bactérias fermentadoras e não fermentadoras dr. carlos emílio levy

Bactérias Fermentadoras e não Fermentadoras

Dr. Carlos Emílio Levy

índice

NF Provas básicas Fermentadores x não fermentadoresFermentadores x Não fermentadores no meio OFglicose Bactéria fermentadoraBactérias Não fermentadoras Provas para identificação de bactérias não fermentadoras OF glicose P. aeruginosa Gelatina Hidrólise da uréia de Christensen Agar citrato Hidrólise da esculina Crescimento em caldo NaCl 6,5% Prova do indol por extração PYR (pyrrolidonyl arylamidase) Discos de PMX e IPM

NF frequentemente isolados e de importância clínica

P. aeruginosa

Acinetobacter spp

Burkholderia cepacia - complexo B. cepacia e B. pseudomallei

Stenotrophomonas maltophilia

Chryseobacterium meningosepticum e C. indologenes

Moraxella spp e Oligella spp

Achromobacter spp e Alcaligenes spp

Pseudomonas putida, P. fluorescens, P. stutzeri

P. oryzihabitans e P. luteola

NF pouco isolados

NF raramente isolados e importância clínica duvidosa

• Acidovorax spp• Brevundimonas spp• Comamonas spp• Delftia spp• Methylobacterium spp• Ralstonia picketii• Roseomonas spp• Sphingomonas spp• Sphingobacterium spp• Shewanella spp

Fontes hospitalares de NF

• P. aeruginosa - agua de torneira, superfícies, medicamentos, alimentos, equipamentos

• S. maltophilia - equipamentos, pias, superfícies germicidas

• Acinetobacter spp - pia, agua, equipamentos, medicamentos, sabões, superfícies

• Burkholderia cepacia - água, soro, sabonetes, germicidas, equipamentos e medicamentos.

Não fermentadores

• Utilizam os carbohidratos como fonte de energia por via oxidativa

• diferem das enterobactérias que utilizam os carbohidratos por via fermentativa

• são todos gram negativos, aeróbios estritos, não esporulados

Tríplice açúcar ferro (TSI)

Não Fermentador Fermentador

Esquema simplificado para caracterização dos principais gêneros e espécies de bactérias não Fermentadoras de importância clínica e em Infecção Hospitalar

Provas básicas

• tubo de OFGlicose(com vaselina)

• tubo de OFGlicose(sem vaselina)

• disco de oxidase

• caldo TSB para motilidade

• tubo com lisina

• tubo com arginina

• tubo controle de aminoácidos

• tubo com gelatina

• placa de DNAse

Fermentadores x não fermentadores

Fermentadores (enterobactérias p. ex.) utilizam a glicose por via aeróbia e anaeróbia, por isso a base do TSI é sempre amarela ou ácida

Os NF crescem e usam a glicose apenas na parte aerada do tubo, que permanece sempre vermelha ou alcalina

Fermentadores x Não fermentadores no meio OFglicose

Nos tubos de OF glicose de Leifson os fermentadores utilizam a glicose tanto no tubo aberto como no fechado com óleo, ficando os dois tubos de cor amarela

Os NF pouco ou não crescem no tubo com óleo e acidificam (amarelo) a parte superior do tubo aberto, enquanto que outros o tornam alcalino (azul)

Bactéria fermentadora:

ácidoácido

ácidoácido

óleoóleo

ácidoácido

OF glicose fermentativo TSI

Bactérias Não fermentadoras

TSI

alcalino

inerte alcalino

Provas para identificação de bactérias não fermentadoras

• Trabalhar com culturas jovens (24h)

• sempre a partir de culturas puras

• a partir de meios ricos (sangue ou chocolate) ou seletivos (Mc Conkey, CLED) ou Muller Hinton

OF glicose

Semeadura

• OFGlicose (com vaselina): retirar 1-2 colônias e picar com agulha até o fundo do tubo

• OFGlicose (sem vaselina): retirar 1-2 colônias e picar com agulha até o fundo do tubo

Incubação

• a 37oC -1a. Leitura com 24h,

• se inerte, incubar até 72h

Leitura e interpretação

• OFGlicose Fermentador: dois tubos ficam amarelos (ácido)

• OFGlicose Oxidativo: tubo sem vaselina a parte superior do agar fica amarelo, tubo com vaselina permanece verde

• OFGlicose inerte ou alcalino: dois tubos não mudam de cor (inerte) ou o tubo sem vaselina fica azulado (alcalino).

• Aguardar no mínimo 72 h para definir como inerte pois pode ocorrer a oxidação tardia ou lenta.

