auswirkungen von minor histokompatibilitätsantigen
TRANSCRIPT
Aus dem Institut für Transfusionsmedizin der Universität Ulm
(Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Hubert Schrezenmeier)
Auswirkungen von Minor
Histokompatibilitätsantigen Mismatchen auf
die unverwandte, allogene hämatopoetische
Stammzelltransplantation
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der medizinischen Fakultät Ulm
der
Universität Ulm
vorgelegt von
Kirsten Recker
geboren in Eupen
2012
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth
1. Berichterstatter: Prof. Dr. Hubert Schrezenmeier
2. Berichterstatter: Prof. Dr. Donald Bunjes
Tag der Promotion: 11. Januar 2013
I
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS .................................................................................................. I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .................................................................................... III
1. EINLEITUNG .................................................................................................................. 1
1.1 Das HLA-System ........................................................................................................... 1
1.2 Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ........................... 5
1.3 Minor Histokompatibilitätsantigene .......................................................................... 15
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit ............................................................................................ 31
2. MATERIAL UND METHODEN ................................................................................. 32
2.1 Material ........................................................................................................................ 32
2.2 Methoden ...................................................................................................................... 38
3. RESULTATE ................................................................................................................. 53
3.1 Validierung des Testkits .............................................................................................. 53
3.2 Allel- und Genotypverteilung der untersuchten mHag ........................................... 54
3.3 Verteilung der HLA-Merkmale in der untersuchten Kohorte ................................ 59
3.4 Bestimmung der Einflussfaktoren und Zielgrößen für die Subgruppenanalyse ... 60
3.5 Quantitative Ergebnisse des Gesamtkollektivs ......................................................... 62
3.6 Statistische Auswertung der Einflussfaktoren .......................................................... 63
3.7 Statistische Auswertung der mHag ............................................................................ 68
4. DISKUSSION ................................................................................................................ 90
II
4.1 Validierung des Testverfahrens ................................................................................. 91
4.2 Etablierte Risikofaktoren einer Stammzelltransplantation und deren
Auswirkungen auf die klinischen Endpunkte nach allogener, unverwandter HSCT . 92
4.3 Einfluss der untersuchten mHag auf die klinischen Endpunkte nach allogener,
unverwandter HSCT ......................................................................................................... 99
4.4 Statistische Auswertung und Interpretation der Ergebnisse ................................ 107
4.5 Auswirkungen von mHag-Mismatchen auf die allogene HSCT: Stand der
Forschung und Ausblick ................................................................................................. 109
5. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................. 115
6. LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................... 117
Danksagung ...................................................................................................................... 137
Lebenslauf ........................................................................................................................ 138
III
Abkürzungsverzeichnis
AGIHO Arbeitsgemeinschaft Infektionen in der Hämatologie und Onkologie
aGvHD akute Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (engl.: acute Graft-versus-
host-disease)
ALL akute lymphatische Leukämie
Allo-HSCT allogene hämatopoetische Stamzelltransplantation (engl.: allogeneic
hematopoietic stem cell transplantation)
AML akute myeloische Leukämie
AP akzelerierte Phase (engl.: accelerated phase); Stadium einer chronischen
Leukämie
APC Antigenpräsentierende Zelle (engl.: antigenpresenting cell)
Aqua dest. destilliertes Wasser
AS Aminosäure
ATG Antithymozytenglobulin
B-ALL akute lymphoblastische Leukämie, ausgelöst durch B-Zellen
BC Blastenkrise (engl.: blast crisis); Stadium einer chronischen Leukämie
BCL2A1-Gen Gen, welches für das B-Cell Lymphoma 2 related protein A1 kodiert
B-CLL chronisch lymphatische Leukämie, ausglöst durch B-Zellen
BEAM BiCNU (Carmustine), Etoposid, Arabinosid (Cytarabin), Melphalan;
Hochdosischemotherapieschema
BMDW weltweites Register für Stammzellspender (engl: Bone Marrow Donors
Worldwide)
bp Basenpaare (engl.: base pairs)
C Cystein (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
C2, C4a und b Komplementfaktoren 2, 4a und 4b
CD immunphänotypische Oberflächenmerkmale von Zellen, meistens
Glykoproteine, die eine Einteilung von Zellen in bestimmte Gruppen
zulassen (engl.: Cluster of differentiation); die Merkmale werden je nach
Gruppe nummeriert, z.B. CD3, CD4, CD8, CD22, CD34
CDL Ligand für Zelloberflächenmoleküle vom CD-Typ, z.B. CD40L, CD62L
CD19+-B-Zelle B-Zelle, auf deren Oberfläche CD19 exprimiert wird
CD8+-T-Zelle T-Zelle, die auf ihrer Oberfläche den Marker CD8 exprimiert
IV
Cen Zentromer (engl.: Centromer)
cGvHD chronische Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (engl.: chronic graft-
versus-host disease)
cGy CentiGray; Einheit für pro Masse absorbierte Strahlungsenergie
CI Konfidenzintervall; 95%CI: geschätzter Bereich in dem 95% aller
möglichen Werte des untersuchten Parameters liegen
CIBMTR internationale Forschungseinrichtung für Stammzell- und
Knochenmarktransplantation (engl: Center for International Blood and
Marrow Transplant Research)
CLL chronisch lymphatische Leukämie
CML chronisch myeloische Leukämie
CMV Zytomegalievirus (engl.: cytomegalovirus)
CP chronische Phase (engl.: chronic phase); Stadium einer chronischen
Leukämie; 1CP: erste chronische Phase, 2CP: zweite chronische Phase
usw.
CR komplette Remission (engl.: complete remission); 1CR: erste komplette
Remission, 2CR: zweite komplette Remission usw.
CRP C-reaktives Protein
CsA Cyclosporin A
CTL zytotoxische T-Lymphozyten (engl.: cytotoxic T- lymphocytes)
CTS gemeinsame Transplantationsstudie (engl.: Collaborative Transplant
Study); Internationale Studie im Bereich Transplantation
Cy Cyclophosphamid
D Asparaginsäure (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
dbSNP Datenbank für Punktmutationen (siehe auch: SNP), engl.: database SNP;
allgemeinzugängliche Datenbank, in der jede einfache genetische
Mutation gesammelt und mit einer charakteristischen Bezeichnung
versehen wird
Df Freiheitsgrad (engl.: degree of freedom), Zahl der frei wählbaren,
voneinander unabhängigen Parameter eines Systems beim statistischen
Test
DFS krankheitsfreies Überleben (engl.: disease free survival)
dl Deziliter
DLI Donorlymphozyteninfusionen
V
DNA Desoxyribonukleinsäure (engl.: desoxyribonucleic acid)
dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat
DRST Deutsches Register für Stammzelltransplantationen
EBMT europäische Gesellschaft für Blut- und Knochenmarktransplantation
(engl.: European Group for Blood and Marrow Transplantation)
EBV Eppstein-Barr-Virus
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (engl.: ethylenediaminetetraacetic acid)
ER endoplasmatisches Retikulum
evtl. eventuell
F Phenylalanin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
Flu/Melph Fludarabin und Melphalan
Flu/Cy Fludarabin undCyclophosphamid
G Glycin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
GIT Gastrointestinaltrakt
GlyCAM-1 glykosilierungsabhängiges Zelladhäsionsmolekül 1(engl.: glycosylation-
dependent cell adhesion molecule 1), Ligand für CD62L/LECAM-
1/SELL
GNU project GNU’s Not Unix projekt, Projekt zur Entwicklung eines vollständig
freien Betriebssystems (GNU)
GvH Transplantat-gegen-Wirt (engl.: graft-versus-host)
GvHD Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (engl.: graft-versus-host-disease)
GvL Transplantat-gegen-Leukämie (engl.: graft-versus-Leukemia)
GvT Transplantat-gegen-Tumor (engl.: graft-versus-Tumor)
H Histidin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
HHV-6 humanes Herpesvirus 6
HL Hodgkin-Lymphom
HLA humanes Leukozytenantigen
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl.: high performance
liquid chromatography)
HR Risikoquotient (engl.: hazard ratio); gibt das Verhältnis der jeweiligen
Risiko des Auftretens eines Ereignisses zwischen zwei betrachteten
Gruppen
HSC hämatopoetische Stammzelle (engl.: hematopoietic stem cell)
VI
HSCT hämatopoetische Stammzelltransplantation (engl.: hematopoietic stem
cell transplantation)
HSP-70 Hitzeschockprotein 70
HSV Herpes simplex Virus
HvG Wirt-gegen-Transplantat (engl.: host-versus-graft)
HWE Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (engl.: Hardy-Weinberg-Equilibrium)
IFN-γ Interferon gamma
iPN idiopathische Pneumonie
ITIM inhibitorische, immunrezeptorähnliche tyrosinbasierte Motive (engl.:
immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs)
IUB internationale Union der Biochemie (engl.: International Union of
Biochemistry)
IUPAC internationale Union der reinen und angewandten Chemie (engl.:
International Union of Pure and Applied Chemistry)
KIR Killerzell-Immunoglobulinähnlicher Rezeptor (engl.: killer cell
immunoglobuline-like receptor); immunglobulinähnlicher Rezeptor, der
auf natürlichen Killerzellen exprimiert wird
KM Knochenmark
KMT Knochenmarktransplantation
KOF Körperoberfläche
l Liter
L Leucin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
Lbc Oncogen lymphoides Blastenkrisenonkogen (engl.: lymphoid blast crisis oncogen)
LECAM-1 Leukozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (engl.: leucocyte
endothelial cell adhesion molecule 1); Membranglykoprotein, welches
als Zelladhäsionsmolekül dient (syn.: CD62L, L-Selectin oder SELL)
LMP1 und 2 latentes Membranprotein 1 und 2 (engl.: latent membrane proteine 1 and
2); zytoplasmatische Peptidpumpe
M Methionin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
MAC myeloablative Konditionierung (engl.: myeloablative conditioning
regimen)
MadCAM-1 mukosales vaskuläres Addressin Zelladhäsionsmolekül-1 (engl.: mucosal
vascular addressin cell adhesion molecule-1); Ligand für
CD62L/LECAM-1/SELL
VII
MAGE-3 Melanomassoziiertes Antigen-3 (engl.: melanoma-associated antigen 3)
MDA multiple Dislokationsamplifizierung (engl.: Multiple displacement
amplification); Art der ganzgenomischen Vervielfältigung
MDS myelodysplastisches Syndrom
MESNA 2-Mercaptoethansulfonat-Natrium
mg Milligramm
mHag Minor Histokompatibilitätsantigen (engl.: minor histocompatibility
antigen)
MHC Majorhistokompatibilitätskomplex (engl.: major histocompatibility
complex)
min Minuten
ml Milliliter
l Mikroliter
MM Mismatch
MMF Mycophenolatmofetil
MTX Methotrexat
MUD Fremdspender (engl.: matched unrelated donor)
MYO1G Myosin 1 Gen; Gen für das unkonventionelle Myosin der Klasse I
N Asparagin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
ng Nanogramm
NHL Non-Hodgkin-Lymphom
NK-Zellen natürliche Killerzellen
NRM Tod, der nicht durch einen Krankheitsrückfall / -progress verursacht
wurde (engl.: Non relapse mortality), ist in dieser Arbeit TRM
gleichgesetzt
OS Gesamtüberleben (engl.: overall survival)
P Prolin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
P antigenes Peptid (Kapitel 1.1.3, Abbildung 3)
PANE 1 Proliferationsassoziiertes nukleares Element 1 (engl.: proliferation
associated nuclear element 1); auch Bezeichnung für das gleichnamige
mHag
PASW Predictive Analysis Software; zwischenzeitliche Bezeichnung für SPSS
zwischen 2009 und 2010 (siehe auch SPSS)
Pat. Patient(en)
VIII
PBSZ periphere Blutstammzellen
PCR Polymerasekettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction)
PCR-SSP Polymerasekettenreaktion mit sequenzspezifischen Primern
PCR-SSO Polymerasekettenreaktion mit sequenzspezifischen Oligonukleotiden
PECAM-1 Thrombozyten-Endothelzell-Adhäsionsmolekül-1 (engl.: platelet
endothelial cell adhesion molecule 1); Membranglykoprotein, welches
als Zelladhäsionsmolekül dient (syn.: CD31)
Pers. Person
Phi29 (φ29) Phage phi29 des Bacillus subtilis
Pos Position
Post-tx nach Transplantation
p-Wert Signifikanzwert (engl.: p für probability); Kennzahl zur Auswertung
statistischer Tests
R Arginin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
Rel Krankheitsrückfall (engl.: relapse), rel1: erster relapse, >1rel:
nächstfolgender relapse
RFLP Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (engl.: restriction fragment
length polymorphism); Genotypisierungsverfahren mit allelspezifischen
Restriktionsendonukleasen
RIC reduzierte Konditionierung (engl.: reduced intensity conditioning
regimen)
RSCA Referenzstrangkonformationsanalyse (engl.: reference strand
conformational analysis); Genotypisierungsverfahren mit Hilfe natürlich
vorkommender Bezugsallele
S Serin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
SAA schwere aplastische Anämie
SCID angeborener schwerer kombinierter Immundefekt (engl.: severe
combined immunodeficiency); charakterisiert durch Mangel oder
Fehlfunktion von T-Zellen
sec Sekunde
SELL Selectin L (engl.: selectin L); siehe LECAM-1
SNP Punktmutation (engl.: single nucleotid polymorphism); einzelner
Basenaustausch auf DNA-Ebene
IX
SPSS Statistical Package for the Social Sciences, Statistikanalysesoftware von
IBM
T Threonin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
TAP1 und 2 Transporter der Antigenprozessierung 1 und 2 (engl.: transporter of
antigen processing); zytoplasmatische Peptidpumpe
Taq Thermus aquaticus
TBI Ganzkörperbestrahlung (engl.: total body irradiation), low dose TBI:
niedrigdosierte Ganzkörperbestrahlung
TBI/Cy Ganzkörperbestrahlung (engl.: total body irradiation) und
Cyclophosphamid
TCR T-Zell-Rezeptor (engl.: T-cell receptor)
Tel Telomer
TH1 T-Helferzellen Subpopulation 1
TNF- α und –β Tumornekrosefaktor-α und Tumornekrosefaktor–β
TRM Tod durch transplantationsbedingte Komplikationen (engl.: Transplant
related mortality), ist in dieser Arbeit NRM gleichgesetzt
Tx Transplantation
UGT2B17 Uridindiphosphat-Glycosyltransferase-Gen 2B17 (auch Bezeichnung für
das gleichnamige mHag)
US Vereinigte Staaten von Amerika (engl.: United States of America)
UV ultraviolett
V Valin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
VOD Venookklusive Lebererkrankung (engl.: veno-occlusive disease of liver)
VZV Varizella-Zoster-Virus
χ2 Prüfgröße des Chi-Quadrat-Anpassungstests zur Prüfung der Verteilung
von Daten
Y Tyrosin (offizieller Einbuchstabencode nach IUPAC-IUB)
ZAP 70 Zetakette-assoziierte Proteinkinase 70 (engl. Zeta-chain-associated
protein kinase 70); zum T-Zell-Rezeptor zugehöriges Protein, welches
eine Rolle bei der Signalübertragung spielt
1
1. Einleitung
Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ist für maligne
Erkrankungen des hämatopoetischen Systems die meist einzig kurative Therapie. Für die
heutzutage über 50.000 transplantierten Patienten jährlich (Gratwohl et al, 2010) stehen
weltweit über 18 Millionen Fremdspender in Spenderregistern (BMDW, 03. April 2012)
zur Verfügung. Der Erfolg einer HSCT ist jedoch durch eine hohe Komplikationsrate
limitiert (siehe hierzu Kapitel 1.2, Abschnitt 3). Trotz großer Fortschritte durch
Entwicklung neuer, individueller Behandlungsschemata, Verbesserung der
Konditionierungsregimes, Entwicklung neuer, besser verträglicherer Immunsuppressiva
und Antibiotikaprophylaxen sterben immer noch zwischen 30% und 40% der allogen
transplantierten Patienten innerhalb des ersten Jahres nach ihrer Transplantation (Pasquini
and Wang, 2011). Hauptsächlich sind hierfür ein früher Rückfall der Grunderkrankung und
transplantationsbedingte Komplikationen verantwortlich. Eine weitere große Rolle spielen
immunogen vermittelte Reaktionen wie die Graft-versus-Host (GvH)-Reaktion, bei der
immunkompetente Spender-T-Zellen gesundes Gewebe des Patienten angreifen. Die
Hauptursache der GvH liegt in Gewebsantigendifferenzen zwischen Patient und Spender.
Das hierfür verantwortliche Gensystem, für das man schon vor über 70 Jahren Hinweise
gefunden hat (Gorer, 1936) und das heutzutage bei allen untersuchten Säugetieren
gefunden wurde (Götze, 1977), bezeichnet man generell als
„Haupthistokompatibilitätskomplex“ (engl: major histocompatibility complex, MHC) und
speziell bei Menschen als „HLA-System“ (humanes Leukozytenantigensystem).
1.1 Das HLA-System
1.1.1 Entdeckung, Rolle und Genetik des HLA-Systems
Die Entdeckung des HLA-Systems durch Professor Dausset im Jahre 1958 (Dausset, 1958)
resultierte aus Untersuchungen zur Gewebetransplantation. Transplantiert man Gewebe
von einem Individuum auf ein genetisch nicht identisches Individuum derselben Spezies,
wird das Transplantat als immunologisch fremd erkannt und zerstört. Die Ausprägung
2
dieser immunologischen Abstoßungsreaktion hängt im Wesentlichen davon ab, inwieweit
sich Spender und Empfänger in ihren Transplantationsantigenen unterscheiden. So wird
dem HLA-System eine zentrale Rolle in der „Selbst“- und „Fremd“-Erkennung
zugesprochen, und dies sowohl bei der Prägung des Immunsystems als auch im Rahmen
der spezifischen zellulären Immunantwort als Antigen-präsentierendes Molekül, das nach
intrazellulärer Prozessierung fremde (allogene) wie auch körpereigene (autologe)
Proteinantigene exprimiert. Darauf gründet sich nun die zentrale Bedeutung des HLA-
Systems für die Übertragung von Zellen, Geweben und Organen.
