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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DIANA QUITÉRIA CABRAL FERREIRA
AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL RELATIVO AO SELÊNIO E
DA EXPRESSÃO GÊNICA DE SELENOPROTEÍNAS EM PACIENTES
COM ATEROSCLEROSE TRATADOS COM ESTATINAS
Orientadora: Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild
Co-Orientadora: Profª. Drª. Adriana Augusto de Rezende
NATAL-RN
2010
ii
DIANA QUITÉRIA CABRAL FERREIRA
AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL RELATIVO AO SELÊNIO E
DA EXPRESSÃO GÊNICA DE SELENOPROTEÍNAS EM PACIENTES
COM ATEROSCLEROSE TRATADOS COM ESTATINAS
NATAL-RN
2010
Dissertação de mestrado
apresentada ao curso de Pós-
graduação como pré-requisito
para obtenção do título de mestre
em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal do Rio
Grande do Norte.
iii
CATALOGAÇÃO NA FONTE
F383a
Ferreira, Diana Quitéria Cabral.
Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da
expressão gênica de selenoproteínas em pacientes com
aterosclerose tratados com estatinas / Diana Quitéria Cabral
Ferreira. – Natal, 2010.
67f.
Orientadora: Profª Drª Lucia de Fátima Campos Pedrosa
Schwarzschild.
Co-orientadora: Profª Drª Adriana Augusto de Rezende.
Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas. Centro de Ciências da Saúde.
Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
1. Aterosclerose – Dissertação. 2. Selênio – Dissertação.
3. Rosuvastatina – Dissertação. I. Schwarzschild, Lucia de Fátima
Campos Pedrosa. II. Título.
RN-UF/BS-CCS CDU: 616.13-004.6(043.3)
iv
COLABORADORES
Profª. Drª. Silvia Maria Franciscato Cozzolino
Universidade de São Paulo (USP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF),
Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental.
Profa. Drª. Dulcinéia Saes Parras Abdalla
Universidade de São Paulo (USP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF),
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas
Profa. Ms. Karine Cavalcanti Maurício de Sena
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Centro de Ciências da Saúde
(CCS), Departamento de Nutrição.
Drª. Maria Sanali Moura de Oliveira Paiva
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Hospital Universitário Onofre
Lopes (HUOL), Departamento de Medicina Clínica.
Paula Cristina Silveira Dias
Nutricionista, Mestranda do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas,
Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
v
FINANCIAMENTOS E BOLSAS CONCEDIDAS
- Edital Universal CNPq: N° do processo – 475781/2008-0
- Edital MCT/CNPq, N° 27/2007: N° do processo - 136201/2008-3
Bolsa de Mestrado (Duração: agosto 2008 a fevereiro 2010).
vi
Diana Quitéria Cabral Ferreira
Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão gênica de selenoproteínas
em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas
Dissertação apresentada para obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas
Banca Examinadora
Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild
Orientadora/Presidente
Profª. Drª. Silvia Maria Franciscato Cozzolino
Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental. Faculdade de Ciências Farmacêuticas
(FCF). Universidade de São Paulo (USP).
Profª. Drª. Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. Centro de Ciências da Saúde (CCS).
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
Natal, 24 de maio de 2010.
vii
Aos meus queridos pais, Ezilda Barros e João Ferreira,
que são para mim um exemplo de amor, dedicação, respeito e companheirismo.
A minha irmã, Daiane Ferreira, pelo apoio incondicional.
Ao meu grande amor, Felipe,
pelas palavras de força nas horas que mais precisava,
me incentivando e sempre estando ao meu lado.
viii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pela bênção que ele me concede a cada dia, pela minha
família e por ter ao meu lado pessoas maravilhosas.
A meus pais, João e Ezilda, por sempre me apoiarem nessa longa, árdua e prazerosa
caminhada que é a pós-graduação.
A minha irmã, Daiane, e meu cunhado Daniel, por representarem pra mim mais que pessoas
queridas, são exemplos de superação e dedicação.
Ao meu noivo, Felipe, por estar ao meu lado em todo momento, pelas palavras de ânimo nos
momentos que mais precisei.
A professora Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild pelo exemplo profissional
que representa em minha vida, pelas oportunidades concedidas desde a graduação, como
aluna de iniciação científica até hoje com o mestrado.
A professora Adriana Augusto de Rezende, pelo apoio, principalmente pela abertura do
Laboratório de Biologia Molecular (LABIOMOL), confiando e acreditando no trabalho.
A professora Karine Cavalcanti Maurício de Sena, pela confiança e por ser para mim um
exemplo de dedicação e amor à profissão.
A mestranda Paula C. S. Dias, pelo apoio nos momentos mais difíceis dessa trajetória.
A professora Silvia Maria Franciscato Cozzolino pela abertura concedida em seu
laboratório, pelo total apoio à nossa pesquisa e por ter aceitado colaborar e enriquecer
nosso trabalho.
A professora Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas pela colaboração, desde o
momento da qualificação, até a disponibilidade de estar na minha banca de apresentação do
mestrado.
ix
As alunas bolsistas, Heliane, Renata, Carol e Patricia, pela dedicação e empenho a cada dia
de coleta e análise dos dados.
Aos amigos do Laboratório Multidisciplinar (LABMULT), principalmente nas pessoas de
Marcela, Freie, Felipe, Gustavo, Clélio, pela ajuda inestimável para desenvolvimento desse
trabalho, bem como pelos momentos de descontração fora do laboratório.
Aos amigos do Laboratório de Nutrição Experimental da FCF-USP, nas pessoas de
Alexandre, Kaluce, Graziela, Suzana e Janaína, pela ajuda nas análises e também na estadia
em São Paulo, terra até então desconhecida para mim, mas que me encanto e onde pude fazer
verdadeiros amigos.
Aos pacientes, pela imensurável contribuição.
x
RESUMO
FERREIRA, D. Q. C. Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão
gênica de selenoproteínas em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas. 2010.
67f. [Dissertação] Natal (RN): Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande
do Norte, Natal – RN, 2010.
Este trabalho tem como objetivo verificar os efeitos do uso da rosuvastatina em pacientes com
aterosclerose, em relação aos parâmetros sanguíneos de selênio e selenoproteínas, bem como
observar possíveis alterações na expressão gênica de selenoproteínas nesses pacientes. A
amostra foi constituída de 27 pacientes adultos e idosos com o diagnóstico clínico de doença
arterial coronariana submetidos à angioplastia, atendidos no Natal Hospital Center, Natal, RN.
Os pacientes foram tratados com 10mg/dia de rosuvastatina durante 4 meses. Variáveis
antropométricas, como Índice de Massa Corporal (IMC) e Circunferência Abdominal (CA),
foram medidas antes e após o tratamento, bem como o perfil lipídico, glicemia e enzimas
hepáticas (AST e ALT). A dieta dos pacientes também foi analisada utilizando o Recordatório
alimentar de 24 horas. Foram analisadas as concentrações do selênio no plasma e nos
eritrócitos, e também a atividade da enzima Glutationa Peroxidase e a expressão gênica por
PCR em Tempo Real das selenoproteínas GPx1, SelP1 e SelN1. Os pacientes apresentaram
idade média de 61,0±9,4 anos, sendo 59,3% homens e 40,7% mulheres. Após os quatro meses
de tratamento observou-se redução significativa da CA e, de acordo com o IMC, a maior parte
estava com sobrepeso. A ingestão dos macronutrientes, colesterol, ácidos graxos
polinsaturados, monoinsaturados e saturados foi adequada, porém a de energia e fibras estava
abaixo das recomendações. Com relação a ingestão de selênio foi observada uma alta
prevalência de inadequação. Como esperado, após o tratamento com a rosuvastatina, houve
redução significativa do colesterol total e LDL, bem como da glicemia, o que não foi
observado para o HDL. As concentrações de selênio no plasma e eritrócitos não apresentaram
alterações, se mantendo dentro dos pontos de corte estabelecidos. Foi observado um aumento
significante na atividade enzimática da GPx e na expressão de mRNA do GPX1 e SEPN1,
mas não para o gene SEPP1. Dessa forma, foi verificado que o tratamento com a
rosuvastatina não diminuiu a expressão das selenoproteínas. Mais estudos são necessários
para esclarecer os efeitos da rosuvastatina sobre a expressão gênica de selenoproteínas em
pacientes com aterosclerose.
Palavras-chave: Aterosclerose; Rosuvastatina; Selênio; Selenoproteínas; Expressão gênica.
xi
ABSTRACT
FERREIRA, D. Q. C. Assessment of nutritional status of selenium and gene expression of
selenoproteins in patients with atherosclerosis treated with statins. 2010. 67f.
[Dissertation] Faculty of Pharmaceutical, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal –
RN, 2010.
The aim of this study was to determine the effects of the use of rosuvastatin in patients with
atherosclerosis, in relation to blood parameters of selenium and selenoproteins, and also
observe possible changes in gene expression of selenoproteins in these patients. The sample
consisted of 27 adult and elderly patients with a clinical diagnosis of coronary artery disease
undergoing angioplasty, treated at Natal Hospital Center hospital, Natal, RN. Patients were
treated with rosuvastatin 10 mg/day during four months. Anthropometric variables such as
body mass index (BMI) and Waist circumference (WC) were measured before and after
treatment, as well as lipid profile, blood glucose and liver enzymes (AST and ALT). The diet
of the patients was also analyzed using 24-hour diet recall. We analyzed the concentrations of
selenium in plasma and erythrocytes, and also the activity of Glutathione Peroxidase and gene
expression by Real Time PCR of selenoproteins GPx1, SelP1 and SelN1. Patients had mean
age of 61.0 ± 9.4 years, 59.3% were men and 40.7% were women. After four months of
treatment there was significant reduction of CA and, according to BMI, most were
overweight. The intake of macronutrients, cholesterol, polyunsaturated fatty acids,
monounsaturated and saturated was adequate, but the energy and fiber intake was below
the recommendations. Regarding the selenium intake was observed a high prevalence of
inadequacy. As expected, after treatment with rosuvastatin, a significant reduction in total
cholesterol, LDL and glucose, which was not observed for HDL. Selenium concentrations
in plasma and erythrocytes showed no changes, keeping within the established cutoffs. We
observed a significant increase in GPx enzyme activity and mRNA expression of GPX1 and
SEPN1, but not for gene SEPP1. Thus, it was found that treatment with rosuvastatin did not
reduce the expression of selenoproteins. More studies are needed to clarify the effects of
rosuvastatin on gene expression of selenoproteins in patients with atherosclerosis.
Key words: Atherosclerosis; Rosuvastatin; Selenium; Selenoproteins; Gene expression.
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAS Ácido Acetil Salicílico
ALT Alanina Aminotransferase
AST Aspartato Aminotransferase
CA Circunferência Abdominal
CT Colesterol total
cDNA Ácido Desoxirribonucléico complementar
DM Diabetes mellitus
DNA Ácido Desoxirribonucléico (Deoxyribonucleic Acid)
DP Desvio Padrão
DRIs Ingestão Dietética de Referência (Dietary References Intakes)
EAR Necessidade média estimada (Estimated Average Requirements)
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
GAPDH Gliceraldeído trifosfato desidrogenase
GPx Glutationa Peroxidase
GPX1 Gene da Glutationa Peroxidase 1
HDL Lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein)
HMG-CoA redutase 3-hidroxi-3metilglutaril coenzima A redutase
HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes
IMC Índice de Massa Corporal
LDL Lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein)
NHC Natal Hospital Center
PCR Reação de Polimerase em Cadeia
pH Potencial Hidrogeniônico
RDA Ingestão Dietética Recomendada (Recommended Dietary Allowance)
RNA Ácido Ribonucleico (Ribonucleic Acid)
RT-PCR Reação de Polimerase em Cadeia por transcriptase reversa
Se Selênio
SelP Selenoproteína P
SEPP1 Gene da Selenoproteína P 1
SelN Selenoproteína N
SEPN1 Gene da Selenoproteína N 1
xiii
SBC Sociedade Brasileira de Cardiologia
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGO Transaminase Glutâmica Oxalacética
TGP Transaminase Glutâmica Pirúvica
TG Triacilgliceróis
TM Temperatura de Melting
UL Limite Superior Tolerável de Ingestão (Tolerable Upper Intake Levels)
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
USP Universidade de São Paulo
xiv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Via do Mevalonato: biossíntese de Isoprenóides e efeito das
estatinas..............................................................................................................
5
FIGURA 2 – Fluxograma do arrolamento dos pacientes com aterosclerose tratados com
rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.............................................
13
FIGURA 3 - Coleta de sangue, segundo análises bioquímicas, dos pacientes com
aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital
Center...............................................................................................................
15
FIGURA 4 - Fluxograma das atividades do estudo com pacientes com aterosclerose
tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital
Center.................................................................................................................
FIGURA 5 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina,
de acordo com o Índice de Massa Corporal (IMC), atendidos no Natal Hospital
Center...............................................................................................................
FIGURA 6 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina,
de acordo com a Circunferência Abdominal (CA), atendidos no Natal Hospital
Center.................................................................................................................
16
27
27
FIGURA 7 - Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de
acordo com a adequação do consumo de calorias, macronutrientes e colesterol,
atendidos no Natal Hospital Center......................................................................
29
FIGURA 8 - Distribuição da ingestão de Se, bruta (A) e ajustado (B) dos pacientes com
aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center....
30
FIGURA 9 - Percentual de alterações do perfil lipídico dos pacientes com aterosclerose
após o tratamento com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center..........
33
xv
FIGURA 10 - Valores médios e intervalos de confiança (95%) das expressões relativas
de mRNA do GPX1(A), SEPN1 (B) e SEPP1 (C) de pacientes com
aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital
Center. .......................................................................................................
37
xvi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Iniciadores e sondas utilizados nas reações de PCR em tempo real para a
avaliação da expressão dos genes GPX1, SEPP1, SEPN1 e GAPDH.................
23
TABELA 2 - Características de estilo de vida dos pacientes com aterosclerose tratados
com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.....................................
