avances en biolog ía molecular con fines diagn ósticos · tendencias en el diagn óstico de...

Avances en biologAvances en biologíía a

molecular con fines molecular con fines

diagndiagnóósticossticos

Jovita Fernández [email protected]

Centro de Investigación en Sanidad Animal (CISA-INIA), Valdeolmos, Madrid

XVI SIMPOSIO ANUAL AVEDILA, Tenerife, 24-25 Noviembre 2011

Técnicas de detección molecularTTéécnicas de deteccicnicas de detecci óón molecularn molecular

Tendencias en el diagnTendencias en el diagn óóstico de stico de enfermedades infecciosas animalesenfermedades infecciosas animales

TTéécnicas de aplicacicnicas de aplicacióón en campo n en campo

o o penpen--sideside teststests

TTéécnicas de aplicacicnicas de aplicacióón a gran escalan a gran escala

Avances tecnológicos en PCRAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCRgicos en PCR

Enzimas/reactivos mejoradosEnzimas/reactivos mejorados

PolimerasasPolimerasas hothot--startstart: : ensayos de RTensayos de RT--PCR en un solo pasoPCR en un solo paso

Master Master mixmix: : reactivos premezclados, menor manipulacireactivos premezclados, menor manipulacióónn

PCR PCR fastfast: : reacciones de amplificacireacciones de amplificacióón en una horan en una hora

PolimerasasPolimerasas menos sensibles a inhibicimenos sensibles a inhibicióón: n: ensayos mensayos máás robustoss robustos

Avances tecnológicos en PCR:

sistemas de PCR múltipleAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR:

sistemas de sistemas de PCR mPCR múúltipleltiple

Empleo de varias parejas de primers en una única

reacción

Empleo de varias parejas de primers en una única

reacción

DetecciDeteccióón simultn simultáánea de varios patnea de varios patóógenos:genos:ahorro econahorro econóómico y de tiempomico y de tiempo

AplicaciAplicacióón en el diagnn en el diagnóóstico diferencial:stico diferencial:enfermedades relacionadas (huenfermedades relacionadas (huéésped, clsped, clíínica)nica)

HemorrágicasVesiculares

RespiratoriasAcuicultura

HemorrágicasVesiculares

RespiratoriasAcuicultura

PESTE PORCINA AFRICANA (PPA)

PESTE PORCINA AFRICANA (PPA) PESTE PORCINA CLÁSICA

(PPC)PESTE PORCINA CLÁSICA

(PPC)

• 1-3: Cerdo infectado con el VPPC España 2/2001. 1: bazo, 2: tonsila, 3: riñón.

• 4-5: Cerdo infectado con el VPPC Paderborn. 4: bazo, 5: ganglio linfático.

• 6-7: Cerdo infectado con el VPPC Alfort 187. 6: sangre-EDTA, 7: riñón.

• 8-14: Cerdo infectado con el VPPA Lisboa 60. 8: sangre-EDTA, 9: bazo, 10: riñón, 11: ganglio linfático, 12: pulmón, 13: hígado, 14: tonsila.

• C: Control positivo de reacción. MV y MVI: Marcadores de peso molecular V y VI (Roche)

108 bp-

257 bp-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C M V

PPA-1/2 + PPC-3/4

DetecciDetecci óón de VPPA y VPPC n de VPPA y VPPC mediante RTmediante RT --PCR mPCR múúltipleltiple

Avances en PCR: PCR múltipleAvances en PCR: Avances en PCR: PCRPCR mmúúltipleltiple

FIEBRE AFTOSA (FA)FIEBRE AFTOSA (FA) ENFERMEDAD VESICULAR PORCINA (EVP)

ENFERMEDAD VESICULAR PORCINA (EVP)ESTOMATITIS

VESICULAR (EV)ESTOMATITISVESICULAR (EV)

DetecciDetecci óón de VFA, VEVP y VEV n de VFA, VEVP y VEV mediante RTmediante RT --PCR mPCR múúltipleltiple

275 bp-

154 bp-110 bp-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C+ M11 12

• 1-2: Cerdo infectado con el VFA-O UK2001. 1: epitelio vesicular, 2: suero.