Die Gene des HLA-Komplexes sind auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 lokalisiert
(6p21.1-6p21.3) und umfassen in etwa den Bereich von 3500 Kilobasenpaaren. Innerhalb
dieses Bereiches werden drei verschiedene Regionen unterschieden: Auf der telomernahen
Seite des Komplexes liegt die Region der HLA-Klasse I-Gene (HLA-A bis F), daran
schließt sich zentromerwärts die historisch als Klasse III bezeichnete Region an. In diesen
Bereich gehören außer z. B. den Komplementfaktoren C2, Faktor B, C4a und b unter
anderem auch die Gene für den Tumornekrosefaktor (TNF-α und β) und das
Hitzeschockprotein (HSP-70). Somit stellt Klasse III einen heterogenen Bereich dar, der
Gene enthält, die weder HLA-Klasse I noch Klasse II zugerechnet werden können.
Auf der dem Zentromer zugewandten Seite des Komplexes liegt der HLA-Klasse II-Genort
(HLA-DP bis DR), der zusätzlich auch Gene für die intrazelluläre Antigenprozessierung
und den Transport prozessierter Antigene (TAP1/TAP2 und LMP1/LMP2) enthält (siehe
hierzu Abbildung 1).
Abbildung 1: Genetische Organisation des HLA-Systems; Tel: Telomer, Cen: Zentromer
(Quelle: Mehra and Kaur, 2003)
3
1.1.2 Struktur und Funktion der HLA-Antigene
HLA-Klasse I- und II-Moleküle unterscheiden sich durch ihren unterschiedlichen
molekularen Aufbau, ihre Expression in unterschiedlichen Geweben sowie
unterschiedlichen Antigenpräsentationswegen und den damit verbundenen
unterschiedlichen Funktionen voneinander (siehe hierzu Abbildung 2).
Abbildung 2: Struktur der HLA-Klasse I- und II-Moleküle, CD: cluster of differentiation
(Membranproteine), N: aminoterminales Ende, α1 bis α3: α-Kette, β2m: β2-Mikroglobulin,
β1 und β2: β-Kette (Quelle:Waßmuth, 2005a)
HLA-Klasse I-Moleküle bestehen aus einer schweren, membranverankerten α-Kette mit
drei Domänen (α1 bis α3), die mit einer leichten β-Kette (β2-Mikroglobulin) nicht kovalent
verknüpft ist (Nakamuro et al, 1973; siehe hierzu auch Abbildung 2). Das β2-
Mikroglobulin-Molekül kartiert auf Chromosom 15q22 und weist keine Polymorphismen
auf (Cunningham and Berggård, 1974). HLA-Klasse I-Moleküle werden auf fast allen
kernhaltigen Zellen exprimiert.
Dagegen werden HLA-Klasse II-Moleküle bevorzugt auf antigenpräsentierenden Zellen,
wie B-Lymphozyten, aktivierten T-Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten oder
dendritischen Zellen exprimiert (Shackelford et al, 1982). Sie setzen sich aus einer
schweren α- und einer leichten β-Kette mit den Domänen α1 und α2 bzw. β1 und β2
zusammen (siehe hierzu Abbildung 2). Beide nicht kovalent miteinander verbundenen
Ketten sind membranverankert (Snary et al, 1977).
4
Die hochpolymorphe Antigenbindungsstelle, die beim HLA-Klasse I-Molekül durch die
α1- und α2-Domänen gebildet wird, stellt hierbei den funktionell wichtigsten Teil des HLA-
Moleküls dar. Kristallographische Analysen haben gezeigt, dass HLA-Moleküle an dieser
dem T-Zell-Rezeptor (TCR) zugewandten Seite eine Vertiefung ausbilden, die sogenannte
Antigenbindungsfurche (Bjorkman et al, 1987a und 1987b), die es vermag, Peptide bis zu
einer Länge von 11 Aminosäuren (AS) aufzunehmen. Außerdem existieren im Bereich der
Antigenbindungsstelle sogenannte Taschen, welche die Seitenketten der AS der antigenen
Peptide aufnehmen können. Typischerweise besitzt ein HLA-Klasse I-Molekül sechs mit A
bis F bezeichnete Taschen. Wenn die Aminosäureseitenketten mit den jeweiligen Taschen
zusammenpassen, wird die Antigenbindung stabilisiert. Die Bindungsmöglichkeit der
Peptide ist daher durch eine HLA-abhängige Aminosäurebevorzugung, besonders an den
Positionen P2 und P9, limitiert. Diese Positionen werden daher auch als Ankerpositionen
bezeichnet.
Anhand dieser durch die Ankerpositionen gegebenen Peptid-Bindungsspezifitäten kann
man einen Großteil aller humanen HLA-A und –B- Moleküle in HLA-Supertypen einteilen
(Sidney et al, 1996): den HLA-A3-Supertyp mit A*03:01, A*11:01, A*31:01, A*33:01,
A*34:01, A*66:01, A*68:01 und A*74:01, den HLA-B7-Supertyp mit B*07:02-05,
B*35:01-03, B*51:01-05, B*53:01, B*54:01, B*55:01-02, B*56:01, B*67:01 und B*78:01
sowie schließlich den HLA-B44-Supertyp mit den Allelen B*37, B*40(60), B*40(61),
B*41, B*44, B*45, B*47, B*49 und B*50.
1.1.3 Die HLA-abhängige Antigenpräsentation
Die eigentliche Antigenerkennung erfolgt durch den Komplex aus HLA-Molekül,
prozessiertem Antigen, welches an das HLA-Molekül gebunden ist, und dem T-Zell-
Rezeptor (TCR).
Der auf die Antigenerkennung spezialisierte TCR kann das ihm dargebotene antigene
Peptid nur im Zusammenhang mit einem HLA-Molekül erkennen, was als MHC (oder
HLA) –Restriktion bezeichnet wird (Zinkernagel and Doherty, 1974). Gleichzeitig können
T-Lymphozyten durch den TCR nicht nur das präsentierte Antigen, sondern auch zwischen
„eigenen“ oder „fremden“ HLA-Molekülen unterscheiden (Garcia et al, 1998). Der HLA-
TCR-Komplex wird ergänzt durch auf den T-Lymphozyten liegende Glykoproteine und
die Oberflächenmarker CD4 bzw. CD8: CD4-positive Lymphozyten (z. B. die klassichen
TH1-Helferzellen) erkennen gebundene Peptide im Komplex mit HLA-Klasse II–
5
Molekülen. CD8-positive, zytotoxische Lymphozyten (CTL’s) hingegen erkennen die
antigenen Peptide nur im Zusammenhang mit HLA-Klasse I–Molekülen (Allison and
Lanier, 1987), siehe hierzu Abbildung 3.
Abbildung 3: Interaktion von HLA-Klasse I-und II-Molekülen mit dem TCR (HLA-TCR-
Komplex), P: antigenes Peptid ; TCR: T-Zell-Rezeptor, α1 bis α3: α-Ketten, β2-m: β-
Mikroglobulin,β1 und β2: β-Kette, CD4-CD8: Oberflächenmarker der T-Zellen (Quelle:
Waßmuth, 2005b)
Peptide, die von HLA-Klasse I-Molekülen präsentiert werden, entstammen größtenteils
von intrazellulären, zumeist zytoplasmatischen oder nukleären Proteinen, die innerhalb der
Zelle synthetisiert wurden. HLA-Klasse II-Moleküle dagegen präsentieren Peptide, die
durch Degradation im Phagolysosom entstanden sind; diese können sowohl exogener wie
auch endogener Herkunft sein.
1.2 Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT)
Die erste Transplantation allogener hämatopoetischer Stammzellen nach Hochdosis-
Chemotherapie bei einem Patienten mit maligner hämatologischer Erkrankung wurde 1957
6
durch (Thomas et al, 1957) durchgeführt. Mit der Entdeckung des HLA-Komplexes ein
Jahr später wurde eine geeignete Auswahl von Spendern, die in ihren HLA-Antigenen
weitgehend mit den HLA-Antigenen des Empfängers übereinstimmen („Matching“),
möglich. Die Anzahl Transplantierter steigt bis zur heutigen Zeit durch Verbesserung der
medizinischen Bedingungen an.
1.2.1 Indikationen für eine allogene HSCT
Eine HSCT ist bei vielen malignen hämotologischen Erkrankungen sowie auch bei einigen
gutartigen Störungen der Hämatopoese angezeigt.
Etablierte Indikationen für eine HSCT unter den malignen Erkrankungen sind akute
Leukämien (akute myeloische Leukämie - AML - und akute lymphatische Leukämie -
ALL). Bei einer akuten Hochrisikoleukämie ist eine allogene HSCT sogar schon in der
ersten kompletten Remission (1CR) indiziert, da eine Transplantation in fortgeschrittenen
Krankheitsstadien zusätzlich zum Risiko des Krankheitsrückfalls (Relapse) auch das
Risiko für transplantationsbedingte Komplikationen (Aschan, 2006) erhöht.
Auch für die chronisch myeloische Leukämie (CML) ist eine HSCT trotz der Einführung
der Tyrosinkinaseinhibitoren wie Imatinib (Glivec) bis heute die einzig kurative Therapie.
Meistens werden jedoch jüngere Patienten mit niedrigerer vorhersagbarer
transplantationsbedingter Mortalität (TRM/NRM) oder Patienten nach Versagen der First-
Line-Therapie mit Imatinib transplantiert. Besonders letzteres Kriterium verschiebt die
Patienten, die für eine Transplantation in Frage kommen, in die Gruppe derer mit
fortgeschrittener, resistenter oder genetisch komplexer Erkrankung.
Die einzige Therapie mit kurativem Potential bleibt die HSCT auch für das
myelodysplastische Syndrom (MDS). Abhängig vom Krankheitsstatus vor HSCT können
zwischen 30% und 70% der Patienten auf lange Dauer geheilt werden (Bartenstein and
Deeg, 2010). Dabei sind die Transplantationserfolge bei Patienten in weniger
fortgeschrittenen Stadien, jüngeren Patienten, sowie früh Transplantierten höher als bei
Patienten mit weit fortgeschrittenen Stadien (Appelbaum, 2003).
Auch bei jüngeren, ausgewählten Patienten mit multiplem Myelom/Plasmozytom ist eine
allogene Stammzelltransplantation möglich (Costa et al, 2009), sollte aber nur im Rahmen
von klinischen Studien angewendet werden, da sie nicht unbedingt Vorteile zur autologen
HSCT - dem bisherigen Gold-Standard - bietet (Kuruvilla et al, 2007).
7
Der Großteil (85%) der Patienten mit Hodgkin-Lymphomen (HL) und 40-50% der
Patienten mit hochmalignen Non-Hodgkin-Lymphomen (NHL) können nach klassischer
Chemotherapie lange Zeit überleben (Hart and Peggs, 2007). Eine allogene Transplantation
ist Patienten vorbehalten, die nach autologer HSCT (Gold-Standard für primär refraktäre
oder zurückkehrende Lymphome) einen erneuten Rückfall erleiden.
Bei den bisher unheilbaren niedrigmalignen Non-Hodgkin-Lymphomen verspricht eine
Transplantation nach reduzierter Konditionierungstherapie (RIC) durch eine niedrige
TRM/NRM (11% in 3 Jahren), gutes progressionsfreies Überleben und gutes Ansprechen
auf Donorlymphozyteninfusionen (DLI) bisher sehr viel, Ergebnisse zu
Langzeitergebnissen stehen aber noch aus (Morris et al, 2004). So werden Patienten mit
chronisch lymphatischer Leukämie (CLL), die zu den niedrigmalignen B-Zell-NHL gehört,
nur bei vorhandenen Hochrisiko-Indikatoren wie Chemotherapeutikaresistenz (besonders
Purinanaloga), ZAP 70 Expression oder Deletionen (17p13 oder 11q23) transplantiert.
Zu den durch HSCT heilbaren, nicht malignen Erkrankungen des hämatopoetischen
Systems zählen neben der schweren, aplastischen Anämie (SAA) auch verschiedene
Hämoglobinopathien (z. B. homozygote Form der β-Thalassämie) sowie angeborene
Immundefekte (z. B. SCID, Osteopetrose).
1.2.2 Vorbereitungen zur allogenen HSCT
1.2.2.1 Spenderauswahlkriterien
Die wichtigste Rolle für eine erfolgreiche Stammzelltransplantation spielt die
immunologische Gewebekompatibilität zwischen dem Patienten und seinem Spender.
Der immunologisch ideale Spender ist somit ein eineiiger Zwilling. Eine Allo-HSCT
zwischen eineiigen Zwillingen (syngene Transplantation) ist jedoch mit einer erhöhten
Rückfallrate verbunden (Horowitz et al, 1990), was die Vermutung, dass ein genetisch
komplett identer Spender auch der beste wäre, fraglich erscheinen lässt. Eine angestrebte
Transplantation ist die mit einem komplett HLA-identen Geschwister, da bei einer solchen
Konstellation mit hoher Wahrscheinlichkeit neben den HLA-Merkmalen auch andere
(bisher nicht regelmäßig untersuchte) Gewebsmerkmale, die auf dem gleichen Chromosom
vererbt werden, identisch wären. Bisher werden für ca. 30% aller Patienten HLA-idente
Geschwisterspender gefunden, da jedoch in vielen Ländern der westlichen Welt die
Geburtenrate zurück geht, sinkt diese Wahrscheinlichkeit. Dies und auch die Tatsache,
8
dass spezifische HLA-Kombinationen nur in bestimmten ethnischen Gruppen vorkommen,
unterstreicht die Wichtigkeit von Fremdspenderregistern, die weltweit versuchen,
möglichst viele Spender zu typisieren und aufzunehmen.
Wünschenswert ist ein sogenanntes 10/10 Match, d. h. ein in beiden Allelen eines jeden
HLA-Locus (HLA-A, B, C, DR und DQ) übereinstimmender Spender. Mit der Anzahl der
HLA-Mismatche steigt das Risiko für Abstoßung und GvHD (Petersdorf and Malkki,
2005). Dank der heutzutage existierenden genaueren, molekulargenetischen
Gewebetypisierungsmethoden und folglich besserem Matchinggrad sind die Ergebnisse
nach unverwandter HSCT mittlerweile fast genauso gut, wie nach HSCT mit HLA-identen
Familienspendern (Ringdén et al, 2004). Sind mehrere in den HLA-Merkmalen komplett
mit dem Patienten übereinstimmende Spender vorhanden, gibt es zusätzliche Kriterien zur
Auswahl.
Da bei einer Transplantation mit weiblichen Stammzellen ein erhöhtes GvHD-Risiko
besteht, sollte für einen männlichen Patienten möglichst kein weiblicher Spender gewählt
werden (Ottinger et al, 2005). Auch das Spenderalter zeigt Effekte auf das
Gesamtüberleben nach HSCT: Somit überleben Patienten mit jüngeren Spendern (18-30
Jahre) signifikant besser und haben eine niedrigere GvHD-Inzidenz (Kollman et al, 2001).
Genauso wie für die HLA-Merkmale wird für den CMV(Zytomegalievirus)-Status ein
Matching angestrebt um Neu- oder Reinfektionen im Stadium der Neutropenie zu
verhindern. CMV-seronegative Patienten sollten möglichst mit CMV-seronegativen
Spendern transplantiert werden, CMV-seropositive Patienten mit CMV-seropositiven
Spendern (Ljungmann et al, 2003; Boeckh et al, 2004). Eine Blutgruppenübereinstimmung
zwischen Spender und Patient ist zwar nicht so wichtig wie in der Organtransplantation,
eine Nichtübereinstimmung kann jedoch zu einem verzögerten Engraftment führen (Eapen
and Rocha, 2008).
1.2.2.2 Stammzellquelle
Vom Zeitpunkt der ersten HSCT bis weit in die 1990er Jahre war Knochenmark (KM) die
einzig nennenswerte Quelle für hämatopoetische Stammzellen. Seitdem aber haben
periphere Blutstammzellen (PBSZ) das Knochenmark als Hauptstammzellquelle besonders
bei erwachsenen Patienten immer mehr verdrängt: Zwischen 2000 und 2004 betrug der
Anteil von KM an Transplantaten noch über 35%, zwischen 2005 und 2009 nur noch unter
20% (Pasquini and Wang, 2011).
9
Die Gründe hierfür sind vielfältig. Neben der weitaus einfacheren Entnahme enthalten
PBSZ eine höhere Anzahl kernhaltiger Zellen, darunter CD34- und CD3-positive Zellen
genauso wie NK-Zellen, was zu einer schnelleren Neutrophilen- und
Thrombozytenrekonstitution führt. Trotz der höheren Zellzahl (besonders von
Immunzellen) ist die Inzidenz für aGvHD nicht höher als bei einer HSCT mit KM (Oehler
et al, 2005; Körbling and Anderlini, 2001). Besonders Patienten mit fortgeschrittener
Leukämie scheinen durchaus von PBSZ zu profitieren (Bensinger and Storb, 2001). Ein
Nachteil von PBSZ ist jedoch die deutlich höhere Inzidenz von chronischer GvHD
(cGvHD) als bei Nutzung von KM, weswegen bei Patienten mit gutartigen Erkrankungen,
die folglich auch nicht von einem parallel zur cGvHD auftretenden GvL-Effekt profitieren,
PBSZ meistens nicht eingesetzt werden (Bensinger and Storb, 2001).
