Univerzitetni študijski program Kemija

Izbirni sklop analizna in anorganska kemija

Avtomatizirana analiza

Seminar 2012

Predavatelj: prof. dr. Boris Pihlar

Seminarska naloga je izdelana v okviru študijskih obvez dodiplomskega izbirnega predmeta Avtomatizirana analiza

(30-0641). Delo ni lektorirano ali vsebinsko korigirano s strani predavatelja ali drugih univerzitetnih inštitucij. Avtor in

inštitucija ne jamčita za pravilnost podatkov in navedb ter ne izključujeta možnosti, da so v objavljenem gradivu

napake ali druge nepravilnosti.

Gradivo predstavljeno v tem delu je avtorska lastnina, oziroma last navedenih virov, iz katerih je bilo povzeto.

Univerza v Ljubljani

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Univerza v Ljubljani

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo

Poučevanje monocelične

digitalne analize z uporabo

»droplet-based« mikrofluidov (Seminarska naloga)

Mentor: Avtor:

Prof. Dr. Boris Pihlar David Milićević

2

1. Kazalo

1. Kazalo .............................................................................................................................................. 2

2. Namen študije ................................................................................................................................. 3

3. Prednosti mikrofluidov in digitalne analize ..................................................................................... 3

3.1. Uporaba mikrofluidov in digitalne analize pri preučevanju celic ............................................. 4

4. Poučevanje digitalne analize na univerzah ..................................................................................... 5

4.1. Teoretična priprava .................................................................................................................. 6

4.2. Laboratorijske vaje ................................................................................................................... 6

4.3. Laboratorijska oprema ............................................................................................................. 7

4.4. Izdelava mikrofluidnih čipov (Vaja 1) ....................................................................................... 7

4.5. Karakterizacija mikrofluidnih čipov (Vaja 2) ............................................................................. 8

4.6. Digitalna kvantifikacija enotnega bakterijskega seva (Vaja 3) ................................................. 9

4.7. Hkratna kvantifikacija dveh bakterijskih sevov v mešani kulturi (Vaja 4) .............................. 10

5. Zaključek ........................................................................................................................................ 10

6. Literatura ....................................................................................................................................... 11

3

2. Namen študije

Mikrofluidi omogočajo delo z majhnimi količinami reagentov in so zato zelo primerni tako za enocelično analizo kot tudi za analize na različnih področjih, kot so genomika, diagnostika, preučevanje poteka evolucije in čiščenje zdravilnih učinkovin. Vse večja zastopanost mikrofluidov v bioloških laboratorijih je avtorje članka spodbudila, da so razvili študijski program, kjer se dodiplomski in podiplomski študenti učijo izdelovati »droplet-based« mikrofluidne naprave, jih opredeliti in na koncu uporabiti za izvajanje digitalnih analiz bakterijskih vzorcev, ki temeljijo na fenotipskih označevalcih. [1]

Slika 1: »Droplet-based« mikrofluidna naprava [1]

3. Prednosti mikrofluidov in digitalne analize

Izjemen napredek v elektroniki in računalništvu je omogočil miniaturizacijo elektronskih komponent. V zadnjih letih se je podoben pojav začel pojavljati tudi v kemijskih in bioloških znanostih, z razvojem miniaturiziranih »lab-on-chip« naprav, ki temeljijo na tehnologiji mikrofluidov. Mikrofluidi omogočajo delo z zelo majhnimi volumni tekočin (običajno v nL ali pL merilu) in jih je mogoče opredeliti kot aplikacijo toka tekočin v miniaturnih napravah, v katerih je vsaj ena dimenzija v mikrometrskem območju. Tisočkratno do milijonkratno zmanjšanje reakcijskih volumnov je postalo mogoče z uporabo mikrofluidov, ki so sposobni povečati pretok tradicionalnih analitskih metod, obenem pa predstavljajo tudi novo, učinkovito orodje za izvajanje digitalne analize na celični ali molekulski ravni. [1]

