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CAROLINA SCHNEIDER CHADUD

AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE DNA FETAL LIVRE NO PLASMA MATERNO

DURANTE O PRIMEIRO TRIMESTRE DA GESTAÇÃO: ESTUDO COMPARATIVO ENTRE A COLETA E

ARMAZENAMENTO EM TUBO EDTA E PPT

São Paulo 2013

CAROLINA SCHNEIDER CHADUD

AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE DNA FETAL LIVRE NO PLASMA MATERNO

DURANTE O PRIMEIRO TRIMESTRE DA GESTAÇÃO: ESTUDO COMPARATIVO ENTRE A COLETA E

ARMAZENAMENTO EM TUBO EDTA E PPT

Dissertação apresentada ao Curso de Pós Graduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do Título de Mestre

Área de Concentração: Ciências da Saúde

Orientador: Prof. Dr. Tsutomu Aoki Co-orientador: Prof. Dr. Luis Claudio de Silva Bussamra

São Paulo 2013

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo

Chadud, Carolina Schneider Avaliação da concentração de DNA fetal livre no plasma materno durante o primeiro trimestre da gestação: estudo comparativo entre a coleta e armazenamento em tubo EDTA e PPT./ Carolina Schneider Chadud. São Paulo, 2013.

Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.

Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Tsutomu Aoki

1. Diagnóstico pré-natal 2. DNA/sangue 3. Plasma 4. Troca materno-fetal

BC-FCMSCSP/69-13

DEDICATÓRIA

A minha filha, Maria Luísa, amor da minha vida, pela compreensão nos momentos em que me ausentei e por me mostrar que o amor não tem limites. Minha filha querida, você é e sempre será o meu bem mais valioso.

Aos meus pais, Fernando e Elsa, não somente pelo presente da vida, mas por todas as lições de vida, por todos os valores e pela fundamental presença em toda minha trajetória, assim como pelo apoio incondicional às minhas escolhas. Meu amor por vocês é eterno.

Ao meu irmão, Vitor, pelas lembranças inesquecíveis de uma infância muito feliz, pela convivência sempre harmoniosa e pelos ensinamentos sobre o amor fraternal. Esteja sempre presente na minha vida.

Ao meu marido, André, amor da minha vida, pela dedicação, companheirismo e amor diários, mas principalmente por me ensinar que o verdadeiro sentimento pode superar obstáculos e se manter inabalável.

Aos meus tios, Ana Lúcia e Fábio, pela estimada e constante presença em minha vida pessoal e profissional. Sempre dedicarei um grande amor a vocês.

Ao meu avô, Ihiel (in memorian) por todo o amor, incentivo e amizade, imprescindíveis para minha formação, mas também pelo exemplo de dedicação à pesquisa científica e vida acadêmica. Você sempre será um exemplo para mim.

“Por mais longa que seja a caminhada o mais importante é dar o primeiro passo”

Vinícius de Moraes

AGRADECIMENTOS

À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa, pelo acolhimento e oportunidade.

À Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, berço de meu aprendizado durante a residência médica, por ensinar-me o verdadeiro sentido do amor ao próximo e respeito ao ser humano.

Ao Serviço de Medicina Fetal da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo, por todo o aprendizado e por fornecer o apoio necessário para a realização deste trabalho.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Tsutomu Aoki, exemplo de profissional e ser humano; pela oportunidade, confiança e constante apoio frente aos obstáculos enfrentados no desenvolvimento desta tese, além do relevante incentivo à vida acadêmica.

Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Luis Cláudio de Silva Bussamra, coordenador do setor de Medicina Fetal da Santa Casa de São Paulo, pelo acolhimento fraternal; além dos ensinamentos, oportunidade e incentivo ao crescimento profissional e vida acadêmica.

Ao Prof. Dr. José Mendes Aldrighi, Diretor do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de São Paulo, pelo constante incentivo à pesquisa e titulação dos docentes e confiança em meu trabalho.

Ao Prof. Dr. Antônio Pedro Flores Auge, coordenador do programa de pós-graduação do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de São Paulo, por permitir a concretização deste sonho.

À CAPES, pelo apoio financeiro durante o tempo de desenvolvimento da pesquisa.

A RDO, pelo apoio técnico prestado durante o processamento do material, fundamental para a concretização deste trabalho.

A Prof. Dr. Ciro Dresch Martinhago, competente médico geneticista, pelo apoio, confiança e incentivo no desenvolvimento deste projeto.

À Giselle Tedesco e Viviane Andari, companheiras durante a elaboração desta tese, não só pelo incansável esforço e trabalho dedicados, mas pela amizade construída.

Por fim, às gestantes, que em momento relevante de suas vidas, permitiram e contribuíram de forma generosa para o desenvolvimento desta pesquisa.

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

CCD - charge-coupled devices

CCN - comprimento cabeça - nádega

CT - ciclo de threshold

DNA - ácido desoxirribonucleico

EDTA - ethylenediaminetetracetic acid

FISH - rapid fluorescence in situ hybridization

ml - mililitro

ng - nanograma

NIFTY - The National Institute of Child Health and Human Development Fetal Cell

Isolation Study

pb - pares de base

PCR - protein chain reaction

PPT - plasma preparation tube

rpm - rotações por minuto

WGA - whole genome amplification

∆Rn - baseline corrected normalized fluorescence

µl - microlitro

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .............................................................................................. 1

1.1 Rastreamento e diagnóstico de aneuploidias fetais na gestação ........... 1

1.2 Revisão Bibliográfica ............................................................................... 3

1.2.1 Células fetais intactas no sangue materno ..................................... 3

1.2.2 DNA fetal livre no plasma materno ................................................. 5

1.3 Diagnóstico não invasivo pré-natal .......................................................... 7

1.4 Aplicações clinicas .................................................................................. 9

1.5 Técnicas de processamento e enriquecimento de DNA ......................... 10

1.6 PCR em tempo real ................................................................................. 14

1.7 Tubos EDTA e PPT ................................................................................. 17

2. OBJETIVO .................................................................................................... 19

3. CASUÍSTICA E MÉTODOS .......................................................................... 20

3.1 Critérios e inclusão .................................................................................. 21

3.2 Critérios de exclusão ............................................................................... 21

3.3 Coleta de material ................................................................................... 22

3.4 Processamento do plasma materno ........................................................ 22

3.5 Extração de DNA das amostras .............................................................. 23

3.6 Desenho dos primers e sondas TaqMan MGB® .................................... 23

3.7 PCR em tempo real ................................................................................. 24

3.8 Controle de contaminação ...................................................................... 26

3.9 Análise estatística .................................................................................... 26

3.10 Cálculo amostral .................................................................................... 27

4. RESULTADOS ............................................................................................. 28

5. DISCUSSÃO ................................................................................................. 32

6. CONCLUSÃO ............................................................................................... 36

7. ANEXOS ....................................................................................................... 37

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 42

FONTES CONSULTADAS ........................................................................... 50

RESUMO ...................................................................................................... 51

ABSTRACT ................................................................................................... 52

1. INTRODUÇÃO:

1.1 Rastreamento e diagnóstico de aneuploidias fetais na gestação

O diagnóstico pré-natal é de extrema importância para o manejo de

gestações com anormalidades fetais, além de permitir o planejamento adequado do

parto e de cuidados neonatais específicos (Dhallan et al, 2004).

Aneuploidia é definida como alteração numérica dos cromossomos, afetando

1 em cada 300 recém-nascidos, sendo a causa mais comum de retardo mental

(Sayres, Cho, 2011). A incidência na população geral de doenças resultantes de

uma anomalia genética detectável é de 1 a 2 %, com predomínio das alterações

cromossômicas sobre as gênicas (Wolff et al, 2009).

Estudos populacionais mostram que a incidência de anomalias

cromossômicas é de aproximadamente 50% em abortamentos espontâneos, 5 a

10% em natimortos e 0,5% em nativivos (Wolff et al, 2009). No momento da

detecção clínica da gravidez, a frequência das cromossomopatias está ao redor de

5%, e ao nascimento de 0,3%, em virtude do processo de seleção negativa natural

dos embriões cromossomicamente anormais. Como evidência de tal seleção

negativa, 50 a 70% dos abortos espontâneos e natimortos apresentam alterações

cromossômicas (Wolff et al, 2009).

Atualmente, existe uma gama de exames disponíveis para o rastreamento

pré-natal de aneuploidias, durante o primeiro trimestre. No entanto, todos

apresentam alguma limitação. Exames não invasivos, como marcadores séricos

maternos (dosagem da fração livre do beta HCG e da proteína plasmática A),

aferição ultrassonográfica da translucência nucal, osso nasal e dopplerfluxometria do

ducto venoso são utilizados tradicionalmente para o rastreamento de

cromossomopatias, porém não permitem o diagnóstico definitivo (Evans, Kilpatrick,

2010; Sayres, Cho, 2011).

2

A taxa de detecção de trissomia do cromossomo 21 é de aproximadamente

92 a 96% com o uso destes métodos de rastreamento, com taxa de falso positivo

menor do que 3% (Malone et al, 2005; Nicolaides, 2011). Em relação às outras

alterações cromossômicas, como trissomia do cromossomo 13 e 18 e monossomia

do cromossomo X, a detecção é similar, podendo ser discretamente maior. A taxa de

falso positivo encontra-se ao redor de 5%, o que gera procedimentos invasivos e

riscos desnecessários (Sayres, Cho, 2011; Verweij et al, 2012). Além disso, estes

métodos apresentam especificidade e sensibilidade limitadas, além de só serem

executados em um período da gestação, especificamente entre 11 e 14 semanas

(Lo, Chiu, 2008).