• 3-4: Cerdo infectado con el VFA-A A22 Iraq. 3: hisopo faríngeo, 4: sangre-EDTA.

• 5-8: Cerdos infectados con el VEVP UKG 27/72. 5: epitelio vesicular, 6: heces, 7: hisopo faríngeo,

8: sangre-EDTA.

• 9-10: Cerdo infectado con el VEV-Ind-1 Colorado 1942. 9: epitelio vesicular, 10: sangre-EDTA.

• 11-12: Cerdo infectado con el VEV-NJ Colombia 1964. 11: hisopo faríngeo, 12: tonsila.

• C+: control positivo de reacción. M: Marcador de peso molecular V (Roche)

FMD-B/FMD-C + SS4/SA2 + VSV-1/VSV-2

Avances en PCR: PCR múltipleAvances en PCR: Avances en PCR: PCRPCR mmúúltipleltiple

DETECCIDETECCI ÓÓN DEL PRODUCTO N DEL PRODUCTO AMPLIFICADO DURANTE LA PCRAMPLIFICADO DURANTE LA PCR

� Mayor rapidez

� Menor riesgo de contaminaciones

� Sensibilidad igual o superior

� Cuantitativa

� Amplificación-detección automatizadas

� Creciente implantación en laboratorios de

diagnóstico

Avances tecnológicos en PCR: PCR en tiempo realAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR: PCRPCR en tiempo realen tiempo real

¿¿CCÓÓMO?MO? UtilizaciUtilizacióón de n de fluorocromosfluorocromos y y termocicladorestermocicladores

con sistemas de deteccicon sistemas de deteccióón de n de fluorescenciafluorescencia

PCR en tiempo real: sondas de hidrólisisPCR en tiempo real: sondas de hidrPCR en tiempo real: sondas de hidr óólisislisis

MGB:minor groove binder

LNA: locked nucleic acid

• Sondas de hidrólisis tipo TaqMan

• Grupos modificados para mayor estabilidad en la

unión con ADN molde: sondas más cortas

• Útil para detección de virus con genoma variable

VLA, VPEA, WNV, …VLA, VPEA, WNV, …

Sondas Sondas TaqManTaqMan

VPPA, VPPC, VFA, VEVP, VIA, …VPPA, VPPC, VFA, VEVP, VIA, …

Avances en PCR en tiempo real: sondas UPL (Universal Probe Library)Avances en PCR en tiempo real: Avances en PCR en tiempo real: sondas UPL sondas UPL (Universal (Universal ProbeProbe LibraryLibrary ))

• Sondas de hidrólisis (8-9 LNA) de detección

universal: 165 sondas pre-validadas

• Desarrolladas para estudios de expresión génica

• Reciente comercialización: sistema rápido y

asequible

• Aplicación en técnicas de detección de patógenos:

influenza pandémica H1N1

Avances en PCR en tiempo real: sistema PriProETAvances en PCR en tiempo real: Avances en PCR en tiempo real: sistema sistema PriProETPriProET

Cy5 FAM

Energy transferEmission

Excitation

Cy5 FAM

”Cold” primer Fluorescent primerFluorescent probe

DVI, Lindholm

• Sistema robusto

• Buena sensibilidad

• Confirmación mediante curva de disociación

VPPC, VPPAVFA, VEVP, VEV…VPPC, VPPAVFA, VEVP, VEV…


desarrollo de kits comercialesAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR:

desarrollo de desarrollo de kitskits comercialescomerciales

• Único tubo con master mix: menor riesgo de

contaminaciones, pipeteo más fiable

• Facilidad y rapidez ante una situación de emergencia

• No necesidad de optimizar el ensayo en el laboratorio

• Gran variedad para la detección y caracterización de

patógenos

• Reactivos liofilizados: empleo en equipos portátiles

• Sistemas costosos

Avances tecnológicos en PCR: AutomatizaciónAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR: AutomatizaciAutomatizaci óónn

