bacteriocin asal tambak udang (draft)
TRANSCRIPT
1
POTENSI Bacillus sp. PENGHASIL SENYAWA BAKTERIOSIN ASAL TAMBAK UDANG
SEBAGAI PENGHAMBAT Vibrio harveyi
Asahedi Umoro1, Nisa Rachmania Mubarik2*, Widanarni3
1Program studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor
2Departemen Mikrobiologi FMIPA Institut Pertanian Bogor
3Departemen Budidaya Perairan FPIK Institut Pertanian Bogor
*Corresponding Author: Telp. 0815 8321 972, Fax. 0251 8622833, email. [email protected]
Running title : Bacillus sp. penghasil Bakteriosin penghambat Vibrio harveyi
Abstract
One of the important bacterial pathogen in shrimp culture is Vibrio harveyi. Application of
Bacillus sp. is alternative solution to control the growth of bacterial pathogen in shrimp culture,
because this bacteria could produce antimicrobial polypeptides such as bacteriocins that can
inhibit growth of other bacteria. The objective of the research was to screen Bacillus sp. as
bacteriocin produce from shrimp farm in Pangandaran, West Java and examined their
antimicrobial activity againts Vibrio harveyi. Five potential bacterial were obtained and all of
bacterial suspect to produce bacteriocins. The LTP 1 isolate has the biggest antimicrobial
activity and selected to identify using 16s RNA, produce of bacteriocins on growth media culture,
and test antagonistic to Vibrio harveyi. The LTP 1 isolate was identified as Bacillus subtilis with
the similarity level 96%. Maximal activity of bacteriocin was recorded during the early stationay
phase. A reduction in antimicrobial activity was recorded after treatment of bacteriocins with
protease K. The 70% ammonium sulfate precipitate of bacteriocin is the highest inhibitory of
activity with index inhibitory 2,7; Activity Unit 2490 mm2/ml and could increase 142 % than
inhibitor zone. The LTP 1 isolate could be used as a potential bacteriocin and reduced growth of
Vibrio herveyi.
Keywords: Bacillus sp., bacteriocins, antimicrobial, Vibrio harveyi, shrimp
2
2
Abstrak
Salah satu bakteri patogen penting didalam budidaya udang ialah Vibrio harveyi. Aplikasi
Bacillus sp. dapat digunakan sebagai alternatif solusi untuk mengontrol pertumbuhan bakteri
patogen pada budidaya udang, dikarenakan bakteri Bacillus sp. dapat menghasilkan senyawa
antimikrob polipeptida seperti bakteriosin yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri
patogen. Tujuan dari penelitian ini adalah mengisolasi Bacillus sp. penghasil bakteriosin asal
tambak udang, Pangandaran, Jawa Barat dan melakukan pengujian aktifitas penghambatan
terhadap Vibrio harveyi. Lima isolat potensial berhasil diperoleh dan diduga sebagai penghasil
bakteriosin. Isolat LTP 1 merupakan isolat dengan aktivitas antimikrob terbesar dan dipilih untuk
analisa molekuler dengan 16s RNA, produksi bakteriosin pada media pertumbuhan, dan uji
antagonis penghambatan terhadap Vibrio harveyi. Isolat LTP 1 telah diidentifikasi sebagai
Bacillus subtillis dengan tingkat kesamaaan 96%. Aktivitas maksimal antimikrob bakteriosin
terjadi pada awal fase stasioner. Penurunan aktivitas antimikrob bakteriosin terjadi setelah
dilakukan perlakuan dengan enzim protease K. Pengendapan bakteriosin dengan amonium
sulfat 70% memiliki aktivitas penghambatan terbesar dengan indeks penghambatan 2,7; aktifitas
unit penghambatan 2490 mm2/ml dan dapat meningkatkan zona penghambatan sebesar 142%.
Isolat LTP 1 dapat digunakan sebagai bakteriosin yang potensial dan menekan pertumbuhan
Vibrio harveyi.