Eine weitere, relativ neue Stammzellquelle stellt das Nabelschnurblut dar, welches in
speziellen Nabelschnurblutbanken gelagert wird. Es bietet eine Reihe von Vorteilen, wie
u.a. bessere Verträglichkeit und schnelle Verfügbarkeit durch Kryokonservierung, wird
jedoch häufig wegen der begrenzten Menge eher für Transplantationen im Kindesalter
verwendet.
1.2.2.3 Konditionierung
Die myeloablative Konditionierung (MAC) ist darauf ausgelegt, die maligne Erkrankung
maximal zu beseitigen und das Immunsystem des Patienten komplett zu zerstören, um das
Risiko einer Transplantatabstoßung zu minimieren und gleichzeitig Platz für das neue
Immunsystem des Spenders zu schaffen. Durch die schweren, beeinträchtigenden
Nebenwirkungen als Folge der Toxizität der Substanzen ist die Anwendung einer
myeloablativen Konditionierung auf jüngere Patienten beschränkt, die sich üblicherweise
in einem besseren Allgemeinzustand befinden und keine weiteren Begleiterkrankungen
haben.
Um auch älteren Patienten (z. B. MDS-Patienten), Patienten mit ernsthaften
Begleiterkrankungen sowie Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen den Zugang zu
einer HSCT zu öffnen, wurde eine Konditionierung mit reduzierter Intensität (RIC)
entwickelt. Durch die niedrigere Dosierung von Chemo- und Bestrahlungstherapie weist
die RIC eine verminderte Behandlungssterblichkeit (Transplant related mortality – TRM
oder non relapse mortality – NRM) auf. Die RIC macht durch ihre vorwiegende
Ausrichtung auf Immunsuppression die Koexistenz von hämatopoetischen Stammzellen
10
(HSC) des Spenders und des Empfängers möglich (mixed chimerism). In der Mehrzahl der
Fälle eliminieren die Spenderabwehrzellen die Resthämatopoese und damit auch die
verbleibenden Tumorzellen des Patienten. Dieser sogenannte graft-versus-tumor (GvT)
oder graft-versus-leukemia (GvL)-Effekt führt zu einem vollen Spenderchimärismus. Ein
Eckpfeiler der RIC ist die weiterführende Immunsupression nach HSCT um das
Engraftment nicht zu gefährden. 1998 repräsentierte die RIC noch 1% aller
Konditionierungen vor allogener Transplantation, 2003/2004 war ihr Anteil schon auf 31%
angestiegen (Gratwohl et al, 2006). Dazu beigetragen hat vor allem die Beschreibung des
GvT-Effektes (Kolb et al, 1995; Feinstein and Storb, 2001). Doch hat auch die RIC
negative Effekte zur Folge, wie eine erhöhte Gefahr des Transplantatversagens und ein auf
lange Sicht erhöhtes Rückfallrisiko. Diese treten besonders bei schnell fortschreitenden
Erkrankungen mit geringem Ansprechen auf GvT-Maßnahmen (ALL, AML, hochmalignes
NHL) auf, so dass hier oft auf myeloablative Konditionierung zurückgegriffen wird (Alyea
et al, 2006). Gerade auch Patienten, die nicht in Remission transplantiert werden, können
durch RIC seltener geheilt werden (Shimoni et al, 2006); siehe hierzu auch Abbildung 4.
Abbildung 4: Die Balance zwischen der Konditionierungsintensität und
transplantationsbedingten Nebenwirkungen (TRM/NRM); TBI/Cy: Ganzkörperbestrahlung
und Cyclophosphamid, BEAM: Carmustin, Etoposid, Cytarabin und Melphalan,
Flu/Melph: Fludarabin und Melphalan, Flu/Cy: Fludarabin und Cyclophosphamid, low
dose TBI: niedrigdosierte Ganzkörperbestrahlung, DLI: Donorlymphozyteninfusion, ATG:
Antithymozytenglobulin (Quelle: Hart and Peggs, 2007)
11
1.2.3 Komplikationen nach allogener HSCT
1.2.3.1 Transplantationsbedingte Komplikationen (Transplant related mortality -
TRM/ Non relapse mortality - NRM)
a) Toxizität der Konditionierung
Die Toxizität der Konditionierungsbehandlung ist substanz- und dosisabhängig. Übelkeit
und Erbrechen sowie milde Hautausschläge sind unmittelbare Folgen jeder
Chemoradiotherapie. Eine orale Mukositis entwickelt sich meistens innerhalb des 5. bis 7.
Tages post-tx. Nach zwei Wochen haben die meisten Patienten eine komplette Alopezie
entwickelt und sind panzytopen. Selten entwickeln Patienten auch schwerwiegende
substanzabhängige Nebenwirkungen, die entweder durch eine spezielle Prophylaxe
verhindert werden können (z. B. akute hämorrhagische Zystitis – Gabe von MESNA,
venooklusive Erkrankunge der Leber – Ursodeoxycholsäure (Bearman, 1995)) oder für die
es bisher noch keine Therapie gibt (z. B. idiopathische interstitielle Pneumonie) (Crawford
et al, 1993); siehe auch hierzu Abbildung 5.
Die Konditionierungsbehandlung hinterlässt auch Spätnebenwirkungen; so sind
Wachstumsverzögerungen bei Kindern, Azoospermie bei Männern und Ovarialinsuffizienz
bei Frauen sowie generelle endokrinologische Störungen nicht selten gesehen.
b) Graftversagen
Nach Konditionierung und erfolgter allogener HSCT kommt es innerhalb von 12 bis 16
Tagen zu einem Engraftment, d. h. zu einem stabilen Wert der neutrophilen Granulozyten
von > 1,0 x 109/l. Bei Non-Engraftment unterscheidet man primäres Graftversagen, d. h. es
erfolgt gar kein initialer Anstieg der Granulozyten, von sekundärem Graftversagen, bei
dem nach bereits erfolgtem Engraftment die Granulozyten wieder auf Werte < 0,5 x 109/l
abfallen. Insgesamt ist das Graftversagen eine seltene Komplikation (<5% aller HSCT),
wobei HLA-Inkompatibilitäten zwischen Patient und Spender, ein T-Zell depletiertes
Transplantat, zu niedrig dosierte Konditionierungsbehandlung, zu hohe Immunsuppression
oder therapierefraktäre Erkrankung zum Zeitpunkt der HSCT die wichtigsten Ursachen
darstellen.
12
c) Infektionen
Infektionen stellen den Hauptteil der TRM/NRM dar, weshalb wir auf dieses Thema hier
detaillierter eingehen werden (siehe auch hierzu Abbildung 5). Nach HSCT bestimmt das
Stadium der Grunderkrankung, die Form der Vorbehandlung (MAC – RIC) und vor allem
die gewählte Transplantationsmodalität (allogen – autolog, Grad der Übereinstimmung in
den HLA-Merkmalen, T-Zell-Depletion) das Infektionsrisiko (Einsele et al, 2001).
Abbildung 5: Häufigste Komplikationen einer HSCT (y-Achse) und deren typische
Auftretenszeitpunkte in Tagen nach HSCT (x-Achse),
VOD: Venoocclusive disease of liver; HSV: Herpes simplex virus; CMV:
Cytomegalovirus; VZV: Varizella Zoster Virus, GvHD: graft-versus-host-disease (Quelle:
Appelbaum, 2003)
Fast alle Patienten entwickeln innerhalb der ersten drei Wochen nach HSCT eine
fieberhafte Neutropenie, welche hauptsächlich für die Empfindlichkeit gegenüber
Infektionen in dieser frühen Posttransplantationsphase verantwortlich ist. Da bakterielle
13
und Pilzinfektionen in der neutropenen Phase häufig lebensbedrohlich verlaufen, werden
diese Patienten in den meisten Tx-Zentren routinemäßig mit einer Antibiotika- und
Antimykotikaprophylaxe abgedeckt, so dass das Risiko, an einer Infektion zu versterben,
in der frühen neutropenen Phase auf etwa 5% gesunken ist. Nach dem Engraftment bleibt
ein schwerer kombinierter quantitativer und funktioneller B-und T-Zell-Defekt bestehen,
der bei HLA-Inkompatibilitäten zwischen Spender und Empfänger deutlich protrahiert
verläuft. Daraus resultiert eine Störung der T-Helferzellfunktion sowohl für die Synthese
von Immunglobulinen als auch für die Differenzierung und Proliferation zytotoxischer T-
Effektorzellen. Neben seltener werdenden, aber mit gleicher Mortalität behafteten
Bakteriämien (bei 14% aller Patienten nach Engraftment), werden die Infektionen in der
mittleren Posttransplantationsphase (Engraftment bis Tag 100 post-tx) meist durch Viren
(Adenoviren, VZV, EBV, HHV-6 usw.) verursacht. Die bedrohlichste, da eine der
Hauptursachen für infektionsassoziierte Mortalität nach HSCT, ist die CMV-Infektion. Die
häufigsten Gründe hierfür sind Virusreaktivierungen bei seropositiven Patienten oder die
Transmission von einem seropositiven Donor auf einen seronegativen Patienten.
Infektionen in der späten Posttransplantationsphase werden vor allem durch die
Anwesenheit einer cGvHD begünstigt. Dabei sind auch hier insgesamt die Infektionsraten
besonders bei Patienten mit einem unverwandten oder nicht 10/10 HLA-gematchten
Spender erhöht (Einsele et al, 2001).
1.2.3.2 Graft-versus-host-disease
Eine GvHD tritt auf, wenn immunkompetente, allogene T-Zellen, die entweder mit dem
Transplantat übertragen werden oder neu aus den transplantierten Spender-HSC’s
entstehen, Gewebe oder Organe des Patienten angreifen (Ferrara and Deeg, 1991). Die
Graft-versus-host-disease ist als eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität nach
HSCT eine ernst zu nehmende Komplikation (Nash et al, 1992; Horowitz et al, 1990) und
wird grundsätzlich nach Erscheinungszeitpunkt in zwei Formen eingeteilt: die akute Form
(aGvHD) tritt innerhalb der ersten drei Monate (90 Tage) nach Tx auf; die chronische
Form (cGvHD) tritt später auf, kann jedoch auch aus einer aGvHD entstehen. Die beiden
Formen unterscheiden sich, zusätzlich zu ihrem unterschiedlichen zeitlichen Auftreten,
auch durch verschiedene klinische Manifestationsformen und pathophysiologische
Vorgänge (Via and Finkelman, 1993). Die Stärke der aGvHD wird nach der Glucksberg-
14
Skala in die Schweregrade 0 – IV eingeteilt, wobei Grad II bis IV als klinisch relevante
GvHD bezeichnet werden (Glucksberg et al, 1974; siehe hierzu auch Tabelle 1).
Tabelle 1: Glucksberg-Kriterien zur klinischen Einteilung der akuten GvHD bei
Erwachsenen; KOF: Körperoberfläche
Grad der aGvHD Ausmaß der Organbeteiligung
Haut Leber Darm
I
Makulopapulöses
Erythem der Haut,
<50% der KOF
Keine Beteiligung Keine Beteiligung
II Generalisierte
Erythrodermie Bilirubin 2-3mg/dl
Durchfall 500-1000ml/Tag
oder anhaltende Übelkeit
mit oder ohne Erbrechen
III Generalisierte
Erythrodermie
Bilirubin >3mg/dl
<15mg/dl
Durchfall >1000ml/Tag
(blutig) oder Krämpfe oder
Ileus
IV
Generalisierte
Erythrodermie mit
Blasenbildung und
Schuppung
Bilirubin >15mg/dl
Gleichzeitiges Auftreten
zweier Symptome aus dem
dritten Stadium
Abhängig von Stammzellquelle, Transplantationsart und HLA-Kompatibilität zwischen
Spender und Empfänger zeigt die Inzidenz moderater bis schwerer (Grad II bis IV) aGvHD
eine große Schwankungsbreite (Nash et al, 1992). Genauso schwankt auch die Mortalität
der aGvHD, je nach Schweregrad, zwischen 10% und 75% (siehe hierzu Tabelle 2).
Tabelle 2: Inzidenz von aGvHD und relative Überlebenshäufigkeit bei 5809 Erwachsenen
nach allogener, verwandter HSCT bis 1995 (Quelle: Kondakci M, 2005)
Ungefähr 40-60% aller Patienten, welche die ersten sechs Monate nach HSCT überlebt
haben, entwickeln eine chronische Graft-versus-Host-Disease (cGvHD) (Atkinson et al,
15
1990). Häufig ist es jedoch nicht möglich, mit Hilfe der klinischen Symptomatik und der
Laborbefunde zwischen einer GvHD und einer Infektion zu unterscheiden und es müssen
im Einzelfall zur Sicherung der Diagnose Gewebeproben des betroffenen Organs (wie
Haut, Bindehaut oder Darm) untersucht werden. Somit ist die Diagnose cGvHD sehr
schwer zu stellen und wird auch folglich in klinischen Daten nicht zuverlässig erfasst,
weshalb die cGvHD auch in dieser Studie nicht berücksichtigt wurde.
1.2.3.3 Krankheitsrückfall
Die Rückkehr der Grunderkrankung (engl. Relapse) ist heutzutage der häufigste Grund für
Therapieversagen und Sterblichkeit nach einer HSCT. Das Relapserisiko hängt von der
Grunderkrankung, dem Krankheitsstadium bei HSCT und der Art der GvHD-Prophylaxe
ab (Aschan, 2006). Patienten, die in erster Remission einer akuten Leukämie oder einer
ersten chronischen Phase einer CML transplantiert werden, haben ein Relapserisiko von
20-30%, das schon auf 40-60% ansteigt, wenn die Transplantation erst in späterer
Remission oder der zweiten chronischen Phase stattfindet. Patienten, die nicht in
Remission oder mit primär refraktärer Erkrankung transplantiert werden, haben ein
70%iges Relapserisiko. Eine intensive GvH-Prophylaxe senkt durch die
Immunsuppression die Inzidenz einer GvHD, erhöht jedoch dadurch das Relapserisiko.
Eine längerdauernde, niedrigdosierte GvH-Prophylaxe senkt jedoch dieses Risiko wieder
(Carlens et al, 1999). Um die bestmögliche Behandlung zu gewährleisten, ist es wichtig,
ein Relapse so früh wie möglich zu erkennen. Jedoch bestehen bisher für alle
Erkrankungen außer der CML (erneuter Nachweis des bcr/abl-Gens) keine eindeutigen
molekulargenetischen Marker zur Frühdiagnostik. Als Alternative zur kostspieligen und
zeitaufwendigen Entwicklung krankheitsspezifischer Marker gibt es noch die Möglichkeit,
ein Relapse anhand des Wiederauftretens der patienteneigenen Hämatopoese früh zu
entdecken.
1.3 Minor Histokompatibilitätsantigene
Die erste Beschreibung von Minor Histokompatibilitätsantigenen (mHag) in Mäusen
datiert schon von vor über 60 Jahren. Damals konnten außerhalb des MHC gelegene Gene
mit der Abstoßung allogener Hauttransplantate zwischen MHC-identen Mäusen in
Verbindung gebracht werden (Snell, 1948; Barth et al, 1956). Jahrzehnte später zeigten
16
klinische und experimentelle Daten, dass bei Patienten nach allogener HSCT trotz
kompletter HLA-Übereinstimmung mit dem Spender in 20-40% der Fälle eine GvH-
Reaktion auftreten kann (Beatty und Hervé, 1990; Bortin et al, 1991). Außerdem wurde im
Vergleich zur autologen HSCT nach HLA-kompatibler allogener HSCT eine niedrigere
Rückfallrate gefunden (Zittoun et al, 1995; Ljungmann et al, 1993). Die Entfernung von T-
Zellen aus dem Transplantat hing dagegen in mehreren Studien mit niedrigerem GvH-
Risiko und deutlich höherem Rückfallrisiko zusammen (Apperley et al, 1986; Hale et al,
1988; Sullivan et al, 1989). Offensichtlich sind also alloreaktive T-Zellen aus dem
Transplantat für eine erhöhte Inzidenz von sowohl GvH- als auch GvL-Reaktion
verantwortlich. Man vermutet, dass die Alloreaktivität der T-Zellen gegen verbleibende
Variationen in der Aminosäuresequenz der in den HLA-Molekülen präsentierten Peptiden
gerichtet ist, weshalb diese auch als Minor Histokompatibilitätsantigene (mHag)
bezeichnet werden.
1.3.1 Genetik, Entstehung, Lokalisation und Nachweis von mHag
1.3.1.1 Genetik und Entstehung
Im menschlichen Genom gibt es unzählige Punktmutationen (Single Nucleotid
Polymorphisms - SNP), d.h. Austausche einzelner DNA-Basen durch andere Basen.
Liegen diese Basenveränderungen im kodierenden Bereich eines Gens, können sie zu
einem Aminosäureaustausch in Proteinen führen. Werden diese Proteine als Peptide
prozessiert und diese in der Bindungsfurche von HLA-Molekülen an der Zelloberfläche
exprimiert, so sind sie in der Lage, eine alloreaktive T-Zell-Reaktion bei einem fremden
Individuum auszulösen und werden daher als mHag bezeichnet (Simpson et al, 2002).
MHag werden analog zu anderen Selbst-Peptiden aus intrazellulären Proteinen gebildet
und in der Antigenbindungsfurche eines passenden HLA-Moleküls (MHC-Restriktion)
gebunden (siehe hierzu Kapitel 1.1, Abschnitt 3, Abbildung 3 und Kapitel 1.3, Abschnitt
1.1, Abbildung 6). Durch die Aminosäure-Varianz in den zytosolischen Proteinen kann es
nun zwischen einzelnen Individuen zu einer qualitativ und quantitativ unterschiedlichen
Expression eines mHag kommen. Im HSCT-Setting bedingt dies eine entweder uni- oder
bidirektional gerichtete T-Zell-Antwort. So können Spender-T-Zellen das vom Empfänger
gebildete antigene Peptid als fremd erkennen, umgekehrt können auch Patienten-T-Zellen
gegen das vom Spender gebildete mHag reagieren (unidirektional); in seltenen Fällen
17
können auch beide Peptide antigene Reaktionen hervorrufen (bidirektional) (Falkenburg et
al, 2003).
