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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO - CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS CURSO DE BACHARELADO EM FARMÁCIA
AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE E POTENCIAL ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE DE ÓLEO DE PEQUI EM EMULSÕES COSMÉTICAS
(Caryocar brasiliense Camb.)
ALÉXIA LORENZI RAISER
SINOP-MT
2016/2
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO - CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS CURSO DE BACHARELADO EM FARMÁCIA
AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE E POTENCIAL ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE DE ÓLEO DE PEQUI EM EMULSÕES COSMÉTICAS
(Caryocar brasiliense Camb.)
ALÉXIA LORENZI RAISER
Trabalho de Curso apresentado ao Curso de
Farmácia da Universidade Federal de Mato
Grosso – UFMT, campus de Sinop para
obtenção do título de Bacharel em Farmácia,
sob a orientação da Professora Dra. Dênia
Mendes de Sousa Valladão.
SINOP-MT
2016/2
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
L869a Lorenzi Raiser, Aléxia. Avaliação da estabilidade e potencial atividade antioxidante de óleo de pequi
em emulsões cosméticas (Caryocar brasiliense Camb.) / Aléxia Lorenzi Raiser. -- 2017
50 f. : il. color. ; 30 cm.
Orientadora: Denia Mendes de Sousa Valladão. TCC (graduação em Farmácia) - Universidade Federal de Mato Grosso,
Instituto de Ciências da Saúde, Sinop, 2017. Inclui bibliografia.
1. Emulsões. 2. Potencial Atividade Antioxidante. 3. Caryocar brasiliense. 4. Pequi. 5. DPPH. I. Título.
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO - CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE SINOP INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS CURSO DE BACHARELADO EM FARMÁCIA
“Dedico este trabalho principalmente aos meus
pais, Zuleide e Fortunato, que não mediram
esforços para me auxiliar na busca desta
conquista. Ambos me ensinaram lições de vida,
onde a educação, conhecimento e
responsabilidade são de suma importância.”
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por ter iluminado o meu caminho prevalecendo Sua vontade.
Agradeço aos meus pais e aos meus avós, Iva e Sérgio, por todo apoio psicológico e
financeiro, por todo o amor, carinho e compreensão durante todos esses anos. Sem vocês não
haveria razão para todos os meus esforços, que ainda são poucos perto do que fizeram e fazem
por mim. Agradeço as minhas irmãs, Aline e Alessandra e a existência do meu sobrinho
Miguel, que renova minhas forças e ânimo para que eu me torne uma pessoa e uma
profissional cada vez melhor.
Agradeço todo o apoio e confiança recebido pelo Prof. Dr. Leandro Dênis Battirola desde o
inicio da graduação e a minha orientadora Prof. Dra. Dênia Mendes de Sousa Valladão pela
receptividade desde o inicio dos nossos trabalhos de pesquisa, pelos conhecimentos teórico-
práticos transmitidos, pelo incentivo, paciência, carinho e atenção para com minha pessoa.
Tenho grande admiração por vocês e serei eternamente grata por cada detalhe que os
envolvam. Vocês possibilitaram minha evolução no âmbito profissional e pessoal.
Agradeço aos meus amigos e colegas durante todos esses anos pelo carinho, ajuda e
compreensão, principalmente ao Caio Vinicius Cunha, Renata Piran, Juliana Alves Oliveira e
Milena do Nascimento que sempre estiveram ao meu lado me ajudando, me dando apoio
psicológico e permitindo serem pessoas importantes na minha vida.
Agradeço a minha amiga e parceira de pesquisa, Marcia Regina Marcílio por toda a ajuda,
paciência e carinho. Ainda, agradeço aos meus amigos Rafael Morales, Marcelo Ávila, Maria
Aparecida Deliberal, Cristiangela Santos, Vanessa Hanel e Larissa Lopes por todo o carinho,
apoio e bom humor.
Agradeço aos meus irmãos do coração, Mariana Ritter Nizer e Eder Guadanhini, pelo grande
incentivo quanto a minha vida pessoal e profissional. Com toda certeza, vocês me encorajam
a sempre seguir em frente e a enfrentar desafios e os meus medos.
Agradeço o apoio financeiro prestado pela FAPEMAT e CNPq através da bolsa de iniciação
científica e a UFMT por permitir a realização deste trabalho.
Enfim, com pura sinceridade e carinho, obrigada a todos os envolvidos em minha trajetória.
RESUMO
RAISER, A.L. Avaliação da estabilidade e potencial atividade antioxidante de óleo de
pequi em emulsões cosméticas (Caryocar brasiliense Camb.). 2016. Nº pág. 50. Trabalho de
Curso de Farmácia – Universidade Federal de Mato Grosso, Campus de Sinop.
Palavras-chaves: emulsões, potencial atividade antioxidante, Caryocar brasiliense, DPPH.
INTRODUÇÃO: O Brasil é um país rico em espécies frutíferas cujos produtos se destacam,
principalmente, por suas agradáveis características sensoriais, como cor, sabor e aroma. No
estado de Mato Grosso destaca-se o pequi (Caryocar brasiliense), um fruto rico em óleo,
proteínas e carotenoides, compostos químicos que oferecem propriedades importantes e de
interesse a área de cosmetologia, principalmente com relação a potencial atividade
antioxidante. OBJETIVO: O objetivo do trabalho foi avaliar a estabilidade e a potencial
atividade antioxidante de emulsão contendo óleo de pequi (Caryocar brasiliense) em
diferentes concentrações. MATERIAIS E MÉTODOS: O óleo de pequi foi obtido utilizando-
se extração por ultrassom e então incorporado em emulsão base aniônica na proporção de 5 e
10%. As emulsões preparadas foram avaliadas com relação à estabilidade preliminar,
estabilidade acelerada, caracterização reológica e potencial atividade antioxidante pelo
método do DPPH (2,2 difenil-1-picril hidrazil). RESULTADOS: Dos sistemas desenvolvidos
a emulsão contendo 5 % de óleo de pequi apresentou características organolépticas, pH,
densidade e espalhabilidade adequados durante todo o período de estudo mesmo em
temperaturas extremas, bem como manutenção do perfil não-Newtoniano, pseudoplástico e
viscoelástico. Os resultados evidenciaram que as emulsões não podem ser expostas a radiação
luminosa e a altas temperaturas, pois essas condições levam a ocorrência do processo de
cremeação. A formulação foi capaz de melhorar a eficácia antioxidante frente a formulação
base e o óleo de pequi separadamente. A incorporação do óleo de pequi em emulsões é uma
opção da potencial atividade antioxidante permitindo a redução de antioxidantes sintéticos.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 8
2. REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 10
2.1. Aspectos gerais: Caryocar brasiliense Camb. ........................................................... 10
2.2. Extração ..................................................................................................................... 12
2.3. Emulsões e controle de qualidade .............................................................................. 12
2.4. Atividade antioxidante e DPPH ................................................................................. 13
3. ARTIGO ............................................................................................................................ 15
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 41
ANEXO A - NORMAS DA REVISTA INTERCIENCIA ...................................................... 47
8
1. INTRODUÇÃO
O Brasil é conhecido pela sua biodiversidade, sendo um país rico em espécies
frutíferas cujos produtos destacam-se pelas agradáveis características sensoriais, como cor,
sabor e aroma (CANUTO et al., 2010; SILVA et al., 2015). Assim, as frutas oleaginosas vêm
ganhando destaque devido as suas potencialidades na indústria cosmética. No estado de Mato
Grosso encontram-se frutos característicos da região de cerrado, como o pequi.