4

3.1. Uporaba mikrofluidov in digitalne analize pri preučevanju celic

Digitalni testi, s katerimi vzporedno preučujemo mnogo posameznih celic ali molekul, imajo številne prednosti pred več analognimi, običajnimi testi. Pri analizi celic v analogni obliki, celotno populacijo celic preučujemo istočasno, kot rezultat pa uporabimo povprečno vrednost celotne populacije. Vendar pa je zmožnost, da bi lahko opredelili vsako posamezno celico populacije, zelo pomembna. Kot primer lahko vzamemo tumorje, ki so zapletene mešanice celic z različnimi genotipi in fenotipi, zato je za pravilno razumevanje razvoja in napredovanja rakavih obolenj ter učinkovito zdravljenje le-teh, bistvenega pomena poznavanje tumorja na enocelični ravni. Prav tako je postalo jasno, da stohastične razlike v izražanju genov ustvarijo neenotnost med celicami, tudi če so le-te gensko povsem enake in iz istega okolja. Ta raznolikost, ki se pojavlja od celice do celice, igra pomembno vlogo v bioloških procesih (npr. razvijanje odpornosti na antibiotike ali kemoterapevtike), vendar pa jih z analognimi analizami ne moremo zaznati, zato moramo podobne analize opravljati na enocelični ravni. Ena od možnosti je, da preučujemo posamezne celice z uporabo fluorescentnih sond, kot so fluorescentno označena protitelesa ali nukleinske kisline. Izražanje gena na eno samo celico je mogoče preiskovati tudi z izražanjem genetsko kodiranih fluorescenčnih označevalcev. Bolj dinamičen pogled pa lahko dosežemo z uporabo fluorescenčne mikroskopije. Fluorescenčna mikroskopija celic, imobiliziranih v mikrofluidnih napravah, ki so lahko enostavne pretočne celice ali pa bolj sofisticirane naprave, odpira številne nove možnosti za enocelične študije. Posamezne celice se lahko prav tako preučuje z direktnim merjenjem fenotipskih označevalcev kot so encimi, ki uporabljajo pretočno citometrijo. Vendar ta pristop ne omogoča spremljanje izločenih encimov. Znotrajcelične encime lahko preiskujemo, vendar le če fluorescenčni substrat lahko vstopi v celico in se preoblikuje v fluorescenčni produkt, ki potem v celici tudi ostane.

5

Slika 2: Pretočna citometrija [6]

Druga možnost je, da analit razdelimo v več manjših paralelk, od katerih v povprečju vsaka vsebuje manj kot eno celico. Posamezne celice nato denaturiramo, da se izloči njihova znotrajcelična vsebina. Majhen volumen posamezne paralelke omogoča, da so sproščeni fenotipski označevalci v visokih koncentracijah in jih ni težko zaznati. Če je cilj identificirati in ovrednotiti redke ciljne celice v določeni populaciji, izberemo digitalno metodo, saj ima bistveno večjo občutljivost, medtem ko je občutljivost analognih metod omejena z redčenjem redkih ciljnih celic v celotnem volumnu. Tudi če so tarčne celice zelo razredčene in jih večina paralelk sploh ne vsebuje, koncentracija tarčnih celic v določenih paralelkah še vedno ostane visoka in detekcija le-teh postane enostavna. [1]

4. Poučevanje digitalne analize na univerzah Digitalni testi niso omejeni le na analizo celic. Zaradi vse večjega zanimanja za metode, ki temeljijo na mikrofluidnih osnovah (še posebej za digitalno karakterizacijo) v bioloških znanostih, so se avtorji članka odločili, da sestavijo študijski program, po katerem bi poučevali študente dodiplomskega in podiplomskega študija. Študente so s pomočjo preprostih, varnih in poceni bioloških sistemov poučevali, kako se z »droplet-based« mikrofluidnim sistemom opravi digitalni test za hitro in kvantitativno določitev sevov bakterij, z uporabo fenotipskih označevalcev. [1]