Procedimentos diagnósticos invasivos no pré-natal, como biópsia de vilo

corial, amniocentese e cordocentese, são oferecidos a gestantes acima de 35 anos,

com história familiar de aneuploidias, na presença de malformações fetais, e em

casos de risco elevado em exame morfológico de primeiro trimestre (Bianchi et

al,1997). Estes métodos convencionais de obtenção de material para verificação de

anormalidades fetais – cariótipo - são invasivos e carregam um risco potencial de

perda da gestação de 0,5 a 2%, além de outras complicações obstétricas maternas

e fetais tais como infecção materna, oligoâmnio, corioamnionite, punção de partes

fetais, rotura de membranas ovulares, hemorragia e trabalho de parto prematuro

(Alfirevic et al, 2003; Lo, 2005).

Técnicas de imagem avançadas – ultrassonografia tridimensional,

ecocardiograma fetal, dopplerfluxometria e ressonância magnética fetal – assim

como métodos citogenéticos – cariótipo fetal e FISH (rapid fluorescence in situ

hybridization) ou de biologia molecular – PCR (protein chain reaction), PCR em

tempo real, tecnologia de arrays, amplificação de sinais – oferecem a possibilidade

de diagnóstico pré-natal de diversas malformações estruturais congênitas e

desordens genéticas em famílias de alto risco (Agnieszka et al, 2007). Os casais

considerados de alto risco apresentam na anamnese história de parente de primeiro

grau com doença genética, um dos indivíduos é portador de doença genética,

consanguinidade, passado de abortamento habitual, idade materna avançada,

exposição à radiação ou a substâncias com possível efeito teratogênico ou alteração

em ultrassom morfológico fetal durante a gestação (Pinto Junior, 2002). O

3

diagnóstico precoce intra-útero é essencial para o manejo da gestação, cuidados pré

e pós-natais e tratamento. Além disso, é também crucial para a tomada de decisão

em manter ou interromper a gestação (Agnieszka et al, 2007).

1.2 Revisão bibliográfica

1.2.1 Células fetais intactas no sangue materno

A circulação materna é separada da porção fetal pelas vilosidades

trofoblásticas da placenta. Entretanto, sabe-se da existência do tráfego bidirecional

de células entre mãe e feto (Walknowska et al, 1969; Lo et al, 1989; Lo et al, 1996;

Lo et al, 2000b). Desde o século passado, sabe-se da presença de material fetal em

organismo materno, durante o período gestacional (Walknowska et al, 1969). Além

disso, o número de células fetais que atinge a circulação materna aumenta

exponencialmente com o decorrer da gestação (Kirsch-Volders et al, 1980). A

identificação de material genético materno, sobforma de DNA (ácido

desoxirribonucleico) materno livre, ocorreu anos mais tarde, em plasma de cordão

umbilical (Lo et al, 2000b). A partir destas constatações, abriu-se um novo horizonte

para a pesquisa de material genético fetal no sangue periférico materno (Lo et al,

1998a).

Assim, o interesse em buscar alternativas para o diagnóstico pré-natal não

invasivo se tornou foco de diversas pesquisas. Diferentes tipos de células

sanguíneas – eritrócitos, trofoblastos e leucócitos – cruzam a placenta e circulam no

sangue de gestantes (Walknowska et al,1969). Estes diferentes tipos celulares foram

explorados como candidatos em potencial para o diagnóstico pré-natal não invasivo.

Desde meados de 1950, a passagem de eritrócitos entre mãe e feto já era um

fenômeno bem documentado, na proporção de uma célula fetal a cada 50 000

células maternas (Schoder, 1975). A identificação de linfócitos fetais em circulação

materna,a partir do primeiro trimestre de gestação, ocorreu anos mais tarde, sendo

estabelecido um número aproximado de uma célula fetal a cada 500 – 1000 células

maternas (Kirsch-Volders et al, 1980).

Inicialmente, os estudos se concentraram em isolar as células fetais

4

nucleadas do sangue materno, sob a justificativa de que estas continham maior

concentração de DNA fetal, em virtude da existência de material genético

concentrado no núcleo celular (Bianchi et al, 1990; Gaenshirt et al, 1994). Células

fetais são encontradas em quantidade significativamente maior no organismo

materno em gestações de fetos portadores de trissomia do cromossomo 21, em

comparação com fetos euplóides (Bianchi et al, 1997). Este fenômeno está de

acordo com estudos que demonstraram anormalidades patológicas em placentas,

como imaturidade e hidropsia, em casos de trissomia dos cromossomos 13, 18 e 21

(Labbé et al, 1989). Entretanto, após diversas tentativas sem sucesso, buscando

aprimorar técnicas de biologia molecular que aumentassem o poder diagnóstico,

este método foi abandonado. As técnicas de isolamento e enriquecimento celular

são lentas, caras e de difícil implementação em larga escala (Lo et al, 1998a).

As células brancas do sistema imune fetal (CD34+ e CD38+) podem estar

presentes, depositadas no baço e fígado maternos, por mais de vinte anos após o

término da gestação, inviabilizando a aplicação desta técnica pela possibilidade de

interferência de gestações anteriores (Bianchi et al, 1996). Pesquisas recentes

associaram a persistência de células fetais na circulação materna, após o término do

período gestacional, ao desenvolvimento de doenças autoimunes maternas, como

esclerose múltipla (Lo, 2000a).

Em relação às células nucleadas da série vermelha, sua concentração em

sangue materno apresenta oscilação lenta, o que impede a utilização como

marcadores de eventos gestacionais (Lo et al, 1999c). Estudos prévios sobre o

processo de depuração de células fetais do sangue materno concluíram que, em

muitos casos, o tempo necessário pode atingir semanas (Lo et al, 1993; Thomas et

al, 1995). Por fim, a raridade de eritrócitos fetais em amostras de sangue da mãe – 1

– 2/ml de sangue materno – limitou, portanto, a prática e o desenvolvimento dessa

estratégia (Bianchi et al, 1997).

Nas últimas décadas, o isolamento de células fetais em gestantes foi

bastante investigado (Lo et al, 1989). Em 2002, o estudo NIFTY (The National

Institute of Child Health and Human Development Fetal Cell Isolation Study) enfocou

exclusivamente o uso de células fetais, estabelecendo que as técnicas de

enriquecimento e a tecnologia voltada para análise de células intactas não eram

5

viáveis para a prática clínica. Além disso, a sensibilidade para a detecção de

aneuploidias era comparada a de marcadores de rastreamento no sangue materno,

distante do padrão ouro oferecido pelos procedimentos invasivos (Bianchi et al,

2002).

1.2.2 DNA fetal livre no plasma materno

Um estudo da década de setenta constatou pequena quantidade de DNA

presente no soro de indivíduos normais - média de 13 ± 3 ng/ml - e o aumento deste

valor em pacientes portadores de câncer - média de 280 ng/ml (Leon et al, 1977).

A porção acelular do sangue - o plasma – passou a ser objeto de grande

interesse nos estudos após a identificação de DNA tumoral circulando livre no

plasma de pacientes portadores de câncer (Chen et al, 1996). Simultaneamente,

também foi reportada a presença do DNA de indivíduos doadores no plasma dos

pacientes receptores de transplantes de órgãos sólidos (Lo et al, 1998c).

As bases biológicas da liberação de DNA fetal no plasma materno ainda não

foram totalmente esclarecidas. Possivelmente ocorre devido ao contínuo escape de

células fetais através da placenta, que são rapidamente destruídas pelo sistema

imune materno, liberando o DNA fetal livre na circulação (Pertl et al, 2000).

Adicionalmente, a apoptose das células fetais é também um mecanismo envolvido

(Pertl, Bianchi, 2001; Chan et al, 2004; Bischoff et al, 2005), além dos processos de

morte e lise celular (Bianchi, 1998; Angert et al, 2003). Maior quantidade de DNA

livre circulante foi dosada em casos de lúpus eritematoso sistêmico (Davis et al,

1978) e trauma (Lo et al, 2000b). Este fenômeno é atribuído a maiores taxas de

eventos de morte celular que caracterizam estas doenças (Holdenrieder et al, 2005).

Porém, é importante salientar que a principal fonte de DNA fetal livre tem origem no

trofoblasto da placenta, tornando primordial o estudo e compreensão do papel da

placenta na fisiopatologia da gestação normal e patológica (Litton et al, 2009; Tounta

et al, 2011).

Em 1997, Lo e colaboradores descobriram a presença de DNA fetal

circulando livre no plasma e soro de mulheres grávidas (Lo et al, 1997). No mesmo

ano, o achado de DNA circulante em pacientes portadores de câncer e em

indivíduos transplantados impulsionou-o e colaboradores a descrever pela primeira

6

vez a presença de DNA fetal no plasma e soro materno. No mesmo trabalho foi

sugerido que o DNA fetal livre derivado de plasma ou soro materno poderia ser um

recurso alternativo não invasivo de obtenção de material fetal para diagnóstico pré-

natal. Inicialmente, Lo e colaboradores identificaram a presença de sequências

exclusivas de DNA de fetos masculinos - frações específicas do cromossomo Y - no

plasma e soro de gestantes (Lo et al, 1997).

Em 1998, este mesmo grupo desenvolveu um trabalho com o objetivo de

quantificar a concentração de DNA fetal livre em sangue materno. A detecção de

sequências de DNA fetal é possível em 80% e 70% dos casos, com apenas 10µl de

plasma e soro, respectivamente (Lo et al, 1998a). Foi estimado que o DNA fetal livre

constituísse em média 3,4% (de 0,39 -11,9%) do total de DNA no plasma materno

em gestações de primeiro e segundo trimestre e 6,2% (de 2,33 -11,4%) em

gestações de terceiro trimestre (Lo et al, 1998a). Além disso, a concentração média

de DNA fetal livre em plasma materno é 21,2 vezes maior em comparação ao

número de células intactas (Lo et al, 1998a). Estes estudos preliminares indicam,

portanto, que a maior fração de DNA fetal circula na forma livre em ambiente

materno (Lo et al, 2000b).