PENDAHULUAN
Udang merupakan salah satu komoditas unggulan perikanan budidaya di Indonesia,
dengan permintaan dunia yang terus mengalami peningkatan dari tahun ke tahun. Sebagai
salah satu negara penghasil udang, tantangan terbesar yang dihadapi oleh pembudidaya ialah
serangan penyakit. Salah satu penyakit bakterial yang paling serius dan sering menyebabkan
kematian masal pada saat budidaya adalah vibriosis yang disebabkan oleh bakteri patogen
Vibrio harveyi. Alternatif pengendalian penyakit udang yang disebabkan Vibrio harveyi di tambak
udang ialah dengan memanfaatkan Bacillus sp. Bacillus sp. diketahui menghasilkan senyawa
3
antimikrob berupa bakteriosin yang memiliki kemampuan penghambatan pertumbuhan bakteri
patogen gram positif dan gram negatif (Jianhua et el. 2009) dan dapat diisolasi dari sendimen,
lingkungan perairan dan saluran pencernaan udang (Ravi et al. 2007).
Bakteriosin sendiri merupakan senyawa antimikrob polipeptida yang disintesis di
ribosom. Proses sintesis ini berlangsung selama masa pertumbuhannya dan umumnya hanya
menghambat galur-galur yang berkerabatan dekat dengan bakteri penghasil bakteriosin dan
beberapa memiliki aktivitas penghambatan yang berspektrum luas (Drider et al. 2006).
Senyawa aktif bakteriosin yang dihasilkan oleh bakteri Bacillus sp. diharapkan dapat
menekan dan mengendalikan bakteri patogen Vibrio harveyi yang menyerang udang dan
penyebab kegagalan panen. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan menyeleksi bakteri
Bacillus sp. penghasil bakteriosin asal tambak udang Pangandaran Jawa Barat, yang potensial
digunakan untuk menghambat pertumbuhan Vibrio harveyi.
METODE
Pengambilan Sampel. Pengambilan sampel air dan sendimen lumpur diambil dari tambak
udang daerah Pangandaran Jawa Barat. Sampel air diambil sebanyak 100 ml sedangkan
sedimen diambil kira-kira 100 g kemudian dimasukkan ke dalam botol sampel. Semua sampel
disimpan di dalam kondisi dingin hingga sampai di laboratorium (Jamilah et al. 2011).
Seleksi Isolat Bacillus sp. Sampel bakteri diencerkan dengan garam fisiologis hingga
pengenceran 10-4-10-6 kemudian dipanaskan di dalam penangas air pada suhu 80 0C selama 15
menit. Sebanyak 0.1 mL sampel kemudian disebar pada media agar-agar SWC (seawater
complete) 50% yang mengandung 1.5 gL-1 bakto pepton, 0.5 gL-1, ekstrak ragi dan 1.5 mL-1,
gliserol dalam campuran air laut dan akuades dengan perbandingan 3:1, kemudian diinkubasi
pada suhu ruang. Metode ini memberi peluang bagi tertapisnya Bacillus (Jamilah et al. 2011).
4
4
Uji Aktivitas Penghambatan Antimikrob. Isolat bakteri Bacillus sp. dan bakteri V. harveyi
diremajakan pada media SWC, kemudian diinkubasi selama ± 2 hari. Untuk mengetahui
kemampuan isolat bakteri Bacillus sp. yang menghasilkan zat antimikrob, dilakukan uji
penghambatan terhadap V. harveyi. Sebanyak 50 µl biakan bakteri V.harveyi dengan kepadatan
sel 106 CFU/ml disuspensikan dalam 50 ml SWC semipadat, kemudian dituang sekitar ± 10 ml
pada permukaan SWC padat dan didiamkan beberapa saat hingga beku. Selanjutnya isolat
bakteri Bacillus sp. yang berumur dua hari digores atau ditotolkan pada SWC agar yang sudah
berisikan bakteri V. harveyi dengan menggunakan jarum ose dan diinkubasi pada suhu ± 280C
selama 24 jam. Bakteri yang memiliki kemampuan dalam menghasilkan senyawa antimikrob
menunjukan adanya zona bening (zona penghambatan) di sekitar koloni dan dihitung Indeks
penghambatannya dengan menggunakan rumus:
Indeks Penghambatan =
Uji Aktivitas Penghambatan Bakteriosin. Isolat yang sudah diketahui indeks
penghambatannya terhadap V. harveyi ditumbuhkan pada media SWC cair dan diinkubasi
selama 24 jam pada inkubator bergoyang pada suhu ± 280 C, kemudian kultur bakteri
disentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm (Sentrifuge Hermle dengan rotor 220.97) selama 5
menit. Supernatan dilakukan penetralan pada pH 7 dengan penambahan 0,1 M NaOH.