O pequi (Caryocar brasiliense Camb.) é amplamente utilizado desde a culinária,
produção de sorvetes, licores e sucos, até mesmo na fabricação de cremes e sabonetes pela
indústria cosmética (PAULA-JÚNIOR et al., 2006; ROESLER et al., 2008; BATISTA et al,
2010; GEÖCZE et al., 2013; MACHADO et al., 2013; PESSOA et al., 2015). Na medicina
popular, as cascas de seus frutos são usadas em infusões para efeito antipirético e diurético, as
folhas para resfriados e edemas e o óleo do fruto para queimaduras, casos de reumatismo e
como afrodisíaco (BATISTA et al., 2010). Devido às várias utilizações na medicina popular,
tem sido realizado diversas pesquisas com o pequi e algumas atestam sua eficácia como
antifúngica, atividade mulicida (combate hospedeiro intermediário da esquistossomose),
leishmanicida, antimicrobiano e no óleo obtido da polpa encontra-se antioxidantes naturais
(PAULA-JÚNIOR et al., 2006; ROESLER et al., 2008; BATISTA et al., 2010).
A industrialização de matéria-prima vegetal oleaginosa compreende uma importante
área do sistema agroindustrial devido aos seus produtos nas indústrias siderúrgicas,
alimentícias e de cosméticos (SILVA, 2011). Nesse contexto, os produtos fitocosméticos,
cosméticos desenvolvidos a partir de um ativo natural de origem vegetal, podendo este ser
óleo essencial, óleo ou extrato do vegetal em que a ação do mesmo define a atividade do
produto (BRASIL, 2004; AUTON, 2005; ISAAC et al., 2008; GIL, 2010), são cada vez mais
procurados pelos consumidores pela menor agressão quando comparados aos cosméticos
sintéticos devido a crença de que por ser natural não gera danos (SOUZA et al., 2011).
A indútria cosmética tem buscado ingredientes naturais para substuir os sintéticos
visando a formação de novos produtos que apresentem atividade antioxidante, destinados a
proteção, prevenção e recuperação da pele (SILVA et al., 2013; AMORIM et al., 2015). Logo,
o pequi torna-se promissor no desenvolvimento de produtos na área cosmética e farmacêutica,
além da tendência do mercado pelo uso sustentável dos recursos naturais nos tratamentos
cosméticos, a fim de promover vantagens sobre as formulações tradicionais (QUENCA-
GUILLEN, 2007; LIMA et al., 2008; DALLARMI et al., 2012).
9
Para a obtenção do produto final, o fitocosmético deve passar por diversas etapas de
análises, envolvendo estudos preliminares para a criação de um produto, desenvolvimento da
formulação, testes de estabilidade e análise de embalagem adequada ao produto (BRASIL,
2004; ISAAC et al., 2008; GIL, 2010).
O pequi apresenta características favoráveis para o desenvolvimento de produtos
sustentáveis que reduzam o processo de envelhecimento cutâneo. Ainda, a região norte do
estado de Mato Grosso é pertencente a Amazônia legal, que possui uma grande
biodiversidade frutífera. Nesse sentido, a proposta consiste no aproveitamento dos recursos
naturais amazônicos, no caso o fruto do pequi para obtenção de emulsões que poderão ser
utilizadas com fins cosméticos e/ou farmacêuticos.
Dessa maneira, o objetivo do trabalho foi desenvolver formulações cosméticas
emulsionadas incorporando-se óleo de pequi, avaliar a estabilidade das formulações e
verificar a potencial atividade antioxidante.
10
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Aspectos gerais: Caryocar brasiliense Camb.
O pequizeiro (Caryocar brasiliense Camb.) é uma árvore frondosa pertencente a
família Caryocaraceae, conforme a Figura I. Trata-se de uma planta típica do cerrado
brasileiro, além de poder ser encontrada em zonas de transição deste bioma com a mata
atlântica e caatinga. Assim, engloba diversos estados como Ceará, Goiás, Maranhão, Mato
Grosso, Pará, Piauí, Rio de Janeiro, São Paulo, Tocantins, entre outros (LORENZI, 2002;
LIMA et al., 2007; CORREA et al., 2008; SANTOS et al., 2013; CAMARGO et al., 2014).
Trata-se de uma planta semidecídua, heliófita e perene, sendo classificada como
oleaginosa ou frutífera, podendo atingir até 12 metros de altura e seu tronco tem em média 2,5
metros de circunferência (OLIVEIRA et.al., 2008; SANTOS et al., 2013; CAMARGO et al.,
2014).