ExtracciExtraccióón de n de áácidos nucleicoscidos nucleicos

PreparaciPreparacióónn de de muestrasmuestras

AmplificaciAmplificacióónn--deteccideteccióónn

• Menor riesgo de contaminación

• Mayor reproducibilidad

• Análisis a gran escala

Avances tecnológicos en PCR: Sistemas portátilesAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR: Sistemas portSistemas port áátilestiles

AdaptaciAdaptacióónn de de mméétodostodos de PCR en de PCR en

tiempotiempo real a real a sistemassistemas portportáátilestiles

• Pen-side tests: técnicas de primera línea

• Laboratorios móviles

• Aplicación rápida en situación de

emergencia sanitaria

• Sistemas costosos

R.A.P.I.D. SystemRAZOR EX

Bio-seeq

T-COR 4


nuevos equipos de bajo costeAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR:

nuevos equipos de bajo costenuevos equipos de bajo coste

Eco real-time PCR systemEco realEco real--time PCR systemtime PCR system

•Primer equipo low-cost de PCR en tiempo real del mercado

•48 muestras

•Software sencillo y fácil interpretación

•Todas las aplicaciones necesarias en diagnóstico

•Primer equipo low-cost de PCR en tiempo real del mercado

•48 muestras


•Todas las aplicaciones necesarias en diagnóstico


nuevos equipos de bajo costeAvances tecnolAvances tecnol óógicos en PCR: gicos en PCR:

nuevos equipos de bajo costenuevos equipos de bajo coste

LightCycler Nano real-time PCR systemLightCyclerLightCycler NanoNano realreal--time PCR time PCR systemsystem

•Nuevo equipo low-cost de PCR en

tiempo real ya disponible en el mercado

•32 muestras (4x8 tubos en tiras

estandar)


•4 canales de lectura de fluorescencia

•Todas las aplicaciones necesarias en

diagnóstico

•Nuevo equipo low-cost de PCR en

tiempo real ya disponible en el mercado

•32 muestras (4x8 tubos en tiras

estandar)


•4 canales de lectura de fluorescencia

•Todas las aplicaciones necesarias en

diagnóstico

Avances tecnológicos: LATE-PCR (linear-after-the-exponential PCR)Avances tecnolAvances tecnol óógicos: gicos: LATELATE --PCR PCR (linear(linear --afterafter --thethe --exponentialexponential PCR)PCR)

• PCR asimétrica en tiempo real

• Obtención de gran nº de moléculas ssDNA

• Sonda de detección con baja Tm

• Técnica de elevada sensibilidad: detección desde una sola célula

• Aplicación en sistema portátil de PCR Bio-seeq

Influenza AviarEnfermedad de NewcastleFiebre Aftosa

Influenza AviarEnfermedad de NewcastleFiebre Aftosa

Sánchez et al., PNAS 2004

• No requieren uso de termocicladores

• Desarrolladas para su empleo como pen-side tests

• Técnicas rápidas y de alta sensibilidad

• Diseño difícil: necesidad de primers largos

Avances tecnológicos: Técnicas de amplificación isotérmicaAvances tecnolAvances tecnol óógicos: gicos: TTéécnicas de cnicas de amplificaciamplificaci óón isotn isot éérmicarmica

LAMP (loop-mediated isothermal amplification)

LAMP (loop-mediated isothermal amplification)

NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)

NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)

Técnicas de amplificación isotérmica: LAMP (loop-mediated isothermal amplification)TTéécnicas de amplificacicnicas de amplificaci óón isotn isot éérmica: rmica: LAMP LAMP ((looploop --mediatedmediated isothermalisothermal amplificationamplification ))