25
TABELA 3 - Dados antropométricas dos pacientes com aterosclerose tratados com
rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center..........................................
26
TABELA 4 – Ingestão de energia, macronutrientes e colesterol de pacientes com
aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital
Center.............................................................................................................
TABELA 5 – Alimentos fonte de selênio presentes nos R24h dos pacientes com
aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital
Center...................................................................................................................
TABELA 6 – Parâmetros bioquímicos dos pacientes com aterosclerose tratados com
rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...................................
28
31
32
TABELA 7 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose em uso de estatina, atendidos
no Natal Hospital Center, conforme a classificação dos valores de
referência para perfil lipídico e glicemia....................................................
34
TABELA 8 – Concentrações de selênio do plasma e dos eritrócitos e atividade
enzimática da Glutationa Peroxidaes dos pacientes com aterosclerose
tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...................
35
TABELA 9 – Variação da expressão de RNAm dos genes GPX1, SEPN1 e SEPP1 dos
pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no
Natal Hospital Center..............................................................................
36
xvii
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 - Classificação do Estado Nutricional Antropométrico de adultos, segundo
o IMC..........................................................................................................
17
QUADRO 2 - Risco de complicações metabólicas relacionadas à obesidade, com base na
Circunferência abdominal.....................................................................................
18
xviii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................ 2
1.1 Aterosclerose e Estatinas.......................................................................................... 2
1.2 Selênio e Selenoproteínas......................................................................................... 6
2 JUSTIFICATIVA............................................................................................................. 10
3 OBJETIVOS..................................................................................................................... 11
3.1 Objetivo Geral........................................................................................................... 11
3.2 Objetivos Específicos................................................................................................ 11
4 CASUÍSTICA E MÉTODOS......................................................................................... 11
4.1 Protocolo Experimental............................................................................................. 11
4.2 Parâmetros Antropométricos..................................................................................... 17
4.3 Análise da Dieta........................................................................................................ 18
4.4 Análises do Perfil Lipídico, Glicemia de jejum e Enzimas hepáticas...................... 19
4.5 Análise de Selênio..................................................................................................... 20
4.6 Determinação da atividade enzimática da Glutationa Peroxidase............................
4.7 Análise da expressão Gênica de Selenoproteínas.....................................................
21
22
4.8 Análise Estatística..................................................................................................... 24
5 RESULTADOS.................................................................................................................
6 DISCUSSÃO....................................................................................................................
25
38
7 CONCLUSÕES............................................................................................................... 43
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................. 44
ANEXOS..............................................................................................................................
58
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DIANA QUITÉRIA CABRAL FERREIRA
AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL RELATIVO AO SELÊNIO E
DA EXPRESSÃO GÊNICA DE SELENOPROTEÍNAS EM PACIENTES
COM ATEROSCLEROSE TRATADOS COM ESTATINAS
Orientadora: Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild
Co-Orientadora: Profª. Drª. Adriana Augusto de Rezende
NATAL-RN
2010
ii
DIANA QUITÉRIA CABRAL FERREIRA
AVALIAÇÃO DO ESTADO NUTRICIONAL RELATIVO AO SELÊNIO E
DA EXPRESSÃO GÊNICA DE SELENOPROTEÍNAS EM PACIENTES
COM ATEROSCLEROSE TRATADOS COM ESTATINAS
NATAL-RN
2010
Dissertação de mestrado
apresentada ao curso de Pós-
graduação como pré-requisito
para obtenção do título de mestre
em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal do Rio
Grande do Norte.
iii
COLABORADORES
Profª. Drª. Silvia Maria Franciscato Cozzolino
Universidade de São Paulo (USP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF),
Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental.
Profa. Drª. Dulcinéia Saes Parras Abdalla
Universidade de São Paulo (USP), Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF),
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas
Profa. Ms. Karine Cavalcanti Maurício de Sena
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Centro de Ciências da Saúde
(CCS), Departamento de Nutrição.
Drª. Maria Sanali Moura de Oliveira Paiva
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Hospital Universitário Onofre
Lopes (HUOL), Departamento de Medicina Clínica.
Paula Cristina Silveira Dias
Nutricionista, Mestranda do Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas,
Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
iv
FINANCIAMENTOS E BOLSAS CONCEDIDAS
- Edital Universal CNPq: N° do processo – 475781/2008-0
- Edital MCT/CNPq, N° 27/2007: N° do processo - 136201/2008-3
Bolsa de Mestrado (Duração: agosto 2008 a fevereiro 2010).
v
Diana Quitéria Cabral Ferreira
Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão gênica de selenoproteínas
em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas
Dissertação apresentada para obtenção do grau de mestre em Ciências Farmacêuticas
Banca Examinadora
Profª. Drª. Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild
Orientadora/Presidente
Profª. Drª. Silvia Maria Franciscato Cozzolino
Departamento de Alimentos e Nutrição Experimental. Faculdade de Ciências Farmacêuticas
(FCF). Universidade de São Paulo (USP).
Profª. Drª. Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. Centro de Ciências da Saúde (CCS).
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
Natal, 24 de maio de 2010.
vi
Aos meus queridos pais, Ezilda Barros e João Ferreira,
que são para mim um exemplo de amor, dedicação, respeito e companheirismo.
A minha irmã, Daiane Ferreira, pelo apoio incondicional.
Ao meu grande amor, Felipe,
pelas palavras de força nas horas que mais precisava,
me incentivando e sempre estando ao meu lado.
vii
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, pela bênção que ele me concede a cada dia, pela minha
família e por ter ao meu lado pessoas maravilhosas.
A meus pais, João e Ezilda, por sempre me apoiarem nessa longa, árdua e prazerosa
caminhada que é a pós-graduação.
A minha irmã, Daiane, e meu cunhado Daniel, por representarem pra mim mais que pessoas
queridas, são exemplos de superação e dedicação.
Ao meu noivo, Felipe, por estar ao meu lado em todo momento, pelas palavras de ânimo nos
momentos que mais precisei.
A professora Lucia de Fátima Campos Pedrosa Schwarzschild pelo exemplo profissional
que representa em minha vida, pelas oportunidades concedidas desde a graduação, como
aluna de iniciação científica até hoje com o mestrado.
A professora Adriana Augusto de Rezende, pelo apoio, principalmente pela abertura do
Laboratório de Biologia Molecular (LABIOMOL), confiando e acreditando no trabalho.
A professora Karine Cavalcanti Maurício de Sena, pela confiança e por ser para mim um
exemplo de dedicação e amor à profissão.
A mestranda Paula C. S. Dias, pelo apoio nos momentos mais difíceis dessa trajetória.
A professora Silvia Maria Franciscato Cozzolino pela abertura concedida em seu
laboratório, pelo total apoio à nossa pesquisa e por ter aceitado colaborar e enriquecer
nosso trabalho.
A professora Janaina Cristiana de Oliveira Crispim Freitas pela colaboração, desde o
momento da qualificação, até a disponibilidade de estar na minha banca de apresentação do
mestrado.
viii
As alunas bolsistas, Heliane, Renata, Carol e Patricia, pela dedicação e empenho a cada dia
de coleta e análise dos dados.
Aos amigos do Laboratório Multidisciplinar (LABMULT), principalmente nas pessoas de
Marcela, Freie, Felipe, Gustavo, Clélio, pela ajuda inestimável para desenvolvimento desse
trabalho, bem como pelos momentos de descontração fora do laboratório.
Aos amigos do Laboratório de Nutrição Experimental da FCF-USP, nas pessoas de
Alexandre, Kaluce, Graziela, Suzana e Janaína, pela ajuda nas análises e também na estadia
em São Paulo, terra até então desconhecida para mim, mas que me encanto e onde pude fazer
verdadeiros amigos.
Aos pacientes, pela imensurável contribuição.
ix
RESUMO
FERREIRA, D. Q. C. Avaliação do estado nutricional relativo ao selênio e da expressão
gênica de selenoproteínas em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas. 2010.
67f. [Dissertação] Natal (RN): Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio Grande
do Norte, Natal – RN, 2010.
Este trabalho tem como objetivo verificar os efeitos do uso da rosuvastatina em pacientes com
aterosclerose, em relação aos parâmetros sanguíneos de selênio e selenoproteínas, bem como
observar possíveis alterações na expressão gênica de selenoproteínas nesses pacientes. A
amostra foi constituída de 27 pacientes adultos e idosos com o diagnóstico clínico de doença
arterial coronariana submetidos à angioplastia, atendidos no Natal Hospital Center, Natal, RN.
Os pacientes foram tratados com 10mg/dia de rosuvastatina durante 4 meses. Variáveis
antropométricas, como Índice de Massa Corporal (IMC) e Circunferência Abdominal (CA),
foram medidas antes e após o tratamento, bem como o perfil lipídico, glicemia e enzimas
hepáticas (AST e ALT). A dieta dos pacientes também foi analisada utilizando o Recordatório
alimentar de 24 horas. Foram analisadas as concentrações do selênio no plasma e nos
eritrócitos, e também a atividade da enzima Glutationa Peroxidase e a expressão gênica por
PCR em Tempo Real das selenoproteínas GPx1, SelP1 e SelN1. Os pacientes apresentaram
idade média de 61,0±9,4 anos, sendo 59,3% homens e 40,7% mulheres. Após os quatro meses
de tratamento observou-se redução significativa da CA e, de acordo com o IMC, a maior parte
estava com sobrepeso. A ingestão dos macronutrientes, colesterol, ácidos graxos
polinsaturados, monoinsaturados e saturados foi adequada, porém a de energia e fibras estava
abaixo das recomendações. Com relação a ingestão de selênio foi observada uma alta
prevalência de inadequação. Como esperado, após o tratamento com a rosuvastatina, houve
redução significativa do colesterol total e LDL, bem como da glicemia, o que não foi
observado para o HDL. As concentrações de selênio no plasma e eritrócitos não apresentaram
alterações, se mantendo dentro dos pontos de corte estabelecidos. Foi observado um aumento
significante na atividade enzimática da GPx e na expressão de mRNA do GPX1 e SEPN1,
mas não para o gene SEPP1. Dessa forma, foi verificado que o tratamento com a
rosuvastatina não diminuiu a expressão das selenoproteínas. Mais estudos são necessários
para esclarecer os efeitos da rosuvastatina sobre a expressão gênica de selenoproteínas em
pacientes com aterosclerose.
Palavras-chave: Aterosclerose; Rosuvastatina; Selênio; Selenoproteínas; Expressão gênica.
x
ABSTRACT
FERREIRA, D. Q. C. Assessment of nutritional status of selenium and gene expression of
selenoproteins in patients with atherosclerosis treated with statins. 2010. 67f.
[Dissertation] Faculty of Pharmaceutical, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal –
RN, 2010.
The aim of this study was to determine the effects of the use of rosuvastatin in patients with
atherosclerosis, in relation to blood parameters of selenium and selenoproteins, and also
observe possible changes in gene expression of selenoproteins in these patients. The sample
consisted of 27 adult and elderly patients with a clinical diagnosis of coronary artery disease
undergoing angioplasty, treated at Natal Hospital Center hospital, Natal, RN. Patients were
treated with rosuvastatin 10 mg/day during four months. Anthropometric variables such as
body mass index (BMI) and Waist circumference (WC) were measured before and after
treatment, as well as lipid profile, blood glucose and liver enzymes (AST and ALT). The diet
of the patients was also analyzed using 24-hour diet recall. We analyzed the concentrations of
selenium in plasma and erythrocytes, and also the activity of Glutathione Peroxidase and gene
expression by Real Time PCR of selenoproteins GPx1, SelP1 and SelN1. Patients had mean
age of 61.0 ± 9.4 years, 59.3% were men and 40.7% were women. After four months of
treatment there was significant reduction of CA and, according to BMI, most were
overweight. The intake of macronutrients, cholesterol, polyunsaturated fatty acids,
monounsaturated and saturated was adequate, but the energy and fiber intake was below
the recommendations. Regarding the selenium intake was observed a high prevalence of
inadequacy. As expected, after treatment with rosuvastatin, a significant reduction in total
cholesterol, LDL and glucose, which was not observed for HDL. Selenium concentrations
in plasma and erythrocytes showed no changes, keeping within the established cutoffs. We
observed a significant increase in GPx enzyme activity and mRNA expression of GPX1 and
SEPN1, but not for gene SEPP1. Thus, it was found that treatment with rosuvastatin did not
reduce the expression of selenoproteins. More studies are needed to clarify the effects of
rosuvastatin on gene expression of selenoproteins in patients with atherosclerosis.
Key words: Atherosclerosis; Rosuvastatin; Selenium; Selenoproteins; Gene expression.
xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AAS Ácido Acetil Salicílico
ALT Alanina Aminotransferase
AST Aspartato Aminotransferase
CA Circunferência Abdominal
CT Colesterol total
cDNA Ácido Desoxirribonucléico complementar
DM Diabetes mellitus
DNA Ácido Desoxirribonucléico (Deoxyribonucleic Acid)
DP Desvio Padrão
DRIs Ingestão Dietética de Referência (Dietary References Intakes)
EAR Necessidade média estimada (Estimated Average Requirements)
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
GAPDH Gliceraldeído trifosfato desidrogenase
GPx Glutationa Peroxidase
GPX1 Gene da Glutationa Peroxidase 1
HDL Lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein)
HMG-CoA redutase 3-hidroxi-3metilglutaril coenzima A redutase
HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes
IMC Índice de Massa Corporal
LDL Lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein)
NHC Natal Hospital Center
PCR Reação de Polimerase em Cadeia
pH Potencial Hidrogeniônico
RDA Ingestão Dietética Recomendada (Recommended Dietary Allowance)
RNA Ácido Ribonucleico (Ribonucleic Acid)
RT-PCR Reação de Polimerase em Cadeia por transcriptase reversa
Se Selênio
SelP Selenoproteína P
SEPP1 Gene da Selenoproteína P 1
SelN Selenoproteína N
SEPN1 Gene da Selenoproteína N 1
xii
SBC Sociedade Brasileira de Cardiologia
TCLE Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TGO Transaminase Glutâmica Oxalacética
TGP Transaminase Glutâmica Pirúvica
TG Triacilgliceróis
TM Temperatura de Melting
UL Limite Superior Tolerável de Ingestão (Tolerable Upper Intake Levels)
UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
USP Universidade de São Paulo
xiii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Via do Mevalonato: biossíntese de Isoprenóides e efeito das
estatinas..............................................................................................................