A casca do pequizeiro é espessa, com rachaduras de cor escura e a madeira de
coloração amarelada, pesada e resistente a agentes de deterioração. O fruto trata-se de uma
drupa que apresenta pericarpo de coloração marrom-esverdeada ou esverdeada, o mesocarpo é
pouco fibroso e rico em taninos, sendo o mesocarpo externo de cor parda acizentada e o
interno de cor amarelada e o endocarpo apresenta espinhos e filamentos alojando uma
semente oleaginosa de cor branca, conforme Figura II (LIMA et al., 2007; CORREA et al.,
2008). Os frutos do pequizeiro são ricos em óleo, proteínas e carotenoides, sendo compostos
químicos que oferecem propriedades importantes contra doenças degenerativas,
cardiovasculares e propriedades antioxidantes (OLIVEIRA et al., 2006; LIMA et al., 2007;
AQUINO et al., 2009). A poupa do pequi é uma grande fonte nutritiva que apresenta alto
valor calórico e alto teor de vitaminas (SANTOS et al., 2013). É utilizada na culinária, para
produção de sorvetes, lícores e sucos. Ainda, na indústria cosmética, extração do óleo do
pequi permite fabricar cremes e sabonetes (PAULA-JÚNIOR et al., 2006; CORREA et al.,
2008; ROESLER et al., 2008; BATISTA et al, 2010; SIQUEIRA et al., 2012; GEÖCZE et al.,
2013; MACHADO et al., 2013; PESSOA et al., 2015; ESCOBAR et al., 2016).
O óleo extraído do pequi apresenta em sua constituição a vitamina A, carotenóides e
ácidos graxos como o palmítico, mirístico, oléico, palmitoléico, esteárico, linoléico e
linolênico (CRODA DO BRASIL, 2002; AZEVEDO-MELEIRO, 2004; PIANOVSKI et al.,
2008; AQUINO et al., 2011; CAMARGO, et al., 2014; MONTEIRO et al., 2015). A presença
destes constituintes no óleo faz com que ele possua propriedades emolientes, hidratantes e
11
nutritivas sobre a pele, impedindo a lipoperoxidação e evitando desta forma a formação de
radicais livres e consequentemente retardando o envelhecimento cutâneo (PIANOVSKI et al.,
2008; AGUILAR, 2010).
Figura I: Pequizeiro
Fonte: https://jeffcelophane.wordpress.com/2012/02/16/pequi/
Figura II: Pequi
Fonte: http://www.curtamais.com.br/goiania/11-frutas-do-cerrado-que-todo-mundo-deveria-
conhecer
12
2.2. Extração
Os óleos podem ser obtidos através de diversos métodos extrativos utilizando-se
solventes diferentes como, por exemplo, água, metanol, etanol, tetrahidrofurano (THF),
hexano e éter, onde cada um têm suas peculiaridades (CARDOSO et al., 2014).
Para extração de óleos, os métodos tradicionais envolvem a prensagem e a extração
com solvente ou a combinação de ambos (ROBBERRS et al., 1997; MORETTO et al.,1998;
PIGHINELLI et al., 2008; SARTORI et al., 2009).
O método de extração por prensagem mecânica é um dos processos mais antigos de
extração de óleos e gorduras. Com o avanço tecnológico, os processos industriais para
extração de óleos de sementes e frutas ocorrem por prensas contínuas ou, também,
denominado expeller (RAMALHO, SUAREZ, 2013). A prensa mecânica contínua é um
método simples, de baixo custo, que permite adaptação a diversos tipos de oleaginosas e o uso
de subprodutos (PIGHINELLI et al., 2008; PIGHINELLI et al., 2009; RUTZ et al., 2011).
Dos métodos que utilizam solventes orgânicos o mais utilizado é a extração por
Soxhlet, que determina as substâncias extraídas com hexano a 90°C por 6-8 horas de
aquecimento, seguido posteriormente de destilação do solvente (A.O.A.C., 1995). Ainda,
estudos associam a prensa mecânica com a extração por Soxhlet, utilizando mais de um
solvente (CASTANHEIRAS, 2005).
A extração com ultrassom não é comumente usada para extração de óleos vegetais,
entretanto já existem relatos na literatura de seu uso (THOE et al.,1998). As vantagens do
ultrassom estão na simplicidade do equipamento, na economia do custo inicial, na
possibilidade de usar diferentes solventes e reduzir seus volumes para a extração tornando
menores os possíveis danos ao meio-ambiente, bem como diminuir o tempo necessário para
realizá-las, além de apresentar uma boa reprodutibilidade (THOE et al.,1998; BENEDITO et
al.,2002; CARDOSO, et al., 2014).
2.3. Emulsões e controle de qualidade
As formulações denominadas emulsões são preparações farmacêuticas e cosméticas
originadas pela mistura de duas fases, a aquosa, a oleosa, estabilizadas por um agente
emulsificante (tensoativo). As emulsões podem ser classificadas de acordo com a fase
13
contínua (externa) em óleo em água (O/A) ou água em óleo (A/O) (ZANIN et al., 2001;
AUTON, 2005; LIMA et al., 2008).
As emulsões apresentam grande destaque na indústria cosmética onde são
incorporados componentes que apresentem finalidades específicas, de acordo com os efeitos
que se desejam, os chamados ativos cosméticos (ZANIN et al., 2001; BRASIL, 2004;
AUTON, 2005).
A estabilidade nas emulsões é um parâmetro importante, uma vez que sinais de
instabilidade ocasionados por fatores intrínsecos e extrínsecos como, por exemplo, alteração
nos valores de pH, componentes da formulação, característica do tensoativo utilizado,
viscosidade, volume de fases, velocidade de agitação no preparo, entre outros, podem gerar
cremeação, floculação ou coaslecência do produto (LIMA et al., 2008; PIANOVSKI et al.,
2008).
Para avaliar a estabilidade das formulações são realizados ensaios de estabilidade
preliminar, acelerada, prolongada e de acompanhamento (BRASIL, 2004) o qual envolve
vários parâmetros como pH, densidade, viscosidade, entre outros (BRASIL, 2008). Assim, a
estabilidade refere-se à capacidade do produto em manter, em um determinado espaço de
tempo, as mesmas características de quando foi fabricado (ZANIN et al., 2001; LANGE et al.,
2009; SILVA et al., 2009; GIL, 2010) sendo determinante no estabelecimento do prazo de
validade.