Meio OF glicose de Leifson

alcalino fermentativo oxidativo

azul

CQ do OFglicose

• Repetir procedimento com cepa E. coli ATCC e P. aeruginosa ATCC

• E. coli após 24h de incubação deverá apresentar os dois tubos aberto e fechado(cm óleo) de cor amarela

• P. aeruginosa após 24h de incubação deverá apresentar o tubo fechado de cor verde com crescimento na linha de picada e amarelo na parte superior do tubo aberto

• Reagente: disco de oxidase, papel impregnado ou reativo na forma líquida a ser pingado em papel de filtro

• Técnica: com alça retirar 2-3 colônias semelhantes e esfregar sobre o disco ou tira de papel (pode-se umedecer o papel com 1 gota de salina estéril)

Prova da oxidase

Leitura, interpretação e CQ

• Leitura: é feita em 15 a 20 segundos. A cor violeta forte aparece rapidamente.

• Cor violeta = oxidase positivo

• Após este intervalo, cores violeta pálido são falso positivos.

• Cor branco-acinzentado = oxidase negativo

Obs: A B. cepacia pode dar reação fraca.

• Controle:

• P.aeruginosa ATCC 27853 = positivo

• A. baumannii ATCC = negativo

Prova da oxidase

Pigmento

• Amarelo : P. oryzihabitans, P. luteola Chryseobacterium spp

• verde: P. aeruginosa (no M. Hinton)• metálico: P.aeruginosa (em ágar sangue)• marron: P. aeruginosa (M. Hinton)• roseo: Roseomonas spp e Methylobacterium spp

P. aeruginosa

Prova da motilidade

• Material: caldo TSB ou BHI para motilidade

• Semeadura: inocular 2 a 3 colônias no caldo

• Incubação: 37oC durante 4 horas e repetir com 24h se negativo

• Teste: • agitar o tubo;• retirar uma gota do caldo com pipeta com

ponteira estéril ou alça bacteriológica estéril;• depositar sobre uma lâmina, cobrí-la com

lamínula; • levar ao microscópio.

Leitura, interpretação e CQ

• Observar com aumento de 400 vezes e condensador baixo.

• A presença de muitas ou poucas bactérias cruzando o campo é significativo de motilidade positiva.

• Movimentos vibratórios fracos = negativo.

• CQ: realizar o teste com cepas :

• P. aeruginosa ATCC 27853 =motilidade positiva

• Acinetobacter baumanni ATCC + motilidade negativa

Utilização de aminoácidosdescarboxilação de Moeller

São utilizados 3 tubos:• 1.-lisina• 2.-arginina:• 3.-controle de aminoácidos

Para cada tubo:• semear inóculo denso e volume pequeno de meio (1-2mL)• adicionar 2 mL de vaselina líquida

incubar a 37oC por 24h • se todos negativos, incubar pelo menos mais 24 h

Leitura e interpretação

leitura: comparar os tubos testes dos aminoácidos com o controle negativo.

• tubo controle negativo: azul-esverdeado; • provas negativas: azul esverdeado pálido;• provas positivas: cor púrpura.

Se negativo aguardar entre 48-72 h.

Resultados esperados:• ambas provas negativas• ou apenas 1 prova pode ser positiva, pois nenhum

NF é arginina + e lisina +

CQ

Cepa P. aeruginosa ATCC27853 - lisina negativa e arginina positiva

A maioria das cepas de B. cepacia e S. maltophilia são lisina positivas e todas são arginina negativas

lisina ornitina controle

+

negativo negativo

CQ

Gelatina

Reagentes: salina e uma tira de filme Raio-X revelado

• Semeadura: inocular 2-3 colônias na salina e deixar o fragmento imerso

• incubar 30oC, 24horas • leitura: se positivo ocorre precipitado cinza no

fundo do tubo e filme fica transparente.• se negativo aguardar no mínimo 72 h.

• CQ: cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 gelatina + e A. baumannii gelatina negativo.

Prova da utilização da gelatina

negativa++

DNAse

Semear 2 a 3 colônias em spot (círculo de 0,5 cm de diâmetro) deixando espaço entre os testes para avaliar a presença de halo;

Incubar 37oC por 24h• adicionar ácido clorídrico 1N e aguardar 5 minutos;• observar a presença de halo transparente em volta do

inóculo e o restante do meio fica leitoso; • QC: S. maltophilia = positivo e A baumannii negativo.

Prova da DNase

negativa positiva

Provas complementares

• agar uréia • caldo TSB para crescimento 42oC • ágar citrato• ágar esculina• caldo NaCl 6,5%• caldo indol• disco de PYR• disco de polimixina/imipenem

Hidrólise da uréia de Christensen

Material: Ágar inclinado com uréia

Semeadura: com alça, inóculo denso na superfície do meio

Leitura: a cor pink (rosa forte) aparece em parte do ápice ou em todo o meio após 24 a 72 h de incubação; ligeira mudança de cor rósea no ápice que não progride com maior incubação é considerado negativo. Bordetella bronchiseptica pode dar reação positiva em 4 h.