A análise quantitativa do tráfego bidirecional de material genético entre mãe

e feto ocorreu anos mais tarde, em um trabalho publicado por Lo e colaboradores

em 2000. Embora a detecção de células nucleadas e DNA materno livre na

circulação fetal seja de aproximadamente 24% e 30%, respectivamente, na direção

oposta, ou seja, as células nucleadas e o DNA fetal livre na circulação materna

apresentam taxa de detecção de 26% e 100%, respectivamente (Lo et al, 2000b).

Existe, portanto, uma impressionante diferença na taxa de detecção entre DNA fetal

no plasma materno (100%) e DNA materno no plasma do cordão umbilical (30%).

Uma possível explicação seria a existência da placenta, como estrutura de interface

entre a circulação materna e fetal, e que seria a grande fonte responsável pelo

controle da liberação do material genético fetal (Lo et al, 2000b; Wataganara et al,

2005).

7

1.3 Diagnóstico não invasivo pré-natal

Uma alternativa aos métodos tradicionais de diagnóstico pré-natal seria o

uso do material genético fetal, o DNA fetal, existente na circulação materna. O

diagnóstico pré-natal não invasivo é uma meta procurada há bastante tempo na

história da genética humana (Lo et al, 1998a). Durante a gravidez, a circulação entre

mãe e feto é separada parcialmente pela membrana placentária. Porém, o tráfego

bidirecional de células eritrocitárias, através das vilosidades trofoblásticas, foi

comprovado cientificamente, aumentando as possibilidades de um potencial método

para o diagnóstico pré-natal não invasivo (Lo et al, 1996).

A concentração do DNA fetal no soro e plasma das gestantes aumenta

gradativamente durante a gestação (Lo et al, 1998a, Zhong et al, 2001). Além disso,

a detecção da sequência Y de DNA fetal no organismo materno é possível a partir

da quinta semana de gestação (Thomas et al, 1995).

A concentração de DNA fetal livre aumenta linearmente com o avanço da

gestação, com taxa de crescimento de 16 genomas fetais por ml de sangue materno

no primeiro trimestre para 80 no terceiro trimestre de gestação, atingindo o pico nas

últimas oito semanas de gestação (Zhong et al, 2000; Wright, Burton, 2009; Tounta

et al, 2011). Portanto, existe um aumento equivalente a 29,3% a cada semana no

terceiro trimestre de gestação (Chan et al, 2003).

A análise de DNA fetal livre no plasma materno não é afetada pela

persistência de células fetais de gestações anteriores (Bianchi et al, 1996). Além

disso, sua concentração é estável no plasma materno (Angert et al, 2003) e a

depuração deste material é rápida, com meia vida de 16,3 minutos – média de 4 a

30 minutos (Lo et al, 1999c). A ausência de DNA fetal em plasma materno

proveniente de outras gestações já está comprovada (Smid et al, 2003b).

Com base nestes dados, o turn over de DNA fetal circulante foi estudado e

concluiu-se que o DNA fetal é liberado constantemente na circulação materna, com

média de 2,24 X 104 cópias por minuto (Lo et al, 1999c). Os rins desempenham

importante papel no clearance de DNA fetal pelo organismo materno, uma vez que

este material fetal foi identificado em urina de mulheres gestando fetos masculinos

(Lo, 2000a).

8

O uso de DNA fetal no plasma materno passou a ser uma alternativa

promissora para o diagnóstico pré-natal não invasivo e precoce. Desde então,

diversos avanços nesta direção têm sido feitos. A detecção de sequências

exclusivamente fetais, como marcadores do cromossomo Y e sequências RHD, no

DNA fetal circulante, tornou possível a determinação na prática clínica do sexo e

fator RH fetais (Lo et al, 1989; Lo et al, 1998b). A abordagem com DNA fetal livre é,

portanto, um recurso melhor do que o uso de células intactas fetais para diagnóstico

não invasivo na gestação (Bischoff et al, 2002).

No entanto, o uso do DNA fetal livre para a detecção de anormalidades

cromossômicas em fetos ainda é limitado pela pequena porcentagem de DNA fetal

livre que é recuperado do plasma das gestantes (Dhallan et al, 2004). A fração de

DNA fetal recuperada representa aproximadamente 5 a 10% do total de DNA

circulante no plasma materno em gestações de primeiro e terceiro trimestre

respectivamente (Lo et al, 1998a). A eficiência da extração de DNA está diretamente

relacionada com a capacidade de detecção de sequências de DNA, ou seja, com a

técnica utilizada (Johnson et al, 2004).

O objetivo mais almejado no diagnóstico não invasivo pré-natal ainda é a

detecção de aneuploidias (Litton et al, 2009). Assim, ainda é necessário que novas

pesquisas desenvolvam caminhos alternativos, com o objetivo de aumentar a

detecção da fração fetal que compõe o DNA circulante no sangue de gestantes,

permitindo melhor assistência no período pré-natal em casos de suspeita de

alterações cromossômicas fetais.

Para um teste com DNA fetal livre se tornar disponível comercialmente

visando a triagem pré-natal, é mandatório que este seja confiável, viável e acessível

para implementação em larga escala (Sayres, Cho, 2011). Ademais, qualquer

método não invasivo deve ser preciso o suficiente para dispensar a confirmação

futura por procedimento invasivo, além de ser mais barato do que os procedimentos

invasivos em uso atualmente (Hahn et al, 2011).

9

1.4 Aplicações clínicas

A detecção qualitativa de sequências de DNA fetal tem implicação prática

em diagnósticos moleculares pré-natais de sexagem fetal associada a doenças

ligadas ao sexo (Lo et al, 1997; Costa et al, 2002a; Sesarini et al, 2009; Tounta et al,

2011); genotipagem do gene RhD (Lo et al, 1998b; Sesarini et al, 2009; Tounta et al,

2011), desordens autossômicas recessivas, como distrofia miotônica (Amicucci et al,

2000; Tounta et al, 2011), acondroplasia (Saito et al, 2000; Tounta et al, 2011) e

doença de Huntington (Tounta et al, 2011) ou desordens monogênicas, como a

fibrose cística e hemoglobinopatias (Chiu et al, 2001; Chiu et al, 2002; Keymolen et

al, 2007; Tounta et al, 2011).

A sensibilidade na avaliação do sexo fetal foi definida ao redor de 95%, com

especificidade de aproximadamente 99%, independentemente do trimestre da

gestação, indicando que este é um bom método para a rotina pré-natal, a partir de

cinco semanas de gestação, em casos de risco para doenças gênicas ligadas ao X,

genitália ambígua e hiperplasia adrenal congênita materna (Sekizawa et al, 2001;

Tounta et al, 2011; Wright et al, 2012). O uso do diagnóstico não invasivo do sexo

fetal, em casos de pré-natal com risco para doenças ligadas ao sexo, diminui para

metade o número de procedimentos invasivos, com implicação tanto no custo

quanto em taxas de complicação e perdas gestacionais (Sekizawa et al, 2001).

A detecção quantitativa focou amplamente na mensuração de DNA fetal no

plasma materno utilizando gestações normais como referência. Diferenças relativas

têm sido reportadas em casos de trissomia dos cromossomos 13, 18 ou 21 (Pertl et

al, 2000; Spencer et al, 2003; Jorgez et al, 2007); pré-eclâmpsia (Zhong et al, 2001;

Sekizawa et al, 2004; Leung et al, 2001); parto prematuro (Leung et al, 1998; Farina

et al, 2005); e abortamento (Lau et al, 2000).

Diversos estudos têm indicado a influência de certas desordens na liberação

de DNA fetal na circulação materna, corroborando a hipótese do papel primordial da

placenta como barreira seletiva neste processo (Leung et al, 1998; Lo et al, 1998a;

Pertl, Bianchi, 2001; Zhong et al, 2001; Leung et al, 2001; Spencer et al, 2003;

Sekizawa et al, 2004; Bischoff et al, 2005; Litton et al, 2009). Em gestações

complicadas por préeclâmpsia há um aumento significativo de material genético fetal

10

encontrado no plasma materno (Lo et al, 1999a; Leung et al, 2001; Zhong et al,

2001; Sekizawa et al, 2004). Em fetos portadores de trissomia do cromossomo 13,

18 e 21 também foi observado um grande aumento de DNA fetal (Lo et al, 1999b;

Pertl et al, 2000; Spencer et al, 2003; Jorgez et al, 2007), podendo se elevar em até

seis vezes (Bianchi et al, 1997); assim como em casos de parto prematuro (Leung et

al, 1998; Farina et al, 2005), abortamento (Lau et al, 2000), hiperêmese gravídica

(Sugito et al, 2003), processos invasivos da placenta (Sekisawa et al, 2002),

crescimento fetal restrito (Tounta et al, 2011), hemorragia feto-materna (Tounta et al,

2011) e polidrâmnio (Tounta et al, 2011). Portanto, a mensuração de DNA fetal

também pode ser um possível marcador para a predição de desordens maternas e

fetais durante o pré-natal, já que a disfunção placentária progressiva se manifesta

por maiores taxas de apoptose das células trofoblásticas, com consequente

aumento da concentração de DNA fetal livre circulante (Litton et al, 2009).

Menores concentrações de DNA fetal estão associadas a maiores taxas de

sucesso na terapia de tocólise, sugerindo o uso da concentração de DNA fetal como

screening para diferenciação entre falso trabalho de parto e trabalho de parto

prematuro (Pertl, Bianchi, 2001). A aplicação da concentração de DNA fetal livre em

gestações gemelares ainda não está bem estabelecida (Smid et al, 2003a).

O DNA fetal plasmático é, portanto, um método valioso e acessível para

obtenção de material genético fetal, aplicável para diagnóstico e acompanhamento

pré-natal (Lo et al, 2000a).