� Reacción de amplificación isotérmica a 60-65ºC

� 1 hora

� Válido para ARN/ADN

� ADN polimerasa con actividad desplazadora de doble cadena de ADN

� 4 primers en 6 regiones del fragmento a amplificar: FIP, F3, BIP, B3

de M. Hakhverdyan, SVA, Suecia

B3B2 B1c

FIP

BIP

F3F3

B3

Notomi et al., Nucl Acids Res 2000

F3 F2 F1 B1c B2c B3c5’ 3’

F3c F2c F1c B1 B2 B33’ 5’

F2

F1c

Técnicas de amplificación isotérmica: LAMPTTéécnicas de amplificacicnicas de amplificaci óón isotn isot éérmica: rmica: LAMPLAMP

http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/principle.html


http://loopamp.eiken.co.jp/e/

Detección visual por turbidez

Detección visual por fluorescencia

Detección a tiempo real

Detección mediante electroforesis


• No requiere equipamiento especial

• Sensibilidad comparable a PCR

• Alta especificidad por el empleo de 4 primers

frente a 6 regiones del genoma a detectar

• Detección directa del producto amplificado

• Aplicación real en campo como pen-side test

• Posibilidad de análisis cuantitativo y a gran

escala en laboratorio

• Diseño difícil, principalmente en virus altamente

variables

NDV, VIA, VFA, VEVP, VPPA, VPPC,Virus del Nilo Occidental

NDV, VIA, VFA, VEVP, VPPA, VPPC,Virus del Nilo Occidental

Técnicas de amplificación isotérmica: RPA(Recombinase Polymerase Amplification)TTéécnicas de amplificacicnicas de amplificaci óón isotn isot éérmica: rmica: RPARPA(Recombinase (Recombinase PolymerasePolymerase AmplificationAmplification ))

� Reacción de amplificaciónisotérmica a 37ºC

� No necesaria la desnaturalización del ADN

� Resultados en minutos

� Válido para ARN/ADN

•• No hay mNo hay méétodos para deteccitodos para deteccióón n de patde patóógenosgenos

•• CombinaciCombinacióón con equipos n con equipos portportáátilestiles

Piepenburg et al., PLOS Biology 2006

Avances tecnológicos: Bioinformática y secuenciaciónAvances tecnolAvances tecnol óógicos: gicos: BioinformBioinform áática tica y secuenciaciy secuenciaci óónn

• Análisis y comparación de secuencias de ADN

• Estudios de caracterización y epidemiología molecular

• Tipificación rápida de virus: vacunación, medidas de

control

• Diseño de nuevos métodos de detección molecular

Avances en diagnóstico molecular: Algunos trabajos del grupo EET del CISA-INIA en respuesta al escenario epidemiológico

Avances en diagnAvances en diagn óóstico molecular: stico molecular: Algunos Algunos trabajos del grupo EET del CISAtrabajos del grupo EET del CISA --INIA en INIA en respuesta al escenario epidemiolrespuesta al escenario epidemiol óógicogico

Peste Porcina AfricanaPeste Porcina AfricanaPeste Porcina Africana

Lengua AzulLengua AzulLengua Azul

Virus BagazaVirus Virus BagazaBagaza

Avances en diagnóstico molecular:

Lengua AzulAvances en diagnAvances en diagn óóstico molecular: stico molecular:

Lengua AzulLengua Azul

• Afecta a rumiantes salvajes y domésticos.

• Ovinos: enfermedad aguda con mortalidad entre 0-

50%.

• Bovinos: enfermedad subclínica habitualmente.

Virus de la Lengua Azul (VLA)Virus de la Lengua Azul (VLA)

• Familia Reoviridae, género Orbivirus.

• Genoma viral: 10 segmentos dsRNA.

• 24 serotipos descritos con alta variabilidad genética

entre ellos (25 y 26 propuestos).

