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AVALIAÇÃO DA IMUNOEXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DA VIA DE SINALIZAÇÃO WNT
CANÔNICA E NÃO CANÔNICA NO ADENOCARCINOMA GÁSTRICO
PROGRAMA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA PIBIC DO IAMSPE
ACADÊMICO: PEDRO AUGUSTO SOFFNER CARDOSOORIENTADOR: PROF. DR. JAQUES WAISBERG
INTRODUÇÃO – EPIDEMIOLOGIA
• 3° CA sexo masculino • 5° CA sexo feminino• Idade entre 50-70 anos
• 14° CA mais comum • 5° CA em incidência• 3° CA em mortalidade
• INCA 2016 Estimativas 2016. Incidências do câncer no Brasil [data base on the internet]. 2016• GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide
INTRODUÇÃO – ALTERAÇÕES GENÉTICAS
1. Alterações no genoma
2. Alterações pós-transcricionais
3. Alterações nas vias de sinalização
INTRODUÇÃO –VIA DE SINALIZAÇÃO WNT
• White B et al., 2012•Lyas M et al., 2005
• Funções da via canônica
• Regulação e produção de proteínas
• Migração e diferenciação celular
• Embriogênese
• Alteração na via de sinalização
• Câncer
• Canônica: participação da betacatenina
• Não canônica: FZD e Wnt-5a
INTRODUÇÃO
• Proteína WNT
• Sinalizadores transmembrana
• Mutações e metilações relacionadas ao câncer gástrico
• Wnt 1, 2, 3 e 5
•Habas R et al., 2006• Nojima M et al., 2007
INTRODUÇÃO
• FZD
Proteínas transmembrana
Receptor sinalização Wnt
Ativado estimula a agregação com axina evitando a degradação da betacatenina
• Ciclina D1
Gene CND1
Reguladora ciclo celular
Mutações e hiperexpressões relacionadas ao câncer
• Kinoshita T et al., 2011• Qu Y et al., 2013
INTRODUÇÃO
• Axina
Gene Axin 1
Complexo destruição da betacatenina
• CK1
Reguladora da transdução celular
Fosforilação da betacatenina
• Lyas M et al., 2005
INTRODUÇÃO
• Myc
Regulador da cascata da via Wnt
Mutações relacionadas ao câncer
• Ubiquitina
Marca proteínas para serem degradadas no proteossoma
• Ko A et al., 2012
INTRODUÇÃO
• Desregulação da via Wnt
• Mutações no gene APC no câncer
gástrico: diminui sua função
• Mutações do gene da betacatenina
• Impede que ela seja fosforilada
• Outros mecanismos carcinogênese
gástrica
• Hiperexpressão do FZD
• Hipoexpressão de fatores inibitórios
• Todos esses mecanismos aumentam a betacatenina no citoplasma e no núcleo celular
•White B et al., 2012 •Ayed et al., 2014
OBJETIVOS
• Avaliar a expressão de proteínas da via de sinalização celular Wntcanônica e não canônica no tecido neoplásico de doentes operados deadenocarcinoma gástrico
• Relacionar o nível de expressão das proteínas e sua localização na célulacom as características biodemográficas dos doentes e com as característicasmorfológicas e histopatológicas do tumor
MÉTODOS
• Estudo retrospectivo e comparativo
• Amostra• 72 doentes operados por adenocarcinoma gástrico no Serviço de
Cirurgia do Aparelho Digestivo da FMABC no período de janeiro 2007 a dezembro 2010
MÉTODOS
• Critérios de inclusão • Maiores de 18 anos
• Ambos os sexos
• Diagnóstico de adenocarcinoma gástrico
• Não submetidos à neoadjuvância
• Critério de exclusão• Tecidos no bloco de parafina inadequados para confecção do tissue
microarray (TMA)
MÉTODO - CONSTRUÇÃO DO TISSUE MICROARRAY (TMA)
• Realizada no Laboratório de Patologia da FMUSP
• Blocos de parafina com tecido de adenocarcinoma gástrico
• Pequenos fragmentos cilíndricos de tecido tumoral a partir do bloco original
• Bloco de parafina único contendo fragmentos de tecido tumoral de todos os doentes
MÉTODO – CLASSIFICAÇÃO
Intensidade da reação Extensão da Área Positiva de Imunocoloração
0 pontos NEGATIVA < 10%
1 ponto FRACA 11-25%
2 pontos MODERADA 26-50%
3 pontos FORTE >50%
MÉTODO
• Imunoexpressão
• Intensidade da reação X extensão da coloração
• Resultados em escore de 0 a 9 pontos
Positivo – escore ≥ 4 pontos
Negativo – escore < 4 pontos
MÉTODO – VARIÁVEIS ESTUDADAS
• Características biodemográficas da amostra (idade e sexo)
• Características macroscópicas da lesão neoplásica ( localização e diâmetro)
• Características histopatológicas (TNM, classificação de Lauren, presença de invasão vascular
venosa, linfática e/ou perineural)
• Expressão tecidual das proteínas Wnt-5a, FZD5, GSK3B, axina, CK1, ubiquitina, ciclina D1 e
myc no tecido de adenocarcinoma gástrico
RESULTADOS - AXINA