CQ: • S. maltophilia = uréia negativa • usar cepa de P. aeruginosa urease positiva

Prova da hidrólise da uréia

negativa positiva

Crescimento a 42oC ou 44oC

• Material: 2 tubos com caldo TSB ou BHI para avaliar crescimento 42/44oC • Semeadura: semear 2 colônias em cada tubo com caldo verificando

leve turbidez• incubar em estufa regulada ou em banho-maria• Leitura: ocorre acentuada turbidez no meio ou é nítido o aumento da

densidade bacteriana. • Comparar com controle mantido a temperatura ambiente.• Para espécies de Acinetobacter testa-se 44oC e para as demais

bactérias 42oC• CQ -

• A baumannii ATCC = crescimento 42 e 44oC positivo• A. lwoffii = crescimento 42 e 44oC negativo

Prova do crescimento a 42/44oC

+ negativo

Ágar citrato

• Material: tubo com agar citrato de Simmons

• Semear com agulha na superfície do meio

• Incubação: 37oC por 24 a 72h

• Leitura: a cor azul forte aparece inicialmente no bico e com maior incubação estende-se a todo o meio

• CQ:

• P. aeruginosa ATCC 27853 ou A baumannii= citrato positivo

• A lwoffii - citrato negativo

Utilização do citrato

positivonegativo

• Material: tubo com agar esculina inclinado

• semeadura: 2 a 3 colônias na superfície do meio

• incubação: 24h a 37oC

• Leitura e interpretação: ocorre precipitado negro intenso nas provas positivas a partir de 6 horas de incubação até 48 h. Cor castanho escuro é prova negativa

• Obs: não usar ágar bile-esculina

• CQ:

• P. aeruginosa ATCC 27853 = negativa

• P. luteola ou cepa de B. cepacia positiva

Hidrólise da esculina

Hidrólise da esculina

negativa positiva

Crescimento em caldo NaCl 6,5%

• Material: tubo contendo caldo NaCL 6,5% com indicador purpura de bromocresol (roxo)

• semear: 2 a 3 colônias no caldo NaCL 6,5%

• Incubar: 24h a 37oC

• Leitura: a presença de turbidez e mudança de cor de roxo para amarelo indicam crescimento.

• CQ:

• Alcaligenes faecalis = positivo

• cepa de S. maltophilia negativa

Crescimento em Na Cl 6,5%

negativo positivo

Prova do indol por extração

Material: caldo triptona, xilol e Kovaks ou EhrlichSemeadura: inocular 2 colônias no caldoIncubação: 24h, se negativo repetir com 48hTeste:

• colocar 5 gotas de xilol e agitar vigorosamente o tubo.

• Adicionar 5 gotas do reagente de Ehrlich ou Kovacs. • Observar a presença de anel púrpura pálido ou

intenso que revelam prova positiva.CQ:

• Chryseobacterium spp = positivo • Acinetobacter baumannii = negativo

Prova de indol por extração

+ neg

PYR (pyrrolidonyl arylamidase)

• Material: discos de PYR e reagente cinnamaldehyde

• Incubação: colocar um disco de PYR sobre crescimento bacteriano de cerca de 24h de incubação e deixar por 4 h

• retirar o disco da placa de cultura, colocar sobre uma lâmina e depositar uma gota do reagente que acompanha o teste.

• Leitura: cor alaranjada é prova positiva; cor amarela é prova negativa.

• CQ:• B. cepacia ou S. maltophilia = negativo

• Chryseobacterium spp e P. luteola = positivos

Prova do PYR

+negativo

Discos de PMX e IPM

• Material: discos de Imipenem e polimixina ou colistina

• Semeadura: ágar Mueller Hinton

• Técnica: colocar os discos de polimixina e/ou Imipenem usando a mesma técnica para fazer antibiograma

• Incubar: 35oC por 16-18h para P. aeruginosa e Acinetobacter spp e 20 a 24h para S. maltophilia e B.cepacia

• Interpretação: • disco de polimixina - qualquer halo em torno do disco

significa sensibilidade

• disco de imipenem - P. aeruginosa e Acinetobacter 16mm e B. cepacia 20mm

• CQ: P. aeruginosa ATCC 27.853

Tabelas de identificação das bactérias não fermentadoras

TABELA .1B - Prova opcional

Microrganismos Hemólise*A. baumannii neg

A. calcoaceticus neg

A. haemolyticus pos

A. lwoffii neg

*hemólise em agar sangue


TABELA .2 - Cocos Gram negativo, oxidase positivo, motilidade negativa, OF-Glicose Inerte