5
FIGURA 2 – Fluxograma do arrolamento dos pacientes com aterosclerose tratados com
rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.............................................
13
FIGURA 3 - Coleta de sangue, segundo análises bioquímicas, dos pacientes com
aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital
Center...............................................................................................................
15
FIGURA 4 - Fluxograma das atividades do estudo com pacientes com aterosclerose
tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital
Center.................................................................................................................
FIGURA 5 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina,
de acordo com o Índice de Massa Corporal (IMC), atendidos no Natal Hospital
Center...............................................................................................................
FIGURA 6 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina,
de acordo com a Circunferência Abdominal (CA), atendidos no Natal Hospital
Center.................................................................................................................
16
27
27
FIGURA 7 - Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de
acordo com a adequação do consumo de calorias, macronutrientes e colesterol,
atendidos no Natal Hospital Center......................................................................
29
FIGURA 8 - Distribuição da ingestão de Se, bruta (A) e ajustado (B) dos pacientes com
aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center....
30
FIGURA 9 - Percentual de alterações do perfil lipídico dos pacientes com aterosclerose
após o tratamento com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center..........
33
xiv
FIGURA 10 - Valores médios e intervalos de confiança (95%) das expressões relativas
de mRNA do GPX1(A), SEPN1 (B) e SEPP1 (C) de pacientes com
aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital
Center. .......................................................................................................
37
xv
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - Iniciadores e sondas utilizados nas reações de PCR em tempo real para a
avaliação da expressão dos genes GPX1, SEPP1, SEPN1 e GAPDH.................
23
TABELA 2 - Características de estilo de vida dos pacientes com aterosclerose tratados
com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.....................................
25
TABELA 3 - Dados antropométricas dos pacientes com aterosclerose tratados com
rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center..........................................
26
TABELA 4 – Ingestão de energia, macronutrientes e colesterol de pacientes com
aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital
Center.............................................................................................................
TABELA 5 – Alimentos fonte de selênio presentes nos R24h dos pacientes com
aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital
Center...................................................................................................................
TABELA 6 – Parâmetros bioquímicos dos pacientes com aterosclerose tratados com
rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...................................
28
31
32
TABELA 7 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose em uso de estatina, atendidos
no Natal Hospital Center, conforme a classificação dos valores de
referência para perfil lipídico e glicemia....................................................
34
TABELA 8 – Concentrações de selênio do plasma e dos eritrócitos e atividade
enzimática da Glutationa Peroxidaes dos pacientes com aterosclerose
tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center...................
35
TABELA 9 – Variação da expressão de RNAm dos genes GPX1, SEPN1 e SEPP1 dos
pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no
Natal Hospital Center..............................................................................
36
xvi
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 - Classificação do Estado Nutricional Antropométrico de adultos, segundo
o IMC..........................................................................................................
17
QUADRO 2 - Risco de complicações metabólicas relacionadas à obesidade, com base na
Circunferência abdominal.....................................................................................
18
xvii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................ 2
1.1 Aterosclerose e Estatinas.......................................................................................... 2
1.2 Selênio e Selenoproteínas......................................................................................... 6
2 JUSTIFICATIVA............................................................................................................. 10
3 OBJETIVOS..................................................................................................................... 11
3.1 Objetivo Geral........................................................................................................... 11
3.2 Objetivos Específicos................................................................................................ 11
4 CASUÍSTICA E MÉTODOS......................................................................................... 11
4.1 Protocolo Experimental............................................................................................. 11
4.2 Parâmetros Antropométricos..................................................................................... 17
4.3 Análise da Dieta........................................................................................................ 18
4.4 Análises do Perfil Lipídico, Glicemia de jejum e Enzimas hepáticas...................... 19
4.5 Análise de Selênio..................................................................................................... 20
4.6 Determinação da atividade enzimática da Glutationa Peroxidase............................
4.7 Análise da expressão Gênica de Selenoproteínas.....................................................
21
22
4.8 Análise Estatística..................................................................................................... 24
5 RESULTADOS.................................................................................................................
6 DISCUSSÃO....................................................................................................................
25
38
7 CONCLUSÕES............................................................................................................... 43
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................. 44
ANEXOS..............................................................................................................................
58
1
1. Introdução
1.1 Aterosclerose e Estatinas
A aterosclerose é uma doença inflamatória, progressiva e caracterizada pelo acúmulo
de lípides e componente fibroso em grandes artérias. O processo crônico da aterosclerose
envolve o endotélio arterial culminando com complicações aterotrombóticas, podendo ser
causado por uma resposta inflamatória e estresse oxidativo desencadeados por partículas de
lipoproteína de baixa densidade (LDL) oxidada devido a presença de radicais livres (PAI et
al., 2004; STEPHENS; KHANOLKAR; BAIN, 2009).
Atualmente a doença arterial coronariana (DAC) e o acidente vascular cerebral
(AVC), principais manifestações clínicas da aterosclerose, constituem as maiores causas de
morbidade e mortalidade no mundo ocidental (NISSEN et al., 2006). Projeções da
Organização Mundial da Saúde para 2020 indicam que estas doenças continuarão aumentando
em países do leste europeu e em nações em desenvolvimento, consolidando a perspectiva de
maior causa de morte no mundo (WHO, 2004). No Brasil, as doenças cardiovasculares
representam a principal causa de morte nos indivíduos acima de 40 anos (BRASIL, 2006),
além do mais, seu tratamento representa um grande ônus financeiro (RIBEIRO et al., 2005).
A doença aterosclerótica se manifesta em nível das artérias coronárias como angina de
peito e infarto do miocárdio; nas artérias carótidas e cerebrais como acidente vascular
cerebral; nas artérias dos membros inferiores como a claudicação intermitente, caracterizada
como dor com a marcha que alivia com o repouso; e como lesões cutâneas, levando ao risco
de amputação nos casos mais graves se não tratado (PALINSKI; NAPOLI, 2002).
Dentre os fatores de risco para doenças cardiovasculares estão a idade,
hipercolesterolemia, diabetes mellitus, tabagismo, hipertensão arterial sistêmica,
hipertrigliceridemia, obesidade e história familiar de cardiopatia isquêmica; além da qualidade
da dieta e estilo de vida (RODRÍGUEZ-MORÁN et al., 2008; SARAÇ et al., 2007; SBC,
2007; STEPHENS et al., 2004).
O papel das dislipidemias na gênese da aterosclerose coronariana está bem
estabelecido. A hipercolesterolemia é um dos mais importantes fatores de risco para o
desenvolvimento das doenças cardiovasculares, principalmente a aterosclerose. O colesterol
plasmático está distribuído entre três classes de lipoproteínas, incluindo a lipoproteína de
baixa densidade (LDL), a lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) e a de alta
densidade (HDL). O risco para as doenças cardiovasculares (DCV) está possivelmente
correlacionado com a LDL colesterol (LDL), desde que essa partícula esteja inversamente
2
associada com a HDL (SHOJI et al., 2009). As concentrações elevadas do colesterol total e
LDL, diminuição da HDL e aumento nos teores de triacilgliceróis, também predispõem à
doença coronariana. (SEMAN et al., 1999; ROMALDINI et al., 2004). Apesar disso, alguns
mecanismo fisiopatológicos de desenvolvimento das DCV ainda permanecem parcialmente
elucidados. Atualmente, vem aumentando o interesse no desenvolvimento de marcadores
alternativos, como os marcadores plasmáticos de estresse oxidativo, que podem ter um papel
importante na predição de risco cardiovascular (STEPHENS; KHANOLKAR; BAIN, 2009).
A utilização do oxigênio nos sistema biológico leva a formação de espécies reativas de
oxigênio (ERO’s), que podem causar danos à biomoléculas (DNA, lipídeos e proteínas). O
estresse oxidativo é descrito como um desequilíbrio entre agentes pró-oxidantes e
componentes antioxidantes, o que pode ser conseqüência de uma inadequada ingestão de
nutrientes (SIES; STAHL; SEVANIAN, 2005). Os desequilíbrios da peroxidação lipídica das
estruturas celulares nas doenças cardiovasculares ocorrem devido ao aumento na produção de
radicais livres e deficiência nos mecanismos de defesa antioxidantes (STEPHENS;
KHANOLKAR; BAIN, 2009; SOLIMAN, 2008).
A oxidação da LDL na parede arterial pode levar a formação de aldeídos altamente
reativos, principalmente malondialdeído (MDA) e 4-hidroxinonenal, que reagem com
proteínas da matriz extracelular na parede arterial. A ativação da resposta imune contra
componentes da matriz extracelular na placa aterosclerótica pode ser considerada fundamental
no desenvolvimento da aterosclerose e suas complicações, pois promove a instabilidade da
capa fibrosa da lesão aterosclerótica. Os macrófagos e os linfócitos produzem citocinas pró-
inflamatórias, como fator de necrose tumoral-alfa (FNT-α), interferon-gama (IFN-γ),
interleucina-6 (IL-6) e interleucina-8 (IL-8) que mantêm o estímulo quimiotático para as
células do sistema imune e inibem a síntese de colágeno pelas células musculares lisas
(ORTIZ-MUÑOZ et al., 2009; DUNÉR et al., 2009).
Segundo Artwohl et al. (2009), as altas concentrações de ácidos graxos saturados
circulantes, oriundos da dieta, induz à apoptose de células musculares lisas do sistema
vascular, contribuindo para a progressão prematura da aterosclerose, ou mesmo para a
instabilidade da placa aterosclerótica. Por outro lado, existe o efeito protetor de alguns tipos
de gorduras, como é o caso dos ácidos graxos monoinsaturados e polinsaturados, que
contribuem para a prevenção do aparecimento de trombos e arritmias cardíacas (CALDER,
2008; ERKKILA et al., 2008).
Os nutrientes antioxidantes, a exemplo das vitaminas E e C, os carotenóides e alguns
minerais, como o selênio, cobre e zinco, são capazes de seqüestrar as ERO’s e impedir sua
3
ação oxidativa sobre as membranas (SIES; STAHL; SEVANIAN, 2005). A vitamina E atua
de forma protetora na doença cardiovascular, devido aos mecanismos de inibição da oxidação
da LDL e na diminuição da adesão de monócitos e plaquetas ao endotélio (JIALAL; GRUND,
1992). A vitamina C, por sua vez, age transferindo elétrons para radicais de tocoferol em
membranas ou lipídeos, evitando também a oxidação da LDL (KNEKT; RITZ; PEREIRA,
2004). O cobre e o zinco são minerais essenciais na defesa antioxidante do corpo,
principalmente por serem incorporados na enzima CuZn superóxido dismutase (CuZn-SOD),
enquanto o selênio participa da estrutura da enzima glutationa peroxidase (GPx) (KOSAR et
al., 2006).
As células também possuem um sistema de defesa contra as ERO’s, representado
pelas enzimas antioxidantes, que apresentam substratos específicos e diferentes estruturas e
localização. Dentre as principais enzimas antioxidantes estão a superóxido dismutase (SOD),
a catalase e a glutationa peroxidase (GPx) (NIKI et al., 2005).
No tratamento da aterosclerose preconiza-se uma abordagem multifatorial e
simultânea em relação a todos os fatores de risco, priorizando-se inicialmente a mudança do
estilo de vida, incluindo a terapia nutricional, a atividade física, a abstenção do tabagismo,
associadas ou não ao tratamento farmacológico específico (SBC, 2007).
A angioplastia com balão tem recebido ultimamente maior atenção no tratamento do paciente
com doença arterial oclusiva periférica, pelo fato de ser um procedimento relativamente de
baixo risco, pouco invasivo e com possibilidade de repetição. O desenvolvimento dos
sistemas de guias e cateteres representa um avanço importante na técnica da angioplastia
transluminal percutânea, tornando o procedimento possível em situações anatômicas
desfavoráveis, quer seja pela configuração da lesão ou do calibre do vaso afetado (OSTERNE
et al, 1999; PEREIRA; GRUDTNER, 2003).
Os benefícios da terapia com hipolipemiantes em pacientes com hipercolesterolemias
e fatores de risco para DAC são bem documentados, principalmente em indivíduos idosos
(KJEKSHUS et al., 2007; STOCKL et al., 2008). Recomenda-se também o uso de inibidores
da enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima-A Redutase (HMG-CoA redutase), uma das
enzimas chave na síntese intracelular do colesterol, que apresentam efeitos na função
vasomotora do endotélio, na inflamação e na trombose. Além da redução do colesterol sérico,
as estatinas têm ação reguladora na função endotelial, aumenta a estabilidade de placas
ateroscleróticas, diminuem o estresse oxidativo, a inflamação e a resposta trombogênica
(KINLAY, 2005; CAMPO; CARVALHO, 2007).
4
As estatinas são os fármacos mais utilizados nas hiperlipidemias em nível de
prevenção primária e secundária, com o propósito de diminuir as concentrações de
lipoproteínas plasmáticas ricas em colesterol e reduzir os riscos de DAC. As formas
comerciais mais usadas são: lovastatina (Mevacor®), pravastatina (Pravachol
®), sinvastatina
(Zocor®), fluvastatina (Lescol
®), atorvastatina (Lipitor
®) e rosuvastatina (Crestor
®) (CAMPO;
CARVALHO, 2007).
As estatinas atuando como inibidores da enzima HMG-CoA redutase, agem
consequentemente impedindo a conversão da 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A (HMG-
CoA) em ácido mevalônico e inibindo os primeiros passos da biossíntese de colesterol na via
do Mevalonato (Figura 1). O próximo produto dessa cascata é o isopentenil pirofosfato (IPP),
o qual serve de substrato para a isopentenil transferase Sec tRNA (selenocisteína tRNA), que
está relacionada com a expressão gênica das selenoproteínas (CARLSON et al., 2004;
MOOSMANN; BEHL, 2004a).