6

4.1. Teoretična priprava

Pred praktičnim delom so študente poučili o teoretičnih osnovah in aplikacijah mikrofluidov. Razpravljali so o detekcijskih sistemih in o različnih metodah, ki se uporabljajo za poganjanje toka v mikrofluidnih sistemih. Posebno pozornost so namenili razlikovanju med pretokom tekočin v mikrofluidnih kanalih in bolj znanim pretokom v makro dimenzijah. Pojasnili so tudi dejstvo, da se v mikrofluidnih sistemih najpogosteje uporablja laminaren tok. Odsotnost turbulence v mikrofluidnih sistemih povzroči, da lahko tekočini tečeta ena ob drugi, samo mešanje ki nastane zaradi difuzije, pa je minimalno. Prav tako so razložili, kako se na podlagi upoštevanja ravnotežja med različnimi fizikalnimi pojavi okarakterizira tok tekočin. Da bi lahko to storili, so preučevali uporabo brezdimenzijskih števil v mikrofluidih. Osredotočili so se zlasti na Reynoldsovo število (Re), ki povezuje inercialne sile z viskoznostnimi silami, na Pecletovo število (Pe), ki povezuje konvekcijo z difuzijo in na Kapilarno število (Ca), ki povezuje viskoznostne sile s površinsko napetostjo. Pomembnost teh števil se je izkazala tudi v praksi. Med samim usposabljanjem so študente poučili tudi o glavnih prednostih, ki jih droplet-based mikrofluidi nudijo v digitalnih analizah. Analiti visokih koncentracij, ki zapustijo celico kot pikolitrska kapljica, povzročijo znatno povečanje občutljivosti digitalnih tehnik v primerjavi z analognimi. Ta učinek so študenti enostavno spoznali skozi teoretične vaje, kjer so računali kinetiko encimsko katalizirane reakcije. [1]

4.2. Laboratorijske vaje

Laboratorijske vaje so zasnovali tako, da so lahko študenti večino prej teoretsko opisanih osnov spoznali tudi v praksi. Cilj vaje je bil z uporabo droplet-based mikrofluidnega sistema opraviti test za hitro, digitalno in kvantitativno določitev sevov bakterije Escherichia coli z uporabo fenotipskih označevalcev. Escherichia coli se zelo veliko uporablja v izobraževalne namene, saj je delo z njo varno in poceni ter še posebej primerno za začetnike. V poskusu so uporabili dva seva in oba sta

vsebovala encim -glukoronidazo. Vendar pa je ena paralelka vsebovala tudi encim

-galaktozidazo, medtem ko je druga paralelka ni vsebovala. Da bi omejili spremembe, ki lahko nastanejo zaradi stohastičnega izražanja gena v eni paralelki, so oba gena locirali na veliko število plazmidov pod nadzorom močnega promotorja

T7 RNA polimeraze. -glukoronidaza in -galaktozidaza sta ena najbolj razširjenih encimskih reporterskih sistemov, ki imata na voljo celo vrsto kromogenih in fluorescentnih substratov. Zato je tudi možno paralelno spremljanje obeh procesov. [1]

7

Slika 3: Bakterija Escherichia coli [5]

4.3. Laboratorijska oprema

Biokemijski laboratorij je vseboval osnovne laboratorijske pripomočke (mikropipete, centrifuge, termostatiran inkubator, …). Opremljen je bil z delovnim mestom za mikrofluide, ki je vsebovalo invertni mikroskop, povezan s CCD kamero, ki lahko obdela do 58 posnetkov na sekundo. Poleg tega so uporabljali niz dveh brizgnih črpalk, za injiciranje tekočine v mikrofluidne naprave. Na voljo pa je bil tudi epi-fluorescenčni mikroskop, ki so ga uporabljali za fluorescenčno slikanje na emulziji. Poleg samega laboratorija se je nahajal še dodaten prostor (t. i. »clean room«), kjer so bili shranjeni osnovni pripomočki za mikrofabrikacijo, kot so »spin coater«, »mask aligner« in plazemska pečica. Uporabo tega prostora so priporočali za izdelavo kalupa. [1]