1.5 Técnicas de processamento e enriquecimento de DNA

Apesar do plasma e soro materno conterem DNA fetal livre, o plasma é o

material de escolha para uso em diagnóstico pré-natal, pois a concentração de DNA

materno misturado ao fetal é menor (Sesarini et al, 2010). Uma importante limitação

na detecção de sequências de DNA fetal é o fato de que este material se encontra

misturado ao material genético materno, o que gera interferência – background - na

recuperação do material de interesse para o estudo cromossômico do feto (Bianchi,

1998). O principal obstáculo para a extração eficiente do material genético fetal é,

portanto, o processo de diferenciação e separação do DNA fetal, já que a fração

11

materna representa 90 a 97% do total de DNA circulante e coexiste com a fração

fetal no plasma (Lo et al, 1998a).

A detecção de DNA fetal livre apresenta, portanto, os seguintes desafios

técnicos: a concentração de DNA fetal livre no sangue materno é relativamente

baixa; a concentração total de DNA fetal livre apresenta variação individual; a

concentração de DNA fetal livre apresenta relação de aproximadamente 1: 20 do

total de DNA total livre; o feto herda metade do genoma da mãe (Wright, Burton,

2009).

Como a utilidade do diagnóstico pré-natal não invasivo depende da

habilidade em separar e analisar o material genético misturado ao sangue materno,

a fração de DNA fetal livre pode ser aumentada por meio do enriquecimento da

fração fetal de DNA, ou pela diminuição da fração materna de DNA livre –

background – como esquematizado na Figura 1 (Lo, Chiu, 2008).

DNA fetal % = DNA fetal DNA fetal + DNA materno

DNA fetal % = DNA fetal

DNA fetal + DNA materno





Fonte: Lo, Chiu, 2008 FIGURA 1: Ilustração esquemática com as possíveis abordagens visando o

aumento da fração fetal de DNA

12

As técnicas utilizadas para detecção de DNA fetal livre na circulação

materna são mais simples, rápidas e confiáveis em comparação as utilizada para

detecção de células intactas fetais (Pertl, Bianchi, 2001; Bianchi et al, 2002).

Diferentes métodos de processamento podem afetar drasticamente a quantidade de

DNA que é detectado pelo PCR em tempo real no sangue materno (Chiu et al, 2001;

Johnson et al, 2004; Gonzáles-González et al, 2005; Chiu et al, 2005).

Em relação ao uso de protocolos de centrifugação, independente da

velocidade utilizada, não existe associação com dano em células sanguíneas, nem

tampouco a falsos aumentos na concentração de DNA livre da amostra submetida

ao processo (Chiu et al, 2001; Lui et al, 2002).

Dhallan e colaboradores adicionaram formaldeído à amostra de plasma

materno com o objetivo de aumentar a recuperação da fração fetal, por meio da

estabilização das células maternas e diminuição da lise celular (Dhallan et al, 2004).

Porém, outros grupos tentaram reproduzir a mesma técnica sem sucesso (Benachi

et al, 2005).

Quando o ácido fetal de interesse é exclusivo do concepto a demanda por

métodos de enriquecimento se torna desnecessária (Go et al, 2011). Um exemplo

disso seria a identificação de frações de DNA fetais (marcadores epigenéticos), em

locus que exibissem sinais epigenéticos feto-especificos, analisando diferentes

status de metilação do DNA entre a mãe e o feto (Jones, Takai, 2001; Chim et al,

2005; Tsui et al, 2010). A epigenética abrange processos, como a metilação de

DNA, que alteram o fenótipo, porém sem alterações na sequência do DNA (Sesarini

et al, 2010; Lim et al, 2011). Desde a descoberta do primeiro marcador epigenético

fetal, outros marcadores já foram descritos (Chiu et al, 2007; Tong et al, 2010). Os

marcadores epigenéticos fetais podem ser empregados tanto para análise qualitativa

como quantitativa do DNA fetal no plasma materno (Tsui et al, 2010). A detecção de

DNA fetal não metilado apresentou baixa sensibilidade (Poon et al, 2002). A principal

limitação ao uso da metilação do DNA está no método utilizado para detectar os

marcadores de metilação, baseado na conversão de bissulfite. O uso deste método

resulta em destruição de 95% do DNA (Grunau et al, 2001). Este fato pode levar a

resultado falso – negativo, principalmente em gestações de primeiro trimestre, em

função da redução do DNA fetal na amostra (Tounta et al, 2011).

13

Por este motivo, as pesquisas foram desviadas para marcadores

epigenéticos independentes da conversão de bissulfite, como a sequência

RASSF1A. Esta técnica, no entanto, requer importante manipulação, o que a torna

pouco viável para a prática clínica (Tounta et al, 2011).

Os fragmentos de DNA materno são maiores do que os de origem fetal

durante a gestação. Já foi demonstrado, pela análise por PCR, que o DNA fetal livre

circula sob a forma de fragmentos de até 300 pb (pares de base) em comparação ao

materno, que apresenta tamanho consideravelmente maior (Chan et al, 2004).

Portanto existe uma distribuição de diferentes tamanhos de DNA no plasma de

mulheres grávidas, abrindo a possibilidade de enriquecimento fetal por meio do

fracionamento de DNA. Esta técnica também é limitada, demorada e susceptível a

contaminação, não sendo útil como ferramenta diagnóstica isolada, mas sim como

método auxiliar de outras técnicas (Chan et al, 2004; Jorgez, Bischoff, 2009; Hahn,

Zimmermann, 2010; Go et al, 2011).

Outra maneira de se identificar a porção do cromossomo de origem fetal é

pela análise da proporção de variação genética nos alelos em um determinado ócus.

Porém só pode ser usada se o feto for heterozigoto para o ócus em análise (Lo,

Chiu, 2008). Uma opção para genes presentes de forma homozigota, em casos de

trissomia, seria a análise pelo PCR digital (Lo et al, 2007).

Atualmente, diversas novas tecnologias, como PCR digital, sequenciamento

massivo paralelo e a amplificação de todo o genoma – WGA (Whole genome

amplification) – tem se apresentado com alternativa para contornar o problema da

baixa concentração de DNA fetal livre no organismo materno. O PCR digital tem a

capacidade de detectar fragmentos menores de DNA livre, quando comparado com

a técnica de PCR em tempo real (Sikora et al, 2010). Porém, estes métodos são de

alto custo, lentos, de baixa produtividade, e ainda não foram submetidos à avaliação

em larga escala para permitir sua aplicação como rotina (Hanson, Ballantyne, 2005;

Chiu et al, 2010; Tsui et al, 2010; Chiu et al, 2011; Hahn et al, 2011; Tounta et al,

2011; Tsui, Lo, 2012).

14

1.6 PCR em tempo real

A partir do desenvolvimento de técnicas de biologia molecular,

especialmente com o advento da reação de PCR, poderosas ferramentas de

identificação de sequências genéticas fetais no sangue periférico materno, passaram

a ser empregadas (Lo et al, 1996). O PCR permite o sequenciamento de genomas, a

expressão de genes em sistemas recombinantes, o estudo de genética molecular, a

determinação rápida da paternidade e o diagnóstico rápido de doenças infecciosas.

O PCR em tempo real representa um avanço tecnológico, já que está técnica

apresenta a capacidade de gerar resultados quantitativos, permite o

acompanhamento da reação e apresenta resultados de forma precisa e rápida, em

comparação ao PCR que apresenta resultados apenas de forma qualitativa (Pertl,

Bianchi, 2001).

O método PCR em tempo real é uma tecnologia de inovação que permite

mensurar a taxa de acúmulo de amplificação através da detecção de fluorescência

emitida a cada ciclo da reação (Heid et al, 1996). Este processo é baseado numa

relação quantitativa entre o número de DNA-alvo presente no início da reação de

PCR e o montante de produto amplificado durante a fase exponencial da reação.

Dentre os vários sistemas suportados pela PCR em tempo real, o mais

utilizado é o TaqMan®, que utiliza um oligonucleotídeo marcado (sonda), uma

molécula fluorescente (fluoróforo) e outra de apagamento intamolecular (quencher),

além do par de oligo iniciadores (primers), utilizados na PCR comum. Portanto,

quando a sonda se liga na sequência-alvo, o fluoróforo e o quencher são separados

e a fluorescência pode ser mensurada pela máquina, através de uma câmera CCD

(charge-coupled devices) que capta o sinal de cada ciclo (Fig. 2).

FIGURA 2: Sistema TaqMan®

Com a emergência de uma nova tecnologia de sondas chamada

MGB™ (minor groove binder)

genoma (70 pb), deixando esse sistema de detecção mais sensível e com a

possibilidade do uso de várias sondas

sistema pode ser útil para a detecção de várias regiões na mesma reação.

O conceito chave para se entender a reação de PCR em tempo real é o ciclo

de threshold (CT). Inicialmente, se determina

de base ou baseline), e a partir des

linha de base o intervalo entre 3 a 5 ciclos, precedentes ao primeiro ciclo que se

inicia o sinal fluorescente de amplificação. O CT ocorre quando a fluorescência

ultrapassa a linha de threshold

A linha de threshold deve ser determinada na fase exponencial da curva para

resultados mais precisos, já que se presume que esta fase seja caracterizada p

eficiência máxima da reação (Fig

TaqMan® para PCR em tempo real.

Com a emergência de uma nova tecnologia de sondas chamada

(minor groove binder) foi possível amplificar regiões muito pequenas do


lidade do uso de várias sondas – multiplex (Kutyavin et al

ser útil para a detecção de várias regiões na mesma reação.


(CT). Inicialmente, se determinam os níveis de ruído fluorescente (linha

), e a partir desta referência o CT é definido. Compreende



threshold, a qual pode ser fixa ou determinada pelo operador.

deve ser determinada na fase exponencial da curva para

resultados mais precisos, já que se presume que esta fase seja caracterizada p

eficiência máxima da reação (Fig. 3).

15

Com a emergência de uma nova tecnologia de sondas chamada TaqMan®

foi possível amplificar regiões muito pequenas do


et al, 2000). Assim, este

ser útil para a detecção de várias regiões na mesma reação.


os níveis de ruído fluorescente (linha

ta referência o CT é definido. Compreende-se por



ser fixa ou determinada pelo operador.

deve ser determinada na fase exponencial da curva para

resultados mais precisos, já que se presume que esta fase seja caracterizada pela

FIGURA 3: Conceitos básicos de PCR em tempo real.