Sebanyak 100 µl biakan bakteri V. harveyi dengan kepadatan sel 106 CFU/ml dituang pada
media SWC agar dan dilakukan penggoresan dengan menggunakan cotton bud steril untuk
meratakan. Sebanyak 50-100 µl supernatan di teteskan ke kertas cakram berukuran 5 mm.
Kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ± 280C dan zona bening (zona penghambatan)
yang terbentuk dihitung (Sharma et al. 2011) dan aktivitas unit (mm2/ml) penghambatan
bakteriosin dihitung dengan persamaan (Usmiati & Marwati. 2007).
Akitivitas unit (mm2/ml)=
5
Untuk memastikan bahwa aktivitas penghambatan yang terjadi disebabkan oleh
senyawa polipeptida bakteriosin, maka dilakukan uji kepekaan terhadap enzim proteolitik
dengan menambahkan enzim protease K (1 mg/ml) dan supernatan dengan perbandingan 1:1
dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu ± 280C kemudian diuji aktivitas penghambatan terhadap
V. harveyi. (Nguyen et al. 2014).
Kurva Tumbuh dan Penentuan Sintesis Bakteriosin. Satu lup isolat Bacillus sp. terpilih yang
berumur 24 jam dan memiliki aktivitas penghambatan terbesar ditumbuhkan pada 10 ml media
SWC cair kemudian ditumbuhkan selama 12 jam. Kemudian pindahkan sebanyak 1,5 ml kultur
ke dalam media cair 150 ml dan diinkubasi selama 24 jam untuk diamati pertumbuhan sel
dengan mengukur absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm setiap 3 jam. Penentuan
sintesis bakteriosin dilakukan setiap 3 jam selama 24 jam dengan diambil sebanyak 3 ml kultur
ke dalam tabung mikro dan dilakukan sentrifuse pada kecepatan 10.000 rpm (Centrifuge Hermle
dengan rotor 220,97) selama 5 menit kemudian supernatan bebas sel kita uji aktivitas
antimikrobnya terhadap V. harveyi (Lisboa et al. 2006) dan dihitung kadar proteinnya.
Pengendapan Amonium Sulfat, Perhitungan Kadar Protein dan Penentuan Bobot Molekul.
Isolat Bacillus sp. terpilih ditumbuhkan di dalam kultur cair hingga memasuki fase awal stationer,
lalu sel dipisahkan dengan sentrifugasi dan protein di dalam supernatan dilakukan presipitasi
dengan penambahan 10% amonium sulfat secara bertingkat dari 30-80%. Kemudian presipitat
dilarutkan kedalam sodium phospate–buffer saline pH 7 (PBS). Hasil presiptasi ammonium
sulfat kemudian dilakukan pengujian aktivitas antimikrob (Lisboa et al. 2006) dan dihitung
konsentrasi protein. Selanjutnya dilakukan elektroforesis SDS-pages untuk penentuan bobot
molekul. Penentuan bobot molekul ditentukan dengan menggunakan 12% gel pemisah dan 4%
gel penumpuk. Kondisi elektroforesis ialah 50 mA, 100 volt selama 30 menit. Hasil
elektroforesis diwarnai oleh Coomasie Brilliant Blue G-250 (CBB G-250). Bobot molekul sampel
dihitung dengan menggunakan kurva standar bobot molekul protein.
6
6
Karakterisasi Isolat Bakteri. Isolat Bacillus sp. dikarakterisasi berdasarkan ciri-ciri morfologi
dan fisiologi berdasarkan: pewarnaan Gram, dan spora mengikuti Bergey’s Manual of
Determintive Bacteriology.