• Transmisión por vectores artrópodos (Culicoides)

• Vacunación específica de serotipo.

LENGUA AZUL EN EUROPA: 2008-2009LLENGUA ENGUA AAZULZUL ENEN EEUROPA: 2008UROPA: 2008--20092009

BTV ST-1 Y ST-8BTV STBTV ST--1 1 YY STST--88 Desarrollo de un ensayo

múltiple de RRT-PCR DesarrolloDesarrollo de un de un ensayoensayo

mmúúltipleltiple de RRTde RRT--PCR PCR

OBJETIVO:OOBJETIVO:BJETIVO:

DetecciDeteccióónn gengenééricarica de BTV: de BTV: primers y primers y sondasonda TaqManTaqMan--LNA LNA

PanPan--BTV BTV de Toussaint et al., 2007de Toussaint et al., 2007

IdentificaciIdentificacióónn especespecííficafica de BTVde BTV--1 1 ((ArgeliaArgelia 2006): 2006): primers y primers y sondasonda

TaqManTaqMan--MGB MGB disediseññadosados en en regiregióónn VP2 (M. VP2 (M. AgAgüüeroero))

IdentificaciIdentificacióónn especespecííficafica de BTVde BTV--8:8: DiseDiseññoo dede primers y primers y sondasonda

TaqManTaqMan en en regiregióónn VP2 de VP2 de BTVBTV--8 8

Control Control internointerno parapara material material clclííniconico:: primers y primers y sondasonda TaqManTaqMan parapara

ββββββββ--actinaactina de Toussaint et al., 2007de Toussaint et al., 2007

AutomatizaciAutomatizacióónn del del procesoproceso de de

extracciextraccióónn de ARNde ARN

DiseDiseññoo del del mméétodotodo empleandoempleando

sondassondas marcadasmarcadas concon distintosdistintos

fluorocromosfluorocromos

EmpleoEmpleo de de reactivosreactivos parapara

amplificaciamplificacióónn mmúúltipleltiple

Análisis a gran escala

Menor riesgo de contaminación

Detección simultánea

Lecturas independientes

Sensibilidad comparable a ensayos individuales

Desarrollo del ensayo múltiple de RRT-PCR:

pan-BTV/BTV-1/BTV-8/ββββ-actina DesarrolloDesarrollo del del ensayoensayo mmúúltipleltiple de RRTde RRT--PCR: PCR:

panpan--BTV/BTVBTV/BTV--1/BTV1/BTV--8/8/ββββββββ--actina actina

FAMFAM

Pan-BTV (Toussaint et al 2007)

Pan-BTV (Toussaint et al 2007)

VICVIC

BTV-1BTV-1

Cy5Cy5

BTV-8BTV-8

ROXROX

ββββ-actinaββββ-actina

Detección específica en la reacción múltipleDetecciDeteccióónn especespecííficafica en la en la reaccireaccióónn mmúúltipleltiple

Aplicación del ensayo en muestras clínicasAplicaciAplicacióónn del del ensayoensayo en en muestrasmuestras clclíínicasnicas

100 Km.

Cádiz

Alectoris rufa

Phasianus colchicus

Identificación y caracterización de patógenos emergentes

IdentificaciIdentificaci óón y caracterizacin y caracterizaci óón n de patde pat óógenos emergentesgenos emergentes

• Septiembre 2010, Cádiz.

• Alta mortalidad en perdices (faisanes

afectados).

• Debilidad, postración, diarrea, pérdida de

peso, ausencia de coordinación motora.

• Primeros casos de WNV en caballos.

Diagnóstico inicialen LCV-MARM

DiagnDiagnóósticostico inicialinicial

en LCVen LCV--MARMMARM

Secuencia parcial NS5

VIRUS BAGAZA

Identificación y caracterización de patógenos

emergentes: Virus BagazaIdentificaciIdentificaci óón y caracterizacin y caracterizaci óón de patn de pat óógenos genos

emergentes: emergentes: Virus Virus BagazaBagaza

• Familia Flaviviridae, género Flavivirus.