A partir do princípio de que a PCR em tempo real reflete o número de cópias

do DNA-molde, quanto maior a concentração deste DNA, ou quanto maior o número

de cópias iniciais, mais precocemente vai aparecer à fluorescência e

consequentemente, menor será o valor obtido do CT.

Outra definição importante em PCR em tempo real é o

corrected normalized fluorescence

emitida após a amplificação menos a fluorescência basal emit

reação e os reagentes. Quanto maior o

valor do ∆Rn depende de vários fatores, dentre os mais importantes est

desenho dos primers e a sonda, a eficiência da reação, concentração de

sonda e o conjunto de todos os reagente, ou seja, reflete diretamente a eficácia com

que a reação foi realizada.

O uso do PCR em tempo real com objetivo de quantificar o DNA fetal

plasmático, baseado na identificação de sequências Y específicas, apres

os básicos de PCR em tempo real.


molde, quanto maior a concentração deste DNA, ou quanto maior o número


consequentemente, menor será o valor obtido do CT.

Outra definição importante em PCR em tempo real é o

corrected normalized fluorescence), que nada mais é que a fluorescência final

emitida após a amplificação menos a fluorescência basal emitida naturalmente pela

reação e os reagentes. Quanto maior o ∆Rn mais robusta e eficiente foi a reaç

Rn depende de vários fatores, dentre os mais importantes est

e a sonda, a eficiência da reação, concentração de


que a reação foi realizada.


plasmático, baseado na identificação de sequências Y específicas, apres

16


molde, quanto maior a concentração deste DNA, ou quanto maior o número


Outra definição importante em PCR em tempo real é o ∆Rn (baseline

), que nada mais é que a fluorescência final

ida naturalmente pela

Rn mais robusta e eficiente foi a reação. O

Rn depende de vários fatores, dentre os mais importantes estão o

e a sonda, a eficiência da reação, concentração de primers e



plasmático, baseado na identificação de sequências Y específicas, apresentou 95 a

17

100% de sensibilidade e 100% de especificidade (Bischoff et al, 2002; Zolotukhina et

al, 2005).

O PCR em tempo real é utilizado para a maioria destas análises porque este

método é automatizado, oferece dados em tempo real e, por ser um sistema

fechado, é menos susceptível a contaminação. Além disso, é uma metodologia que

mostra resultados quantitativos, justificando seu emprego na maioria dos estudos

com objetivo de determinar a concentração de DNA fetal livre em plasma materno

(Sikora et al, 2010). Além disso, é sensível o suficiente para detectar o DNA de uma

única cópia (Pertl, Bianchi, 2001).

1.7 Tubos EDTA e PPT

Os tubos para coleta de material hematológico são transparentes, incolores,

estéreis e,por serem herméticos são usados para coleta de sangue a vácuo (e

outras coletas), garantindo a esterilidade da amostra.

Existe uma variedade de tubos, com características distintas, o que os

diferencia quanto ao seu emprego.

O tubo EDTA (Ethylenediaminetetracetic acid) contém um anticoagulante, o

EDTA K2, jateado na parede interna.

Já o tubo PPT (Plasma Preparation Tube) também é um sistema a vácuo

com anticoagulante EDTA, porém possui um gel separador. Usado nos casos em

que é necessário o envio de plasma EDTA a partir do tubo original de coleta. A

presença do gel separador impede o contato entre as células presentes no sangue

materno e o plasma contendo o DNA fetal livre ao contrário do tubo EDTA que

contém apenas anticoagulante.

Diante das limitações expostas, nós decidimos investigar uma técnica

alternativa de coleta e armazenamento do sangue periférico materno, que permitisse

maior taxa de recuperação do DNA fetal livre. Sabemos que a maior parte do DNA

livre presente no plasma de gestante provém do próprio organismo materno (Lo et

18

al, 1998a; Fernando et al, 2010), em decorrência dos processos de apoptose

(Bischoff et al, 2005), morte e lise celular (Angert et al, 2003). Portanto, qualquer

fator que atuasse diminuindo estes processos, após a coleta da amostra de sangue

periférico materno, poderia diminuir a quantidade de DNA livre materno misturada ao

DNA fetal livre fetal, aumentado, portanto, a taxa relativa de DNA fetal livre.

Neste estudo nós construímos a hipótese de que por meio da inibição da lise

celular após a coleta de amostra de sangue materno em tubo PPT, uma maior

porcentagem de DNA fetal livre seria recuperada durante o processamento deste

material. Essa comparação entre a taxa de recuperação da fração fetal nos dois

diferentes tubos de coleta do plasma materno é inédita e não encontramos nenhuma

referência na literatura médica disponível.

19

2. OBJETIVO

O estudo visa comparar a concentração de DNA fetal livre em plasma

materno durante o primeiro trimestre de gestação, obtido em dois diferentes tubos:

EDTA e PPT.

20

3. CASUÍSTICA E MÉTODOS

Foram selecionadas para participar deste estudo as gestantes que

apresentavam os critérios de inclusão propostos neste protocolo, selecionadas no

Setor de Medicina Fetal do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa

Casa de Misericórdia de São Paulo, no período entre dezembro de 2011 e outubro

de 2012.

As pacientes selecionadas foram avaliadas inicialmente com

ultrassonografia obstétrica precoce (até 14 semanas), para a confirmação da idade

gestacional, por meio da medida do CCN (comprimento cabeça-nádega). Após, foi

realizada ultrassonografia morfológica de primeiro trimestre (entre 11 e 14 semanas),

com o objetivo de afastar possíveis malformações fetais. O sexo fetal foi confirmado

em exame morfológico de segundo trimestre (entre 20 e 24 semanas), ocasião em

que também foi realizada uma segunda avaliação da morfologia fetal. Os fetos sem

alteração morfológica nas duas ultrassonografias morfológicas foram considerados

normais. Não houve nenhum caso de óbito fetal durante o período de

acompanhamento dos fetos selecionados.

A coleta dos casos foi iniciada após a aprovação da Comissão Científica do

Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de Misericórdia de São

Paulo e do Comitê de Ética e Pesquisa da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia

de São Paulo – projeto n° 295/11 (Anexo 1).

Após esclarecimento verbal sobre todos os procedimentos necessários à

pesquisa, foi solicitada a assinatura de um termo de consentimento livre e

esclarecido e o preenchimento de um questionário com dados demográficos

(Anexos 2 e 4).

21

3.1 Critérios de inclusão

- gestação de primeiro trimestre (até 14 semanas), segundo a data da última

menstruação, confirmada por meio da medida do CCN em ultrassonografia

obstétrica precoce

- gestação única

- ausência de malformação fetal

- ausência de doenças clínicas crônicas ou obstétricas maternas

- fetos do sexo masculino

As gestações gemelares não foram incluídas neste trabalho, pois a

concentração de DNA fetal ainda não está bem estabelecida nestes casos. Os fetos

com malformação fetal, independentemente da idade gestacional, não foram

incluídos na casuística, devido possibilidade da associação com cromossomopatias.

Sabe-se que gestações complicadas por cromossomopatia fetal apresentam

maiores concentrações de DNA fetal livre, o que seria um fator de viés.

Qualquer afecção materna, clínica ou obstétrica, que curse com a

possibilidade de insuficiência placentária, como hipertensão arterial crônica, diabetes

mellitus, tireoidopatias, doença hipertensiva específica da gestação e infecções

congênitas (toxoplasmose, rubéola, citomegalovirose, sífilis, infecção pelo vírus da

imunodeficiência humana) foi excluída da casuística, pois poderia levar a um

aumento da concentração de DNA fetal plasmático, em relação às gestações não

patológicas.

3.2 Critérios de exclusão

- perda de seguimento após a realização da coleta do material

- falha técnica durante o processamento das amostras de sangue materno

- constatação de malformação fetal durante seguimento ultrassonográfico

22

- constatação de feto do sexo feminino em ultrassonografia de segundo

trimestre

3.3 Coleta de Material

Foram coletados 10 ml do sangue de uma veia da região antecubital do

antebraço das pacientes, em dois diferentes tubos, sendo um EDTA (BD

Vacutainer® Plus Plastic K2EDTA Tubes – referência 367861) e outro PPT (BD

Vacutainer® PPT™ Plasma Preparation Tube - referência 362788), a fim de se

extrair o DNA fetal livre no plasma materno (Fig. 4).

FIGURA 4: Imagem do tubo PPT e do tubo EDTA, respectivamente.

3.4 Processamento do Plasma Materno

As amostras de sangue coletadas no tubo PPT foram submetidas,

imediatamente após a coleta, a centrifugação a 3000 rpm (rotações por minuto) por

10 minutos e encaminhadas ao Laboratório RDO Diagnósticos Médicos,

devidamente identificadas e refrigeradas. As amostras do tubo EDTA foram

centrifugadas apenas no laboratório mencionado, uma vez que não possuem gel

separador.

Os plasmas dos tubos PPT e EDTA foram divididos em alíquotas em

23

microtubos de PCR de 2 ml (Axygen) e re-centrifugados em micro-centrífuga a

14.000 rpm por 10 minutos. Posteriormente, o sobrenadante foi retirado e estocado

em novos microtubos de PCR de 2 ml e estocados a -20°C até o processo de

extração de DNA. A duração do processo entre a coleta do material e o

processamento do plasma materno foi inferior a quatro horas, em todos os casos

incluídos na casuística.

3.5 Extração de DNA das amostras

O DNA fetal livre foi extraído do sangue materno, automaticamente, por meio

do robô de extração Qiacube (Qiagen) seguindo o protocolo QiaAmp MinElute Spin -

Large body-fluid samples, disponível eletronicamente no site do fabricante, com o

uso do Kit comercial de extração QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen). O produto da

extração foi eluído em 60µl de Buffer de eluição.