Slika 4: »Spin coater« [2]

4.4. Izdelava mikrofluidnih čipov (Vaja 1)

Tekočino so injicirali v mikrofluidno napravo preko treh dovodnih odprtin. Prvi dve odprtini sta namenjeni vodnim raztopinam; ena za vodno raztopino nasičeno z

8

bakterijami in druga za reagente. Skozi tretjo so injicirali oljno fazo, ki so ji dodali površinsko aktivno snov. Vsak vhod je obdan s krožnim filtrom, ki ima vlogo lovilca prahu in ostalih delcev ter ščiti kanale pred zamašitvijo. Mikrofluidne čipe so izdelovali v poli(dimetilsiloksanu) z uporabo mehke litografije. Najprej so izdelali »masko«, ki so jo uporabili za proizvodnjo kalupa s fotolitografijo. Izdelane kalupe so nato razdelili študentom, ki so jih uporabili za izdelavo mikrofluidnih čipov v poli(dimetilsiloksanu). V ta namen so PDMS mešali s trdilom, ga razplinili in vlili v kalup. Ko se je ulitek strdil, so ga vzeli iz kalupa in izvrtali dovode za injiciranje. Na koncu so ulitek po obdelavi vezali na steklo in vhodne kanale obdelali z raztopino triklorosilana ter na ta način povečali njihovo hidrofobnost in lipofobnost. [1]

4.5. Karakterizacija mikrofluidnih čipov (Vaja 2)

Da so razkrojili bakterijske celice so sprostili -glukoronidazo in -galaktozidazo in po oblikovanju kapljic naredili encimski test. Laminaren tok je omogočal, da sta tekočini tekli ena ob drugi, vendar pa vse do formacije kapljice ni prišlo do mešanja. Da bi neposredno videli tok tekočin in karakterizirali nastanek kapljic v mikrofluidni napravi, so študenti naredili poskus, pri katerem so dve vodni fazi injicirali v mikrofluidno napravo. Reagente so dali v 1 mL plastične brizge, jih povezali s čipom in tekočine injicirali v napravo. Prikaz vzporednega toka tekočin je lep primer eksperimentalne predstavitve laminarnega toka z nizkim Reynoldsovim številom, kjer viskoznostne sile prevladujejo nad vztrajnostnimi. Neučinkovito mešanje kaže na nizko Pe število, kjer prevladuje difuzija nad konvekcijo in je samo mešanje počasno. Nato so študenti analizirali nastale kapljice na mikrofluidnih napravah, ki so jih izdelali pri prejšnji vaji. Kombinacija tlaka in viskoznostnega stresa, ki ga povzroča olje, ki prihaja iz obeh strani, prisili vodno fazo, da prodre v kapljice. Na novo izoblikovane kapljice so bile stabilizirane s površinsko aktivnimi snovmi, ki so se nahajale v oljni fazi, ki preprečuje združevanje večih kapljic. Velikost kapljic so kalibrirali s spreminjanjem oblike šobe ali s prilagajanjem pretoka. Pri tej vaji so spoznali tudi posledice padanja števila Ca. Kapilarno število, ki označuje pomembnost viskoznostnih in kapilarnih sil, je najbolj pomemben brezdimenzijski parameter, ki vpliva na nastanek kapljic. Opazili so, da s spreminjanjem pretoka in s padanjem Ca števila, pride do prehoda iz brizgalnega načina na kapljanje. To se zgodi, ko površinska napetost prevladuje nad viskoznostnimi silami. Študenti so morali tudi opredeliti mikrofluidne čipe, ki so jih pripravili pri prvi vaji. To so storili z nastavitvijo pretoka, ki je omogočal tvorbo kapljic volumna 18 pL. Pri izvedbi tega poskusa so čip namestili na enostavno mikrofluidno opazovalno postajo, opremljeno z invertnim mikroskopom, povezanim s CCD kamero. [1]