De acordo com Moosmann e Behl (2004b), a inibição da isopentilação da Sec tRNA
resulta na redução significativa das selenoproteínas. Esse efeito pode explicar os efeitos
adversos das estatinas sobre o sistema imune, neuromuscular e hormonal (hormônios
tireoidianos).
5
IPP – Isopentenil pirofosfato.
FONTE: Adaptado de Moosmann e Behl (2004a).
FIGURA 1 – Via do Mevalonato: biossíntese de Isoprenóides e efeito das estatinas.
De uma maneira geral, as estatinas são fármacos bem tolerados pelo organismo, no
entanto é possível observar alguns efeitos indesejáveis discretos, como distúrbios
gastrintestinais, aumento das concentrações plasmáticas das enzimas hepáticas, insônia,
miosite e rabdomiólise (THOMPSON; CLARKSON; KARAS, 2003). Esses efeitos adversos
durante o tratamento com estatinas são raros e dependentes da dose. No entanto, para
identificar possíveis efeitos adversos recomenda-se a dosagem das concentrações basais de
creatinofosfoquinase (CK) e de transaminases (especialmente de ALT) e a repetição na
primeira reavaliação ou a cada aumento de dose (LINARELLI; POTT JÚNIOR, 2008; SBC,
2007).
6
Takarada et al. (2009) identificaram que o efeito protetor do tratamento com estatinas
deve-se ao fato destes fármacos aumentarem a capa fibrosa sobre a placa aterosclerótica
coronariana, o que produz uma baixa vulnerabilidade da placa e evita o infarto agudo do
miocárdio.
Nissen et al. (2006) observaram que uma terapia de alta potência com estatina
utilizando 40mg/dia de rosuvastatina, alcançou a redução da LDL e o aumento na
concentração de HDL, resultando em regressão significativa da aterosclerose. Pacientes
idosos que fizeram uso de rosuvastatina apresentaram redução no número de internações
oriundas de complicações cardiovasculares; porém não houve redução sobre o número de
mortes (KJEKSHUS et al., 2007).
1.2 Selênio e Selenoproteínas
O selênio (Se) como essencial para humanos tem sido pesquisado quanto à sua
participação em compostos essenciais para homeostase corporal (REILLY, 2006), cuja
demanda corporal aumenta, principalmente, devido seu papel importante no sistema
antioxidante (HAMBIDGE, 2003). O selênio está envolvido em diversas atividades
metabólicas, via selenoproteínas, que são essenciais para a proteção contra os danos
oxidativos e na regulação do sistema imunológico, atuando na diminuição da resposta do NF-
kB ao mecanismo de pró-inflamação da célula endotelial (ZHANG et al., 2002; SHRIMALI
et al., 2008). Altas concentrações de selênio melhoram as funções das células do sistema
imune inato e adaptativo (HOFFMANN et al., 2007).
O alimento mais rico em selênio é a castanha do Brasil, conhecida com castanha do
Pará, que tem em média 55 μg de Se/castanha (FREITAS et al., 2008). O selênio está
associado a proteínas nos tecidos, por conseguinte os outros alimentos que mais contribuem
para o aporte de Se são os peixes, o fígado e as carnes (BURK; HILL; MOTLEY, 2003). Os
produtos de laticínios e ovos possuem baixas concentrações de selênio, mas podem ser fontes
significativas nos países em que seu consumo é alto. Os grãos e as sementes, entretanto,
variam no conteúdo de selênio de acordo com o solo em que foram cultivadas. Frutas e
hortaliças, em geral, apresentam baixos teores de selênio e fornecem menos de 8% do aporte
de Se na dieta (COMBS JUNIOR, 2001), podendo estar presente na forma de selênio
elementar, selenito e selenato em associação com outros elementos (REILLY, 2006).
7
Um estudo nacional avaliou o consumo diário médio de selênio em diferentes grupos
etários e cidades do Brasil. O maior consumo ocorreu em crianças da cidade de Macapá (AP)
(107μg de Se/dia), seguido de adultos de Manaus (AM) (98μg de Se/dia) devido ao consumo
de castanha do Brasil. Crianças residentes em São Paulo (SP) apresentaram concentrações
médias diárias mais baixas (26,3μg de Se/dia) (MAIHARA et al., 2004).
A biodisponibilidade e a toxicidade do Se consumido dependem da sua forma
química, sendo os compostos orgânicos mais biodisponíveis e menos tóxicos do que os
inorgânicos, como selenito e selenato (TINGGI, 2003).
Para Finley (2006), a absorção de todas as formas de Se é relativamente alta (70 a
95%), mas pode variar dependendo da fonte e do indivíduo. O autor comparou a
biodisponibilidade de Se em cereais, carnes, peixes e outros produtos e verificou que o Se foi
mais biodisponível em alimentos de origem vegetal. Analisando alimentos consumidos no
Brasil, Ferreira et al. (2002) verificaram que as frutas, legumes e tubérculos apresentaram
baixos teores de Se, enquanto que valores superiores foram encontrados nos peixes (11 a 80
μg.100 g-1), fígado (44 μg.100 g-1), gema de ovo de galinha (23 a 55 μg.100 g-1) e no feijão
preto, cuja concentração de Se variou de 0,5 a 23,9 μg.100 g-1
A Ingestão Dietética de Referência (Dietary Reference Intakes - DRIs) engloba 4
valores de referência de ingestão de nutrientes e que devem ser utilizados para planejar e
avaliar dietas para pessoas saudáveis. Na avaliação em grupo é utilizada a Necessidade média
estimada (Estimated Average Requirements- EAR) que orresponde a um valor de ingestão
diária de um nutriente que se estima que supra a necessidade de metade (50%) dos indivíduos
saudáveis de um determinado grupo de mesmo gênero e estágio de vida. A EAR para o
mineral selênio é 45 μg/dia.
Na Ingestão Dietética Recomendada (Recommended Dietary Allowance - RDA) para o
Se é de 55 μg/dia, para homens e mulheres adultos. A RDA é utilizada na avaliação individual
e considera que 97% dos indivíduos têm suas necessidades supridas, ela é baseada na
quantidade necessária de selênio para maximizar a atividade da enzima GPx, enquanto que o
valor do Limite Superior Tolerável de Ingestão (Tolerable Upper Intake Levels -UL) de 400
μg/dia foi fixado considerando o risco de selenose (NRC, 2000).
A deficiência grave do selênio pode causar uma doença conhecida como Doença de
Keshan, uma forma de cardiomiopatia, identificada inicialmente no nordeste da China. Essa
deficiência pode estar relacionada com doenças, como câncer, doenças cardiovasculares e
problemas hepáticos (SAITO et al., 2003; HATFIELD; BARRY; GLADYSHEV, 2006). O
Se tem sido objeto de pesquisas sobre o possível efeito anticarcinogênico (WHANGER,
8
2004), segundo este autor, doses de 100-200 μg de Se/dia inibiriam danos genéticos e o
desenvolvimento de câncer em humanos. Entretanto, para Silvera e Rohan (2007) não há
evidência consistente da associação entre baixas concentrações de Se e aumento no risco de
alguns tipos de câncer. A deficiência de selênio pode levar a redução significativa na
atividade das selenoproteínas, incluindo as enzimas GPx, DIOs e TRs (LU; HOLMGREN,
2009; RENKO et al., 2009).
Como análogo dos aminoácidos sulfurados, a forma orgânica de selênio está presente
como um produto direto da incorporação de Se em proteínas em substituição ao enxofre
(selenometionina e selenocisteína-Sec), mas pode também ser incorporado de maneira
inespecífica em proteínas como selenometionina (KRYUKOV et al., 2003). Tais mecanismos
diferem das metaloproteínas ou quelatos, nos quais ocorre simplesmente uma complexação
com grupos funcionais das proteínas (SUZUKI, 2005).
Baixos níveis de selênio foram associados à ocorrência de aterosclerose (GONZÁLEZ et al.,
2006). Em estudo de observação de aproximadamente mil homens, com idades entre 55 e 74
anos, baixos níveis de selênio sérico foram associados a DCV e AVC (VIRTAMO et al.,
1985)
As selenoproteínas incorporam o selênio na estrutura do resíduo de selenocisteína, que
é ionizado inteiramente em pH fisiológico e atua como um catalisador redox muito eficiente.
Existem no mínimo 25 selenoproteínas identificadas; a selenoproteoma humana consiste de
17 famílias de selenoproteínas, formadas de vários genes, porém com funções biológicas
semelhantes. Muitas dessas selenoproteínas são enzimas, porém algumas ainda não foram
caracterizadas quanto as suas funções fisiológicas (KRYUKOV et al., 2003; PAPP;
HOLMGREN; KHANNA, 2010). De acordo com Castellano et al. (2005) e Papp et al.(2007),
apenas 12 selenoproteínas foram caracterizadas quanto as funções no organismo, dessas,
cinco são GPx, três são deiodinases da iodotironina (DIOs), três são tioredoxina redutases
(TRs) e uma selefosfatase sintetase 2 (SPS2). As demais selenoproteínas foram registradas de
acordo com o seu tamanho (Sep 15 – selenoproteína com 15kDa) ou conforme a sequência do
alfabeto: SelH, SelI, SelK, SelM, SelN, SelO, SelP/SepP, SelR, SelS, SelT, SelV e SelW.
As selenoproteínas com papel antioxidante possuem a capacidade de remover os
radicais livres, por exemplo, peróxidos de hidrogênio, hidroperóxidos e ERO’s, os quais, em
desequilíbrio, oxidam os lipídeos da membrana, causando danos a sua estrutura (peroxidação
lipídica), o que pode resultar na aterosclerose (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2007).
A glutationas peroxidases (GPx) são enzimas da família das selenoproteínas capazes
de reduzir o peróxido de hidrogênio (H2O2) e hidroperóxidos orgânicos a água (H2O) e
9
alcoóis correspondentes, utilizando a glutationa reduzida como co-substrato (HAMANISHI et
al., 2004).
Até o momento seis tipos de glutationas peroxidases foram descritas em humanos:
GPx1 – citosólica, GPx2 – gastrointestinal, GPx3 – plasmática, GPx4 – fosfolipídeo
hidroeroxidase, Gpx5 – epididimal e GPx6 – olfatória. A glutationa citosólica (GPx1) é
expressa em vários tecidos, principalmente em eritrócitos, rins e fígado, e sua deficiência
pode estar envolvida na disfunção endotelial e anormalidades cardíacas, sendo dessa forma
considerada uma selenoproteína protetora dos vasos evitando o estresse oxidativo e posterior
aterogênese. O gene que codifica a GPx1 (GPX1) localiza-se no cromossomo 3 (3p21.2) e
possui dois exons (FORGIONE et al., 2002a; FORGIONE et al., 2002b).
Há ainda a GPx2 expressa principalmente no trato gastrointestinal, a GPx3
(extracelular) que é secretada por glicoproteínas e está presente principalmente no plasma,
mas também é expressa em rins, coração, pulmões e placenta; enquanto a fosfolipídeo
hidroperóxido GPx (GPx4) possui atuação específica na peroxidação dos fosfolipídeos
(IMAI; NAKAGAWA, 2003), e pode estar envolvido no controle da morte celular por
apoptose (NOMURA et al., 2001). A Gpx5 e GPx6 não possuem selenocisteína ou selênio, a
GPx5 está expressa principalmente no epidídimo. A GPx6 ainda não está bem caracterizada
quanto as funções e relações com doenças, porém sabe-se que participa da detoxificação do
peróxido de hidrogênio e sua expressão está restrita ao tecido olfatório de embriões e adultos
(KRYUKOV et al., 2003; REEVES; HOFFMANN, 2009).
A Selenoproteína P (SelP) possui dez átomos de selênio por molécula, tem ação
antioxidante e é a principal selenoproteína presente no plasma. Essa selenoproteína,
juntamente com a GPx3 extracelular, contêm mais de 90% do selênio plasmático, e serve
como proteína de transporte e distribuição corporal ( ARTEEL; SIES, 2001; BURK; HILL;
MOTLEY, 2003; HILL et al., 2003; BURK; HILL, 2009). O gene SEPP1 localiza-se no
braço curto do cromossomo 5 (5p12) (REDERSTORFF; KROL; LESCURE, 2006).
A Selenoproteína N (SelN) está envolvida na fisiologia muscular, de forma que
algumas formas de miopatias, caracterizadas por hipotonia, fraqueza, rigidez espinhal,
distrofias musculares estão ligadas ao gene da SelN (SEPN1) (REDERSTORFF; KROL;
LESCURE, 2006). Os mecanismos moleculares que envolvidos nas miopatias, dependentes
da SelN, ainda não foram esclarecidos, provavelmente pela falta da caracterização funcional.
Essa selenoproteína está distribuída por todo o organismo e é expressa principalmente na
membrana do Retículo Endoplasmático (RE) celular (PETIT et al., 2003; LESCURE et al.,
2008). O gene SEPN1 está localizado no cromossomo 1 (1p35.36). Assim, uma das hipóteses
10
é de que a SelN esteja envolvida na maturação de outras proteínas relacionadas ao
desenvolvimento do tecido muscular (MOGHADASZADEH; BEGGS, 2006; PAPP et al.,
2007).
Considerando a importância da nteração fármaco-nutrientes em terapias
medicamentosas crônicas, este estudo propõe-se a verificar os efeitos do uso da rosuvastatina
no estado nutricional de selênio, em parâmetros enzimáticos e na expressão gênica de
selenoproteínas.