Identifikasi Molekuler Bakteri Terpilih. Isolasi DNA genom dilakukan menggunakan Geneid
Presto Mini gDNA Bacteria Kit. Primer yang digunakan ialah primer spesifik untuk prokariot, 63f
(5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan 1387r (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’)
Komposisi reaksi PCR dengan volume reaksi 50 µl yang mengandung 25 µl mix PCR, 0.8 µl
DNA template, 0.5 µl primer forward (10 pmol), 0.5 µl primer reverse (10 pmol) dan 23.2 µl
ddH2O steril. Kondisi PCR yaitu pradenaturasi (94 0C, 5 menit), denaturasi (94 0C, 1 menit),
annealing (55 0C, 1 menit), elongation (72 0C, 1 menit), dan post elongation (72 0C, 7 menit)
sebanyak 27 siklus. Elektroforesis dengan menggunakan agarosa 1% pada tegangan listrik 80
Volt selama 45 menit. Visualisasi DNA dilakukan di atas UV transluminator menggunakan
pewarna Etidium Bromida (EtBr). DNA hasil amplifikasi disekuen untuk mengetahui urutan basa
nukleotidanya. Urutan basa nukleotida hasil sekuen kemudian disejajarkan dengan data
GeneBank menggunakan program BLASTN (Basic Local Alignment Search Tool-Nucleotida)
dari situs NCBI (National Center for Biotechnology Information). Analisis filogenetik dilakukan
menggunakan program MEGA 6 dengan metode Neighbour Joining (NJ) dengan bootstrap
1000x.
Uji Penghambatan Bakteriosin dan Kompetisi Bacillus sp. terhadap V. Harveyi. Bakteriosin
hasil pengendapan ammonium sulfat diinokulasi bersama dengan bakteri V. harveyi (106
CFU/ml) pada media SWC cair 50 ml dengan perbandingan 1:1 (50 µl : 50 µl) dan 1:2 (100 µl :
50 µl) dan satu erlemeyer digunakan sebagai kontrol (tanpa penambahan bakteriosin). Inkubasi
dilakukan selama 24 jam pada suhu ± 28 0C untuk menentukan kemampuan penghambatan
bakteriosin terhadap V. harveyi. Jumlah sel V. harveyi yang tumbuh dihitung dengan metode
cawan sebar pada media SWC padat. Sedangkan uji kompetisi Bacillus sp. dengan bakteri V.
harveyi dilakukan dengan menginokulasikan Bacillus sp. dan V. harveyi dengan perbandingan
7
1:1 (50 µl : 50 µl) dan 2:1 (100 µl : 50 µl) diinkubasi selama 24 jam. Kemampuan kompetisi
ditentukan dengan menghitung jumlah V. harveyi dengan metode cawan sebar. Penentuan
persentase penghambatan dihitung dengan persamaan.
Persen Penghambatan =
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Bacillus sp. Penghasil Bakteriosin. Sebanyak 22 isolat Bacillus sp. diperoleh dari
sampel sendimen lumpur dan air tambak udang Pangandaran, Jawa Barat. Penapisan Bacillus
sp. dilakukan dengan cara memanaskan sampel dalam larutan garam fisiologis pada suhu 800 C
selama 15 menit. Metode ini sudah menjadi cara yang umum dilakukan untuk menyeleksi
Bacillus dari sampel alam, karena bakteri ini merupakan bakteri penghasil endospora.
Endospora akan tahan terhadap suhu pemanasan dan bakteri yang tertapis ialah kelompok
Bacillus (Jamilah et al. 2011). Bakteri ini memiliki ciri-ciri koloni yang spesifik seperti permukaan
yang berpati, umumnya berwarna krem keputihan atau kekuningan jika ditumbuhkan pada
media padat. Bacillus dari tambak udang diperkirakan termasuk kepada kelompok bakteri
mesofilik. Suhu perairan tambak udang berkisar antara 26-320 C. Pada penelitian ini, sendimen
lumpur merupakan sumber Bacillus yang paling dominan dibandingkan dengan sampel lainnya.
Hal ini dapat disebabkan banyaknya nutrisi dari sisa pakan yang ikut terakumulasi pada
sendimen sebagai sumber nutrisi bagi Bacillus.
Dari 22 isolat yang didapat dilakukan seleksi penghambatan terhadap bakteri Vibrio
harveyi dan diperoleh 12 isolat yang mempunyai aktivitas antimikrob. Dari 12 isolat yang
mempunyai kemampuan antimikrob kemudian di pilih 5 isolat terbaik yaitu: LTP 1, LTP 4, LTP 6,
LTP 14, dan ATP 2, yang memiliki indeks penghambatan terbesar (Tabel 1) untuk diamati
karakteristik morfologi isolat dan diuji lanjut aktivitas antimikroba bakteriosin.