O produto da extração foi estocado a -20°C até a aplicação dos ensaios

moleculares.

3.6 Desenho dos primes e sondas TaqMan MGB®,

A escolha da região genômica como o desenho dos primers e sondas são

fundamentais para o sucesso e eficiência de uma reação em multiplex. Foi escolhida

uma região genômica para realizar as reações de PCR em duplex. Esta região

genômica alvo é específica do cromossomo Y, chamada TSPY (DYS-14). A região

do marcador DYS-14, amplifica apenas quando o DNA é do sexo masculino. Trata-

se de uma região que possui 20 a 30 cópias no cromossomo Y, diferente de outras

regiões como SRY que possui apenas uma cópia. Essa característica eleva a

sensibilidade da reação, pois se houver um dano no DNA na região escolhida pode

não haver amplificação. Em uma região de múltiplas cópias, além de existir várias

cópias iniciais, se houver um dano em uma dessas cópias, existem as outras para

serem amplificadas.

Os primers e sondas foram desenhados através do programa Primer

24

Express 2.0 (Applied Biosystems) nas condições sugeridas pelo fabricante. Para

PCR em tempo real usando o sistema TaqMan MGB®, amplicons pequenos (50-

150pb) rendem tipicamente resultados mais consistentes e sinais robustos. Após o

desenho dos oligos, os mesmos foram submetidos à análise do BLAST e In-Silico

PCR para checar a especificidade dos mesmos. O BLAST e In-Silico PCR são

ferramentas da biotecnologia disponíveis livremente na internet

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/; http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr), pelas

quais se confere a similaridade de regiões do DNA para se saber a especificidade

das mesmas. Os primers e sondas utilizados bem como informações sobre seu

produto estão dispostos na Tabela 1.

TABELA 1: Primers e sondas

REGIÃO

PRIMERS

SONDA

FRAGMENTOS

β -

GLOBINA

F-5’-TGCTGTTATGGGCAACCCTAA-3’

(VIC)TGAAGGCTCATGGCAAG

74 pb

R-5’-GAGCCAGGCCATCACTAAAGG-3’

TSPY

5’-AGAGCGTCCCTGGCTTCTG-3’

(FAM)TCCTTCTCAGTGTTTCTT

77 pb

5’-GAGAGCACCTCTCCACTAGAAAGG-3’

3.7 PCR em Tempo Real

As reações (ensaios moleculares) foram realizadas em máquina de PCR em

tempo real (7500 Real Time PCR System - Applied Biosystems, Foster City, CA,

USA) utilizando o sistema TaqMan®para detecção do produto de amplificação.

Para a ciclagem foram utilizados os seguintes parâmetros: volume de reação

de 25µl; incubação inicial a 50ºC por 2 minutos, o primeiro passo de denaturação foi

de 10 minutos a 95ºC e posteriormente, 45 ciclos de PCR em dois passos:

25

denaturação a 95ºC por 15 segundos, seguido de temperatura de anelamento a

60°C por 60 segundos (Fig. 5).

Os retângulos superiores mostram a temperatura em graus Celsius, e nos retângulos inferiores o tempo em minutos.

FIGURA 5 - Condições de ciclagem realizadas pela PCR em tempo real em

célula única.

Foram realizadas as reações de PCR em tempo real. Do volume total de

25µl, aproximadamente 10µl eram do DNA extraído do plasma materno, 12,5µl de

Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems - PN 4304437), sistema

composto de reagentes necessários para a realização da atividade 5’nucleásica,

como enzima AmpliTaq Gold; Enzima AmpErase UNG; dNTPs com dUTP; referência

passiva e buffer, e para a região TSPY 400nM de primers e 150nM para a sonda.

Para completar o volume final de cada reação, foi utilizada água pura estéril (Sigma-

Aldrich -Water).

A fluorescência contínua foi monitorada no passo de anelamento de cada

primer específico em sua sequência alvo. Neste caso, cada alelo do genoma possui

seu primer específico que emite uma coloração diferente para cada alelo. O

threshold foi fixado em 0.10 em todas as reações para padronização dos resultados

(Ct). A duração média de uma reação de 45 ciclos é de 1hora e 50 minutos.

26

Os dados da análise foram gerados segundo o software SDS v1.4 21

(Applied Biosystems).

3.8 Controle de Contaminação

O preparo dos reagentes da PCR foi realizado dentro de um fluxo laminar, o

qual é restrito de outras atividades, com material único para essa manipulação. Todo

o material como pipetas e superfície onde foram realizadas as reações, foi mantido

apenas para o projeto, e foram manipulados com luvas sem talco. A

descontaminação das superfícies de trabalho foi realizada antes de cada reação

com álcool 70% ou com água sanitária a 10%. O profissional que realizou as

reações sempre esteve munido de máscara e toca. Após o término e análise de

cada reação, todo material foi descartado, evitando qualquer contaminação com

material já amplificado (no caso PCR). Em nenhum momento os tubos de PCR

foram abertos após a reação.

3.9 Análise estatística

A análise estatística foi realizada no programa SPSS (Statistical package for

Social Sciences), versão 13.0, através do teste t pareado.

Foi adotado o teste t pareado em virtude do poder deste em definir o nível de

semelhança ou diferença entre dois momentos de uma mesma amostra ou

população, pois estuda as diferenças entre duas situações de uma mesma

população.

Além disso, permite a realização de duas medidas feitas na mesma unidade

experimental desde que exista uma correlação entre elas, ou seja, as amostras são

dependentes.

27

3.10 Cálculo amostral

O cálculo amostral foi realizado pelo setor de estatística da Faculdade de

Ciências Médicas da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo. Para um poder

estatístico de 80%, com intervalo de confiança de 90%, a amostra deve ser

constituída por 42 casos.

4. RESULTADOS

O número de casos colhidos

apenas 24 foram de fetos do sexo masculino, o que corre

restante correspondeu a 28 fetos do sexo feminino (45,16%) e 10 casos descart

por falha técnica (16,12%), como mostrado na Figura 6

FIGURA 6: Detalhamento

A amostra utilizada para o trabalho

masculinos, e totalizou, portanto,

Dos casos excluídos por falha t

material no tubo EDTA,

DNA fetal e um por contaminação do material.

A análise dos dados demográficos mostrou que

de 17 a 35 anos, com média de 26,04

eram primigestas e 8 pacientes

grau de parentesco entre os pais.

RESULTADOS

de casos colhidos totalizou 62 gestantes, sendo que deste total,

apenas 24 foram de fetos do sexo masculino, o que corresponde a 38,70%. O

correspondeu a 28 fetos do sexo feminino (45,16%) e 10 casos descart

ica (16,12%), como mostrado na Figura 6.

etalhamento do total de casos colhidos.

A amostra utilizada para o trabalho foi constituída apenas dos fetos

totalizou, portanto, 24 casos (Anexo 3).

s casos excluídos por falha técnica, sete ocorreram

um por falha de alíquotas, um por falha na amplificação do

por contaminação do material.

A análise dos dados demográficos mostrou que a idade das gestantes variou

média de 26,04 anos. Dos 24 casos incluídos,

pacientes eram secundigestas. Não houve nenhum caso com

grau de parentesco entre os pais.

28

62 gestantes, sendo que deste total,

sponde a 38,70%. O

correspondeu a 28 fetos do sexo feminino (45,16%) e 10 casos descartados

foi constituída apenas dos fetos

ocorreram por hemólise do

por falha na amplificação do

das gestantes variou

Dos 24 casos incluídos, 16 pacientes

Não houve nenhum caso com

MASCULINOS

FEMININOS

DESCARTADOS

29

TABELA 2: Análise da amostra em relação à idade gestacional.

IDADE GESTACIONAL

Intervalo de confiança 95%

Idade gestacional média 11,08

Mediana 12,00

Desvio padrão 2,302

Idade gestacional mínima 6

Idade gestacional máxima 14

Variação 8

Fonte: Serviço de Medicina Fetal do Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo

Os valores obtidos de DNA fetal coletado em tubo EDTA e PPT foram

expressos pelo CT, obtido por PCR em tempo real (Fig. 7).

FIGURA 7: Distribuição gráfica dos valores obtidos de CT.

30

As amostras colhidas em tubo EDTA tiveram valores médios de CT

correspondente a 30,2354, com intervalo de confiança de 95%.

Em relação às amostras colhidas em tubo PPT, o valor médio do CT foi de

30,0846, também com intervalo de confiança de 95%.

TABELA 3: Análise da amostra colhida em tubo PPT, expressa por CT.

CT PPT


Ct ppt médio 30,0846

Mediana 30,2350


Ct ppt mínimo 27,08

Ct ppt máximo 32,61

Variação 5,53


TABELA 4: Análise da amostra colhida em tubo EDTA, expressa por CT.

CT EDTA


Ct edta médio 30,2354

Mediana 30,0650


Ct edta mínimo 28,01

Ct edta máximo 32,09

Variação 4,08


31

TABELA 5: Análise comparativa entre os valores de CT das amostras colhidas em tubo EDTA e PPT.

CT EDTA x CT PPT

MÉDIA

N

DESVIO PADRÃO

CT EDTA

30,2354

24

0,19671

CT PPT

30,0846

24

0,21624


p = 0,357

A partir do exposto acima, podemos observar que o valor absoluto do CT

obtido no material colhido em tubo EDTA foi maior do que o obtido em tubo PPT. O

CT, como já explicado, representa um sinal da reação de PCR em tempo real, e

quanto menor for este valor obtido, significa que maior quantidade de DNA fetal livre

estava presente naquela amostra. Porém, não houve significância estatística nesta

diferença de valores obtidos entre a coleta realizada em tubo PPT e EDTA, pois o p

foi maior do que 0,05.