Jedes mHag ist das Produkt eines einzigen Gens und folgt dem Mendelschen Erbgang. Die
Loci der einzelnen mHag sind nicht mit dem HLA-Genkomplex verbunden, so dass bei
einer HLA-identen Situation nicht automatisch auch die mHag übereinstimmen; jedoch ist
bei HLA-identen Geschwistern auch wahrscheinlich, dass sie für manche mHag identisch
sind (Schreuder et al, 1993).
Abbildung 6: Zytosolische Proteine werden im Proteasom in kurze Peptidfragmente
degradiert. Diese werden wiederum durch Aminopeptidasen N-terminal gekürzt und
daraufhin durch den TAP (Transporter in antigen processing) ins ER (Endoplasmatisches
Reticulum) geschleust. Die HLA-Klasse I Moleküle werden solange im ER zurück
gehalten, bis ein Peptid erfolgreich gebunden ist. Diese Peptid/HLA Komplexe werden nun
über den Golgi-Apparat an die Zelloberfläche transportiert (Quelle: Falkenburg et al, 2003)
1.3.1.2 Lokalisation und molekularbiologischer Nachweis
Mehrere mHag, darunter die auf dem Y-Chromosom kodierten oder auch die autosomalen
mHag HA-3 und HA-8 werden ubiquitär exprimiert (Brickner et al, 2001; de Bueger et al,
1992). Dagegen ist die Expression anderer mHag auf bestimmte Zell- oder Gewebetypen
beschränkt (siehe hierzu auch Tabelle 3): HA-1 und HA-2 werden nur auf
hämatopoetischen Zellen (de Bueger at al, 1992), HB-1 nur auf Vorläufer B-Zellen
(Dolstra et al, 1997) und CD31 sowohl auf Immunzellen (T-Lymphozyten, NK-Zellen,
Granulozyten, Monozyten) als auch auf Endothelzellen und Thrombozyten exprimiert
18
(Behar et al, 1996). Der Grund für die spezifische Expression kann die je nach Zelltyp
variierende Art von Proteasomen sein. Für Immunoproteasome, einer Untergruppe von
Proteasomen, die in vielen hämatopoetischen Zellen und besonders APC’s vorkommt,
wurde im Gegensatz zu gewöhnlichen Proteasomen ein spezielles Muster nachgewiesen,
nach dem diese Proteine zerteilen. So ist die Präsenz von z. B. MAGE-3, einem melanom-
spezifischen Protein, an Immunoproteasomen gebunden (Schultz et al, 2002).
Tabelle 3: Gewebsverteilung der von uns untersuchten mHag; B-ALL: akute lymphatische
Leukämie der B-Zellen, B-CLL: chronisch lymphatische Leukämie der B-Zellen, EBV:
Eppstein-Barr-Virus, APC: antigenpräsentierende Zelle, NK-Zelle: Natürliche Killerzelle,
GIT: Gastrointestinaltrakt
mHag HA-1 HA-2 HA-3 HA-8 HB-1
Vorkommen Hämatopoetische
Zellen ubiquitär
Vorläufer B-Zellen, B-ALL, EBV
transformierte
B-Zelllinie
mHag ACC-1 ACC-2 CD31 CD62L PANE-1 UGT2B17
Vorkommen
Hämatopoetische
Zellen (inclusive
Leukämiezellen)
unter
inflammatorischen
Bedingungen auch
ubiquitär
Immunzellen,
Thrombozyten,
Endothelzellen
APC’s,
NK-Zellen,
neutrophile
Granulozyten
B-Lymphozyten
(B-CLL)
GIT, Prostata,
APC’s
Manche Proteine und die daraus gebildeten mHag werden unter normalen Bedingungen
nicht überall im Körper exprimiert, sondern z. B. nur bei Zellaktivierung im Rahmen von
Inflammationsprozessen (z. B. durch Konditionierung vor HSCT) im geschädigten
Gewebe (siehe hierzu Tabelle 3, ACC-1 und -2).
1976 wurden erstmals spezifische zytotoxische T-Lymphozyten (CTL’s) gegen das auf
dem Y-Chromosom lokalisierte mHag H-Y in Patienten nach HLA-identer allogener KMT
nachgewiesen. (Goulmy et al, 1976). Seitdem konnten bis zum heutigen Zeitpunkt auch
viele autosomal lokalisierte mHags zuerst mit Hilfe von CTL-Klonen aus spezifischen T-
Zellen von Patienten, die nach HLA-gematchter allogener HSCT eine GvHD entwickelt
hatten, bestimmt werden (Marijt et al, 1993). Zusätzlich ist es für viele mHag auch
gelungen, mittels biochemischer Isolationsverfahren (Säureelution der gebundenen Peptide
aus aufgereinigten HLA-Molekülen gefolgt von Trennung der Peptide durch HPLC und
19
darauffolgender Analyse der TCR-Bindung) deren Aminosäuresequenz und darauffolgend
auch die Nukleotidsequenz zu entschlüsseln, so dass nun die Möglichkeit besteht, diese
mHag mittels PCR-basierten Verfahren, wie PCR-SSP und Multiplex-PCR-SSO,
nachzuweisen (Wilke et al, 1998; Wilke et al, 2002; Pietz et al, 2005).
1.3.2 Die Rolle von mHag bei der allogenen HSCT
1.3.2.1 akute Graft-versus-Host-Disease (aGvHD)
MHag werden mit für die Entwicklung einer aGvHD nach allogener, HLA-identer HSCT
verantwortlich gemacht. Welche mHag eine Rolle bei der Entstehung einer aGvHD spielen
und ob die Gewebeverteilung hier eine Rolle spielt, ist bis heute nicht eindeutig geklärt.
Außerdem konnte gezeigt werden, dass manche unter normalen Bedingungen nur auf
hämatopoetischen Zellen exprimierte mHag durch Anwesenheit entzündlicher Zytokine
auch auf Zellen anderer Gewebsarten gebildet werden können (Kloosterboer et al, 2005).
Somit ist die Gewebsverteilung von mHag nicht immer eindeutig. Allerdings besteht
Konsens über die Bedingung, dass das eine aGvHD auslösende mHag auf
antigenpräsentierenden Zellen (APC) präsentiert werden muss, um die erforderliche CD8+-
T-Zell-Antwort auslösen zu können (Shlomchik et al, 1999).
Einerseits wird eine Reaktion gegen ubiquitär exprimierte mHag als Auslöser einer
klinisch manifesten aGvHD vermutet. Ein in situ Versuch mit Tetramer-gebundenen mHag
zeigte bei gleichzeitigem Ausbleiben des T-Zell-Anstiegs gegen hämatopoesespezifische
mHag einen deutlichen Anstieg von zytotoxischen T-Zellen gegen ubiquitär exprimierte
mHag; gleichzeitig wurden Anzeichen einer schweren aGvH-Reaktion beobachtet
(Dickinson et al, 2002). Gegen eine Reaktion auf ubiquitär exprimierte mHag spricht die
explizite Beteiligung von Haut, Leber, GIT und Lunge an einer aGvHD, wohingegen
andere Gewebe nicht betroffen sind (Glucksberg et al, 1974).
Andererseits konnte auch gezeigt werden, dass hämatopoesespezifische mHag an der
Entwicklung einer aGvHD beteiligt sind (Goulmy et al, 1996b). Ein Versuch in
Mausmodellen zeigte, dass T-Zell-Antworten gegen hämatopesespezifische mHag
signifikanten „Kollateralschaden“ auslösen und auch in Abwesenheit von T-Zell-
Reaktionen gegen ubiquitär exprimierte mHag eine aGvHD auslösen können (Teshima et
al, 2002a). Diese Theorie besagt, dass die aGvHD und deren Klinik durch eine
Zytokinausschüttung verursacht wird und wie folgt abläuft: Die T-Zell-Reaktion gegen die
20
in dendritischen (oder anderen hämatopoetischen) Zellen exprimierte mHag findet in den
bei aGvHD involvierten Organen statt, führt zu einer lokalen Inflammationsreaktion und
darauffolgend zu einer zytokin-vermittelten Zerstörung der umliegenden
nichthämatopoetischen Gewebe (Teshima and Ferrara, 2002b). Alternativ dazu kann man
behaupten, dass die T-Zell-Reaktion gegen hämatopoesespezifische mHag zusammen mit
der lokalen Inflammation zu einer Vermehrung der reaktiven T-Zellen führt und diese T-
Zellvermehrung nun für den Gewebsschaden verantwortlich ist (Mutis et al, 1999).
1.3.2.2 Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekt
Neben einer aGvHD können allogene T-Zellen auch für den Graft-versus-leukemia (GvL)-
Effekt verantwortlich gemacht werden, da dieser bisher weder bei der autologen HSCT
noch nach einer HSCT mit T-Zell depletiertem Transplantat beobachtet wurde (Gale et al,
1994). Es wird nun vermutet, dass mHag, die auf malignen Zellen exprimiert werden, als
Targetstrukturen für den durch alloreaktive T-Zellen vermittelten GvL-Effekt dienen. In-
vitro und in Mausmodellen konnte bislang nachgewiesen werden, dass viele der bis jetzt
beschriebenen mHag, darunter HA-1 bis HA-8 und HB-1 in klonalen
Leukämievorläuferzellen exprimiert und von allogenen T-Zellen erkannt werden können
(Pierce et al, 2001; Dolstra et al, 1997; Falkenburg et al, 1991; Bonnet et al, 1999). Gerade
bei malignen hämatologischen Erkrankungen könnten hämatopoese-spezifische mHag als
Targets funktionieren: so würden Donor-Lymphozyten-Infusionen (DLI) von mHag-
negativen Spendern zur Eliminierung der restlichen malignen Zellen des mHag-positiven
Patienten führen, ohne dabei die neue donorinduzierte Hämatopoese zu stören. Erste
Studien konnten dies für die hämatopoesespezifischen mHag HA-1 und HA-2 bestätigen
(Falkenburg et al, 1991; Bonnet et al, 1999). Für besondere Spender-Empfänger-Paare, in
denen der jeweilige Spender negativ und der Empfänger positiv für diese HA-1/HA-2 war,
konnte nach DLI gleichzeitig mit dem Verschwinden der Grunderkrankung und dem
vollen Spenderchimärismus das Auftreten von HA-1/HA-2-spezifischen T-Zellen
nachgewiesen werden (Marijt et al, 2003). Zurzeit wird in klinischen Phase I- und II-
Impfstudien getestet, ob hämatopoese- sowie tumorspezifische mHags einen GvL- bzw.
GvT-Effekt verstärken können (Goulmy, 2006).
21
1.3.2.3 Transplantatversagen
Im Gegensatz zur Transplantation von soliden Organen, die auch mit eingeschränkter
Immunsuppression und einer größeren Zahl an HLA-Differenzen zwischen Spender und
Empfänger toleriert wird, verursachen hämatopoetische Stammzellen beim Patienten schon
bei kleinsten Differenzen der HLA-Merkmale oder einer zu schwachen Konditionierung
eine starke T-Zell-Aktivierung bis hin zum Transplantatversagen. Hierfür werden bei
HLA-Identität zwischen Spender und Empfänger unter anderem mHag-Differenzen
verantwortlich gemacht. Eine akute Abstoßung des Stammzelltransplantats macht sich
anfänglich durch einen schnellen Anstieg der patienteneigenen CD8+-T-Zellen kurz nach
Graftinfusion bemerkbar. Durch Klonieren dieser CD8+-T-Zellen konnte eine Reaktivität
gegen geschlechtsspezifische und autosomale mHags nachgewiesen werden (Goulmy et al,
1977; Voogt et al, 1990; Marijt et al, 1995). Da wir in unserer Studie das
Transplantatversagen nicht untersucht haben, wird dies nur der Vollständigkeit halber
erwähnt.
1.3.2.4 Relapse und Transplant related / Non relapse mortality (TRM/NRM)
Ein Einfluss auf einen Krankheitsrückfall konnte bisher für die mHag CD31, CD62L und
HY gezeigt werden (El-Chennawi et al, 2006; Katagiri et al, 2006; Markiewicz et al,
2009). Der Einfluss von mHag auf TRM/NRM nach allogener, unverwandter HSCT wurde
bisher nur in drei Studien untersucht; zwei davon konnten bei den untersuchten mHag
keinen Effekt auf TRM/NRM feststellen (Lin et al, 2001; Pérez-García et al, 2005).
Dagegen scheint ein Mismatch in UGT2B17 zwischen Spender und Empfänger eine
erhöhte Inzidenz von TRM/NRM zu zeigen (Terakura et al, 2005).
Da bisher nur vereinzelte Studien den Effekt von mHag auf Relapse und NRM/TRM
untersucht haben (siehe Tabelle 28), wurde dies nun systematisch in unserer Studie
gemacht.
1.3.3 Untersuchte autosomale Minor Histokompatibilitätsantigene
1.3.3.1 HA-1
Bei HA-1 handelt es sich um ein diallelisches Nonapeptid, das durch zwei Exons des
KIAA0223-Gens auf Chromosom 19 kodiert wird (Wilke et al, 1998) und einen
22
Aminosäureaustausch von Arginin zu Histidin aufweist (den Haan et al, 1998). Das
komplette KIAA0223-Gen kodiert ursprünglich für ein Protein zur intrazellulären
Signalweiterleitung. Das HA-1H Peptid (VLHDDLLEA), kodiert durch das HA-1
H-Allel,
wird von spezifischen zytotoxischen T-Zellen im Zusammenhang mit HLA-A*02 erkannt,
im Gegensatz zum VLRDDLLEA-Peptid (kodiert durch das HA-1R-Allel), welches nur
sehr wenig durch HLA-A*02 gebunden und auf der Zelloberfläche exprimiert wird sowie
ein funktionelles Null-Allel darstellt (den Haan et al, 1998). HA-1H weist bei weißen US-
Amerikanern eine durchschnittliche Allelfrequenz von 35,9% und HA-1R eine Frequenz
von 64,1% auf (Spierings et al, 2007), und wird ausschließlich auf Zellen
hämatopoetischen Ursprungs exprimiert (de Bueger et al, 1992). Zum
molekulargenetischen Nachweis von HA-1 existieren verschiedene Methoden (Tseng et al,
1998; Wilke et al, 1998; Aróstegui et al, 2000). HA-1 gehört als eins der ältesten
bekannten mHag zu den in Studien am besten untersuchten mHag. Neuerdings gibt es
Hinweise auf weitere immunogene Peptide, die von HA-1 kodiert werden, sowie weitere
HLA-Moleküle, in denen das HA-1H-Peptid exprimiert werden kann, z. B. HLA-B60,
HLA-A*02:06 (Mommaas et al, 2002; Torikai et al, 2007).
Bisherige Studienergebnisse zum Einfluss von HA-1-Mismatchen auf die HSCT behandeln
hauptsächlich das Thema aGvHD und sind genauso zahlreich wie widersprüchlich. Ältere
Studien zeigen einen signifikanten Zusammenhang zwischen HA-1-Mismatchen und
erhöhter aGvHD-Inzidenz (Goulmy et al, 1996b; Tseng et al, 1999; Gallardo et al, 2001;
Socié et al, 2001), neuere Studien widersprechen dem und zeigen zudem auch einen
fehlenden Einfluss auf Gesamtüberleben, Relapse und TRM/NRM (Lin et al, 2001;
Heinemann et al, 2004; Spellman et al, 2009; Markiewicz et al, 2009).
1.3.3.2 HA-2
Auch HA-2 wird ausschließlich auf hämatopoetischen Zellen und in HLA-A*02 exprimiert
(de Bueger et al, 1992). Erstmals wurde die zum mHag HA-2 gehörende
Aminosäuresequenz YIGEVLVSV durch den Haan et al im Jahr 1995
massenspektrometrisch dargestellt und beschrieben (den Haan et al, 1995). 2001 gelang es
Pierce et al, das HA-2 kodierende Gen als ein bisher unbekanntes Gen der Klasse-I-
Myosine (unkonventionelles Myosin 1G –MYO1G) auf dem kurzen Arm von Chromosom
7 zu bestimmen. Des Weiteren konnten zwei allelische Varianten, die sich durch einen
Aminosäureaustausch von Valin (MYO1GV) zu Methionin (MYO1G
M) unterscheiden,
23
nachgewiesen werden. Die erste Variante (MYO1GV) kodiert für das als antigene Peptid
bekannte HA-2V (YIGEVLVSV), wohingegen das von der zweiten allelischen Variante
(MYO1GM
) kodierte Peptid HA-2M
(YIGEVLVSM) nicht an der Oberfläche von
MYO1GM
enthaltenden Zellen exprimiert werden kann, obwohl der Aminosäureaustausch
weder HLA-Bindung noch T-Zell-Erkennung behindert (Pierce et al, 2001). 2002
entwickelten Wilke et al einen molekulargenetischen Nachweis für HA-2 mittels PCR-SSP
(Wilke et al, 2002). HA-2V weist bei weißen US-Amerikanern eine Allelfrequenz von
75,6% und HA-2M
eine Frequenz von 24,4% auf (Spierings et al, 2007).
Für HA-2 konnte bisher kein Einfluss auf die von uns untersuchten Outcomes nach HSCT
festgestellt werden (Goulmy et al, 1996b).