Aktivitas Penghambatan Bacillus sp. Hasil uji aktivitas penghambatan sel lima isolat Bacillus
sp. penghasil antimikrob dari tambak udang terhadap V.harveyi (sel 106 cfu/ml) menunjukan
8
8
bahwa indeks penghambatan yang didapat berkisar antara 1,07-1,77 dengan nilai tertinggi pada
isolat LTP 1 dan aktivitas penghambatan supernatan bebas sel untuk kelima isolat berkisar
antara 1,53 – 1,93 dengan nilai tertinggi pada isolat LTP 1 (Tabel 2). Faktor yang mempengaruhi
besar kecilnya aktivitas penghambatan zat antimikrob diantaranya adalah aktivitas zat
antimikrob gugus fungsi dari substansi sendiri, resistensi dari bakteri terhadap substansi zat
antimikrob, kadar substansi aktif serta jumlah inokulum atau kepadatan bakteri uji (Noaman et
al. 2014)
Aktivitas unit yang didapat dari kelima isolat Bacillus sp. berkisar antara 1063-1492
mm2/ml, dan berdasarkan pengujian kepekaan enzim proteolitik dengan menggunakan enzim
protease K menunjukan bahwa kelima supernatan bebas sel ternyata sensitif terhadap enzim
protease (Gambar 1). Hal ini ditunjukkan kelima isolat menurun aktivitas penghambatannya
terhadap V. harveyi ketika diuji supernatan bebas sel dengan perlakuan enzim protease K, ini
menunjukan bakteriosin merupakan senyawa polipeptida (protein) yang peka terhadap enzim
protease K dan enzim protease mampu mendegradasi senyawa bakteriosin. Berdasarkan
penelitian Lisboa et al (2006). tingkat sensitivitas pada perlakuan enzim protease terkait dengan
konsentrasi enzim protease pada perlakuan, asam-asam amino, dan rantai peptida yang dimiliki
oleh bakteriosin.
Kurva Tumbuh dan Sintesis Bakteriosin. Isolat LTP 1 yang merupakan isolat dengan
kemampuan penghambatan terbaik sehingga dipilih untuk dilakukan pengamatan terhadap laju
fase pertumbuhan, waktu sintesis bakteriosin, dan pengukuran kadar proteinnya. Sintesis
bakteriosin sudah mulai terjadi pada fase logaritmik, dimana aktivitas penghambatan supernatan
(bakteriosin) mulai terjadi pada waktu pengamatan jam ke-9 dengan zona hambat yang terjadi 8
mm (Gambar 2). Bakteriosin merupkan senyawa antimikrob polipeptida yang disintesis di
ribosom, proses sintesis ini berlangsung selama masa pertumbuhannya (Drider et al. 2006).
Perhitungan kadar protein yang didapat selama fase pertumbuhan berkisar antara 16,7 10-2
mg/ml sampai 69,4 x 10-2 mg/ml.
9
Pengendapan Amonium Sulfat dan Perhitungan Bobot Molekul Bakteriosin. Pengendapan
dengan menggunakan amonium sulfat bertujuan untuk meningkatkan konsentrasi protein
sehingga diperoleh zat antimikrob dalam jumlah yang banyak. Pengendapan dilakukan secara
bertingkat dengan penambahan amonium sulfat 10% mulai pengendapan 30%-80%. Hasil
pengendapan 60-70% dan 70-80% menunjukan aktivitas penghambatan tertinggi dengan nilai
penghambatan sebesar 18,5 mm dan 16,5 mm (Gambar 3). Peningkatan zona hambat sebesar
142 % terjadi pada pengendapan 60-70% dengan nilai AU sebesar 2490 (mm2/ml) dan
peningkatan zona hambat sebesar 126 % untuk pengendapan 70-80% dengan nilai AU
1941(mm2/ml) jika dibandingkan dengan ekstrak kasar supernatan sebelum pengendapan
(Tabel 3). Penelitian ini memiliki kesamaan dengan penelitian yang dilakukan oleh Sharma et al.
(2011) bahwa Bacillus subtilis R75 memiliki aktivitas penghambatan bakteriosin tertinggi hasil
pengendapan pada konsentrasi 70% dengan aktivitas penghambatan menunjukkan spektrum
penghambatan yang luas.