2.4. Atividade antioxidante e DPPH
Os radicais livres são controlados por antioxidantes endógenos (SOUSA et al., 2007),
porém quando há uma desequilíbrio, em que as substâncias antioxidantes endógenas não são
suficientes, ocorrerá um estresse oxidativo (VASCONCELOS et al., 2007; NASCIMENTO et
al., 2011). Assim, as espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio, por exemplo, podem reagir
com lipídios, proteínas e com o DNA (SOUSA et al., 2007) e como consequência desencadear
diversas doenças como cânceres, doenças cardiovasculares e as relacionadas com processo de
envelhecimento (VASCONCELOS et al., 2007; DUZZIONE et al., 2010; NASCIMENTO et
al., 2011).
Os compostos que protegem o organismo de efeitos nocivos ou reações que causem
oxidação excessiva são chamados de antioxidantes (RUFINO et al., 2007), logo, são
14
substâncias que retardam ou inibem a produção de radicais livres (SOUSA et al., 2007;
CANUTO et al., 2010; NASCIMENTO et al., 2011).
Para a determinação da atividade antioxidante, vários métodos são utilizados, entre
eles, sequestro do radical peroxil (Método ORAC), sequestro do peróxido de hidrogênio
(H2O2), sequestro do radical hidroxil, método da co-oxidação do β-caroteno/ácido linoleico,
entre outros (RUFINO et al., 2007; ALVES et al., 2010). O método que é amplamente
utilizado para a determinação da atividade antioxidante é o de captura do radical orgânico 2,2-
difenil-1-picril-hidrazil (DPPH), sendo o mesmo um radical de nitrogênio orgânico, estável de
cor violeta que possui absorção máxima na faixa de 515-520 nm. Na presença de um doador
de hidrogênio, esse radical é reduzido e a intensidade de absorção diminui. Quanto maior a
presença de compostos com o poder de doar esse hidrogênio maior é a perda de coloração,
transformando a solução de coloração violeta a amarela (RUFINO et al., 2007; SOUSA et al.,
2007; BALESTRIN et al., 2008; DUZZIONI et al., 2010; NASCIMENTO et al., 2011).
A atividade antioxidante de sequestro do radical DPPH (2,2-difenil-1- picri-hidrazil)
pode ser expressa de duas formas, utilizando uma curva padrão com o antioxidante sintético
ou através de equações para determinação da atividade antioxidante, porém o princípio da
reação em ambas às análises é o mesmo (BRAND-WILLIAMS et al.,1995).
15
3. ARTIGO
O artigo foi elaborado de acordo com as normas da Revista Interciencia (Anexo A), à
qual foi submetido.
16
Raiser AL, Ludwig L, Marcilio MR, Ribeiro EB, Andrighetti CR, Agostini JS, Valladao
DMS*
Alexia Lorenzi Raiser – Academic of the Federal University of Mato Grosso, Pharmacy
Course. Email: [email protected]
Larissa Ludwig – Academic of the Federal University of Mato Grosso, Pharmacy
Course. Email: [email protected]
Marcia Regina Marcílio – Academic of the Federal University of Mato Grosso,
Pharmacy Course. Email: [email protected]
Elton Brito Ribeiro – Doctor in Nanoscience – Professor of the Federal University of
Mato Grosso. Email: [email protected]
Carla Regina Andrighetti – Doctor in Chemistry – Professor of the Federal University
of Mato Grosso. Email: [email protected]
Juliana da Silva Agostini - Doctor in Agronomy- Professor of the Federal University of
Mato Grosso. Email: [email protected]
*Dênia Mendes de Sousa Valladão – Doctor in Chemistry - Professor of the Federal
University of Mato Grosso, Email: [email protected] *Author to whom
correspondence should be addressed
17
Evaluation of stability and potential antioxidant activity of pequi oil in cosmetic
emulsions (Caryocar brasiliense Camb.)
Abstract
The pequi (Caryocar brasiliense Camb.) is a fruit rich in oil, proteins and carotenoids,
chemical compounds that provide important properties and are also of interest in the
area of cosmetology. The objective was to evaluate the stability and potential
antioxidant activity of emulsion containing pequi oil at different concentrations. The
pequi oil was obtained by extraction using ultrasound and then incorporated in anionic
emulsions on ratios of 5 and 10%. The emulsions were evaluated for preliminary
stability, accelerated stability, rheological characterization and potential antioxidant
activity by DPPH method (1,1-difenil-2-picrilidrazil). Developed emulsions containing
5 and 10% pequi oil presented organoleptic characteristics, pH, density and
spreadability suitable throughout the study period even in extreme temperatures and
showed the Non-Newtonian profile, pseudoplastic and viscoelastic. The results showed
that the emulsions can’t be exposed to light radiation and to high temperatures, as these
conditions lead to occurrence of creaming process. The formulations were able to of
improving the antioxidant efficacy compared to control formulation and to pequi oil
separately. Moreover, the emulsions exhibit behavior and potential antioxidant activity
similar being recommended for future applications cosmetic.
Keywords: emulsion, pequi, Caryocar brasiliense, antioxidant, DPPH.
18
Avaliação da estabilidade e potencial atividade antioxidante de óleo de pequi em
emulsões cosméticas (Caryocar brasiliense Camb.)
Resumo
O pequi (Caryocar brasiliense Camb.) é um fruto rico em óleo, proteínas e
carotenoides, compostos químicos que oferecem propriedades importantes e de interesse
a área de cosmetologia. O objetivo do trabalho foi avaliar a estabilidade e a potencial
atividade antioxidante de emulsão contendo óleo de pequi em diferentes concentrações.
O óleo de pequi foi obtido utilizando-se extração por ultrassom e então incorporado em
emulsão base aniônica na proporção de 5 e 10%. As emulsões preparadas foram
avaliadas com relação à estabilidade preliminar, estabilidade acelerada, caracterização
reológica e potencial atividade antioxidante pelo método do DPPH (1,1-difenil-2-picril-
hidrazila). As emulsões desenvolvidas contendo 5 e 10 % de óleo de pequi apresentaram
características organolépticas, pH, densidade e espalhabilidade adequados durante todo
o período de estudo mesmo em temperaturas extremas e manutenção do perfil Não-
Newtoniano, pseudoplástico e viscoelástico. Os resultados evidenciaram que as
emulsões não podem ser expostas a radiação luminosa e a altas temperaturas, pois essas
condições levam a ocorrência do processo de cremeação. As formulações melhoraram a
eficácia antioxidante frente a formulação controle e o óleo de pequi separadamente.