1.3.3.3 HA-3
Erstmals wurden HA-3 spezifische T-Zellen aus dem Blut eines AML- Patienten isoliert,
der nach HLA-identer HSCT an aGvHD Grad II erkrankt war (Goulmy, 1988). Das später
entdeckte antigene Peptid von HA-3, HA-3T (VTEPGTAQY), welches in HLA-A*01
gebunden präsentiert wird, wird durch das lymphoid blast crisis Lbc-Onkogen auf
Chromosom 15q24-q25 kodiert und ist ubiquitär exprimiert (de Bueger, 1992). Somit ist
HA-3 das erste entdeckte mHag, das durch ein Onkogen kodiert wird. Ein
Aminosäureaustausch von Threonin zu Methionin führt zum Verdau des HA-3M
Peptids
(VMEPGTAQY) im Proteasom, so dass dieses nicht an der Zelloberfläche exprimiert
werden kann. Beim Vergleich der beiden Allele fiel auf, dass diese sich zusätzlich noch in
sechs weiteren nicht synonymen SNP’s unterscheiden, die möglicherweise für weitere
mHag kodieren könnten, deren Bedeutung bis jetzt jedoch noch ungeklärt ist (Spierings et
al, 2003). Spierings et al zeigen in dieser Veröffentlichung auch eine SSP basierte
Nachweismethode für beide Allele von HA-3. HA-3T weist bei weißen Amerikanern eine
Allelfrequenz von 65,2% und HA-3M
eine Frequenz von 34,8% auf (Spierings et al, 2007).
HA-3 scheint laut neuester Studienergebnisse einen Einfluss auf die Inzidenz einer klinisch
relevanten aGvHD zu haben (Markiewicz et al, 2009).
1.3.3.4 HA-8
Das Nonapeptid RTLDKVLEV, welches in HLA-A*02 präsentiert und vom KIAA0020
Gen auf Chromosom 9 kodiert wird, wurde von Brickner et al 2001 entdeckt und analog
24
der bestehenden Nomenklatur als mHag HA-8R bezeichnet (Goulmy, 1996a; Brickner et al,
2001). Eine Punktmutation im KIAA0020-Gen führt zum Austausch der an erster Position
stehenden Aminosäure Arginin durch Prolin. Das dadurch entstehende Peptid
PTLDKVLEV (HA-8P) und seine Precursor-Proteine werden nur unzureichend durch den
transporter of antigen processing (TAP) transportiert, so dass es nicht an der Zelloberfläche
exprimiert werden kann. HA-8 wird ubiquitär exprimiert und ist das erste beschriebene
mHag, dessen Entstehung durch verschiedene Antigenprozessierung bedingt ist (Brickner
et al, 2001). HA-8R weist bei weißen Amerikanern eine Allelfrequenz von 45% und HA-8
P
eine Frequenz von 55% auf (Spierings et al, 2007).
Bislang bestehen Hinweise darauf, dass HA-8-Mismatche in Verbindung mit einer
erhöhten Inzidenz von klinisch relevanter aGvHD (Akatsuka et al, 2003b), sowie
verkürztem Gesamtüberleben bzw. krankheitsfreiem Überleben stehen (Pérez-García et al,
2005).
1.3.3.5 HB-1
Dolstra et al haben HB-1 erstmals 1999 aus einem HLA-B*44 restringierten CTL-Klon
eines an B-ALL erkrankten und daraufhin transplantierten Patienten isoliert (Dolstra et al,
1999). Als antigenes Peptid wurde das Decapeptid EEKRGSLHVW (Allel: HB-1H)
identifiziert, welches ausschließlich in HLA-B*44 gebunden wird. Ein Polymorphismus an
Position 153 im HB-1 kodierenden Gen auf Chromosom 5q32, dessen Funktion bisher
unbekannt ist, führt zum Ersatz der Aminosäure Histidin an Position 8 durch Tyrosin und
zur Bildung des EEKRGSLYVW-Peptids (Allel: HB-1Y). Die Expression von HB-1
konnte in weiteren Versuchen nur in leukämischen B-Lymphozyten (B-ALL und EBV
transformierten B-Zellen) nachgewiesen werden. Zwar wurde auch in normalen Zellen
eine kleine Anzahl an Gentranskripten festgestellt, jedoch reichte dies nicht zur Erkennung
durch den TCR aus. Somit ist HB-1 das erste entdeckte leukämieassoziierte mHag (Dolstra
et al, 1999). 2002 entwickelten Dolstra et al einen RFLP-Assay zum molekulargenetischen
Nachweis von HB-1 und bestimmen die Allelfrequenz von HB-1H und HB-1
Y mit 79%
bzw. 21%. 2010 wurde von Park et al ein verbesserter PCR-SSP Test entwickelt, der auch
das bisher schwer nachweisbare HB-1Y Allel gut erfasste (Park et al, 2010). Beide Allele
von HB-1 binden gleich stark an HLA-B*44 und werden durch jeweils spezifische CTL’s
erkannt, so dass HB-1 auch das bisher einzige mHag ist, dass eine bidirektionale allogene
T-Zell-Antwort auslösen kann (Dolstra et al, 2002). De Rijke et al haben 2003 Hinweise
25
auf zwei weitere in HLA-DR präsentierte von HB-1 kodierte Epitope gefunden (de Rijke et
al, 2003).
Bisherige Studien, die einen Einfluss von HB-1-Mismatchen auf die im Rahmen dieser
Arbeit untersuchten klinischen Outcomes nach HSCT untersucht haben, konnten keine
signifikanten Zusammenhänge nachweisen (Spellman et al, 2009; Markiewicz et al, 2009).
1.3.3.6 ACC-1 und ACC-2
Durch zwei nicht synonyme SNP’s an Position 56 und 245 des auf Chromosom 15q24-25
liegenden BCL2A1-Gens, das ursprünglich für ein antiapoptotisches Protein kodiert
(BCL2-related protein A1), entstehen aus einem Gen zwei neue mHag ACC-1 und ACC-2.
Der Austausch von Guanin zu Adenin an Position 56 führt durch den
Aminosäureaustausch von Cystein (C) zu Tyrosin (Y) zu einem durch den TCR in
Verbindung mit HLA-A*24 erkannten Nonapeptid DYLQYVLQI (ACC-1Y). Das durch
ACC-1C Allel kodierte Peptid DYLQCVLQI (ACC-1
C)wird zwar in HLA-A*24 gebunden,
jedoch nicht durch CTL’s erkannt. Das zweite neue mHag, das in HLA-B*44 gebundene
Decapeptid KEFEDDIINW (ACC-2D), ensteht aus einem AS-Austausch von Glycin (G) zu
Asparaginsäure (D). Entsprechend ACC-1 kann auch das ACC-2G Peptid KEFEDGIINW
nicht vom TCR erkannt, jedoch im HLA-Molekül gebunden werden. ACC-1 und ACC-2
sind die bisher einzigen mHag, die aus zwei verschiedenen SNP eines gleichen
autosomalen Gens entspringen (Akatsuka et al, 2003a). Es wurde zuerst angenommen, dass
die beiden mHag ausschließlich auf Zellen hämatopoetischen Ursprungs exprimiert werden
(Akatsuka et al, 2003a). Vorausgehende Studien zeigten jedoch, dass die Expression des
BCL2A1-Gens durch inflammatorische Zytokine wie TNF-α oder IL- 1β auch in
Endothelzellen induziert werden kann (Karsan et al, 1996). So vermutet man, dass unter
normalen Bedingungen ACC-2-spezifische T-Zellen sich gezielt gegen hämatopoetische
Zellen richten und einen GvL-Effekt bedingen können, diese Reaktivität sich allerdings in
Gegenwart inflammatorischer Wirts-Zellen und darauffolgender Hochregulierung
inflammatorischer Zytokine auch gegen andere Gewebe richten kann, so dass sie auch eine
Rolle in der Entstehung von GvHD spielen könnten (Kloosterboer et al, 2005).
Bisher konnten weder für ACC-1 noch für ACC-2 signifikante Auswirkungen auf klinische
Outcomes nach HSCT beobachtet werden (Nishida et al, 2004; Markiewicz et al, 2009).
26
1.3.3.7 PANE 1
Ein zusätzliches Exon eines alternativen Transkripts des PANE-1 (proliferation associated
nuclear element 1)-Gens auf Chromosom 22q13 ist für die Entstehung des in HLA-A*03
gebundenen mHag PANE-1 (Proteinsequenz: RVWDLPGVLK) verantwortlich. Ein
Basenaustausch in diesem zusätzlichen, kodierenden Exon führt anstelle des Einbaus von
Arginin an erster Stelle im Protein zur Bildung eines Stopcodons, so dass das PANE-1-
Protein in manchen Individuen erst gar nicht gebildet wird. Das alternative PANE-1-
Transkript, welches für das mHag kodiert, ist in großen Mengen in ruhenden CD19+-B-
Zellen und B-CLL-Zellen vorhanden. Bei Aktivierung der B-Zellen durch Stimulation mit
CD40L nimmt das alternative zugunsten des nicht-mHag-kodierenden Transkriptes ab
(Brickner et al, 2006). Die Allelfrequenzen einer weißen amerikanischen Population liegen
bei 69,9% PANE-1-positiven und 38,8% PANE-1-negativen Individuen (Spierings et al,
2007).
Bisher gibt es noch keine Studien zur Relevanz von PANE-1-Mismatchen zwischen
Spender-Empfänger-Paaren bei HSCT.
1.3.3.8 UGT2B17
2003 haben Murata et al mit dem durch das UGT2B17-Gen kodierten Peptid
AELLNIPFLY das erste mHag entdeckt, dessen Immunogenität zwischen Spender und
Empfänger durch eine homozygote Gendeletion in den Spenderzellen (bei rund 11% der
weißen Gesamtbevölkerung) zustande kommt. Das neu entdeckte Peptid wird in HLA-
A*29 gebunden und neben Leber, Hypophyse und GIT auch in APC’s exprimiert, so dass
eine Rolle bei GvHD und/oder GvL in UGT2B17-positiven Empfängern mit
Transplantaten von negativen Spendern nicht ausgeschlossen werden kann (Murata et al,
2003).
UGT2B17 selbst kartiert auf Chromosom 4 und gehört zur Familie der UDP-
Glycosyltransferasen, welche für die Elimination von u. a. Steroidhormonen, Bilirubin und
potentiell toxischen exogenen Stoffen (Medikamenten) verantwortlich ist (Tukey and
Strassburg, 2000). Da es schon mindestens 7 Gene in der UGT2-Unterfamilie gibt, die sehr
ähnliche Substratspezifitäten aufweisen, fällt der Ausfall der durch UGT2B17 kodierten
Glycosyltransferase jedoch klinisch nicht auf. Für UGT2B7, eine andere zur UGT2-
Familie gehörende Glycosyltransferase, konnte gezeigt werden, dass sie am Abbau von
27
Cyclosporin A und Tacrolimus beteiligt ist (Strassburg et al, 2001), so dass auch
UGT2B17, das in 88% der AS-Abfolge identisch zu UGT2B7 ist, daran beteiligt sein kann.
Somit kann UGT2B17 entweder als mHag oder auch durch Modifikation des
Arzneimittelmetabolismus das klinische Outcome nach HSCT beeinflussen. UGT2B17 ist
auch das mHag mit der größten Variation zwischen verschiedenen Populationen: Bei
96,5% der Weißen ist der immunogene Phänotyp vorhanden, bei Asiaten und Schwarzen
(70,9%) und Mexikanern (62,4%) ist er signifikant seltener (p<0,001), am seltensten ist er
bei Mulatten zu finden (22,0%, p<0,01) (Spierings et al, 2007).
Es konnte gezeigt werden, dass ein UGT2B17 positiver Spender einen unabhängigen
Risikofaktor für erhöhte Inzidenz für TRM/NRM und ein vermindertes Gesamtüberleben
nach HSCT darstellt (Terakura et al, 2005). Später wurde außerdem gezeigt, dass ein
UGT2B17-Mismatch zwischen Patient und Spender für eine erhöhte Inzidenz von aGvHD
verantwortlich ist, dies jedoch nicht auf einen bestimmten UGT2B17-Genotyp bei Spender
oder Empfänger zurückzuführen war (McCaroll et al, 2009).
1.3.3.9 CD31
CD31 (platelet endothelial cell adhesion molecule 1, PECAM-1) ist ein auf Chromosom
17q23 kartierendes Membranglykoprotein (Gumina et al, 1996), das hauptsächlich auf
Endothelzellen, Thrombozyten, Monozyten, Blutstammzellen sowie auf zirkulierenden
Leukozyten exprimiert wird (DeLisser et al, 1994; Newman et al, 1990). Es gehört zur
Familie der Ig-ITIMs (Proteine der Ig-Superfamilie, welche ITIMs - immunoreceptor
tyrosine-based inhibitory motifs - enthalten) wie auch KIR und CD22.
CD31 spielt eine Rolle in der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion, Leukozytenmigration,
T-Zell-Aktivierung und Angiogenese (DeLisser et al, 1994; Zehnder et al, 1995). Erste
Hinweise auf seine mögliche Rolle als mHag gab ein Polymorphismus in Codon 125 (CTG
-> GTG, AS-Austausch von Leucin zu Valin), welcher bei Nichtkompatibilität zwischen
Spender und Empfänger ein Risikofaktor für die Inzidenz der aGvHD sein soll (Behar et
al, 1996). Zusätzlich dazu wurden 1998 noch drei weitere SNP`s identifiziert: der erste
befindet sich auch in Exon 3, Codon 80 und führt zum Austausch von Valin zu Methionin;
er wurde jedoch nur in einem Individuum gefunden, so dass man nicht auf einen
regelmäßigen SNP schließen kann. Die anderen liegen in Exon 8, Codon 563 (Asparagin
zu Serin) und Exon 12, Codon 670 (Glycin zu Arginin) (Maruya et al, 1998). Die beiden
letzten verbindet ein starkes Kopplungsungleichgewicht: Bei Serin (bzw. Asparagin) in
28
Codon 563 befindet sich in Codon 670 fast immer Arginin (bzw. Glycin). Valin in Codon
125 zeigt eine starke Kopplung mit Asparagin in Codon 563. Ein durch die CD31-
Polymorphismen kodiertes mHag könnte möglicherweise in HLA-Molekülen, die zur
HLA-B44-Superfamilie oder zur HLA-B7-Superfamilie gehören, exprimiert werden
(Maruya et al, 1998, Cavanagh et al, 2005).
In vitro zeigen Monozyten mit heterozygotem Genotyp (Codon 125 L/V, Codon 563 S/N,
Codon 670 R/G) eine erhöhte Adhäsion an Endothelzellen im Vergleich mit den beiden
homozygoten Genotypen (Goodman et al, 2008). Dies ist der erste Hinweis auf eine
Beeinträchtigung der Funktionalität von CD31 durch die SNP’s.
Auch für die Auswirkung von CD31-Mismatchen auf HSCT besteht bisher Uneinigkeit in
den Studienergebnissen: Hinweise gibt es auf eine erhöhte Inzidenz von aGvHD (Behar et
al, 1996; Maruya et al, 1998), sowie ein verkürztes krankheitsfreies Überleben bzw.
Gesamtüberleben (Grumet et al, 2001) oder eine erhöhte Relapseinzidenz (El-Chennawi et
al, 2006) bei Mismatchen zwischen Spender und Patient in den oben genannten Codons.
Außerdem wurde bei Patienten eine erhöhte aGvHD-Inzidenz bei der
Aminosäurenkonstellation Valin/Asparagin/Glycin des Spenders festgestellt (Cavanagh et
al, 2005).
1.3.3.10 CD62L
CD62L (leucocyte-endothelial cell adhesion molecule 1 – LECAM-1, SELL oder L-
Selectin), kodierend auf Chromosom 1, gehört zur Selektinfamilie der Adhäsionsmoleküle,
die für das initiale Anbinden und Rollen der Leukozyten an Venenendothelien vor der
Diapedese verantwortlich sind. Die Selektinfamilie setzt sich aus drei Subtypen zusammen,
wobei L-Selektin auschließlich auf Leukozyten, P-Selektin ausschließlich auf
Thrombozyten und E- und P-Selektin auf vaskulären Endothelzellen exprimiert wird. L-
Selektin besteht aus mehreren Domänen: einer extrazellulären aminoterminalen
Lektindomäne, einer dem epidermalen Wachstumsfaktor ähnlichen Domäne und Short
repeat Units, die denen an C3/C4-komplementbindenden Proteinen ähneln (Tedder et al,
1995). L-Selektin interagiert mit vielen verschiedenen Liganden, u. a. GlyCAM-1
(glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1), MadCAM-1 (mucosal addressin cell
adhesion molecule-1) und CD34, welche alle auf hochendothelialen Venen des
lymphatischen Gewebes exprimiert werden (Ley et al, 1993; Kansas et al, 1996). 1998
wurde der erste Polymorphismus in CD62L beschrieben, welcher in Codon 213 zu einem
29
AS-Austauch von Prolin zu Serin führt, und zwischen inkompatiblen Spender- und
Empfänger-Paaren eine erhöhte aGvHD-Inzidenz bei Patienten verursacht (Maruya et al,
1998). Zudem wurde 2010 ein weiterer Polymorphismus in Codon 206 beschrieben, der
zum Austausch von Phenylalanin durch Leucin führt (Heinold et al, 2010). Ein durch die
CD62L-Polymorphismen kodiertes mHag könnte möglicherweise in HLA-Molekülen, die
zur HLA-A3-Superfamilie oder zur HLA-B44-Superfamilie gehören, exprimiert werden
(Maruya et al, 1998).
Katagiri und seine Mitarbeiter haben 2006 eine verminderte Relapseinzidenz nach HSCT
für CD62L gemismatchte Patienten feststellen können (Katagiri et al, 2006).