Microrganismos / Provas Urease Gelatina Dnase MacConkey

Moraxella(B). catarrhalis Neg Neg Pos Neg

Moraxella canis Neg Neg Pos Pos

M. fenilpiruvica/ureolytica Pos Neg Neg Pos

Moraxella lacunata Neg Pos Neg Neg

Moraxella spp* Neg Neg Neg Var

Moraxella spp: nonliquefaciens, lincolnii, osloensis, atlantae e Oligella urethralis


TABELA .3 A – Bacilos Gram negativo, oxidase negativa, motilidade positiva, OF-Glcose Oxidativo ou Inerte

Microrganismos / Provas Arginina Dnase Lisina Polimixina *

Pseudomonas luteola Pos Neg Neg S

Pseudomonas oryzihabitans Neg (14+) Neg Neg S

B. cepacia Neg Neg 80%+ R

S. maltophilia Neg Pos 93%+ S

* Fazer antibiograma com polimixina


TABELA 3 B - Provas opcionais

Microrganismos / Provas Esculina PYR Imipenem*

Pseudomonas luteola Pos Pos S

Pseudomonas oryzihabitans Neg Pos S

B. cepacia Var Neg Var

S. maltophilia Var neg R * Fazer antibiograma com imipenem


Tabela .4 - Oxidase positiva, Motilidade negativa e OFG Oxidativo, Bacilos c/ pigmento amarelo e Crescimento em MC variável

Microrganismos / Provas Indol Dnase Polimixina Uréia

Chryseobacterium meningosepticum Pos Pos R Neg

C. indologenes Pos Neg R Neg

Sphingomonas paucimobilis Neg Neg S Neg

Sphingobacterium spp* Neg Variável R Pos

*S. multivorum, S. spiritivorum


TABELA .5A - Bacilos Gram negativo, oxidase positiva, motilidade positiva, OF GLICOSE Oxidativo - vide fluxograma para facilitar interpretação

Microrganismos POL LIS ARG NaCl 6,5% GEL 42ºC Característica

A. xilosoxidans S Neg Neg Neg Neg Pos (86)

P. aeruginosa S Neg pos 82 Pos Pigmento

P. fluorescens S Neg pos Pos Neg

P. putida S Neg pos Neg Neg

P. stutzeri S Neg Neg Pos Neg v Seca

B. pseudomallei R Neg pos +79% pos

B. cepacia R 80%+ Neg 20%+ 83%+

S. paucimobilis* S Neg Neg Pos Neg Pigm.Amarelo

Shewanella spp S Neg Neg V V v

* Mot += Temperatura ambiente


TABELA 5B -Provas complementares 1, 2

Microrganismos Esculina* PYR*

A. x. xilosoxidans Neg Pos

P. aeruginosa neg V

P. fluorescens Neg V

P. putida Neg Neg

P. stutzeri neg Neg

B. pseudomallei V Neg

B. cepacia V Neg

Sphingomonas paucimobilis pos 25+

Shewanella spp neg Pos

Provas da esculina e PYR úteis apenas para diferenciar as bactérias lisina e arginina negativas


TABELA.5C - Bacilos Gram negativos não fermentadores oxidase positiva, motilidade positiva, com H2S no TSI, OF Glicose Variável, DNAse positivos

Bactéria/prova Cresc. 42oC Cresc NaCl 6,5%Shewanella putrefaciens Neg Neg

Shewanella alga Pos Pos


TABELA. 6 A - Bacilos oxidase (+), Motilidade (+) OFG Alcalino - incubar 72h.

Microrganismos Uréia NaCl 6,5% DNAseA x. denitrificans negativa 75% Neg neg

Alcaligenes faecalis Neg Pos Neg

B. bronchiseptica Pos++ Neg Neg

S. malthophilia * Neg 78%neg Pos

*raramente pode ser oxidase +


TABELA 6B - Prova complementar 2

Microrganismos PYRA. denitrificans positivo

Alcaligenes faecalis negativo

B. bronchiseptica negativo

S. malthophilia negativo


TABELA .7- Bacilos e coco-bacilos Gram negativos, Não fermentadores, oxidase positiva, OF glicose variável, com pigmento róseo(1)

Microrganismos Motil. Morfo- logia Urease Mc

Conkey 42oC Observação

Methylobacterium spp pos B Pos Neg neg colônia seca coral

Roseomonas spp Var CB Pos Pos pos colônias mucóidesrosadas


FLUXOGRAMA AUXILIAR PARA TABELA 5

Lisina positiva Burkholderia cepacia

Polimixina R

negativa

negativa Arginina positiva

polimixina polimixina

R S R S

B. cepacia esculina B. pseudomallei crescimento a 42oC

positivo negativo positivo negativo

S. paucimobilis NaCl 6,5% P. aeruginosa Gelatina

negativo positivo negativo positivo

DNAse P.stutzeri P. putida P. fluorescens

positivo negativo

S. putrefaciens Achr. xylosoxidans

bactérias fermentadoras e não fermentadoras dr. carlos emílio levy

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