9

Slika 5: Mikrofluidni čipi [4]

4.6. Digitalna kvantifikacija enotnega bakterijskega seva (Vaja 3)

Študenti so pripravili kulturo E. coli Lac-, seva (Gus+ / Gal-), ki so jo pustili stati čez noč in jo nato sprali in suspendirali v PBS. Gostoto bakterij so določili s pomočjo meritev. Dobljene meritve so uporabili za pripravo razredčine na osnovi Poissonove porazdelitve. Vsako razredčenje posebej so nato vbrizgali v mikrofluidno napravo . Kapljice so zbirali v mineralnem olju in emulzijo eno uro inkubirali pri temperaturi 37°C. Fluorescenco kapljic so merili s pomočjo epi-fluorescenčnega mikroskopa. Z uporabo programske opreme JImage so označili posamezne kapljice kot pozitivne in negativne. Pozitivne kapljice so bile tiste, katerih fluorescenca je znašala vsaj 25% vrednosti najbolj fluorescentne kapljice v polju. Kapljice, katerih fluorescenca je bila pod to mejo, so označili kot negativne. Za vsako bakterijsko raztopino so testirali razmerje (pozitivne kapljice / vse kapljice) in tako dobili zastopanost posameznih zvrsti kapljic v treh reprezentativnih okoljih. [1]

Slika 6: Digitalna kvantifikacija bakterijskega seva [1]

10

4.7. Hkratna kvantifikacija dveh bakterijskih sevov v mešani kulturi (Vaja 4)

Študentom so razdelili kulturo E. coli, ki je vsebovala neznano razmerje dveh bakterijskih sevov. Po obdelavi obeh sevov so med njima zlahka razlikovali in na podlagi njihovih ločenih fluorescenčnih profilov določili razmerje 10:1 med rdečimi in rumenimi kapljicami. Rezultat so potrdili tudi s tradicionalno karakterizacijo na agarju kjer so prav tako določili razmerje med belimi in modrimi kolonijami 10:1. [1]

Slika 7: Gojenje bakterij na agarju [3]

5. Zaključek

Predstavili so kombiniran teoretično-praktičen program, za poučevanje digitalne analize dodiplomskih in podiplomskih študentov, ki temelji na mikrofluidnih napravah. Sam postopek so testirali dobri dve leti na cca 40 študentih. Izkazal se je za pedagoško zelo koristnega, saj študentom omogoča, da opazujejo in razumejo osnovna načela, ki podpirajo digitalno analizo in mikrofluide.

Študenti so izvedli digitalno analizo E. coli na podlagi fenotipskih označevalcev -

glukoridaze (Gus) in -galaktozidaze (Gal). Avtorji navajajo, da je ta pedagoški program mogoče zlahka izvajati na večini univerz, saj je potrebna oprema dostopna, relativno cenovno ugodna, uporaba le-te pa enostavna. [1]

11

6. Literatura

[1] Majdi Najah, Andrew D. Griffiths, Michael Ryckelynck, Teaching Single-Cell Digital Analysis Using Droplet-Based Microfluidics. Institut de Science et d`Ingénierie Supramoléculaires, Université de Strasbourg; American Chemical Society. Analytical chemistry 2012, 84, 1202-1209 [2] http://en.wikipedia.org/wiki/Spin_coating/ (dostop 13.07.2012) [3] http://bepast.org/dataman.pl?c=flib&dir=docs/ (dostop 13.07.2012) [4] http://www.geekscover.com/2012/03/microfluidic-chip-rapidly-diagnose-flu/ (dostop 13.07.2012) [5] http://www.pigeonracingpigeon.com/menu/e-coli-infection-in-pigeons/ (dostop 13.07.2012) [6] http://www.rudbeck.uu.se/node47/ (dostop 13.07.2012) [7] http://www.webbofscience.com/2009/08/26/melodies-divert-droplets/ (dostop 13.07.2012) [naslovnica]