2. Justificativa
A aterosclerose é uma doença de importância mundial, tendo em vista sua alta
prevalência e complicações, que são responsáveis por elevados índices de morbi- mortalidade
em todo o mundo. Sabe-se que é uma doença inflamatória crônica, com evolução lenta, cujas
lesões iniciais podem começar na infância e evoluírem gradualmente por toda a vida,
principalmente com a exposição a fatores de risco. No tratamento da aterosclerose, as
estatinas são os principais fármacos de escolha, por inibirem a biossíntese do colesterol e
apresentarem efeitos na função vasomotora do endotélio, inflamação e trombose. Alguns
trabalhos apontam para o fato das estatinas interferirem na síntese das selenoproteínas,
sugerindo que muitos dos efeitos colaterais das mesmas poderiam acontecer em decorrência
deste fato, especialmente as miopatias.
O selênio é um importante agente antioxidante, sendo o único a exercer funções
biológicas através da incorporação em proteínas (selenoproteínas) e no aminoácido cisteína.
As selenoproteínas possuem diferentes funções no organismo, como ação antioxidante (por
exemplo, GPx e SelP), maturação celular (SelN - miócitos), regulação hormonal (TRs), entre
outras.
O presente estudo torna-se relevante, pois traz informações importantes sobre o efeito
das estatinas na expressão gênica de determinadas selenoproteínas (GPx, SelP e SelN) e sobre
a atividade de enzimas antioxidantes (GPx) dependentes de selênio.
11
3. Objetivos
Objetivo Geral
Verificar os efeitos do uso de estatinas (rosuvastatina) em pacientes com aterosclerose,
em relação aos parâmetros sanguíneos de selênio e selenoproteínas, bem como observar
possíveis alterações na expressão gênica de selenoproteínas nesses pacientes.
Objetivos específicos
Caracterizar os pacientes quanto aos parâmetros antropométricos e
bioquímicos, tais como o perfil lipídico, glicemia e enzimas hepáticas;
Determinar as concentrações de selênio plasmático e eritrocitário;
Avaliar a atividade enzimática da Glutationa Peroxidase;
Estudar a expressão do mRNA das selenoproteínas: GPx 1, Selenoproteína P1
e, Selenoproteína N1 em leucócitos totais de sangue periférico;
Avaliar a dieta (ingestão de calorias, proteínas, lipídeos, carboidratos e
selênio), e estabelecer correlações com os parâmetros de selênio, atividade da
enzima Glutationa Peroxidase e expressão gênica das selenoproteínas.
4.Casuística e Métodos
4.1 Protocolo Experimental
Trata-se de um estudo longitudinal quase-experimental. A amostra foi composta por
pacientes adultos e idosos com o diagnóstico clínico de doença arterial coronariana
submetidos à angioplastia, atendidos no Serviço de Hemodinâmica do Natal Hospital Center
(NHC), localizado em Natal, Rio Grande do Norte (RN), no período de junho de 2008 a
janeiro de 2009.
Para o cálculo da amostra foi utilizado o método proposto por Zar (1999) com poder
de 80% com base na variável ―Colesterol plasmático total‖, uma vez que existem estudos
consistentes com amostras robustas demonstrando os valores médios e variações desta
medida, a partir dos quais a representatividade de resposta seria obtida com uma amostra
mínima de 16 pacientes.
12
A pesquisa é um desdobramento do projeto ―Efeito da Suplementação com minerais
antioxidantes em pacientes com aterosclerose tratados com estatinas‖. O referido projeto foi
aprovado no Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de São Paulo, Faculdade de
Ciências Farmacêuticas (FCF/USP) sob o número CAAE 0009.0.294.018-06 e no Comitê de
Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL), sob n° de registro 026/06
– Adendo (Anexo A).
Todos os participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido –
TCLE. Foram incluídos na pesquisa pacientes adultos e idosos de ambos os gêneros com
diagnóstico de aterosclerose coronariana por angiografia, com estenose ≥ 60% em uma ou
mais artérias, associado ao diagnóstico de angina estável. Foram considerados como critérios
de não-inclusão a presença de complicações cardíacas graves ou outras doenças como as
hematológicas, auto-imunes, hepatopatias, insuficiência renal, neoplasias, infecções
associadas, pós-operatório, uso de antiácidos, antibióticos, suplementos vitamínico-minerais,
etilismo e tabagismo.
Foram abordados durante o estudo 76 pacientes, porém a amostra final do estudo foi
composta por 27 pacientes (Figura 2).
13
FIGURA 2 - Fluxograma do arrolamento dos pacientes com aterosclerose tratados com
rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
Após a seleção dos pacientes foi preenchida uma ficha de avaliação individual para
obtenção de dados pessoais e clínicos. Em seguida, foi realizada a primeira avaliação
antropométrica (Índice de Massa Corpórea e Circunferência Abdominal), dietética (calorias,
macronutrientes, colesterol e selênio) e a coleta de 20mL de sangue total, com o paciente em
jejum de 12 horas (Figura 3), para posterior análise do perfil lipídico (Colesterol Total, LDL,
HDL, Triacilgliceróis), glicemia, enzimas hepáticas (Aspartato Aminotransferase - AST e
Alanina Aminotransferase – ALT); selênio no plasma e eritrócitos; atividade enzimática da
glutationa peroxidase (GPx); e análise da expressão do mRNA das selenoproteínas (glutationa
peroxidase 1, selenoproteína P1 e N1) (Figura 3).
14
Os pacientes foram tratados com 10mg/dia de rosuvastatina do Laboratório
Astra|Zeneca (Crestor) durante 4 meses, com retornos mensais para avaliação da intervenção,
período em que foram feitas as análises antes de iniciar o tratamento - tempo Inicial (T0) e
após o tratamento – tempo Final(T1), conforme Figura 4.
15
FIGURA 3 – Coleta de sangue, segundo análises bioquímicas, dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos
no Natal Hospital Center.
HDL: Lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein); ALT: Alanina Aminotransferase; AST: Aspartato
Aminotransferase.
16
FIGURA 4 – Fluxograma das atividades do estudo coms pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
17
4.2 Parâmetros Antropométricos
4.2.1 Índice de Massa Corporal (IMC)
A avaliação antropométrica foi feita por meio do Índice de Massa Corpórea (IMC),
que corresponde à razão do peso pela altura ao quadrado (Peso/Altura²), recomendado pela
Organização Mundial de Saúde (World Health Organizations - WHO, 1998). Para
mensuração do peso, foi utilizada balança digital Tanita®, modelo MEA-03140, com
capacidade para 150 kg e precisão de 100 gramas, estando os indivíduos descalços e com o
mínimo possível de roupa e adereços.
A estatura foi aferida em centímetros, com auxílio de estadiômetro (marca: WCS)
medindo 216cm com plataforma. Os indivíduos foram medidos descalços em posição
ortostática, com os olhos no plano Frankfört, com as costas e a parte posterior dos joelhos
encostados à parede. O estado nutricional antropométrico dos pacientes foi diagnosticado
conforme Quadro 1.
FONTE: WHO (1998).
QUADRO 1 – Classificação do Estado Nutricional Antropométrico de adultos, segundo o
IMC.
4.2.2 Circunferência Abdominal (CA)
A Circunferência abdominal foi mensurada com precisão de 0,1cm, sendo utilizada
uma fita métrica extensível e inelástica com 200cm de comprimento posicionada na menor
curvatura localizada entre o último arco costal e a crista ilíaca, estando o indivíduo ereto com
os braços ao longo do corpo e os pés unidos. Essa medida foi realizada duas vezes para cada
paciente. A classificação foi realizada segundo pontos de corte preconizados pela
Organização Mundial de Saúde (World Health Organizations - WHO, 1998) (Quadro 2).
18
FONTE: WHO (1998).
QUADRO 2 - Risco de complicações metabólicas relacionadas à obesidade, com base na
Circunferência abdominal.
4.3 Análise da Dieta
Foi utilizado o método de Recordatório de 24 horas (R24h) para avaliar a ingestão
dietética atual, que consiste no registro da informação sobre a ingestão alimentar (alimentos e
bebidas) do dia anterior. Esse instrumento foi aplicado cinco vezes e em dias diferentes,
incluindo um dia de final de semana, com o intuito de registrar o consumo habitual dos
pacientes (Figura 4).
Para auxiliar na aplicação do R24h, foi utilizado um álbum fotográfico com uma
compilação de imagens de utensílios, alimentos e preparações com diferentes medidas
caseiras para melhor identificar as porções consumidas pelos pacientes (ZABOTTO; VIANA;
GIL, 1996; ANDRADE; MORAIS, 2004). A definição dos tamanhos das porções foi baseada
nas medidas fornecidas por Tomita e Cardoso (2000), Pinheiro et al. (2004) e Araújo e Guerra
(2007). Os alimentos que não foram encontradas as medidas foram pesados em balança digital
eletrônica, no Laboratório de Técnica Dietética do Departamento de Nutrição da UFRN.
A dieta foi avaliada quanto a energia, macronutrientes, colesterol e selênio utilizando-
se o Software Virtual Nutri Plus® (PHILIPPI, 2008) e os resultados apresentados como a
média dos cinco R24h. Os alimentos/preparações de interesse foram adicionados ao banco de
dados, sendo o cálculo nutricional realizado com o auxílio de Tabelas de Composição de
Alimentos (Tabela Brasileira de Composição de Alimentos – TACO, 2006 e United States
Department of Agriculture – USDA, 2003).
A adequação da ingestão dietética foi baseada nas recomendações dietéticas da SBC
(2007) para macronutrientes, fibras e colesterol (Anexo B), enquanto que para o Se, como não
há recomendação específica para indivíduos com aterosclerose, foi utilizada a EAR (Estimate
Average Requirement) (IOM, 2000).
Para estimar a distribuição da ingestão alimentar habitual do grupo foram aplicados
testes estatísticos para se obter a variância intra e interpessoal a partir da aplicação de análise
19
de variância (One-Way ANOVA) (SLATER; MARCHIONI; FISBERG, 2004). Em seguida
os nutrientes foram ajustados pela energia, segundo Willett, Howe e Kushi (1997). A
prevalência de ingestão inadequada de Se foi obtida utilizando-se o EAR como ponto de corte
(IOM, 2000).
4.4 Análises do Perfil Lipídico, Glicemia de jejum e Enzimas hepáticas
As análises bioquímicas foram realizadas no Laboratório de Análises Clínicas do
HUOL, UFRN- RN. O soro dos pacientes foi separado com centrifugação a 3.500rpm durante
15 minutos a 4°C, utilizando-se a centrífuga Sigma® 2K15 (Alemanha). As análises foram
realizadas por meio do aparelho Analisador Imunoquímico da marca Olympus®, modelo
AU400e (Olympus America Inc., Melville, EUA), utilizando-se o kit do Laboratório
Olympus®.
O perfil lipídico foi avaliado pela concentração no soro de colesterol total, lipotroteína
de alta densidade (High Density Lipoprotein – HDL) e triacilgliceróis. Também foi
determinada a concentração da lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein –
LDL, que foi que foi calculada pela equação de Friedewald (SBC, 2007). Para identificação
de dislipidemias foram utilizados os valores de referência preconizados pela Sociedade
Brasileira de Cardiologia (2001).
Nas determinações das glicemias de jejum e Aspartato Aminotransferase (AST),
também conhecida como Transaminase Glutâmica Oxalacética (TGO) e Alanina
Aminotransferase (ALT) ou Transaminase Glutâmica Pirúvica (TGP) foram considerados
para avaliação os valores sugeridos pelo Laboratório Olympus® (Anexo C).
4.5 Análise de Selênio
A análise do selênio foi realizada no Laboratório de Nutrição e Minerais, Faculdade de
Ciências Farmacêuticas Universidade de São Paulo (USP). Todo material utilizado para
análise de minerais foi desmineralizado em banho de ácido nítrico (HNO3) à 20%, por no
mínimo 12 horas e enxaguadas dez vezes com água deionizada ou água ultrapura (Milli-Q®
),
logo após colocados em estufa de aço inoxidável até que não apresentassem resíduos de água,
em seguida armazenados em sacos plástico. Esses procedimentos visaram reduzir a
contaminação por minerais. Todos os reagentes utilizados nas análises apresentaram um grau
de pureza analítica (P.A.). A água utilizada no preparo de soluções e diluição das amostras foi
a ultrapura (Milli-Q®).
20
A amostra foi preparada a partir de 6,0mL de sangue total coletado em tubo com
EDTA. O plasma foi separado após centrifugação a 3.500rpm, a 4°C, durante 15 minutos,
utilizando-se a centrífuga Sigma® 2K15 (Alemanha). e armazenado à -80°C para posterior
análise. Em seguida foram realizadas 3 lavagens com solução salina (NaCl) a 0,9% com
rotação 10.000rpm a 4°C, durante 10 minutos, utilizando-se a centrífuga IEC MultiRF®
(Thermo Electron Corporation, EUA). Os eritrócitos foram armazenados a -80°C até o
momento da análise.
A análise do selênio foi realizada por espectrofotometria de absorção atômica (marca
HITACHI, modelo Z-5000; Japão) com geração de hidretos acoplados à cela de quartzo, de
acordo com a padronização de Gonzaga (2002). Na fase 1 do experimento foi acrescido 10mL
de ácido nítrico 68% (PA Merck®) às amostras de 250μL de plasma ou eritrócito, em
triplicata, e no branco, para digestão overnight. No dia seguinte, foi realizada a digestão das
amostras em bloco digestor a uma temperatura de 150°C, até que as amostras obtivessem
coloração clara. Após a digestão, as amostras foram acrescidas de 5mL de ácido clorídrico
(HCl) 1,2N e, posteriormente, aquecidas até a redução do Se (VI) em Se (IV). Foi preparada
uma solução de borohidreto de sódio (NaBH4), utilizada como reagente redutor no processo
de determinação do selênio. A curva de calibração foi feita a partir de diluição de uma solução
de trabalho com concentração conhecida. Os resultados das leituras em triplicatas foram
expressos em microgramas por litro (μg/L), considerando o coeficiente de variação inferior a
10% entre as triplicatas.
Para controle da exatidão e reprodutibilidade do método de análise de selênio no
plasma e eritrócitos, utilizou-se o material de referência certificado Seronorm Trace Elements
Serum®, preparados de acordo com as recomendações do fabricante o em água ultrapura e
observando-se os valores da curva de calibração.