Ainda, as emulsões apresentaram comportamento e potencial atividade antioxidante
semelhantes sendo indicadas para futuras aplicações cosméticas.
Palavras-chave: emulsão, pequi, Caryocar brasiliense, antioxidante, DPPH.
19
Evaluación de la estabilidad y el potencial actividad antioxidante aceite de pequi
en emulsiones cosméticas (Caryocar brasiliense Camb.)
Resumen
Pequí (Caryocar brasiliense Camb.) es una fruta rica en aceite, proteínas y
carotenoides, compuestos químicos que proporcionan propiedades importantes de
interés en la área de cosmetología. El objetivo fue evaluar la estabilidad y la potencial
actividad antioxidante de la emulsión que contiene aceite de pequi a diferentes
concentraciones. El aceite pequí fue obtiene por extracción usando ultrasonido y luego
incorporado en las emulsiones aniónicas en la proporciones de 5 y 10%. Se evaluaron
las emulsiones para la estabilidad preliminar, estabilidad acelerada, la caracterización
reológica y el potencial de la actividad antioxidante mediante el método de DPPH (1,1-
difenil-2-picril-hidrazilo). Las emulsiones desarrollados que contienen 5 e 10% de
aceite pequí mostraron características organolépticas, pH, densidad y extensibilidad
adecuados durante el periodo de estudio, incluso en temperaturas extremas y mostró el
perfil no newtonianos, pseudoplástico y viscoelástica. Los resultados mostraron que las
emulsiones no pueden ser expuestos a la radiación deluz y a las altas temperaturas, ya
que estas condiciones conducen a la aparición de proceso de formación de crema. Las
formulaciones fueron capaces de mejorar la eficacia antioxidante en comparación con el
control de la formulación y para pequí aceite separado. Además, las emulsiones tienen
una actividad antioxidante similar y se pueden recomendar para aplicaciones
cosméticas.
Palabras clave: emulsiones, pequi, Caryocar brasiliense, antioxidante, DPPH.
20
INTRODUTION
Brazil is country rich in fruit species, particularly fruits with pleasant and even exotic
sensory traits such as color, flavor and aroma (Proença et al., 2000; Canuto et al., 2010;
Silva et al., 2015). The Brazilian cerrado region has a wide variety of fruits, but many
have a regional consumer and their commercial use is minimal or even absent (Finco et
al., 2012).
Among the various species, stands out pequi (Caryocar brasiliense Camb.), that is a
native fruit of the cerrado biome, rich in oil, protein and carotenoids (Lima et al, 2007;
Oliveira et al, 2006; Aquino et al. 2009; Machado et al, 2013; Monteiro et al, 2015).
The fruits are consumed as pulp and are used as raw material in the production of juices,
ice cream, jellies, liqueurs and traditional dishes (Aquino et al, 2009; Roesler et al,
2008).
The presence of oil in the fruit makes it promising to develop products in the cosmetic
and pharmaceutical field as the market trend is sustainable use of natural resources in
cosmetic treatments, in order to promote advantages over traditional formulations
(Quenca-Guillen et al., 2007; Lima et al., 2008; Dallarmi et al., 2012).
Pianovski et al., (2008a; 2008b) prepared and analyzed the stability of cosmetic
emulsions containing 10% pequi oil (Caryocar brasiliense) verifying the applicability
of the oil in cosmetic preparations while Batista et al., (2010) conducted studies that
demonstrated the anti-inflammatory and healing action of a cream containing pequi oil
of the specie Caryocar coriaceum.
The present research involved the development of emulsions containing different pequi
oil concentrations, and verified the stability and potential antioxidant activity.
METODOLOGY
Samples
21
The pequi samples (Caryocar brasiliense Camb.) used in this study were obtained in the
municipality of Sinop, Mato Grosso state, in December 2014. The samples were
washed, pulped manually with a stainless steel knife and then crushed into analytical
mill. The crushed fruit was stored in a freezing chamber at -20°C.
Extraction
The oil was extracted from the crushed fruit using the hexane solvent, in ratio of 1: 5
(w/v) by ultrasound-assisted extraction. The mixture was placed in a flask of 250 mL
and taken to sonicate for 2 hours with frequency of 40 KHz and average temperature of
35°. After this step, the mixture (oil/ solvent) was filtered and then evaporated using a
rotary evaporator at a temperature of 50°C.
Oil Analysis
The following physicochemical properties of oils were determined: humidity, density,
refraction index, saponification value, iodine value, peroxide value, free acid and ash
content, according to Adolfo Lutz methods (2008). All analyses were performed in
triplicate.
The fatty acid composition was obtained in a gas chromatography (GC) using a GC
3900 model, from Varian, equipped with an injector temperature of 250°C, with a
capillary column of fused silica CP-Sil 88 (0,20 mm x 60 m) and film thickness of 0,20
µm. The temperature of the column was held in 90°C for 4 min-1
. Heating rate of
10°Cmin-1
up to 190°C, and maintained in isotherm during 16 min-1
with flow rate of
hydrogen of 30 mL min-1
. The injection volume was 1,0 µL and split injection ration
was 1:30.
Emulsions
Material
22
Emulsions were formulated using Lanette Wax anionic (Sintética®) 5%, Decyl oleate
(Sintética®) 3%, cetostearyl alcohol ethoxylated (Henrifarma
®) 1%,
Butylhydroxytoluene (BHT) (Sintética®) 0,05%, disodium EDTA (Sintética
®), 0,1%,
Sorbitol (Sintética®) 7%, Cyclomethicone (Sintética
®) 2%, Fenonip (mixture of
antimicrobial agents) (Sintética®) 0,5% and oil pequi 5 and 10%.
Methods
The emulsions were prepared by the addition of the aqueous phase (heated at 75 ± 1°C)
to the oily phase (heated at 70 ± 1°C with continuous agitation. Oil pequi was
incorporated in concentrations of 5 and 10% to the preparations. Agitation was
continued until cooling to room temperature of 25°C. Control emulsion was also
prepared by the same above method but without pequi oil serving as control.
