont un poids moléculaire supérieur à 5 kDa

puisqu’elles ont été exclues dans le volume mort. L’élution des fractions actives sur des

résines échangeuses d’ions ont montré que les entérocines BRO2 et LO12 sont cationiques.

L’analyse par électrophorèse SDS-PAGE des fractions actives a révélé que l’entérocine

BRO2 a une taille moléculaire comprise entre 5700 à 6900 Da. L’absence d’activité de

l’entérocine LO12 sur le gel ne nous a pas permis d’estimer sa taille.

En perspective de cette étude il serait intéressant :

- De déterminer l’influence d’autres facteurs abiotiques pouvant avoir une influence sur

la production des bactériocines étudiées

- D’étudier le mécanisme d’action de ces bactériocines

- Localiser les gènes responsables de la biosynthèse de ces bactériocines

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Annexe I

Milieu de culture M17 (Ter zaghi et Sandine)

Ce milieu est constitué d’une solution de base et d’une solution de lactose, qui sont mélangées

après stérilisation à 120°C pendant 20 min.

Peptone de soja 5g/l

Peptone de viande 2,5g/l

Peptone de caséine 2,5g/l

Extrait de viande 5g/l

Extrait de levure 2,5g/l

Lactose 5g/l

Glycérol phosphate de sodium 19g/l

Acide ascorbique 0,5g/l

Sulfate de magnésium 0,25g/l

pH 7,2

Au bouillon on ajoute de l’agar-agar à une concentration de 15g/l pour obtenir la gélose M17

MRS de culture MRS (Man, Rogosa et Sharpe)

Peptone 10 g/l

Extrait de viande 10 g/l

Extrait de levure 5 g/l

Glucose 20 g/l

Tween 80 1 g/l

Phosphate di potassique 2,00 g/l

Citrate d’ammonium 5 g/l

Sulfate de magnésium 200 g/l

Sulfate de manganèse 50 g/l

pH 6,5

Le milieu est stérilisé pendant 20 minutes à120°C

Au bouillon on ajoute de l’agar-agar à une concentration de 15g/l pour obtenir la gélose MRS

Lait écrémé

Poudre de lait écrémé : 10g

Eau distillée : 100 ml

Le milieu est stérilisé à 110°C Pendant 10min

Bouillon Nutritif

Peptone 10 g/l

Extrait de viande 5 g/l

NaCl 3 g/l

pH 7

Le bouillon est stérilisé à 120°C pendant 20 min.

Au bouillon on ajoute de l’agar-agar à une concentration de 15g/l pour obtenir la gélose

nutritive

Annexe II

Tampon Phospahate Sodium

Solution A (0,2M) NaH2PO4 27,8 g/l

Solution B (0,2M) Na2HPO 53,65 g/l

Pour obtenir un tampon à pH 7, il faut ajouter à 39 ml de solution A, 61 ml de solution B. Le

mélange est complé jusqu'à 200 ml d’eau distillée ou de bouillon de culture dans le cas de

milieu de culture tamponné

Tampon Glycine NaOH

Solution A (0,2M) Glycine 15,01 g/l 50 ml

Solution B (0,2M) NaOH 22,4 ml

Pour obtenir un tampon à pH 9,6, il faut ajouter à 50 ml de solution A, 22,4 ml de solution B.

Le mélange est complété jusqu’à 200 ml d’eau distillée ou de bouillon de culture dans le cas

de milieu de culture tamponné

Tampon Citrate phosphate

Solution A (0,1M) Acide citrique (19,21g/l)

Solution B (0,2M) Na2HPO 53,65 g/l

Pour obtenir un tampon à pH 7, il faut ajouter à 6,5 ml de solution A, 43,6 ml de solution B.

Le mélange est complété jusqu’à 100 ml d’eau distillée ou de bouillon de culture dans le cas

de milieu de culture tamponné.

Tris aminométhane maléate

Solution A (0,2M) Tris Acide maléate (24,2g de tris aminomethane + 23, 2g d’acide

maléique dans1000 ml)

Solution B (0,2M) NaOH

Pour obtenir un tampon à pH 7, il faut ajouter à 50 ml de solution A, 48 ml de solution B. Le

mélange est complété jusqu’à 200 ml d’eau distillée ou de bouillon de culture dans le cas de

milieu de culture tamponné

bactériocines d’entérocoques isolés de lait cru et beurre...

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