Foi determinada a concentração de hemoglobina no eritrócito com a finalidade de
expressar os resultados em termos de massa de selênio e GPx / massa de hemoglobina. Essa
análise foi realizada no Laboratório Multidisciplinar (LABMULT), Centro de Ciências da
Saúde, UFRN-RN.
Para as análises da concentração de hemoglobina no eritrócito foram utilizados kits da
Labtest® (Brasil). Uma alíquota de 300μL de eritrócitos lavados foi diluída com água
ultrapura (Milli-Q), na proporção de 1:3 (lisado). Em tubos de ensaio foram pipetados 5 mL
de solução de Drabkin, previamente preparado conforme instruções do fabricante, em seguida
foi acrescido 20L do lisado, em triplicata. O método utilizado foi o da cianometaemoglobina
(VAN ASSENDELFT, 1972). Os tubos foram homogeneizados em agitador mecânico e as
21
leituras realizadas por espectofotometria, utilizando um espectofotômetro UV visível
(HITACHI, modelo U1100) em 540nm. Os resultados foram expressos em g/dL.
4.6 Determinação da atividade enzimática da Glutationa Peroxidase
As análises foram feitas no Laboratorio Multidisciplina – LABMULT do Programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – PPgCF, no Centro de Ciências da Saúde, Centro
de Ciências da Saúde, UFRN-RN. Para a análise da atividade da enzima Glutationa
Peroxidase (GPx), as amostras foram preparadas a partir de 5mL de sangue total coletado em
tubo com anticoagulante EDTA, com 3 lavagens com solução salina a 0,9%, rotação de
4.500rpm, a 4°C, durante 10 minutos, utilizando-se a centrífuga Sigma® 2K15 (Alemanha).
Os eritrócitos foram armazenados à -80°C até o momento das análises, realizadas em um
prazo máximo de 40 dias após a coleta.
A atividade enzimática da GPx foi mensurada em UV, Espectofotômetro (UV2100S;
Shimadzu Co.®
, Japão), utilizando-se o kit Ransel do Laboratório Randox (Laboratório
Randox, São Francisco, EUA). Este método é baseado em Paglia e Valentine (1967), cujo
princípio se baseia na medida da velocidade de oxidação da Glutationa reduzida (GSH) por
hidroperóxido de cumeno catalisada pela Glutationa Peroxidase (GPx), presente no
hemolisado (amostra do paciente), gerando água e Glutationa oxidase (GSSG). Na presença
da Glutationa Redutase (GR) e nicotinamida-adenina dinucleotídio-fosfato (NADPH) a GSSG
é imediatamente convertida na forma reduzida (GSH), sendo monitorada a 340 nm quando o
NADPH é convertido a NADP+.
Os resultados das leituras foram expressos em unidades por grama de hemoglobina
(U/g Hb). Os valores de referência para a Glutationa Peroxidase são: 27,5 – 73,6 U/g Hb (Kit
Ransel, Laboratório Randox).
4.7 Análise da expressão Gênica de Selenoproteínas
As análises da expressão do mRNA das selenoproteínas (GPX1, selenoproteína P1 e
N1) foram realizadas no Laboratório de Biologia Molecular – LABIOMOL, do Programa de
Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas – PPgCF, no Centro de Ciências da Saúde (CCS)
da UFRN – RN.
4.8.1 Extração do RNA total
O RNA total foi obtido a partir de sangue total periférico (4,0mL), colhido em tubo
contendo EDTA, utilizando o kit Qiamp RNA Blood Mini Kit® (Qiagen, Alemanha)
22
imediatamente após a coleta do sangue, através de metodologia descrita pelo fabricante. O
material foi armazenado em freezer a -80C.
O RNA total extraído foi quantificado (A260nm) e teve seu grau de pureza
(A260/A280) avaliado através de espectrofotometria no ultravioleta utilizando o
espectrofotômetro Cirrus 80MB (FEMTO, São Paulo, Brasil) (SAMBROOK e RUSSEL,
2001). A integridade do RNA das amostras foi avaliada por eletroforese em gel de agarose a
1,0%, na presença de formaldeído a 2,2M e tampão MOPS [MOPS a 20mM (pH 7,0), acetato
de sódio a 8mM e EDTA a 1mM (pH 8,0)] preparado com água tratada com Dietil-
pirocarbonato (DEPC) (SAMBROOK e RUSSEL, 2001).
4.8.2 Análise da Expressão gênica pela PCR em Tempo Real
A síntese do cDNA, a partir do RNA total, foi realizada utilizando-se o kit High
Capacity cDNA Reverse Transcription Kit da Applied Biosystems®, de acordo com a
metologia descrita pelo fabricante (Foster City, CA, EUA) em termociclador MyCiclerTM
(Bio Rad®, Hercules, CA, EUA). O cDNA obtido foi armazenado a –20°C até a realização da
PCR em tempo real.
Os cDNAs dos genes GPX1 (número genbank de acesso NM_000581), SEPP1
(número genbank de acesso NM_001085486) e SEPN1 (número genbank de acesso
NM_020451) e do gene de refrência, gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase (GAPDH)
(número genbank de acesso NM_002046.3) foram amplificados pela PCR em Tempo Real, no
aparelho ABI 7500 fast (Applied Biosystem, Foster City, CA, EUA). Para a amplificação pela
PCR em tempo real dos genes em estudo e do gene de referência foram utilizados iniciadores
e sondas, marcadas com fluoróforo, selecionados com o auxílio do programa Primer Express®
(Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) com base nas seqüências gênicas disponíveis no
banco de dados do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) e estão descritos na Tabela 1.
23
TABELA 1 – Iniciadores e sondas utilizados nas reações de PCR em tempo real para a
avaliação da expressão dos genes GPX1, SEPP1, SEPN1 e GAPDH.
Genes Iniciadores Fragmentos
GPX1 5’ CATCAGGAGAACGCCAAGAAC 3’
3’GCATGAAGTTGGGCTCGAA 5’
5’ FAMTM
GCATGAAGTTGGGCTCGAA 3’
40pb
SEPN1 5’ TCAGTTCACCGGCCACATC 3’
3’CCCCGTAAAGCCACTCCAT 5’
5’ FAMTM
CGTGCCCAACCACAGGTCTCTGAA 3’
38pb
SEPP1
5’ATATATGATAGATGTGGCCGTCTTGT 3’
3’TTTCCACATTTCTTTTCACAGTAAGC 5’
5’ FAMTM
TGGTTTGCCTTTTTCCTTCCTAACTTTCCC 3’
52pb
GAPDH
5’ GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCA 3’
5’ CTGGAAGATGGTGATGGGATTTC 3’
5’VIC® CATGGCACCGTCAAGGCTGAGAACG TAMRA 3’
44bp
NOTA: FAM TM –fluoróforo 6-carboxifluoresceína; VIC® - fluoróforo disponibilizado pela Applied
Biosystems®. GPX1-gene da Glutationa Peroxidase 1. SEPN1 – gene da selenoproteína N 1. SEPP1 – gene da
selenoproteína P 1.
Nos ensaios de amplificação dos genes GPX1 e SEPN1 utilizou-se iniciadores a 300
nmoles/L e sonda de detecção marcada com FAMTM (6carboxifluoresceína) a 200nmoles/L,
para o gene SEPP1 utilizou-se iniciadores a 450nmoles/L e sonda de detecção marcada com
FAMTM a 200nmoles/L. Para o GAPDH utilizou-se a sonda de detecção (200nmoles/L) 24
marcada com VIC® e os iniciadores a 300nmoles/L. Foi utilizado um volume final de 20 μL
por reação.
A quantidade de cDNA utilizados nos ensaios foi otimizado a partir de uma curva-
padrão, realizada com diferentes concentraçoes de amostras de cDNA. A curva-padrão
permite avalizar a linearidade da amplificação, bem como a eficiência da mesma. A eficiência
de cada ensaio foi considerada adequado quando apresentaram valores entre 90 e 110%
(LIVAK; SCHMITTGEN, 2001).
24
Foram realizadas amplificações conjuntas de cada um dos genes de estudo e do gene de
referência. A medida da expressão do mRNA dos genes GPX1, SEPP1 e SEPN1 foi obtida em
relação ao gene de referência, controle endógeno, pela diferença entre o Ct (cycle threshold)
do gene alvo e o Ct do gene de referência (LIVAK; SCHMITTGEN, 2001):
Ct = (Ct gene alvo – Ct controle endógeno)
Com o objetivo de avaliar a variação da expressão em função do uso da estatina foi
utilizado o parâmetro Ct que foi calculado para cada indivíduo em função da média do Ct
encontrada para o grupo no tempo T0, através da fórmula:
Ct = (Ct indivíduo – média Ct T0)
Os dados de Ct foram transformados em escala logarítmica (2-Ct) para comparar
dados de expressão entre os grupos estudados.
4.8 Análise Estatística
Os dados foram apresentados com média ± desvio-padrão. Foi utilizado o teste
estatístico de Kolmogorov-Smirnov para verificar o grau de adesão das variáveis quantitativas
à distribuição normal. Para verificar diferenças entre os sujeitos experimentais para as
variáveis antropométricas, bioquímicas, concentrações de selênio plasmático e eritrocitário foi
utilizado Teste t de Student pareado, na comparação dentre os tempos do tratamento (antes -
T0 e após - T1), nas variáveis paramétricas, e Teste de Wilcoxon para as variáveis não–
paramétricas. Também foi calculado o coeficiente de correlação r de Pearson. No estudo o
nível de significância adotado foi de 5%. Para realização das análises foi utilizado o programa
SPSS (Statistics Packet for Social Sciences) for Windows versão 16.0 (Chicago, Illinois –
EUA).
25
5. Resultados
Todas as variáveis métricas apresentaram distribuição normal no tempo inicial do
estudo (T0) (D(26) ≤ 0,89; p ≥ 0,405) e no tempo final (T1) (D(26) ≤ 0,513; p ≥ 0,955),
exceto a expressão do mRNA da selenoproteína P (D(26) = 1,55; p = 0,016).
Durante os quatro meses de acompanhamento nenhum paciente relatou qualquer efeito
adverso oriundo ao tratamento com a rosuvastatina, também não foram registradas
intercorrências clínicas, como internações, mesmo logo após a angioplastia.
5.1 Caracterização da Amostra
A amostra foi composta por 27 pacientes com aterosclerose, com idade média de
61,0±9,4 anos, sendo 59,3% homens e 40,7% mulheres. A maioria dos pacientes tinha história
de tabagismo e etilismo e afirmou ser hipertensa (81,5%) (Tabela 2).
TABELA 2: Características de estilo de vida dos pacientes com aterosclerose tratados com
rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
*Dados expressos em média ± desvio padrão (DP).
Todos os pacientes referiram usar medicamentos, dentre os principais estão os anti-
hipertensivos, como o Captopril (37,0%), Selozok 25 e 100mg (22,2%) e Enalapril (14,8%).
Os antiagregantes plaquetários foram representados principalmente pelo Plaketar®
(Ticlopidona) (33,3%) e Clopidogrel (Plagrel -18,5%; Lopgrel -14,8%; Plavix 7,4%), que
fazem parte da terapia adjunta da angioplastia. O Ácido Acetil Salicílico (AAS®) de 100mg
foi utilizado por 70,4% dos pacientes e as estatinas eram utilizadas por 44,4% dos pacientes,
na forma de sinvastatina (Sinvastatina e Sinvalip®) e atorvastatina (Lipitor
®), os quais foram
substituídos pela rosuvastatina (Crestor®), conforme delineamento do estudo.
26
5.2 Parâmetros Antropométricos
A maioria dos pacientes apresentou IMC e CA elevados, com 48,1% diagnosticados
com sobrepeso, nos dois períodos de avaliação. A prevalência de obesidade antes do
tratamento foi 22,2%, passando para 25,9% após o tratamento com a rosuvastatina, 77,7% dos
pacientes apresentaram CA acima do desejável no T0 e 63,0% no T1. Após os quatro meses
de tratamento foi observada redução estatisticamente significativa da circunferência
abdominal dos pacientes (Tabela 3 e Figuras 5 e 6).
TABELA 3 – Dados antropométricos dos pacientes com aterosclerose tratados com
rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
T0
(n=27)
T1
(n=27)
t26 p
Peso (kg) 68,3 ± 15,0 68,2 ± 14,7 0,231 0,819
IMC (kg/m2) 27,1 ± 4,5 27,1 ± 4,3 0,000 1,000
CA (cm) 97,9 ± 10,5 96,7 ± 10,7 2,148 0,041
Dados expressos em média ± desvio padrão (DP).
T0 – Pré-tratamento. T1 – Pós-tratamento. IMC – Índice de Massa Corporal. CA – Circunferência Abdominal.
Teste estatístico: Teste t de Student pareado.
27
* Número de pacientes.
T0 – Pré-tratamento. T1 – Pós-tratamento.
FIGURA 5 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de
acordo com o Índice de Massa Corporal (IMC), atendidos no Natal Hospital
Center.
0
10
20
30
40
50
Eutrófico Sobrepeso Obesidade Grau I
Obesidade Grau II
Obesidade Grau III
Fre
qu
en
cia
(%)
T0
T1
87
13 13
3
4
3 3
87
13 13
3
4
3 3
0 0
28
* Número de pacientes.
T0 – Pré-tratamento. T1 – Pós-tratamento.
FIGURA 6 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de
acordo com a Circunferência Abdominal (CA), atendidos no Natal Hospital
Center.
5.3 Análise da Dieta
De acordo com os valores médios os pacientes apresentaram um consumo de energia
inferior ao recomendado, atingindo 86,6%. No entanto a dieta estava adequada quanto a
ingestão de carboidratos e lipídeos, a de proteínas ficou pouco acima do recomendado. Os
pacientes também tiveram um consumo médio de ácidos graxos polinsaturados,
monoinsaturados, saturados e colesterol adequado. Os pacientes apresentaram baixa ingestão
de fibras (Tabela 4).