Quality Control
Some physical parameters and physicochemical to verify the suitability of the emulsions
as well as stability and characterization of which were tested. These quality parameters
were performed after 24 hours of preparation, and the end of the study cycles, in
triplicate. The parameters evaluated were:
Organoleptic Characteristics
The emulsions were evaluated for its organoleptic properties like visual appearance,
color and odor, and were classified as normal, without any change, slightly modified,
changed or modified extensively (Isaac et al., 2008).
pH Determination
The pH of aqueous dispersion of 10% (w / w) of the emulsions prepared freshly and
kept under different storage conditions was measured by a digital pHmeter (Del Lab®).
The pH measurements were also taken for the emulsions at 24h (preliminary study) on
days 45 and 90 (accelerated study).
23
Centrifugation
The emulsions were centrifuged at 25°C with a centrifuge machine (Quimis®) at 3000
rpm (rotations per minute) for 30 minutes. The tests were performed for each sample at
different time intervals (1, 45 and 90 days) and in the different storage conditions
(25°C, 5°C, 50°C, + 75% RH).
Density
The density of the emulsions was conducted in order to determine and standardize the
density of the tested emulsions and for this it used to a pycnometer coupled with
thermometer.
SPREADABILITY
The spreadability of the emulsions was determined from the reading of the diameter
reached by the sample in a system formed by a circular die plate glass, with a central
orifice on a positioned glass support plate on a millimeter scale (Borghetti and Knorst,
2006; Lange et al., 2009, Matangi et al., 2014). About 0.2 g of sample was introduced
into the plate hole and on the predetermined sample weights glass plates were placed.
The spreadability at 25°C was determined using the equation: S = d2. p/ 4, where: S=
spreadability of the sample versus weight (mm2), d= average diameter (mm) (Zanin et
al., 2001; Lange et al., 2009).
Rheological Characterization
Rheological parameters were measured using a Modular Compact Rheometer – MCR
102 (Anton Paar®) according to (Ribeiro et al., 2014). In all of the experiments, 600 µL
emulsion was added to the surface of the reading plate, and the excess of sample was
removed. Readings were taken with continuous control of the gap measurement with the
supported TruGap™ in 0.099 mm. The measuring cell was a Toolmaster™ CP 50, and
precise temperature control was achieved with T-Ready™. The data were compiled
24
using Rheoplus V3.61 Software. Graphics were also obtained using Rheoplus Software.
The flow and viscosity curves were based on the established parameters for the control
of shear stress (τ) to 0 – 5 Pa for the upsweep and 5 – 0 Pa for the curve downward.
These tests were conducted under isothermal conditions at 25°C, and 75 readings were
taken for analysis.
Exposure to light radiation
The emulsions were placed in glass vials and subjected to direct light effect, for
detecting signs of instability for a period of 90 days.
Stability studies
Emulsions were divided into two groups according to temperature: those that were
refrigerated at 5 ± 1°C and those that were heated to 50 ± 1°C. These emulsions were
preliminarily subjected to alternating cycles of 5 ± 1°C and 45 ± 1°C for 24 hours each,
with the cycles completed on the 14th
day. After the cycle, it was possible to identify the
preliminary stability the formulations. After, the emulsions were subjected to extreme
conditions to determine their accelerated stability. The systems were divided into three
groups according to temperature: 5 ± 1°C, 25 ± 1°C, and 50 ± 1°C. The groups were
assessed in triplicate for a period of 90 days. Every 45 days, the emulsions were
maintained at room temperature for 24 hours to determine the physicochemical
properties.
Antioxidant Activity
The potential antioxidant activity determination was measured by the DPPH radical
capture method, diluting the oil pequi, emulsion control and emulsions containing 5 and
10% of pequi oil in methanol, following a standardized protocol Lange et al., (2009). To
the aliquots of the samples (0,5 mL), were added 1.5 mL of the DPPH solution (0.15
mM in methanol). The mixture was shaken vigorously and left to stand for 30 min and
25
the absorbance was measured at 517 nm against a reagent blank. The inhibition
percentage for scavenging DPPH radical was calculated according to the equation: %
inhibition of DPPH = [(A0 - A1) / A0 × 100], where A0 = control absorbance and A1 =
sample absorbance.
Statistical Analysis
The statistical analysis was performed using BioEstat 5.0. To evaluate the flow curves
and viscosity was used unpaired t-test and for potential antioxidant activity was used
analysis of variance (ANOVA) followed by multiple comparisons by Tukey test. The
statistics were considered significant when p values were less than 0.05.
RESULTS AND DISCUSSION
The oil content in the pequi seed was around 59,3%, with orange color. This results,
were similar to the values found by others authors (Vera et al.,2005; Aquino et al.,
2011; Ribeiro, 2012,) and the variation in oil performance can be related to climatic
factors and the different regions where the fruits are found.
The physicochemical parameters of the pequi oil extracted by ultrasound were
determined (Table I) and the values obtained were consistent with the values found in
the literature (Vera et al., 2005; Barbosa et al., 2009; Deus, 2008; Aquino et al., 2011;
Santos et al., 2013).
Table I
The Table II presents the results of the fatty acid composition of pequi oil obtained by
CG analysis. The oleic and palmitic acids are predominant and the calculated values
were in agreement with the literature data (Barra and Oliveira, 2013; Garcia et al., 2007;
Oliveira et al., 2013; Ferreira et al., 2011; Pessoa et al., 2015).
26
Table II
The control emulsion prepared was white while the emulsions content pequi oil (5 and
10%) were pale yellow in color and showed elastic consistence. The centrifugation,
freeze/defrost cycles and stress thermal were used to investigate the preliminary
stability for 14 days and all emulsions maintained their appearance, homogeneity and
color. The values of pH in the samples was in the range of 6,4 and density of 0,926
g.mL-1
. Then, after these studies, the emulsions were submitted to accelerated studies.
The results of accelerated stability studies are in Table III. There was no change
occurred in color, aspect, and density in emulsions stored during period of 3 months at
25 and 5°C demonstrating that the physical stability of the emulsions. The emulsions
stored at 50°C showed signal of separation of phases, but maintained their color and
odor. This is likely due to oxidation reactions between the pequi oil and components of
formulation, because in the emulsion control, was not observed. All the emulsion
content pequi oil (5 and 10%) showed phase separation when were light radiation
exposure, that indicated that package is very important for guarantee the stability of
theses emulsions.