32

5. DISCUSSÃO

A descoberta do DNA fetal livre na circulação materna abriu um novo

horizonte de pesquisas na busca do diagnóstico pré-natal não invasivo (Lo et al,

1997). O DNA fetal livre fetal é uma ferramenta valiosa para o diagnóstico pré-natal

não invasivo, porém o seu uso ainda não está concretizado na prática obstétrica. O

uso da tecnologia de PCR em tempo real permite acessar com sucesso o DNA fetal

para determinação do sexo fetal e status Rh,como rotina durante o pré-natal (Lo et

al, 1989; Lo et al, 1997;Lo et al, 1998b; Costa et al, 2002a; Sesarini et al, 2009;

Tounta et al, 2011). O principal fator limitante para a aplicação desta tecnologia em

outros diagnósticos é a concentração total de DNA livre presente no plasma das

gestantes, a maior parte proveniente do próprio organismo materno (Lo et al,1998a;

Fernando et al, 2010). Portanto, ainda existem desafios técnicos a serem

ultrapassados antes da viabilização desta opção como diagnóstico pré-natal de

rotina. Além disso, a quantidade de DNA circulatório varia consideravelmente em

indivíduos normais e saudáveis (Zhong et al, 2001; Hahn et al, 2001).

A placenta exerce papel fundamental como intermediadora da passagem de

células fetais para a circulação materna, que somado ao processo de apoptose das

células trofoblásticas, dará origem ao DNA fetal livre (Litton et al, 2009; Tounta et al,

2011). Este órgão, exclusivo da gravidez, é a grande fonte responsável pelo controle

da liberação do material genético fetal (Lo et al, 2000b; Wataganara et al, 2005).

Portanto, a integridade e o bom funcionamento da placenta é um fator

fundamental de interferência na concentração de DNA fetal livre. Qualquer doença

clínica e/ou obstétrica materna que evolua com alteração vascular placentária, como

hipertensão arterial crônica, doença hipertensiva específica da gestação e diabetes

mellitus, poderia alterar quantitativamente a detecção de DNA fetal livre no plasma

materno. Diante disso, neste trabalho optamos por só incluir as gestantes sem

qualquer alteração clínica e/ou obstétrica no momento da coleta do material, como

33

prevenção de viés nos resultados.

As gestações gemelares também não foram incluídas no trabalho, pois

imaginamos que haveria aumento da concentração de DNA fetal livre por maior

quantidade de massa placentária e consequentemente de células trofoblásticas,

além de maior quantidade de células intactas na circulação materna. Ademais, a

aplicação da concentração de DNA fetal livre em gestações gemelares ainda não

está bem estabelecida (Smid et al, 2003a).

Os fetos portadores de malformação detectada por ultrassonografia

morfológica não foram incluídos na amostra pelo alto risco de associação com

cromossomopatias. Já está bem estabelecido em diversos trabalhos o aumento da

concentração de DNA fetal livre em gestações de fetos portadores de trissomia do

cromossomo 13, 18 e 21 (Pertl et al, 2000; Spencer et al, 2003; Jorgez et al, 2007).

O DNA total livre aumenta no decorrer da gestação, e este fenômeno é

atribuído a apoptose das células fetais (Pertl, Bianchi, 2001; Chan et al, 2004;

Bischoff et al, 2005), além dos processos de morte e lise celular (Bianchi, 1998;

Angert et al, 2003). Estes processos também atuam após a coleta do sangue

materno, dentro do próprio tubo de coleta (Chiu et al, 2001; Angert et al, 2003).

Apesar da concentração de DNA fetal livre ser menor no primeiro trimestre

de gestação, todos os casos incluídos neste trabalho foram de gestações até 14

semanas. Optamos por realizar a pesquisa nesta idade gestacional por entendermos

a importância do diagnóstico precoce durante o período pré-natal, para o

planejamento do pré-natal, parto e cuidados pós-natais com o recém-nascido

(Agnieszka et al, 2007). Além disso, a idade gestacional precoce favorece a tomada

de decisão entre manter ou interromper o curso da gestação, preserva a saúde

clínica, obstétrica e psicológica materna, além de ser meta procurada desde o início

das pesquisas.

Diante destas limitações, nós intuímos que o uso do tubo PPT seria uma

possível forma de diminuir o contato entre a porção celular materna e o plasma

materno - porção que carrega o DNA fetal livre. Assim, após o início dos processos

de degradação celular o DNA materno livre extra, produzido por estes fenômenos,

ficaria isolado da fração fetal, aumentando a concentração relativa do DNA fetal livre

34

em relação ao materno.

Entretanto, muitas variantes atuam na concentração total de DNA livre e,

consequentemente, na concentração relativa do DNA fetal livre (Angert et al, 2003).

Investigações anteriores mostraram que o tempo entre a flebotomia e o

processamento do material afeta a concentração de DNA livre no plasma materno

(Chiu et al, 2001; Angert et al, 2003). Outro grupo constatou que a concentração

total de DNA livre no sangue materno, colhido em tubo EDTA, permaneceu estável

em temperatura ambiente por até 4 horas após a coleta do material (Angert et al,

2003; Barrett et al, 2011). Aumentos na concentração de DNA livre foram

observados entre 6 a 24 horas da flebotomia (Angert et al, 2003). No período entre

24 e 72 horas da coleta existe um aumento significativo na concentração de DNA

total e, portanto, uma diminuição na proporção de DNA fetal (Angert et al, 2003;

Barrett et al, 2011). Todas estas afirmações se relacionam a degradação das células

maternas após a coleta de sangue. Os processos de apoptose, morte e lise celular

liberam quantidade expressiva de DNA materno, que se mistura ao DNA fetal,

dificultando ainda mais a detecção da fração fetal de material genético.

O protocolo de processamento de material também é uma importante

variável na taxa de detecção do DNA fetal livre em plasma materno (Johnson et al,

2004). O método de PCR, o tipo de reagente empregado, o fabricante dos

instrumentos utilizados na extração de DNA, além do marcador padronizado para

identificação do DNA fetal (Johnson et al, 2004).

A comparação entre a taxa de detecção de DNA fetal livre em material

colhido em tubo EDTA e PPT é inédita. Não encontramos na literatura nenhum

trabalho anterior nesta linha de pesquisa que pudesse ter sido adotado como

referência durante o desenvolvimento desta pesquisa.

Em nosso trabalho, o processamento do material foi iniciado precocemente,

em menos do que 4 horas após a coleta, o que pode ter exercido influência na etapa

da detecção do DNA pelo PCR em tempo real. Se o material coletado tanto no tubo

EDTA quanto no PPT fosse submetido à espera de algumas horas antes de se

iniciar o processamento, talvez no tubo EDTA os processos de apoptose pudessem

ter exercido influência negativa no momento da detecção do DNA fetal livre.

35

Portanto, a taxa de detecção do DNA fetal livre no tubo EDTA poderia ter sido

significativamente menor em relação à do tubo PPT, caso o tempo entre a coleta e o

processamento fosse maior.

Atualmente, os centros genéticos tendem a ser regionalizados, distante,

portanto, de muitas outras localidades. Na prática clínica, sabe-se que uma amostra

de sangue colhido em localidade distante pode ter um transporte de dias até chegar

ao local onde será feito o processamento do material (Barrett et al, 2011). Portanto,

em situações em que se sabe que o material levará mais do que oito horas para

iniciar o processamento, seria interessante a coleta em tubo que diminuísse o

contato do material fetal com o materno, a fim de melhorar a taxa de detecção do

DNA fetal (Barrett et al, 2011).

O Brasil é um país grande e com centros de desenvolvimento e pesquisa

bastante regionalizados. A partir disso, em localidades mais distantes, o tempo entre

a coleta e o processamento do sangue materno certamente ultrapassaria 24 horas.

Isso nos faz pensar que deveríamos testar a nossa hipótese, portanto, em intervalo

maior do que um dia entre a coleta e o processamento do material, o que seria mais

aplicável à realidade do nosso país.

O tubo PPT, apesar de custar três vezes mais do que o EDTA, ainda seria

uma alternativa bastante barata como método de enriquecimento de DNA fetal. A

estimativa de valor do tubo PPT é de aproximadamente US$0,50. Além disso, o tubo

PPT é um material universal, facilmente encontrado independentemente da região e

se caracteriza por ser um sistema fechado, o que contorna a questão da

contaminação do sangue por manipulação em tubos abertos e seringas de coleta.

Apesar dos nossos resultados não se mostrarem expressivos nesta etapa,

nós ainda acreditamos que podemos alcançar resultados concordantes com a nossa

hipótese, se o tempo entre a coleta e o processamento do material for superior a 24

horas, usando a mesma metodologia descrita aqui. Portanto, por este ter sido um

projeto inédito, foi necessária esta primeira etapa para que as arestas da

metodologia pudessem ser aparadas e o projeto aprimorado.

36

6. CONCLUSÃO

A coleta do sangue periférico materno em tubo PPT não melhorou a taxa de

detecção da concentração do DNA fetal livre quando comparado ao tubo EDTA.

37

7. ANEXOS

Anexo 1: Parecer emitido pelo Comitê de ética em Pesquisa da Santa Casa de

Misericórdia de São Paulo.

38

Anexo 2: Termo de consentimento livre e esclarecido

Você está sendo convidada para participar, como voluntária, de uma pesquisa.

Depois da explicação de todas as etapas da pesquisa, caso aceite participar, você

deverá assinar ao final deste documento, em duas vias. Uma delas é sua e a outra é

do pesquisador (médico) responsável. Caso você não aceite participar deste estudo,

não haverá nenhum prejuízo no seu tratamento.