Hasil pemisahan protein hasil pengendapan bakteriosin dengan SDS-PAGE menunjukkan
bahwa bobot molekul dari bakteriosin ekstrak kasar dan bakteriosin hasil pengendapan
bervariasi antara 10,03 kDa hingga sekitar 22,46 kDa (Gambar 4). Bakteriosin dengan
pengendapan 80% dan 70% amonium sulfat memperlihatkan adanya 4 pita dengan bobot
molekul yang bervariasi masing-masing sebesar 10,03 kDa, 15,12 kDa, 18,75 kDa, dan 22,46
kDa. Pita hasil pengendapan ammonium sulfat memiliki pita yang lebih tebal dibandingkan
dengan pita hasil ekstrak kasar bakteriosin ini menunjukan semakin tebal pita hasil
elektroforesis menunjukkan bahwa konsentrasi protein semakin tinggi.
Identifikasi Molekuler. Hasil amplifikasi dari gen penyandi 16S rRNA didapatkan produk pita
yang berukuran 1300 bp yang menunjukkan gen 16S rRNA yang teramplifikasi. Hasil analisis
filogenetik dengan BLASTN isolat LTP 1 menunjukan bahwa isolat LTP 1 mempunyai
kekerabatan dekat dengan Bacillus subtilis galur DSM 10 dengan tingkat kemiripan 96%
10
10
(Gambar 5). Bacillus subtilis merupakan bakteri yang diketahui dapat menghasilkan bakteriosin
jenis subtilisin A (Sharma et al. 2011).
Uji Penghambatan Bakteriosin dan Kompetisi Bacillus sp. terhadap V. Harveyi. Hasil uji
kompetisi penghambatan bakteriosin dan Bacillus LTP 1 terhadap V. harveyi pada kultur cair
selama 24 jam inkubasi menunjukkan adanya kemampuan penghambatan terhadap
pertumbuhan V. harveyi. Persentase penghambatan bakteriosin tertinggi terjadi pada bakteriosin
hasil pengendapan 70 % dengan perbandingan 2:1 yaitu sebesar 59,36 % sedangkan
penghambatan untuk isolat Bacillus LTP 1 terhadap pertumbuhan V.harveyi terbesar terjadi
pada perlakuan konsentrasi 2:1 dengan penghambatan 43,07 % (Gambar 6). Bacillus subtilis
yang banyak terdapat pada lingkungan tambak udang diketahui memiliki kemampuan untuk
menghambat V. harveyi sehinga dapat menurunkan tingkat kematian pada budidaya udang
Litopenaeus vannamei dan dapat dijadikan sebagai kandidat probiotik dalam akuakultur
(Balcazar & Rojas-Luna, 2007).
SIMPULAN
Bakteriosin yang dihasilkan Bacillus LTP 1 memiliki kemampuan untuk menghambat
pertumbuhan Vibrio harveyi, persentase penghambatan sebesar 59,36 %. Sintesis bakteriosin
mulai terjadi pada fase logaritmik dengan indeks penghambatan bakteriosin setelah diendapan
dengan ammonium sulfat 70 % yaitu 2,7 dan aktifitas unit 2490 mm2/ml. LTP 1 memiliki
kemiripan 96% dengan Bacillus subtilis galur DSM 10 berdasarkan hasil identifikasi dengan gen
16 sRNA.
DAFTAR PUSTAKA
Balcazar J L, Rojas-Luna T. 2007. Inhibitory Activity of probiotic Bacillus subtilis UTM 126
against Vibrio Species confers protection against vibriosis in juvenile shrimp (Litopenaeus
vannamei). Current Microbiology 55: 409-412.
11
Drider D, Fimland G, Hechard Y, McMullen M, Prevost H. 2006. The continuing story of class IIa
bacteriocins. Microbiol Mol Biol Rev. 70(2):564-582.
Jamilah IT, Meryandini A, Rusmana I, Suwanto A, Mubarik NR. 2011. Activity of proteolytic and
amylolytic enzymes from Bacillus sp. isolated from shrimp ponds. Microbiol Indones. ISSN
1978-3477
Jienhua X, Zhang R, Shang C, Guo Y. 2009. Isolation and characterization of a bacteriocin
produced by an isolate Bacillus subtilis LFB112 that exhibits antimicrobial activity against
domestic animal phatogens. Afr J Biotechnol vol 8 (20) 5611-5619. ISSN 1684-5315.
Lisboa MP, Bonatto D, Bizani D, Henriques JAP, Brandelli A. 2006. Characterization of a
bacteriocin-like substance produced by Bacillus amyloli quefaciens isolated from the Brazilian
Atlantic forest. Int Microbiol (9):111-118.