The evaluation of the density of emulsions containing 5% and 10% pequi oil showed
that they remained stable throughout the study with values of 0.984 to 0.943 gml-1
.
Table III
The monitoring of pH is an important parameter for the effectiveness of topical
emulsions because changes in these values may indicate the presence of impurities,
hydrolysis, decomposition, storage time and / or inadequate storage conditions
(Czepula, 2006). In this study, the emulsions had a pH of 5.5 to 6.5 (Figure 1), which is
within the pH range of the skin, which according Leonardi (2002), may vary from
reaching 4.5 to 7.2, depending on the area.
27
Furthermore, it was found that emulsions at 25°C showed no differences in pH between
them (p=0,608), but significant changes were noticed in emulsions in different storage
conditions, with the passage of time (p <0,01). The same behavior occurred emulsions -
5 and 50°C.The reduction in pH of the emulsion might be due to the oxidation of pequi
oil.
Figure 1
The flow characteristics of an emulsion are clearly among some of its more important
physical features in either technical or aesthetic terms. Hence the ability to measure,
adjust and, if possible, forecast such characteristics is very important (Khan et al.,
2013).
The shear stress causes strain in solids and liquids, the solid deforms and the liquid
flow. The flow and viscosity curves of the emulsions containing 5 or 10% Pequi oil are
shown in Figures 2 and 3. The flow curve for both formulations began at the origin,
ascended, and was nonlinear (Figure 2). This implies that the viscosity was affected by
change in shear rate (Figure 3). Systems that exhibit this type of behaviour are called
non-Newtonian liquids.
The profile of the curves presented in Figures 2 and 3 show that only above a
certain level of shear is possible to overcome the limits flow of the formulations. This
type of profile describes pseudoplastic fluid with yield stress, called viscoplastic, can be
classified either as liquids or as solids.
The maintenance of the rheological characteristics of the formulations during the
accelerated stability study was also evaluated.
Pequi oil emulsions 5 and 10% remained nonlinear ascending and descending curve,
with yield values and without significant variation (p = 0.2887 and p = 0.2633,
respectively) of the profile non-Newtonian throughout the study period (Figure 2a and
28
b). Formulations show substantially similar viscosity profile over the 90th day study in
extreme conditions (p = 0.4811 and p = 0.4435, respectively), indicating its dynamic
stability (Figure 3a and b).
Figure 2
Figure 3
The spreadability of emulsions at 250C (Figure 4) did not show difference between the
control emulsion and emulsions containing pequi oil (5 and 10%), p=0,706. The same
behavior occurred emulsions 5°C and 50°C.
Figure 4
The potential antioxidant activity by DPPH method of pequi oil showed approximately
17.01% of the ability to scavenge free radicals, while the control emulsion which has
BHT at a concentration of 0.05%, a capacity of 51.5%. Emulsions containing pequi oil
concentrations of 5% and 10% showed about 73% of the capacity of scavenging free
radicals (Figure 5) (p <0.001). This probably happened due to a synergism in the
potential antioxidant activity occurred between the BHT and oil pequi.
Comparing the emulsions containing oil pequi 5 and 10% concentrations of antioxidant
capacity showed similar (Teste t: p = 3,18), suggesting that even with a higher
concentration of oil, the antioxidant activity is not changed. The results showed the
same capacity antioxidant after 90 days.
The synergism occurred between the BHT and pequi oil may aid in maintaining the
antioxidant effect in order to decrease the amount of BHT in the formulation, replacing
it with a natural antioxidant.
According to some authors (Rockenbach et al., 2008; Brand-Williams et al., 1995;
Rezende, 2010; Amorin et al, 2015), the type of solvent used in the oil extraction, and
the reaction kinetics may influence the antioxidant activity. Thus, it is interesting to test
29
other solvents to extract the oil as well as other methods of determining the antioxidant
activity.
Figure 5
CONCLUSION
The formulations containing 5 and 10% pequi oil showed potential antioxidant activity
and remained stable for the evaluated parameters. The temperature rise as well as the
light radiation directly influences the physical stability of all formulations prepared,
resulting in phase separation. Then, the choice of packaging containers and the storage
sites are important parameters to ensuring the quality, safety and efficacy of the product.
The incorporation of pequi oil in emulsions is an option for the antioxidant activity
particularly when associated with BHT, allowing the reduction of the synthetic
antioxidant. Although it is suggested that new research be carried out using other
solvents for oil extraction, as well as using other methods of analysis of antioxidant
activity, because due to the complexity of the processes of oxidation and antioxidant
systems, it is clear that there is no single method of analysis that fully reflects the
antioxidant profile of a sample.
ACKNOWLEDGEMENTS
Our thanks the financial support to the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
Mato Grosso (FAPEMAT).
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Table I.
PHYSICOCHEMICAL
PARAMETERS
VALUE
Humidity (%) 0,0601%
Free acid 1,09 mgKOH/g (0,549% in oleic acid)
Peroxide value 6,07 ± 0,133 meq/Kg
Iodine value 35,25 ± 5,22 g I2/100g
Saponification value 190,6 mgKOH/g óleo
Density 0,908 gcm-3
Refraction index 1,43
Table II.