1.3.4 Y-chromosomal kodierte mHag
Obwohl nahezu 98% der auf dem X- und Y-Chromosom kodierten Peptide in ihrer
Aminosäureabfolge identisch sind, bleiben noch die restlichen 2% als Y-Chromosom-
spezifische Peptide übrig, die u. a. für spezifische Y-chromosomale mHag kodieren
können (Millrain et al, 2005; Vogt et al, 2000; Warren et al, 2000; Müller, 1996; Meadows
et al, 1997). Y-chromosomal kodierte mHag spielen besonders bei einer HSCT mit
weiblichem Donor und männlichem Empfänger eine Rolle, da die weiblichen Spender-T-
Zellen die auf den Empfängerzellen exprimierten mHag als fremd erkennen und somit eine
GvHD auslösen können. Die Bedeutung Y-chromosomaler mHags auf die Entwicklung
einer GvHD/GvL nach HSCT ist genauso widersprüchlich, wie die autosomaler mHags
(Stern et al, 2006; Randolph et al, 2004; Goulmy et al, 1996b; Spellman et al, 2009). Da
wir die einzelnen geschlechtsspezifischen mHag in unserer Studie nicht
molekulargenetisch untersucht haben, haben wir den Einfluss von Y-chromosomalen
mHag durch Einführung der Kovariaten „Geschlechtsmismatch“ berücksichtigt, welche bei
weiblichem Spender/männlichem Patienten als positiv und in allen anderen Fällen negativ
gewertet wird.
30
1.3.5 Tabellarische Übersicht über die untersuchten Minor Histokompatibilitätsantigene (mHag)
Tabelle 4: Übersicht der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten mHag HA-1 bis UGT2B17; mHag: Minor Histokompatibilitätsantigen, Lbc: Lymphoid blast crisis
oncogen, BCL-2: B-cell lymphoma 2, PECAM-1: platelet endothelial cell adhesion molecule 1, LECAM-1: leucocyte endothelial cell adhesion molecule 1, PANE-1:
proliferation associated nuclear element 1, UDP: Uridindiphosphat, CD: cluster of differentiationm, dbSNP: database of SNP’s
mHag Gen (Chromosom) Protein; Funktion Aminosäurepolymorphismen antigenes Peptid dbSNP HLA-Restriktion Referenz
HA-1 KIAA0223/HMHA1
(19p13.3) unbekannt; intrazelluläre Signalweiterleitung
Histidin (H) VLHDDLLEA von HA-1
H rs1801284 HLA-A*02
den Haan et al, 1998 Arginin (R)
HA-2 MYO1G
(7p13-p11.2) Klasse I Myosin; intrazellulärer Transport
Valin (V) YIGEVLVSV von HA-2
V rs61739531 HLA-A*02
Pierce et al, 1995;
den Haan et al, 1995 Methionin (M)
HA-3 Lbc/AKAP13
(15q24-q25) Lbc; Onkogen
Threonin (T) VTEPGTAQY von HA-3
T rs7162168 HLA-A*01
Spierings et al,
2003 Methionin (M)
HA-8 KIAA0020
(9p24.2) unbekannt
Arginin (R) RTLDKVLEV von HA-8
R rs2173904 HLA-A*02
Brickner et al, 2001 Prolin (P)
HB-1 HMHB1
(5q31.3) unbekannt
Histidin (H) EEKRGSLHVW von HB-1H
und EEKRGSLYVW von HB-1Y
rs161557 HLA-B*44 Dolstra et al, 1999
und 2002 Tyrosin (Y)
ACC-1 BCL2A1 (15q24.3)
BCL2 related protein A1; antiapoptotisch
Tyrosin (Y) DYLQYVLQI von ACC-1
Y rs1138357 HLA-A*24 Akatsuka et al,
2003a
Cystein ( C)
ACC-2 Asparaginsäure (D)
KEFEDDIINW von ACC-2D
rs3826007 HLA-B*44 Glycin (G)
CD 31 (Cd 125)
CD31
(17q23.3)
CD31 (PECAM-1); Adhäsion, Migration,
Angiogenese
Leucin (L)
unbekannt
rs668
HLA-B7- oder
B44- Superfamilie (vermutet)
Behar et al, 1996; ,
Maruya et al, 1998
Valin (V)
CD 31
(Cd 563)
Asparagin (N) rs12953
Serin (S)
CD 31 (Cd 670)
Arginin (R) rs1131012
Glycin (G)
CD62L
(Cd 206) CD62L
(1q23-q25)
CD62L (LECAM-1); Adhäsion und
Aggregation von Leukozyten
Phenylalanin (F)
unbekannt
rs1131498 HLA-A3- oder
HLA-B44-
Superfamilie (vermutet)
Maruya et al, 1998 Leucin (L)
CD62L (Cd 213)
Prolin (P) rs2229569
Serin (S)
PANE-1 PANE-1
(22q13.2) PANE-1; unbekannt
Arginin (R) RVWDLPGVLK rs5758511 HLA-A*03
Brickner et al,
2006 stoppcodon
UGT2B17 UGT2B17
(4q13)
UDP-Glykosyltransferase-Familie; Katabolismus von
Hormonen,Toxinen,Bilirubin
pos./neg. AELFNIPFLY -- HLA-A*29 Murata et al, 2003
31
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit
Zielsetzung dieser Arbeit ist es, den Einfluss von mHag-Disparitäten zwischen Patienten
und Spendern in Bezug zum Therapieerfolg einer HSCT zu analysieren. Hierfür ist es
zunächst erforderlich, ein bereits existierendes kommerzielles Testkit zur Analyse von
mHag-Polymorphismen in unserem Labor zu etablieren und zu validieren. Mit einer
einheitlichen Methodik soll eine größtmögliche Anzahl an mHag-Polymorphismen an
einer möglichst großen Patienten-und-Spender-Kohorte nach unverwandter, allogener
HSCT untersucht werden. Der untersuchte Einfluss wird an Hand der Messgrößen
Gesamtüberleben, Inzidenz eines Relapses, Transplant related mortality / Non relapse
mortality und Inzidenz einer aGvHD Grad II bis IV abgeschätzt. Außer den mHag-
Disparitäten soll in die statistischen Modelle auch der Einfluss anderer, patienten-,
spender- sowie therapiebezogener Risikofaktoren einfließen.
Die widersprüchlichen Ergebnisse bisheriger Studien zum Einfluss von mHag-Mismatchen
auf den Erfolg einer HSCT, verursacht u. a. durch verschiedene Studienpopulationen,
verschiedene Größe der Studienpopulationen und verschiedene statistische
Analysemethoden, zeigen uns, dass es in diesem Bereich noch weiterer Klärung bedarf, zu
der wir mit unserer Studie beitragen möchten. Im Gegensatz zur gut untersuchten aGvHD-
Inzidenz wurde der Einfluss von mHag auf andere Endpunkte, wie TRM/NRM,
Relapseinzidenz oder Gesamtüberleben, bisher in vielen Studien nicht berücksichtigt.
Für diesen Zweck wird eine Kohorte von 320 erwachsenen Patienten mit verschiedenen
malignen hämatologischen Erkrankungen in verschiedenen Stadien, welche zwischen 1997
und 2002 in 10 verschiedenen Tx-Zentren deutschlandweit mit unverwandten Spendern
transplantiert worden sind, und deren Spender genetisch getestet. Die Patienten-Spender-
Paare werden danach anhand der HLA-Restriktion der jeweiligen mHag in verschiedene
Subgruppen unterteilt, in denen in einem multivariaten Risikomodell der Einfluss von
mHag-Mismatchen unter Berücksichtigung der vorher identifizierten Risikofaktoren
analysiert wird.
Anhand der Ergebnisse dieser Arbeit soll der Einfluss von mHag-Differenzen und weiteren
klinischen Risikofaktoren im Rahmen des aktuellen wissenschaftlichen Forschungsstands
neu evaluiert und eventuell resultierende neue therapeutische Konsequenzen diskutiert
werden.
32
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Probenmaterial
In der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Studie wird die DNA von 320 Patienten
und deren HLA-A, -B, -C, -DRB1 und DQB1 kompatiblen Fremdspendern (MUD) auf die
Genotypen der mHag HA-1, -2, -3, -8, HB-1, ACC-1 und -2, CD31 - (PECAM-1) - Codon
125, 563 und 670, CD62L - (LECAM-1) - Codon 206 und 213, PANE-1 und UGT2B17
untersucht. Es liegen schon zu Beginn der Studie DNA-Asservate aller Spender und
Patienten vor, sodass keine erneute Probenentnahme durchgeführt werden muss. Die
Konzentration der DNA-Asservate wird photometrisch bestimmt und liegt bei allen Proben
über einem Mindestwert von 10ng/µl.
Im Rahmen einer Vorgängerstudie zum Einfluss der HLA-Kompatibilität auf den
klinischen Ausgang einer HSCT wurden alle Proben HLA-A, -B, -C, -DRB1 und -DQB1
typisiert, anonymisiert und mit einer laboreigenen, spezifischen Identifikationsnummer
versehen. Der Kompatibilitätsgrad zwischen Spender und Patient entspricht den im
Zweiten Deutschen Konsensus zur immungenetischen Spenderauswahl für die allogene
Stammzelltransplantation festgelegten Kriterien zur Übereinstimmung in den HLA-
Merkmalen (Ottinger et al, 2001).
Zusätzlich zu den von uns typisierten DNA-Proben werden acht Referenzproben aus
Heidelberg typisiert (Abteilung Transplantationsimmunologie, Universitätsklinikum
Heidelberg).
Das Projekt wurde von der Ethikkommission der Universität Ulm beurteilt; ein positives
Votum liegt vor (Antrag-Nr. 263/09).
Einen Überblick über den HLA-Matchinggrad der untersuchten Kohorte gibt Tabelle 5.
Tabelle 5: Kompatibilitätsgrad zwischen Patienten und deren Spendern (n=320)
kein HLA-Mismatch >0 HLA-Mismatche
119 Paare (37,2%) 201 Paare (62,8 %)
33
2.1.2 Studiendesign und Patientencharakteristika
Die Patientenkohorte wird nach folgenden Kriterien ausgewählt:
Transplantation ausschließlich durch Fremdspender (MUD), keine Familienspender
Patienten älter als 18 Jahre
Patienten mit HLA-Merkmalen, die der HLA-Restriktion von mindestens einem
mHag entsprechen (siehe Kapitel 1.3, Abschnitt 5, Tabelle 4, HLA-Restriktion)
Vorhandensein von DNA und klinischen Follow-Up-Daten von Spender und
Patient
Die Transplantationen wurden zwischen 1997 und 2002 in 10 verschiedenen deutschen
Transplantationszentren (Berlin, Erlangen, Hannover, Heidelberg, Jena, Mainz, München,
Regensburg, Ulm und Wiesbaden) durchgeführt. Die Patienten (190 männlich, 130
weiblich) sind an akuter myeloischer (98 Pat.) oder akuter lymphatischer Leukämie (58
Pat.), chronisch myeloischer Leukämie (88 Pat.), myelodysplastischem Syndrom (27 Pat.)
oder sonstigen hämatologischen Erkrankungen (49 Pat.) erkrankt. Unter dem Begriff
„sonstige“ werden diejenigen Erkrankungen zusammen gefasst, deren jeweiliger Anteil
unter 5% der Gesamterkrankungen liegt. Er setzt sich aus nicht näher spezifizierten
Lymphomen (17 Pat.), Non-Hodgkin-Lymphomen (8 Pat.), Hodgkin-Lymphomen (4 Pat.),
Multiplem Myelom/Plasmozytom (13 Pat.), schwerer aplastischer Anämie (2 Pat.),
chronisch lymphatischer Leukämie (4 Pat.) und nicht weiter spezifizierter sekundärer
akuter Leukämie (1 Pat.) zusammen.
Für die Erkrankungen AML, ALL, CML und MDS bestanden schon in den Rohdaten des
Deutschen Registers für Stammzelltransplantation (DRST) Stadieneinteilungen nach
Schwere der Grunderkrankung. Die verschiedenen Krankheitsstadien sind wie folgt
definiert:
Frühes Krankheitsstadium (Stadium 1) – 124 Patienten:
AML und ALL in erster kompletter Remission (1CR)
CML in erster chronischer Phase (1CP)
MDS in Niedrigrisikogruppe (geringe Blasteninfiltration des KM, langsam
fortschreitende Erkrankung)
34
Mittleres Krankheitsstadium (Stadium 2) – 100 Patienten:
AML und ALL in zweiter kompletter Remission (2CR) oder erstem Relapse (rel1)
CML in zweiter chronischer Phase (2CP) oder akzelerierter Phase (AP)
MDS in mittlerer Risikogruppe (fortschreitende Blasteninfiltration des KM)
Fortgeschrittenes Krankheitsstadium (Stadium 3) – 49 Patienten:
AML und ALL in zweitem oder höherem Relapse (>rel1) oder primär refraktärer
Erkrankung
CML in Blastenkrise (BC)
MDS in Hochrisikogruppe (breite Blasteninfiltration des KM, schnell
fortschreitende Erkrankung)
Bei 47 Patienten fehlen die Daten zum Krankheitsstadium.
Vor Transplantation erhalten die Patienten entweder eine myeloablative oder eine
reduzierte Konditionierungstherapie. Die myeloablative Konditionierung (MAC) besteht
aus einer Ganzkörperbestrahlung (TBI) mit einer Dosis von >500cGy einmalig oder
>800cGy in fraktionierten Dosen (mit oder ohne Cyclophosphamid (Cy) >4mg/kg KG)
oder aus einer Hochdosischemotherapie mit Cy > 4mg/kg KG (mit oder ohne Busulfan,
Purin-Analoga oder Antikörpern) (Gonçalves et al, 2009). Die reduzierte Konditionierung
(RIC) besteht aus entweder einer alleinigen Ganzkörperbestrahlung (TBI) mit einer Dosis
≤ 500cGy einmalig oder ≤ 800cGy fraktioniert oder einer Kombination dieser mit einer
Niedrigdosischemotherapie (Cy ≤4mg/kg KG, Busulfan ≤9mg/kg KG, Melphalan
≤140mg/m2, Thiotepa ≤10 mg/kg KG, Purin-Analoga in niedriger Dosierung) (Giralt,
2005; Aoudhjane et al, 2005).
Nach Transplantation erfolgt bei den meisten Patienten eine GvHD-Prophylaxe durch eine
Kombination von Cyclosporin A und Methotrexat (CsA+MTX) oder durch CsA und
anderen Therapeutika (Mycophenolatmofetil - MMF -, Steroide, monoklonale Antikörper).
Bei 14 Patienten erfolgte eine andere nicht näher bezeichnete GvHD-Prophylaxe.
Detaillierte patientendemographische Daten sind in Tabelle 6 aufgeführt.