0
10
20
30
40
50
Sem risco Elevado Muito elevado
Fre
qu
en
cia
(%)
T0
T1
6
10
11
8
10
9
29
TABELA 4 –Ingestão de energia, macronutrientes e colesterol de pacientes com aterosclerose
tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
Parâmetros
Recomendaçãoa
Ingestão habitual
(n = 25) b
Calorias (kcal) 1741,01 1507,31 ± 410,01
Carboidratos (%) 50,0 a 60,0 57,6 ± 7,09
Proteínas (%) 12,5 a 17,5 18,7 ± 2,64
Lipídeos (%) 25,0 a 35,0 25,2 ± 5,21
A. G. Polinsaturados (%) ≤ 10,0 7,4 ± 1,42
A. G. Monoinsaturados (%) ≤ 20,0 7,5 ± 1,87
A. G. Saturados (%) ≤ 7,0 6,9 ± 1,28
Colesterol (mg) <200,0 191,8 ± 89,03
Fibras (g) 20,0 a 30,0 15,6 ± 3,87
Dados expressos em média ± desvio padrão (DP).
aSBC (2007).
bn=25, foram retiradas 2 pacientes por apresentarem ingestão energética inferior
500kcal (Willett, Howe e Kushi, 1997).
A Figura 7 apresenta a distribuição dos pacientes de acordo com a adequação de
consumo, onde foi observado que 80,0% dos pacientes estavam com um consumo energético
abaixo do recomendado. Já na avaliação dos macronutrientes, foi encontrado que 44,0%
apresentaram um consumo acima do recomendado para os carboidratos e 76,0% para
proteínas. Quanto ao consumo de lipídeos, a maior parte apresentou-se com consumo
adequado ou abaixo da recomendação (44,0% e 52,0%, respectivamente), o mesmo foi
observado no consumo de ácidos graxos polinsaturados (96,0%); todos os pacientes
apresentaram consumo de gordura monoinsaturada dentro da faixa de recomendação. Já o
consumo de ácidos graxos saturados 44,0% dos pacientes estava com consumo acima da
recomendação, semelhante ao que foi observado no consumo de colesterol, com 48,0% dos
pacientes com ingestão acima da recomendação. Quando foi avaliado o consumo de fibras,
observou-se que todos os pacientes apresentaram consumo abaixo do recomendado.
30
FIGURA 7 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, de
acordo com a adequação do consumo de calorias, macronutrientes e colesterol,
atendidos no Natal Hospital Center.
Observando a ingestão de selênio, ajustada pela variação intrapessoal e energia, foi
identificada uma prevalência de inadequação de 81,9% na população estudada (Figura 8A e
B), que corresponde a proporção de pacientes que estão com um consumo habitual de Se
abaixo da EAR recomendada. É importante observar que essa recomendação é para
indivíduos saudáveis, podendo ocorrer mudanças nas necessidades nutricionais de
micronutrientes em doenças crônicas, como a aterosclerose.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Freq
uên
cia
do
s Pa
cien
tes
(%)
Acima
Adequado
Abaixo
31
FIGURA 8 - Distribuição da ingestão de Se, bruta (A) e ajustado (B) dos pacientes com
aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
32
Na Tabela 5 são apresentados os alimentos que mais contribuíram para ingestão de
selênio no grupo estudado.
TABELA 5 – Alimentos fonte de selênio presentes nos R24h dos pacientes com aterosclerose
tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
33
5.4 Análises do Perfil Lipídico, Glicemia de jejum e Enzimas hepáticas
Como esperado, observou-se uma redução significativa dos valores de Colesterol
Total e LDL após o tratamento com a rosuvastatina. Também foi observada redução
significativa da Glicemia. Os pacientes não apresentaram alterações nas enzimas hepáticas
(Tabela 6 e Figura 9).
TABELA 6 – Parâmetros bioquímicos dos pacientes com aterosclerose tratados com
rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
T0
(n=27)
T1
(n=27)
t26 p
Glicose (mg/dL) 123,2 ± 55,6 111,8 ± 47,1 2,658 0,013
Colesterol Total (mg/dL) 186,9 ± 50,0 141,9 ± 37,7 5,146 < 0,001
LDL (mg/dL)1 115,9 ± 43,3 73,5 ± 29,7 5,173 < 0,001
HDL (mg/dL) 38,3 ± 9,8 40,2 ± 12,2 -1,312 0,201
Triacilgliceróis (mg/dL) 186,7 ± 140,8 139,1 ± 58,2 1,831 0,079
ALT (U/dL) 29,6 ± 20,6 28,1 ± 16,8 0,560 0,580
AST (U/dL) 23,8 ± 13,2 21,4 ± 6,8 1,188 0,246
Valores expressos como média ± DP.
Teste estatístico: Teste t de Student pareado.
1 n = 26 – 1 paciente do gênero masculino com dosagem de triacilgliceróis superior a 400mg/dL, inviabilizando
o cálculo da LDL.
T0: Pré-tratamento. T1: Pós-tratamento. HDL-c: Lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein);
LDL: Lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein); ALT: Alanina Aminotransferase; AST:
Aspartato Aminotransferase.
34
FIGURA 9 - Percentual de alterações do perfil lipídico dos pacientes com aterosclerose após
o tratamento com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
35
A Tabela 7 mostra a distribuição dos pacientes, de acordo com a glicemia e o perfil
lipídico, segundo a classificação dos valores de referência. Observa-se que, após a intervenção
com a rosuvastatina (tempo T1), os pacientes apresentaram um perfil lipídico mais
satisfatório, principalmente para o CT, LDL e TG, bem como melhora na normalização da
glicemia.
TABELA 7 – Distribuição dos pacientes com aterosclerose em uso de estatina, atendidos no
Natal Hospital Center, conforme a classificação dos valores de referência para
perfil lipídico e glicemia.
FONTE: SBC (2001).
a n = 26
T0 – Pré-tratamento. T1 – Pós-tratamento. HDL: Lipoproteína de alta densidade (High Density Lipoprotein);
LDL: Lipoproteína de baixa densidade (Low Density Lipoprotein).
36
5.5 Análises bioquímicas de Selênio e da atividade enzimática da Glutationa Peroxidase
Não foram observadas mudanças significativas nas concentrações de selênio no
plasma e nos eritrócitos após os quatro meses de tratamento com a rosuvastatina (Tabela 8).
As médias das concentrações de selênio plasmático e eritrocitário estão dentro dos pontos de
corte estabelecidos por Ortuño et al. (1997). Estratificando a amostra, observou-se que 40,7%
dos pacientes apresentaram concentração de selênio deficiente no plasma, nos tempos T0 e
T1. Em relação a deficiência do selênio nos eritrócitos houve uma variação de 22,2% a 25,9%
dentre os pacientes.
Foi encontrado um aumento significativo na atividade enzimática da GPx após os
quatro meses de tratamento com a rosuvastatina (Tabela 8). Durante os dois períodos de
avaliação, os valores encontrados estavam dentro da faixa de recomendação preconizada pelo
fabricante do kit (Kit Ransel, Laboratório Randox).
TABELA 8 – Concentrações de selênio do plasma e dos eritrócitos e atividade enzimática da
Glutationa Peroxidaes dos pacientes com aterosclerose tratados com
rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
T0
(n=27)
T1
(n=27)
t26 p
Selênio dos
eritrócitos (µg/L) 111,9 ± 31,6 119,0 ± 43,6
-1,067 0,296
Selênio do plasma
(µg/L) 63,2 ± 15,7 65,3 ± 15,7
-1,279 0,212
Glutationa Peroxidase
(U/ g Hb) 42,6 ± 12,8 48,0 ± 16,4
-2,452 0,021 Valores expressos como média ± DP.
T0 – Pré-tratamento. T1 – Pós-tratamento.
Teste estatístico: Teste t de Student pareado.
Valores de referência:
- Selênio (ORTUÑO et al., 1997):
Se plasmático: 60 - 120μg/L; Se eritrocitário: 90 - 190 μg/L
- Atividade enzimática GPx (Kit Ransel, Laboratório Randox): 27,5 – 73,6 U/g Hb
37
5.7 Análise da Expressão gênicas das Selenoproteínas
Na Tabela 9 e Figura 10 são apresentados os resultados da expressão gênica das
selenoproteínas estudadas. Após os 4 meses de tratamento com a rosuvastatina, os pacientes
apresentaram um aumento significativo na expressão gênica da selenoproteína GPx1 (t27 = -
0,24; p = 0,023) e SelN1 (t27 = -0,35; p = 0,002) (Figuras 9 e 10). A expressão gênica da
SelP1 foi similar entre os tempos de tratamento (Z = 1,12; p = 0,259).
TABELA 9 – Variação da expressão de mRNA dos genes GPX1, SEPN1 e SEPP1 dos
pacientes com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal
Hospital Center.
Valores expressos como média ± DP.
Teste estatístico: Teste t de Student pareado. a Teste estatístico: Wilcoxon
T0 – Pré-tratamento. T1 – Pós-tratamento.
Ct: CT indivíduo – média Ct grupoT0). GPX1-gene da Glutationa Peroxidase 1. SEPN1 – gene da
selenoproteína N 1. SEPP1 – gene da selenoproteína P 1.
Não foram observadas correlações significativas entre a expressão gênica das
selenoproteínas e a atividade enzimática da GPx, o selênio da dieta e as concentrações de
selênio no plasma e nos eritrócitos (r ≤ 0,342; p ≥ 0,094) (ANEXO D).
38
NOTA: T0 – Pré-tratamento. T1 – Pós-tratamento. Teste estatístico: a
Teste t de Student pareado;
b Teste Wilcoxon. Controle endógeno: gliceraldeído- 3-fosfato desidrogenase (GAPDH)
FIGURA 10 - Valores médios e intervalos de confiança (95%) das expressões relativas de
mRNA do GPX1(A), SEPN1 (B) e SEPP1 (C) de pacientes com aterosclerose
tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
a
b
c
39
6. Discussão
A maioria dos indivíduos apresentou alguns hábitos de vida que representavam fatores
de risco para o desenvolvimento da aterosclerose, como histórico de tabagismo e de consumir
bebidas alcoólicas (ARMAGANIJAN; BATLOUNI, 2000). No estudo de Alves et al. (2009),
com pacientes com doença aterosclerótica não coronariana, foi encontrada uma prevalência de
57,3% de ex-fumantes e de 15,6% de ex-etilistas, inferiores aos encontrados no presente
estudo.
É importante ressaltar que a maioria dos pacientes avaliados apresentavam sobrepeso e
obesidade, nos dois momentos de avaliação, além do elevado risco de complicações
metabólicas relacionados a obesidade, com base na circunferência abdominal. A alta
prevalência de sobrepeso e obesidade em indivíduos adultos e idosos vem sendo reportada em
diversos estudos como importantes fatores de risco para de desenvolvimento de doenças
cardiovasculares (SANTOS; SICHIERI, 2005; SARNO; MONTEIRO, 2007; SHISHEHBOR
et al., 2008).
A circunferência abdominal possui vantagem em relação às outras medidas
antropométricas pelo fato de não ser influenciada pela estatura. Essa medida expressa a
obesidade abdominal do paciente que é fortemente associada à resistência insulínica e à
síndrome metabólica (HOLANDA et al., 2006). No estudo IRAS, observou-se que o aumento
do perímetro abdominal foi a variável com maior poder de prever o desenvolvimento futuro
da síndrome metabólica (CIORLIA; GODOY, 2006).
Esses fatores de risco continuam preocupantes no Brasil. Um estudo recente foi
realizado com mais de 48 mil famílias, cujo principal objetivo era estudar a renda familiar, o
consumo de gêneros alimentícios e a composição corporal da população. Conforme este
último parâmetro avaliado, foram apresentadas as taxas de prevalência de obesidade do Brasil
e das capitais. Foi observada em Natal uma prevalência de 10,32% de indivíduos obesos, não
foi relatada a proporção de indivíduos com sobrepeso (LOBATO; COSTA; SICHIERI, 2009).
Com relação a avaliação do consumo alimentar foi observado que 80,0% dos pacientes
apresentaram consumo energético abaixo do recomendado. Na literatura são descritos casos
de sub-relato quando se trata de avaliação do consumo alimentar, tanto na quantidade de
porções quanto dos alimentos em geral (BRIEFEL et al., 1997). A dieta exerce papel
fundamental no tratamento de doenças cardiovasculares (HANKEY; LESLIE, 2001), a terapia
nutricional é reconhecida pela American Heart Association (AHA) e o National Cholesterol
Education Program (NCEP) como método de prevenção e tratamento da doença
40
cardiovascular (AHA, 1993; KRIS-ETHERTON, 2001; EXECUTIVE SUMARY OF...,
2001).
Sobre a contribuição dos macronutrientes no valor energético total (VET) da dieta, foi
observado que os pacientes apresentaram distribuição média de ingestão adequadas, quanto
aos carboidratos, apesar de alguns pacientes referirem o consumo de alimentos integrais
(principalmente a aveia em flocos), a maioria deles ingeriu grandes quantidades de alimentos
refinados (pães e biscoitos), o que contribuiu para a baixa ingestão de fibras. Sabe-se que as
principais fontes de selênio são também fontes de proteínas. Apesar do consumo médio desse
macronutriente ter sido maior que a recomendação, ainda não foi o suficiente para adequar a
ingestão de selênio, o que pode ser atribuído a não inclusão das fontes de selênio de maior
biodisponibilidade.
O desequilíbrio entre os tipos de gordura dietética pode levar a eventos
cardiovasculares, principalmente no que diz respeito ao elevado consumo de gordura saturada
e baixo consumo de gordura monoinsaturada (CLARKE et al., 2009). No nosso estudo os
pacientes apresentaram valores médios de ingestão de gordura mono, poli e saturada
adequados de acordo com a recomendação, porém esses resultados podem ser explicados por
mudanças recentes no hábito alimentar, devido a descoberta da doença e sua relação com os
lipídeos da dieta.