• Genoma ssRNA+ (aprox. 11 kb).

• Transmisión por mosquitos Culex.

• Descrito únicamente en mosquitos en Rep.

Centroafricana (1966) y en India (1996)

• Evidencia serológica en humanos

Gaunt, M.W. et al (2001) J Gen Virol, 82:1867-76

Gen E

Caracterización del genoma completo: Diseño de primers, amplificación y secuenciación

CaracterizaciCaracterizacióónn del del genomagenoma completocompleto: : DiseDiseññoo de primers, de primers,

amplificaciamplificacióónn y y secuenciacisecuenciacióónn

• Corazón y cerebro de una perdiz

• 27 parejas de primers diseñadas

• Regiones solapantes del genoma

• Rediseño de 5 parejas de primers

• Secuencias 100% idénticas

• Corazón y cerebro de una perdiz

• 27 parejas de primers diseñadas

• Regiones solapantes del genoma

• Rediseño de 5 parejas de primers

• Secuencias 100% idénticas

BAGVBAGV

Caracterización del genoma

completo: Comparación de secuencias

CaracterizaciCaracterizacióónn del del genomagenoma

completocompleto: : ComparaciComparacióónn de de

secuenciassecuencias

BAGVBAGV

Caracterización del genoma completo: Análisis filogenéticoCaracterizaciCaracterizacióónn del del genomagenoma completocompleto: : AnAnáálisislisis filogenfilogenééticotico

BAGVBAGV

Análisis filogenético de secuencia parcial gen EAnAnáálisislisis filogenfilogenééticotico de de secuenciasecuencia parcialparcial gengen EE

• BAGV es similar al virus de la

meningoencefalitis del pavo

• Sólo descrito en Israel y Sudáfrica

BAGVBAGV

Avances en diagnóstico molecular:

Peste Porcina AfricanaAvances en diagnAvances en diagn óóstico molecular: stico molecular:

Peste Porcina AfricanaPeste Porcina Africana

Virus de la Peste Porcina Africana (VPPA)Virus de la Peste Porcina Africana (VPPA)

• Familia Asfarviridae, género Asfivirus.

• Virus ADNdc (170-190 kb).

• Viremias tempranas y prolongadas.

• Cerdo doméstico y salvaje, garrapatas del género

Ornithodoros.

• Alta mortalidad en las formas agudas.

• Diagnóstico diferencial con Peste Porcina Clásica

(PPC).

• Ausencia de vacuna.

Fuente: www.oie.int

Emergente en el este de Europa en junio 2007Emergente en el este de Europa en junio 2007

PESTE PORCINA AFRICANA: 2006-2011PPESTE ESTE PPORCINA ORCINA AAFRICANA: 2006FRICANA: 2006--20112011

Task 2: DIAGNÓSTICO DE PPA

TaskTask 2:2: DIAGNDIAGNÓÓSTICO STICO DE PPADE PPA

Actualización y mejora de lastécnicas moleculares actualesActualizaciActualizacióónn y y mejoramejora de de laslas

ttéécnicascnicas molecularesmoleculares actualesactuales

Incrementar las tIncrementar las téécnicas diagncnicas diagnóósticas disponibles sticas disponibles

en los laboratorios de referencia en los laboratorios de referencia

Ofrecer tOfrecer téécnicas sencillas y rcnicas sencillas y ráápidas de aplicacipidas de aplicacióón en n en campo como campo como penpen--sideside teststests

Proporcionar tProporcionar téécnicas asequibles a cnicas asequibles a

laboratorios/palaboratorios/paííses con recursos limitadosses con recursos limitados