Noaman N H, Fattah A, Khaleata M, Zaky S H. 2014. Factor affecting antimicrob activity of
Synechococus leopoliensis. Microbiol research 395-402.
Nguyen Daln V, T Pham, T H Thanh Nguyen, T T Xuan Nguyen. 2014. screning of marine
bacteria with bacteriocin – like activities and probiotik potential for ornate spiny lobster (Panuliris
ornatus) juveniles. J Fish Shelfish Immunolo 40 (2014) 49-60.
Sharma N, Kapoor R, Gautam N, Kumari R. 2011. Purification and characterization of
bacteriocin produced by Bacillus subtilis R75 isolated from fermented chunks of mung bean
(Phaseolus radiatus). Food Technol Biotechnol 49 (2) ISSN 1330-9862.
Ravi A V, Musthafa K S, Jegathammbal G, Kathiresan K, Pandian S K. 2007. Screening and
evaluation of probiotics as a biocontrol agent against pathogenic Vibrios in marine aquaculture.
Lett in App Microbiol (219-223) ISSN 0266-8254.
Usmiati S, Marwati T.2007 Seleksi dan optimasi proses produksi bakteriosin dari Lactobacollus
sp. J. Pascapanen 4 (1) 27-37.
12
12
Tabel 1 Karakteristik morfologi koloni dan sel isolat Bacillus sp. terpilih
No Morfologi Isolat Bacillus sp. Terpilih
LTP 1 LTP 4 LTP 6 LTP 14 ATP 2
A. Koloni
1 Tepi Utuh Berombak Berombak Berombak Utuh
2 Elevasi Timbul Rata Melengkung Melengkung Timbul
3 Warna Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu Putih susu
B. Sel
4 Bentuk Batang Batang Batang Batang Batang
5 Gram Positif Positif Positif Positif Positif
6 Endospora Ada Ada Ada Ada Ada
Tabel 2 Aktivitas penghambatan isolat Bacillus sp. terpilih.
No Asal Isolat Kode
Isolat
Indeks Penghambatan Aktifitas Unit
mm2/ml
Protein
mg/ml
Kepekaan
Protease Sel Supernatan
1 Sendimen LTP 1 1,77±0,93 1,93±0,12 1492 0,0834 +
2 Sendimen LTP 4 1,26±0,16 1,67±0,31 1199 0,0697 +
3 Sendimen LTP 6 1,22±0,38 1,53±0,31 1063 0,0661 +
4 Sendimen LTP 14 1,07±0,81 1,8±0,20 1342 0,0796 +
5 Air ATP 2 1,53±0,35 1,73±0,31 1270 0,0763 +
Tabel 3 Perbandingan aktivitas penghambatan sebelum dan sesudah pengendapan
No Perbandingan
Zona
hambat
(mm)
Indeks
Penghambatan AU (mm2/ml)
Kadar
protein
(mg/ml)
Peningkatan
zona hambat
1 Supernatan 13 1,6 1130 0,0811
2 60-70 % 18,5 2,7 2490 0,0905 142%
3 70-80 % 16,5 2,3 1941 0,0773 126%
Gambar 1 Aktifitas penghambatan bakteriosin pada uji kepekaan enzim protease a) buffer PBS
pH 7, b) supernatan + protease K, c) supernatan
13
Gambar 2 Kurva tumbuh isolat LTP 1 pada media pertumbuhan SWC cair, aktivitas
penghambatan dan kadar protein selama 24 jam pada suhu ±280C.
Gambar 3 Hasil pengendapan amonium sulfat terhadap penghambatan V. harveyi dan kadar
protein hasil pengendapan
Gambar 4 Penentuan bobot molekul bakteriosin isolat LTP 1 dengan SDS-PAGE. 1) Ekstrak
kasar, 2) Pengendapan 70% bakteriosin, 3) Pengendapan 80% bakteriosin
1 2 3
10 kDa
15 kDa
20 kDa
25 kDa
200
kDa
10,03 kDa 15,12 kDa
18,75 kDa
kDakDa
22,46 kDa
14
14
Gambar 5 Hasil amplifkasi 16 sRNA dan kontruksi filogenetik isolat LTP 1
Gambar 6 Uji kompetisi penghambatan bakteriosin dan Isolat Bacillus sp. LTP 1 terhadap V.
harveyi pada media SWC cair
0.02
96
85
78