O nome da pesquisa é “Avaliação da concentração de DNA fetal livre no plasma materno durante o primeiro trimestre: estudo comparativo entre as técnicas EDTA e PPT”. O objetivo do estudo será comparar a melhor técnica de coleta e armazenamento de DNA fetal no sangue das gestantes. O DNA é uma substância que representa o material genético de cada pessoa e está presente em todo nosso corpo, inclusive no sangue das veias do braço. As mulheres grávidas têm, o seu próprio DNA e o DNA do seu bebê, misturados no seu sangue, durante o período da gestação. Atualmente usamos o DNA do bebê para descobrir alguma alteração genética, como exemplo a síndrome de Down. Mas para conseguir este DNA do bebê os médicos devem realizar procedimentos invasivos durante a gestação, como a coleta de células da placenta, de líquido amniótico e de sangue do cordão umbilical, o que pode trazer algumas complicações para a mãe e para o bebê. Com essa pesquisa queremos descobrir uma forma de conseguir coletar o DNA do bebê através do sangue do braço da mãe para evitar estes procedimentos.

Esse estudo não trará malefício para a sua saúde, saúde do seu parceiro e saúde do seu bebê. Além disso, participar deste estudo não significa que o seu bebê tenha alguma doença. Durante o estudo será mantido sigilo absoluto sobre todos os seus dados e resultados. Você poderá retirar este consentimento e abandonar o estudo no momento em que desejar sem prejuízo para o seu atendimento, sem danos financeiros ou morais.

Os procedimentos necessários para contribuir com esta pesquisa será fornecer amostra do seu sangue, que será colhido de uma veia do seu braço. Durante este procedimento você poderá sentir dor, e após a coleta do sangue pode se observado inchaço, hematoma (mancha roxa) e, mais raramente, infecção no local onde a agulha será colocada no seu braço.

Caso aceite participar desta pesquisa, esteja ciente que nenhum tipo de pagamento ou gratificação será fornecido pelo Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de São Paulo, o que reforça o caráter voluntário da sua participação neste estudo.

39

Eu,_________________________________________________________________ fui suficientemente informada a respeito deste estudo. Discuti com a Dra Carolina Schneider Chadud, médica responsável pelo estudo sobre a minha decisão em participar. Ficaram claros para mim quais são os objetivos, os procedimentos que serão realizados, desconforto, riscos, garantia de sigilo e esclarecimentos permanentes. Ficou claro também que a minha participação é isenta de despesas e remuneração. Entendi também que este estudo não apresenta nenhum risco para a minha saúde, saúde do meu parceiro e para a saúde do meu bebê.

A minha assinatura neste termo de consentimento livre e esclarecido dará a autorização ao Departamento de Obstetrícia e Ginecologia da Santa Casa de São Paulo para utilizar estes dados obtidos nesta pesquisa, sempre preservando a minha privacidade e a confidencialidade dos mesmos.

São Paulo, _____ de ________________ 20____.

Nome da Paciente: _________________________________________________

RG: ___________________________

Médico responsável: Carolina Schneider Chadud

CRM: 120612 RG: 33603719-3

Telefone de contato: (11) 50842702 / (11) 50823039

40

Anexo 3: Tabela de pacientes

Nº IDENTIFICAÇÃO IDADE GESTACIONAL CT EDTA CT PPT IDADE PARIDADE

(SEMANAS) (ANOS)

1 MJL 11 29,73. 29,41. 17 0

2 SMC 13 30,50. 30,71. 27 I

3 RSA 8 29,64. 29,64. 19 I

4 ESL 14 29,44. 30,21. 26 0

5 CV 12 29,02. 28,57. 30 0

6 CLMNO 13 29,97. 30,26. 28 0

7 JCS 8 30,33. 30,41. 25 I

8 LJAC 11 29,74. 30,28. 31 0

9 FRR 12 31,75. 30,54. 35 I

10 PRMHP 11 30,91. 29,94. 28 0

11 KDL 12 30,39. 29,90. 24 0

12 DAD 13 29,48. 30,13. 33 I

13 JS 12 30,16. 29,64. 17 0

14 MSL 7 31,48. 30,64. 26 0

15 TSC 12 29,45. 28,60. 18 0

16 FMS 7 30,62. 32,61. 27 I

17 LBG 12 32,09. 30,77. 18 0

18 MMO 12 29,65. 30,72. 20 0

19 SSA 13 29,90. 30,03. 31 I

20 SAT 12 29,58. 29,21. 33 0

21 MVC 12 28,01. 27,08. 32 I

22 VDM 6 31,41. 30,54. 23 0

23 JNO 9 31,38. 31,17. 29 0

24 VCMA 14 31,02. 31,02. 28 0

41

Anexo 4: Questionário – pesquisa de material genético fetal em sangue materno

RG atendimento S. Casa:_______________ Nº Registro na pesquisa:_________

Nome da gestante: ___________________________________________Idade:____

Nome do parceiro: ___________________________________________Idade: ____

Telefone para contato: ( )_____________________ ( ) __________________

Endereço:___________________________________________________________

___________________________________________________________________

Email: ______________________________________________________________

Grau de parentesco do casal: ( ) não existe ( ) existe. Qual? ______________

Tipo sanguíneo da gestante: ( ) O ( ) A ( ) B ( ) AB

( ) Rh- ( ) Rh+

Teve gestações anteriores? ( ) sim ( ) não

Quantos (as)? menino( ) menina ( )

Já teve aborto? ( ) sim ( ) não

Quantas vezes? ( ) 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) Mais de 3 ( ) Nunca

DUM:___________________ DPP: _______________________________________

Idade gestacional atual (em semanas): ____________________________________

Feto: ( ) único ( ) gemelar ( ) trigemelar

Sexo do feto: ( ) não sabe ( ) menina ( ) menino

Tem algum parente com deficiências física ou mental? ( ) sim ( ) não

Quem?______________________________________________________________

Qual deficiência? _____________________________________________________

Observação:_________________________________________________________

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

___________________________________________________________________

42

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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RESUMO

CHADUD CS.“Avaliação da concentração de DNA fetal livre no plasma materno durante o primeiro trimestre da gestação: estudo comparativo entre a coleta e armazenamento em tubo EDTA e PPT”. 2013. Tese de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo. DNA fetal livre é encontrado na circulação materna, correspondendo à fração de 3 a 6 % do total de DNA. O objetivo deste trabalho foi comparar a concentração de DNA fetal livre detectado no plasma materno, após coleta de sangue periférico de gestantes durante o primeiro trimestre de gestação, obtido em dois diferentes tubos EDTA e PPT. Foi realizado um estudo prospectivo, em gestações entre 5 e 14 semanas, com fetos únicos, do sexo masculino e sem malformação fetal detectada em ultrassonografia morfológica. Amostras de 10 ml de sangue periférico materno foram coletadas em tubo EDTA e PPT. O plasma foi extraído das duas amostras e submetido à reação de PCR em tempo real, utilizando o sistema TaqMan®. A identificação da fração fetal ocorreu por meio da região TSPY (DYS -14), exclusiva do cromossomo Y. A concentração de DNA fetal foi expressa por valores de CT (ciclo de threshold), obtidos durante a reação de PCR em tempo real e os resultados do CT entre os dois tubos foram comparados pelo teste t pareado. O CT médio obtido no tubo PPT correspondeu a 30,08 e no tubo EDTA a 30,23. Não houve diferença estatisticamente significante nos valores encontrados de CT entre os tubos PPT e EDTA. O tubo EDTA é usado rotineiramente para coleta de sangue periférico, contém anticoagulante e é um sistema fechado. O tubo PPT também é um sistema fechado e contém um gel separador em seu interior, que isola a porção celular da porção acelular do sangue materno. Como o DNA fetal livre se encontra na porção acelular – plasma – do sangue materno, nós construímos a hipótese de que através da inibição do contato do plasma com a porção celular do sangue materno, menos DNA materno se misturaria ao fetal, melhorando a taxa de recuperação do mesmo nas amostras colhidas em tubo PPT. Atribuímos estes resultados ao fato do intervalo entre a flebotomia e o processamento do material ter sido inferior a 4 horas, o que não permitiu a ação dos processos de apoptose e lise celular na amostra colhida em tubo EDTA.

Palavras chave: Diagnóstico pré-natal, DNA/sangue , Plasma, Troca materno-fetal

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ABSTRACT CHADUD CS. “Determination of free fetal DNA in maternal plasma during the first trimester of pregnancy: a comparative study between the collection and storage in EDTA and PPT tubes”. 2013. Tese de Mestrado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo. Free fetal DNA in the maternal circulation is found, corresponding to the fraction of 3 to 6% of the total DNA. The aim of this study was to compare the concentration of free fetal DNA in maternal plasma detected after collecting peripheral blood of pregnant women during the first trimester of gestation, obtained in two different tubes, EDTA and PPT. We conducted a prospective study in pregnancies between 5 and 14 weeks with single male fetuses, without fetal malformation detected on ultrasound morphology. Samples of 10 ml of maternal peripheral blood were collected in EDTA and PPT tube. The plasma was extracted from the two samples and subjected to PCR reaction in real time using the TaqMan ® system. The identification of fetal fraction occurred through the region TSPY (DYS -14), exclusive of chromosome Y. The concentration of fetal DNA was expressed as CT values (cycle threshold), obtained during the PCR reaction in real time and the results of the CT between the two tubes were compared by paired t test. The obtained average CT PPT corresponded to 30.08 and in EDTA tube to tube 30.23. There was no statistically significant difference in the CT. The EDTA tube is used routinely to collect peripheral blood, contains anticoagulants and is a closed system. The tube PPT is also a closed system containing a separating gel inside, which isolates the cellular portion of the acellular portion of the maternal blood. As the free fetal DNA is in the acellular portion of the maternal blood - plasma - we have built the hypothesis that by inhibiting the contact of the plasma with the cellular portion of maternal blood, less maternal DNA would mix to fetal DNA, improving the recovery rate in samples collected in tube PPT. We attribute these results to the fact that the interval between phlebotomy and processing of the material have been less than four hours, which did not allow the action of the processes of apoptosis and cell lysis in the sample collected in EDTA tube.

Key-words: Prenatal diagnosis, DNA / Blood, Plasma, Exchange maternal-fetal

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