"Evaluating and controlling the risk of

African swine fever in the EU", ASFRISKGrant Agreement no. 211691

April 2008-September 2011

Project coordinator: Prof. Carlos Martins

Desarrollo de un método de PCR en tiempo real rápido

y asequible para la detección mejorada de VPPADesarrollo de un método de PCR en tiempo real rápido

y asequible para la detección mejorada de VPPA

•Método de alta sensibilidad

•Resultados reproducibles

•Detecta todos los genotipos ensayados

•Método de alta sensibilidad

•Resultados reproducibles


Adaptación del método de UPL PCR a kit comercial

AdaptaciAdaptaci óón del n del mméétodo de UPL PCR todo de UPL PCR a a kitkit comercialcomercial

•Implementación rápida y sencilla

•Reactivos listos para usar

•Actualmente en validación

•Implementación rápida y sencilla

•Reactivos listos para usar

•Actualmente en validación

Sistema de PCR empleandouna sonda UPLSistemaSistema de PCR de PCR empleandoempleandounauna sondasonda UPLUPL

Sondas listas para usar

Coste asequible

15

18

21

24

27

30

33

36

39

Ct v

alue

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27Sample no.

run 1

run 2

run 3

run 4

run 5

run 6

run 7

run 8

VALIDADO VALIDADO

Desarrollo de un método de LATE-PCR para la detección

de VPPA en laboratorio y en campoDesarrollo de un método de LATE-PCR para la detección

de VPPA en laboratorio y en campo

•Método sensible y específico


•Compatible con cualquier equipo de PCR tiempo real

•Método sensible y específico


•Compatible con cualquier equipo de PCR tiempo real

BioSeeq-Vet (Smiths Detection):

•Equipo completamente portátil para aplicación

en campo

•Cartucho que incluye extracción de ADN y

amplificación

•Sistema caro

•Actualmente no disponible

BioSeeq-Vet (Smiths Detection):

•Equipo completamente portátil para aplicación

en campo

•Cartucho que incluye extracción de ADN y

amplificación

•Sistema caro

•Actualmente no disponible

Adaptación del método de LATE-PCR a kit comercialAdaptaciAdaptaci óón del mn del m éétodo de todo de LATELATE --PCR a PCR a kitkit comercialcomercial

Desarrollo de un método LAMP de detección del ADN de

VPPA para su aplicación rápida en campo como pen-si de testDesarrollo de un método LAMP de detección del ADN de

VPPA para su aplicación rápida en campo como pen-si de test

•Amplificación de ADN a Tª constante (62ºC)

•Alta especificidad, detecta todos los

genotipos de VPPA ensayados

•Menor sensibilidad que PCR en tiempo real

•No necesidad de equipos sofisticados,

técnica de bajo coste

•Rápida amplificación del ADN

•Técnica de primera línea: pen-side test

•Amplificación de ADN a Tª constante (62ºC)

•Alta especificidad, detecta todos los

genotipos de VPPA ensayados

•Menor sensibilidad que PCR en tiempo real

•No necesidad de equipos sofisticados,

técnica de bajo coste

•Rápida amplificación del ADN

•Técnica de primera línea: pen-side test

•Fácil adquisición e implementación en el laboratorio

•Reactivos liofilizados listos para usar: conservación

a Tª ambiente

•Aplicación en campo

•Fácil adquisición e implementación en el laboratorio

•Reactivos liofilizados listos para usar: conservación

a Tª ambiente

•Aplicación en campo

Adaptación del método de LAMP a kit comercialAdaptaciAdaptaci óón del mn del m éétodo de LAMP a todo de LAMP a kitkit comercialcomercial

VALIDADO VALIDADO

Validación de las técnicas moleculares desarrollada sValidación de las técnicas moleculares desarrollada s