• Expressão citoplasmática positiva se relacionou com tumores moderadamente e bem diferenciados e com os tumores do tipo intestinal da classificação de Lauren (p=0,05)
Tabela 14 - Razão de chances para a associação entre o nível de imunoexpressão positiva da axina no citoplasma e as variáveis biodemográficas dos
doentes e morfológicas e anatomopatológicas do tumor
Positivo (N) Negativo (N)OR p
Grau de diferenciaçãoModerado / Bem diferenciado 35 0
0,05*Pouco / Indiferenciado 26 31
T
0+1+2 17 11,89
0,86
3 37 22,06
0,57
4 9 1 1
Metástase linfonodalAusente 22 0
0,15Presente (1/2/3) 41 4 1
Classificação de LaurenIntestinal 45 1 7,5
0,05*Difuso 18 3 1
RESULTADOS – CK1
• A expressão positiva no citoplasma das células foi significante nos tumores com margens cirúrgicas livres de comprometimento (p=0,031)
Tabela 16 - Nível de expressão citoplasmática da proteína CK1 nos tecidos de adenocarcinoma gástrico associada aos dados
biodemográficos dos doentes e morfológicos e anatomopatológicos do tumor
Negativo Positivo p
N (%) N (%)
Margem comprometida
Ausente 6 (10,2) 53 (89,8)
0,031*
Presente 3 (50,0) 3 (50,0)
Classificação de Lauren
Intestinal 4 (8,9) 41 (91,1)
0,142Difuso 5 (22,7) 17 (77,3)
RESULTADOS - UBIQUITINA
• A proteína ubiquitina apresentou expressão forte em tumores moderadamente e bem diferenciados (p=0,037) e nos tumores do tipo intestinal (p=0,031)
•
Tabela 18 - Expressão citoplasmática da proteína ubiquitina nos tecidos de adenocarcinoma gástrico e os dados biodemográficos
dos doentes e morfológicos e anatomopatológicos do tumor
Negativo N (%) Positivo N (%) p
SexoMasculino 2 (4,7) 41 (95,3)
0,341Feminino 3 (12,5) 21 (87,5)
Idade≤ 50 anos 3 (42,9) 4 (57,1)
0,07> 50 anos 2 (3,3) 58 (96,7)
Grau de diferenciaçãoModerado / Bem diferenciado 0 (0) 35 (100)
0,037*
Pouco / Indiferenciado 4 (13,8) 25 (86,02)
T
0+1+2 1 (5,6) 17 (94,4)
13 3 (7,7) 36 (92,3)
4 1 (10) 9 (90)
Metástase linfonodalAusente 1 (4,5) 21 (95,5)
1Presente(1/2 /3) 4 (8,9) 41(91,1)
Classificação de LaurenIntestinal 1 (2,2) 45 (97,8)
0,031*Difuso 4 (19) 14 (81)
RESULTADOS – CICLINA D1
• A proteína ciclina D1 foi expressa apenas no núcleo e significantemente mais intensa nos tumores dos doentes masculinos (p=0,039)
Tabela 22 - Expressão nuclear da proteína ciclina D1 nos tecidos de adenocarcinoma gástrico associada aos dados biodemográficos dos
doentes e morfológicos e anatomopatológicos do tumor
Negativo N(%) Positivo N(%)p
SexoMasculino 15 (35,7) 27 (64,3)
0,03*Feminino 14 (63,6) 8 (36,4)
Idade≤ 50 anos 3 (50,0) 3 (50,0)
1> 50 anos 26(44,8) 32 (55,2)
LocalizaçãoDistal 9 (39,1) 14 (60,9)
0,602Proximal 20 (48,8) 21 (51,2)
Diâmetro (cm)≤ 5 13 (46,4) 15 (53,6)
0,8045 15 (42,9) 20 (57,1)
Margem comprometidaAusente 26 (45,6) 31 (54,4)
1Presente 2 (40,0) 3 (60,0)
RESULTADOS - MYC
• Expressão significantemente maior nos tumores do tipo intestinal (p=0,028) e com razão de chances com significância (p=0,021).
Tabela 24 - Expressão citoplasmática da proteína c-myc nos tecidos de adenocarcinoma gástrico e os dados biodemográficos dos doentes e morfológicos e anatomopatológicos
do tumor
Negativo N(%) Positivo N(%) p
SexoMasculino 2 (74,4) 1 (25,6)
1Feminino 18 (78,3) 5 (21,7)
Idade≤ 50 anos 5 (83,3) 1 (16,7)
1> 50 anos 45 (75) 15 (25)
Metástase linfonodalAusente 14 (6,9) 9 (39,1)
0,068Presente (1,2,3) 36 (86,7) 7 (16,3)
Classificação de LaurenIntestinal 31 (67,4) 15 (32,6)
0,03*Difuso 19 (95) 1 (5)
RESULTADOS – WNT-5a E FZD-5
• As imunoexpressões das proteínas Wnt-5a e Frizzled-5 não apresentaram diferenças significantes (p≤ 0,05) em relação às características epidemiológicas dos doentes e anatomopatológicas do tumor
CONCLUSÕES
1. A forte expressão das proteínas da via de sinalização celular canônica Wntsugere a sua importância e o seu envolvimento na carcinogênese doadenocarcinoma gástrico
2. Houve relação da expressão positiva das proteínas da via de sinalizaçãocelular canônica Wnt com as variáveis biodemográficas dos doentes eanatomopatológicas do tumor.
3. A fraca expressão das proteínas da via de sinalização celular nãocanônica Wnt e a ausência de relação da expressão positiva com as variáveisbiodemográficas dos doentes e anatomopatológicas do tumor sugerem queessa via pode ter uma baixa participação na carcinigênese gástrica.