35
Tabelle 6: Patientendemographie; N: Anzahl, Tx: Transplantation, AML: akute myeloische Leukämie, ALL:
akute lymphoblastische Leukämie, CML: chronisch myeloische Leukämie, MDS: myelodyplastisches
Syndrom, MTX: Methotrexat, KM: Knochenmark, PBSZ: periphere Blutstammzellen, GvHD: Graft-versus-
host-disease, TRM: Transplant related mortality, NRM: Non relapse mortality, HLA: humanes
Leukozytenantigen, Erkr.: Erkrankung
N evaluiert N(%)
Anzahl Patienten 320
Anzahl Tx-Zentren 10
Patientenalter bei Tx 320
11-20 Jahre 16 (5,0%)
21-30 Jahre 63 (19,7%)
31-40 Jahre 96 (30,0%)
41-50 Jahre 90 (28,1%)
51-60 Jahre 51 (15,9%)
>60 Jahre 4 (1,3%)
Geschlecht 320
männlich 190 (59,4%)
weiblich 130 (40,6%)
medianes Patientenalter (Bereich) Jahre
320 39 (18-67)
medianes Spenderalter
(Bereich) Jahre 306 36 (19-59)
Geschlechtsmatch 319
Männlich/Männlich 134 (42,0%)
Männlich/Weiblich 56 (17,6%)
Weiblich/Männlich 75 (23,5%)
Weiblich/Weiblich 54 (16,9%)
Diagnose 320
AML 98 (30,6%)
ALL 58 (18,1%)
CML 88 (27,6%)
MDS 27 (8,4%)
sonstige 49 (15,3%)
Krankheitsstadium 320
Stadium 1 124 (38,8%)
Stadium 2 100 (31,3%)
Stadium 3 49 (15,3%)
unbekannt 47 (14,7%)
Stammzellquelle 320
KM 158 (49,4%)
PBSZ 162 (50,6%)
Konditionierung 315
myeloablativ 273 (86,7%)
reduced intensity 42 (13,3%)
GvHD-Prophylaxe 318
Cyclosporin + MTX
(± andere) 259 (81,5%)
Cyclosporin ± andere 43 (13,5%)
andere 16 (5%)
T-Zell Depletion 320
keine 311 (97,2%)
vorhanden 6 (1,9%)
unbekannt 3 (0,9%)
36
Todesursache 204
Relapse / Fortschreiten
der Erkr. 57 (27,9%)
sekundäre maligne Erkr. 2 (1%)
TRM/NRM 132 (64,7%)
andere 2 (1%)
unbekannt 11 (5,4%)
HLA-Match 320
Match 119 (37,2%)
Mismatch 201 (62,8%)
Medianes Follow-up 116 334,5 Tage (11,1 Monate)
2.1.3 Laborgeräte und -materialien
96-well Reaktionsplatte mit Barcode Part.No. 4306737, Applied Biosystems GmbH,
Foster City, USA
Abzugshaube, mc6 Elektromodul, Waldner Holding GmbH und Co. KG, Wangen,
Deutschland
Digital Graphic Printer UP-D897, Sony, bezogen durch Biozym Scientific GmbH,
Hessisch Oldendorf, Deutschland
Domed Cap Strips, Cat.# SP-0216, Thermo Scientific, ABgene, Epsom, UK
Druckerpapier für Thermodrucker UPP-110S, Sony, Deutschland
Erlenmayer-Kolben 500ml: Duran Retrace Code 00788967, Schott AG, Mainz,
Deutschland
Gefrierschrank: Sanyo VIP MDF-U53V, Sanyo House, Watford/Herts, UK
Gel-Elektrophoresekammer, Prod.No 501, Universitätsklinikum Heidelberg, Institut für
Immunologie, Heidelberg, Deutschland
Klebefolie für 96-well Platten, Cat.# AB-0558, Adhesive PCR Film, Thermo
Scientific, ABgene, Epsom, UK
Kühl- und Gefrierschränke Modelle Premium, Comfort und Profi-Line, Firma Liebherr
Hausgeräte Ochsenhausen GmbH, Ochsenhausen, Deutschland
Mikrowelle, Marke Exquisit, Firma GGV Handelsgesellschaft mbH & Co. KG, Kaarst,
Deutschland
Multipette® plus, Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
PCR-Thermocycler:
PTC-200, MJ Research Ltd., Watertown, Massachusetts, USA
GeneAmp PCR Systems 9700, Applied Biosystems GmbH, Foster City,
USA
37
peqSTAR, Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland
Pipetten:
Modell Eppendorf Research® (variabel) 0,5-10µl, 10-100µl, 100-1000µl
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Modell Eppendorf Reference® (variabel) 0,5-10µl, 10-100µl, 100-1000µl
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Pipettenspitzen:
0,5-10µl Plastibrand® Filter Tips, Brand GmbH+Co KG, Wertheim,
Deutschland
10µl Safe Seal Tips® premium, Biozym Scientific GmbH, Hessisch
Oldendorf, Deutschland
100µl Safe Seal Tips® premium, Biozym Scientific GmbH, Hessisch
Oldendorf, Deutschland
1000µl Safe Seal Tips® premium, Biozym Scientific GmbH, Hessisch
Oldendorf, Deutschland
Präzisionswaage, Scout Pro 2000g, Ohaus Waagen Vertriebs GmbH, Giessen,
Deutschland
Reaktionsgefäße, 1,5ml, Prod. No. 0030125.150, Eppendorf AG, Hamburg,
Deutschland
Skalpell, Disposable Scalpel, Feather Safety Razor Co. Ltd., Osaka, Japan
Spannungsversorger Pharmacia Biotech EPS 300 für Gel-Elektrophoresekammern,
Pharmacia Biotech AG, Uppsala, Schweden
Spektralphotometer, NanoDrop 1000, Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen,
Deutschland
Thermometer, Standard Glasthermometer E737.1, Carl Roth GmbH und Co. KG,
Karlsruhe, Deutschland
Tischzentrifuge für 1,5ml Eppendorf-Tubes, Centrifuge 5415D, Eppendorf AG,
Hamburg, Deutschland
Transilluminator (Fluoreszenz-Imager + PC ), AlphaImager EP, AlphaImmotech,
Biozym scientific GmbH, Hessisch Oldendorf, Deutschland
Vortex-Genie 2, Scientific Industries Inc., Bohemia, New York, USA
Zentrifuge: Multifuge 3 S-R, Heraeus Holding GmbH, Hanau, Deutschland
38
2.1.4 Chemikalien, Reagenzien, Enzyme
Agarose Biozym LE, Biozym Scientific GmbH, Hessisch Oldendorf, Deutschland
Ethidiumbromid 0,07%, Inno-Train Diagnostik GmbH, Kronberg, Deutschland
LiChrosolv® Wasser (Aqua dest.), Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Taq DNA Polymerase, 5units/µl, Mat.Nr.1005476, Qiagen, Hilden, Deutschland
Borsäure 900nM, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
EDTA 25nM, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Titriplex III, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
Tris(hydroxymethyl)aminoethan 900nM, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland
2.1.5 Verwendete kommerziell erhältliche Komplettsysteme (Testkits)
Illustra GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit® , Prod.Code 25-6600-30/31/32, GE
Healthcare Europe GmbH, Freiburg/München, Deutschland
mHA CTS-PCR-SSP MINITRAY KIT, Prod.No.229, Universitätsklinikum
Heidelberg, Heidelberg, Deutschland
2.2 Methoden
2.2.1 Herstellung von Reagenzien und Lösungen
Die nachfolgend genannten Reagenzien werden zur Durchführung der
Agarosegelelektrophorese benötigt:
2.2.1.1 Agarose Gel 2%ig
In einem Erlenmayerkolben (Volumen: 500ml) werden auf 6g Agarose 300ml
1xBoratpuffer aufgefüllt. Das Gemisch wird in der Mikrowelle aufgekocht und
zwischendurch geschwenkt, bis die Agarose vollständig aufgelöst und die Lösung somit
klar ist. Anschließend wird der Behälter unter fließendem kaltem Wasser bis auf 60° C
abgekühlt (Gelthermometer) und unter den Abzug gestellt. Für die folgenden Schritte ist
39
das Tragen von geeigneter Schutzkleidung (u.a. Nitrilhandschuhe, Schutzkittel)
erforderlich, da mit potentiell mutagener Substanz umgegangen wird.
Unter dem Abzug werden nun 6-8 Tropfen 0,07%iges Ethidiumbromid in die
Agaroselösung gegeben und das fertige Gemisch geschwenkt, damit sich das
Ethidiumbromid verteilt. Die Lösung wird nun gleichmäßig in einen schon vorbereiteten
Gelschlitten mit Gelkämmen gegossen und zum erstarren 20 Minuten unter die
Abzugshaube gestellt. Daraufhin werden die Gelkämme entfernt und der Agarosegel in
eine mit 1xBoratpuffer gefüllte Gelkammer platziert.
2.2.1.2 10x Boratpuffer
Zuerst werden 544,6g Tris(hydroxymethyl)aminoethan, 278,0g Borsäure und 46,52g
EDTA jeweils einzeln abgewogen und zusammen geschüttet. Danach werden die drei
Substanzen ad 5000ml mit Aqua dest. aufgefüllt. Die Lösung wird umgerührt bis die
Substanzen vollständig gelöst und die Lösung somit klar ist. 10x Boratpuffer ist die
konzentrierte Aufbewahrungsform des zur Analyse benötigten 1x Boratpuffers.
2.2.1.3 1x Boratpuffer
200ml des 10xBoratpuffers werden auf insgesamt 2000ml mit destilliertem Wasser
aufgefüllt. Somit ist die notwendige Pufferkonzentration zur Gelelektrophorese erreicht.
2.2.2 Konzentrationsbestimmung der DNA
Zur Amplifikation mit dem GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit® muss die DNA in
einer Konzentration von mindestens 10ng/µl vorliegen, da ansonsten keine ausreichende
Qualität des Produktes garantiert werden kann. Deswegen messen wir die Konzentration
von 1µl Ausgangs-DNA mit Hilfe des NanoDrop Spektralphotometers bei einer
Wellenlänge von 260 bzw. 280nm. Dabei absorbiert DNA Licht der Wellenlänge 260nm,
die Messung bei 280nm dient der Reinheitsgradkontrolle (Absorptionsmaximum von
Proteinen). Bei reiner DNA sollte der 260/280-Quotient zwischen 1,8 und 2,2 liegen, jeder
Wert unter 1,8 zeigt eine Verunreinigung mit Proteinen.
40
2.2.3 Multiple Displacement Amplification (MDA) mit GenomiPhi V2 DNA
Amplification Kit®
2.2.3.1 Methodik
Die MDA ist eine enzymatische Methode zur Vermehrung langer DNA-Abschnitte aus
geringen Mengen an Ausgangs-DNA bei gleichbleibender Temperatur (Dean et al, 2001;
Dean et al, 2002). Es werden sogenannte Random Primer benutzt, die im Gegensatz zu
PCR-Primern das ganze Genom ohne Bevorzugung bestimmter Abschnitte vervielfältigen.
Aufgrund ihrer hohen Prozessivität und starken Fähigkeit, den neu gebildeten
Komplementärstrang von der Matrize zu verdrängen, wird bei der MDA die φ29-DNA-
Polymerase verwendet (Lasken, 2009). Dies erlaubt ein mehrmaliges Abschreiben des
gleichen Matrizenstranges: Nach erneuter Primerbindung bindet die φ29-DNA-Polymerase
an die Matrize und spaltet währenddessen einen kurz vorher gebildeten
Komplementärstrang ab (siehe Abbildung 7 und 8).
Dank der 3’-5’-Exonukleaseaktivität der φ29-DNA-Polymerase ist die Fehlerrate beim
Einbau von Nukleotiden auf 1 von 3x106 Basen reduziert (zum Vergleich: konventionelle
PCR: 1 falsch eingebaute auf 2x103 Basen). Die Random Primer sind an ihrem 3’-Ende
mittels Bindung an Phosphorothioat gegen die Exonukleaseaktivität geschützt.
Abbildung 7: MDA (Multiple Displacement Amplification)-Reaktion; DNA:
Desoxyribonukleinsäure (Quelle: Lasken, 2009)
2.2.3.2 Durchführung
Da die in unserer Studie benötigten DNA-Proben schon als Asservate vorliegen, erfolgt
keine erneute DNA-Isolierung. Wegen der geringen vorhandenen Menge an DNA wird
jedoch eine Vermehrung mit Hilfe der MDA-Methode mit einem GenomiPhi V2 DNA
41
Amplification Kit® durchgeführt. Dies haben wir gemäß den Herstelleranweisungen wie
folgt eingesetzt:
Zuerst werden von jeder Probe 1µl DNA (Mindestkonzentration: 10ng/µl) in die 96-well
Reaktionsplatten vorgelegt. Nachdem wir zu jeder Probe 9µl Samplepuffer hinzugegeben
haben, wird die Platte für 3min bei 95° C denaturiert und dann auf 4° C abgekühlt. Die
folgenden Schritte werden auf einem Kühlrack pipettiert. Zuerst werden für jede Reaktion
1µl Enzymmix (φ29-DNA-Polymerase) und 9µl Reaktionspuffer (bestehend aus Random
Primern, dNTP’s, Salz und Puffer) zusammengefügt, dann wird von diesem Mix jeweils
10µl auf jede Probe in der Barcodeplatte pipettiert. Danach erfolgt die Amplification im
Thermocycler für 1,5 Stunden bei 30° C. Am Schluss erhöhen wir zur Hitzeinaktivierung
der φ29-DNA-Polymerase für 10min die Temperatur auf 65° C.
Abbildung 8: Ablauf einer DNA-Amplifikation mittels MDA (Multiple Displacement
Amplification), DNA: Desoxyribonukleinsäure, dNTPs: Desoxyribonukleosid-
triphosphate, Phi29: Phage des Bacillus subtilis (Quelle: GE Healthcare, illustra
GenomiPhi V2 DNA Amplification Kit, Product web protocol, user manual, 2012)
Die vervielfältigte DNA ist nun das Ausgangsmaterial für unsere PCR-SSP-Testungen.
Die mit dem GemomiPhi V2 DNA Amplification Kit ® gewonnene DNA hat eine
Konzentration von 4-7µg in 20µl Reaktionsvolumen (ca. 280 ng/µl), bei einer
42
Mindestausgangskonzentration von 10ng/µl, muss bei -20° C gelagert werden und ist
genauso lange haltbar wie genomische DNA (mehrere Jahre).
2.2.4 PCR-SSP (Polymerasekettenreaktion mit sequenzspezifischen Primern)
mit Hilfe des mHA CTS-PCR-SSP Minitray Kit
2.2.4.1 Methodik: Polymerasekettenreaktion (PCR) und PCR-SSP
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine enzymatische Methode zur Vervielfältigung
spezifischer DNA-Abschnitte und somit das Kernstück der molekulargenetischen
Gewebetypisierung. Mit Hilfe einer zyklisch durchgeführten DNA-Strangseparation (94-
96° C) mit anschließender Primeranlagerung an beiden Enden des zu amplifizierenden
Teils (ca. 65° C) und darauffolgender Neusynthese des jeweils komplementären Strangs
durch den Einsatz einer thermostabilen DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) und dNTPs
(ca. 72° C) erfolgt die exponentielle Vervielfältigung ausgewählter DNA-Zielsequenzen.
Diese Zielsequenzen treten in quantitativer Hinsicht deutlich gegenüber anderen DNA-
Abschnitten in den Vordergrund und können somit durch nachfolgende Verfahren
(Gelelektrophorese, Färbung) deutlich sichtbar gemacht werden.
Der Erfolg einer PCR hängt maßgeblich von der Primerauswahl (Spezifität), der Qualität
und Quantität der eingesetzten DNA, der Magnesiumkonzentration, und dem
Temperaturprofil der Amplifikationsreaktion im Thermocycler ab.
Durch den Einsatz allel- bzw. gruppenspezifischer Primerkombinationen in einer PCR-
Reaktion erlaubt das PCR-SSP Verfahren die Differenzierung von Allelen bzw.
Allelgruppen. Gemäß den bestehenden Sequenzinformationen werden
Primerkombinationen gewählt, die nur bei Anwesenheit eines bestimmten Allels oder einer
Allelgruppe zur Bildung eines PCR-Produktes führen. Durch Positionierung des 3’-
Terminus eines Primers an eine polymorphe Basenposition der Ausgangs-DNA wird im
Falle einer Fehlpaarung (mismatch) die Primerelongation durch die Taq-Polymerase
verhindert, da diese keine 3’-5’ Exonuklease-Aktivität besitzt. Findet sich eine passende
Kombination (match), wird ein spezifisches Produkt gebildet. So erlaubt die PCR-SSP-
Methode den direkten Nachweis von Punktmutationen (SNP’s) durch eine einfache PCR-
Reaktion. Außerdem können in einem diallelischen System alle drei möglichen Genotypen
mit Hilfe von nur zwei sequenzspezifischen PCR-Reaktionen bestimmt werden.
43
Zur Kontrolle der PCR-Amplifikation wird zu jedem Primerpaar ein Kontrollprimerpaar
hinzugefügt, das ein in jeder DNA-Probe vorhandenes Gen amplifiziert und folglich immer
zu einer sichtbaren Bande führen soll (interne Positivkontrolle).
Der Nachweis der Amplifikate erfolgt anschließend mittels Agarose-Gelelektrophorese.
Die Interpretation des erhaltenen Amplifikatmusters zur Genotypbestimmung erfolgt
anhand des erwarteten Amplifikationsverhaltens der spezifischen Primerpaare für die
jeweiligen Allele, wobei auf Fehlklassifikationen der Amplifikationsreaktionen (falsch-
positive, falsch-negative) zu achten ist (siehe hierzu Abbildung 9, Abbildung 11 und
Tabelle 9).
2.2.4.2 Durchführung
Zur mHag-Genotypisierung der 320 Patienten-Spender-Paare benutzen wir das PCR-SSP
Kit der Abteilung Transplantationsimmunologie des Universitätsklinikums Heidelberg
(mHA CTS-PCR-SSP Minitray Kit).
In einem Kit sind folgende Komponenten enthalten:
32-well-Minitrays mit je 27 vorpipettierten, lyophilisierten allelspezifischen PCR-
Primermixen und einem Negativkontrollmix an Position 28 (12 Stück)
1,3ml 5% Mastermix (Ammoniumsulfat, Tris Puffer, Magnesiumchlorid, Glycerin,
dNTP’s und Cresol-Red Markerfarbstoff)
Minitray-Caps
Die PCR wird gemäß den Vorgaben des Kitherstellers wie folgt angesetzt:
Zuerst werden 92µl Mastermix in einem Eppendorf-Tube vorgelegt und mit 219,3µl Aqua
dest. und 1,93µl Taq Polymerase zusammen pipettiert; der Mix sollte gut gemischt werden.
Hiervon werden 10µl in das Negativkontroll-Well abgegeben. Danach fügen wir 33µl
DNA (Mindestkonzentration: 100 – 150ng/µl) hinzu, mischen gut und sorgfältig, und
verteilen 10µl vom Mix in jedes der 27 wells des Trays. Jetzt wird die PCR-Reaktion mit
dem in Tabelle 7 angegebenen Thermocyclerprofil gestartet.
44
Abbildung 9: PCR-SSP (Polymerasekettenreaktion mit sequenzspezifischen Primern),
PCR: Polymerasekettenreaktion (Quelle: Waßmuth, 2005c)
Tabelle 7: Thermocyclerprofil; min: Minute, sec: Sekunde, ° C: Grad Celsius
Initiale Denaturierung 94° C, 2min
Denaturierung 94° C, 15sec
Annealing und Elongation 65° C, 1min
10 Zyklen
Denaturierung 94° C, 15sec
Annealing 61°C, 50sec
Elongation 72° C, 30sec
20 Zyklen
Kühlen 4° C, 15min
45
Jeder Primermix enthält zusätzlich zu den sequenzspezifischen Primern noch ein
Kontrollprimerpaar, welches ein Teil des CRP-Gens (440bp Länge) vervielfältigt, als
interne Positivkontrolle.
Eine genaue Übersicht über die Primerspezifitäten und die Größe des allelspezifischen
Amplifikats gibt Abbildung 10 (Lokalisation der SNP’s, siehe hierzu Kapitel 1.3.,
Abschnitt 5, Tabelle 4):
Abbildung 10: Primermixe (durchnummeriert), Primerspezifitäten (Minor
Histokompatibilitätsantigen), detektiertes Allel (Angabe des Einbuchstaben-
Aminosäurecode nach IUPAC-IUB Vereinbarung von 1969), Größe des spezifischen
Amplifikates und der internen Positivkontrolle; PECAM-1 entspricht CD31 (Quelle: Tran
TH, Human Minor Histocompatibility Antigen (mHA) CTS-PCR-SSP Minitray Kit,
Working instruction, Locus- and Lot-specific manual No:29, CTS Heidelberg, 2008)
46
2.2.5 Agarosegelelektrophorese
2.2.5.1 Methodik
Zum Nachweis der PCR-Amplifikate kann eine Agarose-Gelelektrophorese, eine Methode
zur Auftrennung von DNA-Fragmenten nach ihrer Größe und darauffolgende
Sichtbarmachung durch Färbung, durchgeführt werden.