• Único kit comercial disponible para VPPA

•Válido en cualquier equipo de PCR en

tiempo real

•Combinado con equipo de PCR portátil

para aplicación en campo

•Buena sensibilidad y especificidad

•Reactivos liofilizados listos para usar

• Único kit comercial disponible para VPPA

•Válido en cualquier equipo de PCR en

tiempo real

•Combinado con equipo de PCR portátil

para aplicación en campo

•Buena sensibilidad y especificidad

•Reactivos liofilizados listos para usar

T-COR 4TM

CombinaciCombinaci óón de n de kitkit comercial+equipo portcomercial+equipo port áátiltil

Validación de kit comercial de PCR en tiempo real pa ra

detección del ADN de VPPAValidación de kit comercial de PCR en tiempo real pa ra

detección del ADN de VPPA

Simplificación en la recogida, transporte

y almacenamiento de muestrasSimplificación en la recogida, transporte

y almacenamiento de muestras

•Recogida de muestras sencilla

•Transporte y conservación a Tª ambiente

•No es necesario personal veterinario especializado

•Equipamiento básico en campo y en laboratorio

•Recogida de muestras sencilla

•Transporte y conservación a Tª ambiente

•No es necesario personal veterinario especializado

•Equipamiento básico en campo y en laboratorio

Simplificación en la recogida, transporte

y almacenamiento de muestrasSimplificación en la recogida, transporte

y almacenamiento de muestras

• Papel de filtro químicamente tratado

• Inactivación de patógenos

• Detección de genoma viral durante años

• Sistema costoso

• Papel de filtro químicamente tratado

• Inactivación de patógenos

• Detección de genoma viral durante años

• Sistema costoso

• Papel de filtro para cromatografías

• Detección de ADN y Ac (aislamiento?)

• Sistema de bajo coste

• Papel de filtro para cromatografías

• Detección de ADN y Ac (aislamiento?)

• Sistema de bajo coste

FTA cardsFTA FTA cardscards

3MM filter paper3MM 3MM filterfilter paperpaper

SANGRE muestrade elección

SANGRE muestrade elección

STANDARD DNA EXTRACTION

(Roche)

FTA-CARD DNA WASHING (Whatman)

FTA-CARD DNA EXTRACTION (NucleoSpin)





BLOOD 4DPI 19,1 23,81/23,67 25,67 21,87 27,05 22,19 25,65BL 4DPI 10 -1 22,79 26,42/26,26 29,01 25,13 30,61 26,17 30,02BL 4DPI 10 -2 27,27 29,05/29,54 32,84 28,41 33,41 29,73 33,74BL 4DPI 10 -3 30,26 33,42/33,23 35,39 32,03 39,76 32,76 35,46BL 4DPI 10 -4 33,28 37,67/36,02 37,87 36,04 No Ct 36,71 37,44BLOOD C- No Ct No Ct/No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct No CtSERUM 4DPI 24,82 30,22/29,73 32,18 28,66 33,62 28,87 35,17S 4DPI 10-1 28,18 32,71/32,73 36,21 32,17 36,83 32,04 >40S 4DPI 10-2 31,7 36,25/37,07 No Ct 35,12 No Ct 35,39 No CtS 4DPI 10-3 34,32 38,98/>40 No Ct No Ct No Ct No Ct No CtS 4DPI 10-4 38,31 No Ct/No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct No CtSERUM C- No Ct No Ct/No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct No Ct

1 day at RT 1 year at RT 2 years at RT

Detección del ADN de VPPA en FTA cardsDetección del ADN de VPPA en FTA cards

UPL PCRUPL PCRUPL PCR

• Sangre como muestra de elección

• Detección de VPPA después de dos

años a RT

• Chequeo del estado del ADN

mediante ensayo de control interno

• Sangre como muestra de elección

• Detección de VPPA después de dos

años a RT

• Chequeo del estado del ADN

mediante ensayo de control interno

ββββ-actinaββββββββ--actinaactinaVPPAVPPAVPPA

¡GRACIAS!¡GRACIAS!

avances en biolog ía molecular con fines diagn ósticos · tendencias en el diagn óstico de...

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