A prevalência de inadequação da ingestão de selênio foi semelhante ao encontrado no
estudo de Alissa et al. (2006), realizado com pacientes com doenças cardiovasculares.
Existem muitas dificuldades para avaliação do consumo alimentar de selênio, pois
existem variações das concentrações desse mineral nos solos de diferentes regiões do Brasil e
limitações de informações nutricionais em tabelas de composição de alimentos brasileiros.
Muitos dos valores de selênio empregados na avaliação do consumo alimentar são referentes a
alimentos oriundos de países com concentrações altas do mineral no solo ou com políticas de
fortificação de alimentos (COZZOLINO, 2007; COMBS, 2001; GONZÁLEZ et al., 2006). A
concentração de selênio em alguns gêneros alimentares consumidos pela população brasileira
já é conhecida, sendo considerados com maior teor do mineral as carnes (aves, peixes e carne
vermelha) e os feijões. Inclusive os feijões se destacaram como fontes predominantes na
população estudada (FERREIRA et al., 2002).
Estudos nacionais identificaram variações no consumo de selênio, o maior consumo
ocorreu em crianças da cidade de Macapá (AP) (107μg de Se/dia), seguido de adultos de
Manaus (AM) (98μg de Se/dia) devido ao consumo de castanha do Brasil. Crianças residentes
em São Paulo (SP) apresentaram concentrações médias diárias mais baixas (26,3μg de Se/dia)
41
(MAIHARA et al., 2004). Outro estudo que utilizou a castanha-do-brasil como
suplementação de selênio, apontou que o consumo do mineral pelos participantes antes da
intervenção era de 94,4 (±23,1)μg/dia (STRUNZ et al., 2008).
Nesse estudo, como esperado, o tratamento com a rosuvastatina (10mg/dia) durante
quatro meses resultou em redução do colesterol total, LDL e Triacilgliceróis, não modificando
o HDL, resultados estes semelhantes aos descritos em estudos anteriores (MOREIRA et al.,
2006; GÓMEZ-GARCÍA et al., 2007; TAKAYAMA et al., 2009). No estudo ASTEROID
(NISSEN et al., 2006), a redução de 53,2% nos valores de LDL foi semelhante aos nosso
resultados. Em estudos clínicos comparativos, a rosuvastatina, administrada em doses de 5 a
10 mg/dia, reduziu as taxas sangüíneas de LDL em níveis significativamente superiores aos
alcançados com estatinas convencionais, como atorvastatina (10 mg/dia), pravastatina (20
mg/dia) e sinvastatina (20 mg/dia). Ao lado dessa maior eficácia em relação à fração mais
aterogênica do colesterol, a rosuvastatina também apresentou efeitos benéficos sobre outros
parâmetros lipídicos, como diminuição dos triacilgliceróis e aumento de HDL (CHENG-LAI,
2003).
Houve uma redução significativa da glicemia que estava elevada tanto em T0 quanto
em T1, comportamento positivo, pois tem sido relatada relação entre a utilização da
rosuvastatina e elevação na glicemia, até mesmo com o desenvolvimento da resistência
insulínica (KOSTAPANOS et al., 2009). A hiperglicemia pode representar um fator de risco
importante para o desenvolvimento das doenças cardiovasculares atribuído ao excesso de
glicose gerando um efeito tóxico no endotélio vascular mediado pelo estresse oxidativo
(SIES; STAHL; SEVANIAN, 2005).
De acordo com Shchukin et al. (2008), o tratamento com rosuvastatina, em doses
moderadas (10mg/dia), diminui significantemente o estresse oxidativo e a atividade
inflamatória endógena, pela ativação do sistema antioxidante plasmático, o que pode explicar
o aumento da atividade enzimática da GPx durante o presente estudo. A GPx1 é considerada
uma das selenoproteínas mais sensíveis a variações nas concentrações de selênio plasmáticas
e eritrocitárias (SUNDE et al., 2008).
Nesse estudo, para determinar o estado nutricional relativo ao selênio, além da
ingestão do mineral foram analisadas as concentrações no plasma e eritrócitos dos pacientes.
Existem diversos fatores que influenciam as concentrações séricas de selênio, como a idade,
gênero, presença de tabagismo e etilismo, além da dieta, considerada o fator mais influente
(VIEGASRESPO et al., 2000; GALAN et al., 2005; STRANGES et al., 2010).
42
Os pacientes apresentaram concentrações de selênio no plasma e nos eritrócitos dentro
dos pontos de corte estabelecidos, sem alterações após o tratamento com a rosuvastatina, o
que corrobora com outros estudos (GHAYOUR-MOBARHAN et al., 2005; LEONHARDT et
al., 1997). No entanto, esses autores investigaram outras estatinas (sinvastatina, atorvastatina
e fluvastatina). Resultados sobre o efeito da rosuvastatina nas concentrações de selênio no
plasma e eritrócitos em estudos semelhantes ao nosso ainda não são conhecidos. A
concentração de selênio no plasma é um marcador da exposição atual, enquanto a dos
eritrócitos reflete o estado nutricional a longo prazo, devido a sua incorporação na síntese dos
eritrócitos, que tem uma meia-vida de 120 dias (NAVARRO-ALARCON; CABRERA-
VIQUE, 2008). A inadequação na ingestão de selênio na dieta não refletiu sobre os
parâmetros sanguíneos desse mineral.
Na meta-análise publicada por Flores-Mateo et al. (2006), a variação de selênio no
plasma foi na faixa de 52,5 e 106,8 μg L. Em outro estudo com população dinamarquesa as
concentrações foram bem homogêneas, entre 94,4 e 98,7 μg L (RASMUSSEN et al., 2009).
No estudo de Strunz et al. (2008) foi observado uma concentração de 56 (±9) μg L. Como se
observa, os valores encontrados para a maioria dos estudos são consistentes com estado
nutricional adequado do mineral.
Segundo Arnaud et al. (2009), existe a hipótese de que a reposta do selênio plasmático
no tratamento com estatinas pode atingir um platô e então ser regulado pelas alterações nas
concentrações de LDL. A elevação desse mineral no plasma está associado a redução nas
partículas de LDL, lipoproteína mais susceptível a oxidação. Essa relação pode reforçar o
papel antioxidante desse mineral a importância do selênio no sistema antioxidante.
A biossíntese do colesterol é uma das funções da via do mevalonato. Essa via é
também essencial para a síntese das diversas isoprenóides como isopentenil pirofosfato (IPP)
(GRUNLER; ERICSSON; DALLNER, 1994), que é um substrato para formação das
selenoproteínas (MOOSMANN; BEHL, 2004a), uma vez bloqueada esta via a partir da
atuação das estatinas consequentemente espera-se uma redução na síntese do IPP.
Dessa forma, poderia se esperar que os pacientes tratados com a rosuvastatina
apresentassem uma redução da expressão gênica dessas selenoproteínas, porém foi observado
um aumento na expressão dos genes das selenoproteínas GPx1 e SelN, o que não corroborou
com os achados de Kromer e Moosmann (2009), que observaram uma redução na expressão
gênica da GPx1 após tratamento com diferentes estatinas (atorvastatina, cerivastatina e
lovastatina), no entanto, com doses e tempo de tratamento diferentes deste estudo. Evidências
sugerem que ocorre uma redução na síntese das selenoproteínas em situações de estresse
43
oxidativo, como um meio de preservar os recursos celulares (HOLCIK; SONENBERG,
2005), porém a GPx1 é a selenoproteína que se recupera mais rapidamente (PAPP et al.,
2007).
A solubilidade das estatinas tem sido estudada como um fator importante no
desenvolvimento dos efeitos colaterais no tecido muscular. Estudos in vivo (NAKAHARA et
al., 1998; REIJNEVELD et al., 1996) e in vitro (MASTERS et al., 1995; GADBUT;
CARUSO; GALPER, 1995) demonstraram que as estatinas hidrofílicas, como a rosuvastatina
e pravastatina possuem menores efeitos no tecido muscular quando comparadas a estatinas
lipofílicas, como a lovastatina e sinvastatina. Todavia, não se pode inferir a relação entre o
tratamento com a rosuvastatina e as miopatias, já que não houve relato de efeitos colaterais
em nosso estudo.
O aumento da expressão do gene da selenoproteína N pode estar relacionado ao fato
desta ser, preferencialmente, expressa na proliferação de células e durante formação de
tecidos (PETIT et al., 2003), porém não há relatos dessa expressão aumentada em pacientes
com aterosclerose. Também não foram relatados efeitos musculares em decorrência do
tratamento, o que está associado a dose de administração do medicamento e ao tempo de
tratamento, que pode variar de uma semana a quatro meses após o início do tratamento com
estatinas (PASTERNAK et al., 2002).
Em nosso estudo o tratamento com a rosuvastatina não alterou a expressão do SEPP1.
A expressão gênica observada está condizente com as concentrações de selênio plasmático e
eritrocitário, encontradas no estudo, uma vez que uma das funções da SelP1 é o
armazenamento e transporte de selênio (BURK; HILL, 2009). Alguns estudos sugerem que a
expressão do mRNA da selenoproteína P se encontra aumentada em doenças inflamatórias
(MOSTERT et al., 2001). A ausência de alteração da expressão dessa selenoproteína em
nosso estudo pode estar relacionada ao efeito anti-inflamatório atribuído a rosuvastatina
(KINLAY, 2005).
A via de bissíntese do colesterol, bloqueada pelas estatinas, parece não ser a única via
que interfere na síntese das selenoproteínas, pois mesmo com o tratamento com a
rosuvastatina não foi observada redução da expressão gênica das selenoproteínas GPx1,
SelN1 e SelP1. Dessa forma, se fazem necessários mais estudos que elucidem esses
mecanismos de síntese das selenoproteínas frente ao tratamento com a rosuvastatina.
44
7. Conclusões
1. Os pacientes apresentaram uma melhora do estado nutricional avaliado pela
antropometria, principalmente com relação a circunferência abdominal;
2. O consumo de energia foi abaixo das necessidades, embora com distribuição
percentual adequada dos macronutrientes. Com relação ao aspecto qualitativo das
gorduras, observou-se um perfil satisfatório quanto aos ácidos graxos poliinsaturados e
monoinsaturados; e do contrário, proporções críticos de elevado consumo de ácido graxos
saturados e colesterol. A fibra foi o nutriente com total inadequação. O consumo de
selênio apresentou alta prevalência de inadequação;
3. Após tratamento com rosuvastatina foi observado que:
3.1. O colesterol total, LDL e glicemia diminuíram significativamente;
3.2. As concentrações de selênio no plasma e nos eritrócitos não apresentaram
alterações, mantendo-se na faixa de valores considerados normais;
3.3. A atividade enzimática da GPx aumentou significativamente;
3.4. Houve aumento da expressão do mRNA do GPX1 e do SEPN1, enquanto que a
expressão gênica do SEPP1 não sofreu alteração;
4. Diante dessas constatações, especula-se que via de biossíntese do colesterol,
bloqueada pelas estatinas, parece não ser a única via que interfere na síntese das
selenoproteínas, pois mesmo com o tratamento com a rosuvastatina não foi observada
redução da expressão gênica das selenoproteínas GPx1, SelN1 e SelP1. Dessa forma, se
fazem necessários mais estudos que elucidem esses mecanismos de síntese das
selenoproteínas frente ao tratamento com a rosuvastatina.
45
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59
ANEXOS
60
ANEXO A - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes
(HUOL) - Adendo.
61
62
ANEXO B - Recomendações dietéticas para o tratamento das hipercolesterolemias.
63
Anexo B - Recomendações dietéticas para o tratamento das hipercolesterolemias.
Nutrientes Ingestão recomendada
Gordura total
Ácidos graxos saturados
Ácidos graxos polinsaturados
Ácidos graxos monoinsaturados
Carboidratos
Proteínas
Colesterol
Fibras
Calorias
25 a 35% das calorias totais
≤ 7% das calorias totais
≤ 10% das calorias totais
≤ 20% das calorias totais
50 a 60% das calorias totais
Cerca de 15% das calorias totais
<200 mg/dia
20 a 30 g/dia
Ajustado ao peso desejável FONTE: SBC (2007).
64
ANEXO C - Valores de referência do Perfil lipídico, Glicemia, ALT e AST.
65
Anexo C - Valores de referência do Perfil lipídico para indivíduos >20 anos de idade
Lípides Valores Categoria
CT (mg/dL)
LDL (mg/dL)
HDL (mg/dL)
TG (mg/dL)
<200
200-239
≥ 240
< 100
100-129
130-159
160-189
≥ 190
< 40
>60
< 150
150-200
201-499
≥ 500
Ótimo
Limítrofe
Alto
Ótimo
Desejável
Limítrofe
Alto
Muito alto
Baixo
Alto
Ótimo
Limítrofe
Alto
Muito alto
FONTE: SBC (2001).
CT: Colesterol total; HDL: Lipoproteína de alta densidade; LDL: Lipoproteína de baixa densidade; TG:
Triacilgliceróis.
Anexo C - Valores de referência para Glicemia, ALT e AST.
Valores
Glicemia (mg/dL)
ALT (U/dL)
AST (U/dL)
70 - 99
7-52
13-39
FONTE: Laboratório Olympus®.
ALT: Alanina Aminotransferase; AST: Aspartato Aminotransferase.
66
ANEXO D - Correlação das expressões dos genes GPX1, SEPN1 e SEPP1, dos pacientes
com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
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Anexo D - Correlação das expressões dos genes GPX1, SEPN1 e SEPP1, dos pacientes
com aterosclerose tratados com rosuvastatina, atendidos no Natal Hospital Center.
Teste estatístico: r de Pearson. a Teste estatístico: rho de Spearman
T0 – Pré-tratamento. T1 – Pós-tratamento.
GPx – enzima glutationa peroxidase. GPX1-gene da Glutationa Peroxidase 1. SEPN1 – gene da
selenoproteína N 1. SEPP1 – gene da selenoproteína P 1.