FATTY ACID PERCENTAGE BY WEIGHT*
Oleic C18:1 55,7 ± 0,11
Palmitic C16:0 40,8 ± 0,08
Palmitoleic C16:1 0,2 ± 0,12
Stearic C18:0 1,9 ± 0,07
Linoleic C18:2 0,9 ± 0,06
Linolenic C 18:3 0,2 ± 0,11
Arachidic C 20:0 0,2 ± 0,11 *The value in the table represents the mean
Table III
Samples Time
(days)
Room
Temperatur
e (0C)
Aspect,
Color
and
Odor
pH
(value)
Density Light
radiation
exposure
Base
emulsion
1 25,0 ± 2,0 N 6,00 ± 0,01 0,932± 0,01 APS
45 25,0 ± 2,0
5,0 ± 2,0
50,0 ± 2,0
N
N
N
5,80 ± 0,01
5,57 ± 0,13
5,67 ± 0,12
0,930± 0,01 APS
90 25,0 ± 2,0
5,0 ± 2,0
50,0 ± 2,0
N
N
N
5,99 ± 0,10
6,00 ± 0,06
6,62 ± 0,03
0,937 ±0,01 APS
Emulsion
with 5%
oil pequi
1 25,0 ± 2,0 N 6,39 ± 0,07 0,955±0,05 APS
45 25,0 ± 2,0
5,0 ± 2,0
50,0 ± 2,0
N
N
N
6,09 ± 0,11
5,76 ± 0,06
5,94 ± 0,08
0,951 ±0,03 PS
90 25,0 ± 2,0
5,0 ± 2,0
50,0 ± 2,0
N
N
M
6,15 ± 0,13
6,35 ± 0,37
5,99 ± 0,14
0,984 ±0,05 PS
36
Emulsion
with 10%
oil pequi
1 25,0 ± 2,0 N 6,42 ± 0,01 0,953±0,03 APS
45 25,0 ± 2,0
5,0 ± 2,0
50,0 ± 2,0
N
N
N
5,53 ± 0,05
5,51 ± 0,11
5,53 ± 0,11
0,951 ±0,04 PS
90 25,0 ± 2,0
5,0 ± 2,0
50,0 ± 2,0
N
N
M
6,10 ± 0,13
6,13 ± 0,08
5,72 ± 0,07
0,944 ±0,01 PS
Legend: Aspect: N - Normal; M – Modified; Color: N - Normal; M – Modified; Odor: N - Normal; M –
Modified; pH – pH value; Light radiation exposure: PS- phase separation; APS- absence phase separation
Time (days)
0,0 15,0 45,0 90,0
pH
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0Emulsion Base
Emulsion Pequi oil (5 %)
Emulsion Pequi oil (10 %)
Figure 1
37
a)
b)
Figure 2
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
5
Pa
Shear Stress
0 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 0.140 0.160 0.2001/s
Shear Rate .
Emulsion Pequi Oil (5 % - Zero time) Emulsion Pequi Oil (5 % - 90 days)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
5
Pa
Shear Stress
0 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070 0.080 0.1001/s
Shear Rate .
Emulsion Pequi Oil (10 % - Zero time) Emulsion Pequi Oil (10 % - 90 days)
38
a)
b)
Figure 3
101
102
103
104
105
106
Pa·s
Viscosity
0 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 0.140 0.160 0.2001/s
Shear Rate .
Emulsion Pequi Oil (5 % - Zero time) Emulsion Pequi Oil (5 % - 90 days)
101
102
103
104
105
106
Pa·s
Viscosity
0 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070 0.080 0.1001/s
Shear Rate .
Emulsion Pequi Oil (10 % - Zero time) Emulsion Pequi Oil (10 % - 90 days)
39
Figure 4
Legend: - Standard Deviation (Mean ± SD); * (ANOVA), F = 46975; p <0.0001.
Figure 5
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
380 758 1136
Sp
read
abil
ity (
mm
2)
Weight (g) emulsion containing 5% pequi oil emulsion containing 10% pequi oil control emulsion
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
% In
hib
itio
n (
DP
PH
)
Samples
oil control emulsion emulsion containing 5% pequi oil emulsion containing 10% pequi oil
** **
*
40
Table I. Physicochemical parameters of the pequi oil
Table II. Fatty acid composition of pequi oil - CG
Table III. Evaluation of the organoleptic characteristics, pH, density and light radiation
exposure of emulsions in the accelerated stability study
Figure 1. Effect of pH of the formulations during stability study at 250C.
Figure 2. Flow curves (a) Emulsion with Pequi Oil (5 %) and (b) Emulsion with Pequi
Oil (10 %) during the period of accelerated stability (25°C). Teste t: (a) p = 0.2887 and
(b) p = 0.2633.
Figure 3. Viscosity curves (a) formulation with Pequi Oil (5 %) and (b) formulation
with Pequi Oil (10 %) during the period of accelerated stability (25°C). Teste t: (a) p =
0.4811 and (b) p = 0.4435.
Figure 4. Spreadability of the formulations during stability study at 250C.
Figure 5. Potential antioxidant activity of emulsions containing 5 and 10% of pequi oil,
compared the control emulsion and oil pequi, expressed as % of inhibition. Values were
expressed as the mean ± SD of triplicate.
41
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47
ANEXO A - NORMAS DA REVISTA INTERCIENCIA
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características similares a los de los artículos.
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básicas o aplicadas, dirigidas a una audiencia especializada. Podrán ser de hasta 15 cuartillas
y escritas en idioma inglés, español o portugués, aunque se recomienda el uso del primero
para facilitar la difusión de los resultados. Deberá incluirse un resumen de aproximadamente
media cuartilla (125 palabras).
En todos los casos, tanto el título del trabajo como el resumen deberá ser enviado en los tres
idiomas de la revista, de ser posible, y se incluirán hasta cinco palabras clave. Todas las
páginas, tamaño carta, deberán estar escritas a doble espacio, con fuente 12, y numeradas
consecutivamente.
Tablas y figuras: Deberán ser numeradas en romanos y arábigos, respectivamente, ser
legibles, concisas y claras, y enviadas en hojas separadas. Los textos correspondientes se
incluirán al final del trabajo.
Citas bibliográficas: Las citas deberán hacerse señalando en el texto el apellido del primer
autor seguido por el del segundo autor o por et al. si fueran más de dos autores, y el año de
48
publicación. Por ejemplo: (Pérez, 1992), (Da Silva y González, 1993), (Smith et al., 1994).
Las referencias serán listadas al final del artículo en orden alfabético, e incluirán autores (así:
Rojas ER, Davis B, Gómez JC), año de publicación en paréntesis, título de la obra o trabajo
citado, en itálicas el nombre y volumen de la publicación, y páginas. Las comunicaciones
personales irán sólo en el texto, sin otra indicación que el nombre completo del comunicador.
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mismo. En los casos de textos con extensión excesiva, figuras o tablas de tamaño excepcional,
o reproducciones a color, se establecerá un monto a pagar.
Todos los artículos y comunicaciones serán enviados a árbitros externos para ser evaluados.
Para facilitar el arbitraje, los autores deberán enviar una lista de seis posibles árbitros con sus
respectivas direcciones y, de ser posible, dirección de correo electrónico.
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49