Aufgrund der negativen Ladung ihrer Phosphodiesterbrücken wandert die DNA in einem
Gleichspannungsstromfeld von der negativen zur positiven Elektrode. Da diese Wanderung
durch den Widerstand einer Agarosegelmatrix erfolgt, trennen sich die verschiedenen
DNA-Fragmente voneinander und von den Primern wegen ihrer größenbedingten
unterschiedlichen Laufgeschwindigkeiten in der Matrix auf. Durch die Zugabe von
Ethidiumbromid, einem Fluoreszenzfarbstoff, der zwischen die Basenpaare der DNA
interkaliert, werden die DNA-Fragmente als Banden unter UV-Licht (302nm) auf einem
Transilluminator sichtbar gemacht.
2.2.5.2 Durchführung und Auswertung
Zur Herstellung des 2%igen Agarosegels und des Boratpuffers siehe Kapitel 2.2.,
Abschnitt 1.
Da das PCR-Produkt schon durch den Mastermix mit Cresolrot gefärbt ist, kann auf eine
weitere Zugabe eines Gel-Ladepuffers verzichtet werden. 10µl des PCR-Produkts werden
nun in die Geltaschen des verfestigten Gels aufgetragen, nachdem das Gel in eine mit 1x
Boratpuffer gefüllte Laufkammer platziert wurde. Die Laufbedingungen der
Gelelektrophorese sind in Tabelle 8 beschrieben.
Nach Beendigung der Gelelektrophorese können die spezifischen Banden im Fluoreszenz-
Imager durch Beleuchten mit UV-Licht (302nm) sichtbar gemacht, anschließend
fotografiert und ausgedruckt werden (siehe hierzu Abbildung 11).
Tabelle 8: Laufbedingungen der Gelelektrophorese, bp: base pairs, V: Volt, mA:
Milliampere, min: Minuten
Konzentration
der Agarose
Auftrennbare
Fragmente (bp)
Spannung (V) Stromstärke
(mA)
Laufzeit (min)
2% 100 – 1000 180 400 15-20
47
Abbildung 11: Beispiel eines Agarosegelelektrophoresebildes (links) mit dazugehörigem
Typisierungsergebnis (rechts), Pos = Position
Anhand der Größe und dem Vorhandensein der Amplifikate werden die Reaktionen als
positiv oder negativ ausgewertet (siehe hierzu Abbildung 11). In jeder Reaktion wird zur
spezifischen Bande zusätzlich noch ein 440bp großes Stück des CRP-Gens als interne
Positivkontrolle vervielfältigt, somit müssen bei jeder positiven Reaktion 2 Banden
vorhanden sein. Anhand Abbildung 10 wird dieses Ergebnis in die zutreffende
Allelkombination übersetzt (siehe hierzu Tabelle 9). Position 28 stellt die Negativkontrolle
dar.
Tabelle 9: Beispiel einer Auswertung einer Gelelektrophorese an Hand Abbildung 11
mHag HA-1 HA-2 HA-3 HA-8 HB-1 ACC-1 ACC-2
Position 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Allele H R V M T M R P H Y Y C D G
Reaktion + + + - + + + + - + - + - +
Ergebnis H/R V/V T/M R/P Y/Y C/C G/G
mHag CD31 CD31 CD31 CD62L CD62L PANE-1 UGT2B17
Position 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
Allele L V N S R G F L P S R Stop +
Reaktion + + + + + + + - + + + - +
Ergebnis L/V N/S R/G F/F P/S R vorhanden
Pos 1: + Pos 9: - Pos 17:+ Pos 25:+
Pos 2: + Pos 10:+ Pos 18:+ Pos 26:-
Pos 3: + Pos 11:- Pos 19:+ Pos 27:+
Pos 4: - Pos 12:+ Pos 20:+ Pos 28:-
Pos 5: + Pos 13:- Pos 21:+
Pos 6: + Pos 14:+ Pos 22:-
Pos 7: + Pos 15:+ Pos 23:+
Pos 8: + Pos 16:+ Pos 24:+
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
48
2.2.6 statistische Methoden
2.2.6.1 Allgemeine statistische Auswertung
Die statistische Auswertung der in dieser Arbeit gewonnenen Daten erfolgt mit Hilfe der
Computerprogramme PASW Statistics 18 und SPSS 19 für Windows® (beides IBM, New
York, USA) und R (freie Statistiksoftware; GNU operating system, 2012). Unter anderem
werden auch die patientendemographischen Daten mit der PASW/SPSS-Software
analysiert.
Nachdem die Typisierungsergebnisse aller 320 Patienten-Spender-Paare vorliegen, werden
Allel- und Genotypfrequenzen für alle untersuchten mHag berechnet und deren Verteilung
zwischen verschiedenen Gruppen (Patienten, Spendern und einer gesunden
Vergleichskohorte) verglichen. Außerdem werden die erhaltenen Allelfrequenzen mit der
Allelverteilung im Hardy-Weinberg-Equilibrium (HWE) verglichen. Das HWE beschreibt
die Verteilung von Allelen in einer idealen Population, die groß genug ist, damit von einer
Panmixie ausgegangen werden kann, wobei jedoch die Allele keiner Selektion unterliegen.
Bei zwei kodominant exprimierten Allelen im HWE folgt die Verteilung der Allele der
Binominalfunktion p2 + 2pq + q
2, wobei p und q den jeweiligen Allelfrequenzen entspricht.
Um nun den Einfluss von mHag-Mismatchen auf die allogene HSCT zu untersuchen,
müssen zuerst die statistischen Endpunkte, die den Erfolg einer allogenen HSCT
determinieren, festgelegt werden. Dazu wählen wir als primären Endpunkt das
Gesamtüberleben (engl.: Overall Survival - OS), welches als Zeit zwischen Transfusion
der Stammzellen (Tag 0) bis zum Todeszeitpunkt (Tod jeglicher Ursache) definiert wird.
Als sekundäre, miteinander konkurrierende Endpunkte werden anhand der EBMT-
Empfehlungen (Labopin et al, 2009) folgende Parameter ausgewählt:
Inzidenz einer klinischen aGvHD (Grad II-IV) eingeteilt nach der Glucksberg-
Skala (Glucksberg et al, 1974)
Inzidenz eines Krankheitsrückfalls (Relapseinzidenz)
Inzidenz von transplantationsassoziierter Mortalität (Transplant related mortality -
TRM) bzw. Non relapse mortality (NRM), definiert als Tod durch
transplantationsbedingte Komplikationen bzw. Tod, der nicht durch einen
Krankheitsrückfall/-progress bedingt ist
49
Zusätzlich zu den statistischen Endpunkten haben wir Störgrößen identifiziert, die
ihrerseits möglicherweise einen Effekt auf die von uns gewählten Endpunkte haben und
deswegen in der Lebenszeitanalyse zusätzlich zu den mHag-Mismatchen berücksichtigt
werden müssen.
Folgende Risikofaktoren werden untersucht und, je nach Einfluss, in der multivariaten
Analyse als Kovariate berücksichtigt:
Patientenabhängige Faktoren:
Patientenalter bei HSCT (18-67Jahre)
Patientengeschlecht (männlich/weiblich)
Krankheitsstadium bei HSCT (Stadium 1 bis 3)
Diagnose (AML, ALL, CML, MDS, sonstige)
Spenderabhängige Faktoren:
Geschlechtsmismatch (siehe Kapitel 1.3, Abschnitt 4)
Stammzellquelle (KM/PBSZ)
HLA-Kompatibilität (match/mismatch)
Spenderalter und -geschlecht
Therapiebezogene Faktoren:
GvHD-Prophylaxe (CsA+MTX, CsA+andere, andere)
Konditionierung (MAC/RIC)
Zur Evaluation des Einflusses der einzelnen mHag-Mismatche auf die gewählten
Endpunkte in Überlebenszeit- und kompetitiver Risikoanalyse wird unsere Kohorte in
mehrere Subgruppen je nach HLA-Restriktionen der jeweiligen mHags eingeteilt (siehe
hierzu Kapitel 3.3, Tabelle 14). Jedes mHag wird somit in einer Subgruppe mit der zu ihm
passenden HLA-Restriktion in Bezug auf die oben genannten Endpunkte analysiert. In den
Subgruppen werden die Einflüsse der verschiedenen mHag-Mismatche auf die Endpunkte
wie folgt analysiert: Für jedes mHag werden zuerst die möglichen Richtungen eines
Mismatchs festgelegt, dann werden für jede Richtung jeweils die Inzidenz- bzw.
Überlebenskurven einer Mismatchsituation den Inzidenz- bzw. Überlebenskurven einer
Matchsituation gegenübergestellt.
Mögliche Mismatchrichtungen entstehen wie folgt:
Ein Mismatch in GvH-Richtung entsteht dadurch, dass das antigene Peptid des jeweiligen
mHag beim Patienten exprimiert wird und folglich von Spender-T-Zellen als fremd
erkannt wird, da der Spender nur das nicht für ein Antigen kodierende Allel besitzt. Genau
50
umgekehrt entsteht ein Mismatch in HvG-Richtung: Übrig gebliebene Patienten-T-Zellen
erkennen ein von Spender-Zellen exprimiertes mHag als fremd, da sie wegen Fehlens des
antigenen Peptids auf Patientenzellen bisher keinen Kontakt damit hatten. Exprimieren nun
Patienten- und Spenderzellen beide das antigene Peptid (oder beide nur das nicht-antigene
Peptid) entsteht eine Matchsituation. Zusätzlich dazu haben wir ein Mismatch als solches
(GvHoderHvG-Richtung) der Matchsituation gegenüber gestellt.
Bei mHag, dessen antigene Peptide bisher unbekannt sind (gilt nur für CD31 und CD62L)
sowie HB-1, das bekannterweise für zwei verschiedene antigene Peptide kodiert, wird
zusätzlich noch die Situation GvHundHvG-Mismatch (d. h. Mismatch in beiden
Richtungen) der Matchsituation gegenübergestellt.
2.2.6.2 Überlebenszeitanalysen
Im Rahmen der Überlebenszeitanalyse vergleichen wir die Überlebenskurven je nach
mHag-Status (match/mismatch) mittels Cox-Regressionsanalyse (uni- und multivariat).
Sowohl uni- als auch multivariate Analysen werden mit dem proportionalen Hazard-
Modell (Cox-Modell) durchgeführt. Dieses Modell, die populärste Regressionsmethode zur
Analyse von Überlebensdaten, kann verwendet werden, wenn gleichzeitig der Effekt von
mehreren Einflussgrößen auf eine Zielvariable untersucht werden soll, kann jedoch auch
für die Analyse einzelner Einflussgrößen verwendet werden. Bei der Zielvariablen handelt
es sich hier um zensierte Überlebenszeiten. Die Grundidee der Cox-Regressionsanalyse ist
es, den Effekt der Therapie (hier: der Stammzelltransplantation) auf die Überlebenszeit zu
schätzen, adjustiert für alle anderen Einflussgrößen (stetig oder kategorial) des
Regressionsmodells. Es erlaubt, die Hazard Ratio (das unmittelbare Risiko) für einen
Patienten im Hinblick auf das interessierende Ereignis (hier: Tod: ja/nein) zu schätzen
(Ziegler et al, 2007).
Folgende Bedingung muss für die Cox-Regressionsanalyse erfüllt sein: die Verfügbarkeit
von Werten für alle Einflussfaktoren von allen untersuchten Individuen (bei Nicht-
Vorhandensein: Zensierung). Ein zeitlich konstanter Einfluss der verschiedenen Variablen
auf das Überleben wird außerdem angenommen. Für die Überlebenszeit wird keine
bestimmte Verteilung benötigt; auch der Beobachtungszeitraum muss nicht für alle
Individuen gleich lang sein. Somit kommt der Hazard-Funktion der zentrale Begriff zur
Interpretation der Ergebnisse zu. Mit der Hazard-Funktion wird die Wahrscheinlichkeit pro
Zeiteinheit bezeichnet, dass ein Patient innerhalb eines kleinen Zeitintervalls das
51
Zielereignis (hier: Tod) erfährt, wenn er den Beginn des Zeitintervalls erreicht hat. Durch
die Annahme der Proportionalität (Gleichheit des Hazards über die Zeit hinweg), kommt
man zur Definition einer von der Zeit unabhängigen Hazard Ratio (HR). Das zugehörige
95%-Konfidenzintervall (95%CI) gibt an, dass das tatsächliche HR mit 95%iger Sicherheit
zwischen den durch die obere und untere Konfidenzintervallgrenze gegebenen Werten liegt
(Ziegler et al, 2007).
In der univariaten Analyse wird nur der mHag-Matching-Status (match/mismatch) in
Bezug zum Gesamtüberleben gesetzt. MHag, die sich in der univariaten Analyse als
signifikant erwiesen (p<0,05) bzw. deren Einfluss geringfügig eine Signifikanz verfehlte
(0,1>p>0,05), sowie oben genannte Risikofaktoren (je nach Signifikanz ihres Einflusses)
werden in die multivariate Analyse miteinbezogen (siehe hierzu Kapitel 3.7, Abschnitt
1.1).
2.2.6.3 Analysen der Inzidenzen von aGvHD, Relapse und TRM/NRM
Da die sekundären Endpunkte in ihrem Auftreten nach HSCT miteinander konkurrieren
und auch parallel oder nacheinander auftreten können, gibt uns die Cox-
Regressionsanalyse durch falsche Zensuren falsche Auftretenswahrscheinlichkeiten eines
jeden Endpunktes. Um dem zu entgehen, berechnen wir die kumulativen Inzidenzen von
aGvHD, TRM/NRM, Relapse je nach mHag-Status (match/mismatch) und stellen sie den
kumulativen Inzidenzen ihres jeweiligen kompetitiven Risikos (auch je mHAg-Status)
gegenüber. Die Inzidenzen einer cGvHD untersuchen wir aufgrund mangelnder
Datenverfügbarkeit nicht.
Tabelle 10 zeigt die sekundären Endpunkte und deren kompetitive Risiken.
Tabelle 10: Sekundäre Endpunkte und deren kompetitive Risiken; TRM: Transplant related
mortality, NRM: Non relapse mortality, aGvHD: akute Graft-versus-Host Erkrankung, Tod
anderer Ursache: unbekannte Todesursache oder Tod durch andere Erkrankung
(Sekundärmalignom, Herzinfarkt, etc.)
Endpunkte Kompetitives Risiko
TRM/NRM Relapse + Tod anderer Ursache
aGvHD Relapse + TRM/NRM + Tod anderer
Ursache
Relapse TRM/NRM + Tod anderer Ursache
52
Die kumulative Inzidenz (engl. cumulative incidence rate) ist ein personenbezogenes
Risikomaß und drückt die Wahrscheinlichkeit aus, dass eine Person in einem Zeitraum
erkrankt bzw. von dem betrachteten Problem betroffen wird (hier: an TRM verstirbt, ein
Relapse/aGvHD erleidet). Sie wird vor allem in Längsschnittstudien verwendet und wird
als Quotient aus der Anzahl der (im betrachteten Zeitraum) erkrankten Personen und dem
Anfangsbestand (gesunder) Personen errechnet.
Wir analysieren die kumulativen Inzidenzen der sekundären Endpunkte und ihrer
jeweiligen kompetitiven Risiken mittels kompetitiver Risikoanalyse. Die kompetitive
Risikoanalyse ist darauf ausgelegt, Auftretenswahrscheinlichkeiten eines bestimmten
Endpunktparameters unter Berücksichtigung der konkurrierenden Risiken in
unterschiedlichen Gruppen zu berechnen (Kim, 2007). Auch hier werden signifikante
mHag und Risikofaktoren in der univariaten Analyse (p<0,05) im multivariaten Modell
berücksichtigt. Durch schrittweisen Ausschluss von Kovariaten mit zu geringer Signifikanz
(p>0,1) wird die Wahl des besten Modells möglich (backward stepwise exclusion) (siehe
hierzu Kapitel 3.7, Abschnitt 2.2).
53
3. Resultate
3.1 Validierung des Testkits
Durch die PCR-SSP-Methodik wurde es uns ermöglicht, die Polymorphismen von 11
verschiedenen mHag eines Individuums gleichzeitig durch sequenzspezifische
Amplifizierung bestimmter Genabschnitte zu bestimmen.
Zunächst wurde der eingesetzte Testkit (CTS-PCR-SSP MINITRAY KIT, Prod. No. 229,
Universitätsklinikum Heidelberg, Heidelberg, Deutschland) anhand von 8 Referenz-DNA-
Proben in unserem Labor validiert (siehe hierzu Tabelle 11, Abbildungen 12 und 13).
Tabelle 11: Ergebnisse der Testung der acht Referenz-DNAs und Grad der
Übereinstimmung mit den Vorergebnissen aus Heidelberg, Cd: Codon, Pers: Person
Gen HA-
1
HA-
2
HA-
3
HA-
8
HB-
1
ACC-
1
ACC-
2 UGT2B17
CD31
Cd 125
CD31
Cd 563
CD31
Cd 670
Übereinstim-
mung mit
Vortestung DNA
Pers1 H/R V/M T/T R/P H/H Y/C D/G Positiv L/V N/S R/G 100%
Pers2 H/H M/M T/T R/P H/Y Y/C D/G Positiv V/V N/N G/G 100%
Pers3 R/R V/M T/M P/P Y/Y Y/Y G/G Positiv L/V N/S R/G 100%
Pers4 R/R V/M T/M P/P H/Y Y/C D/G Positiv L/L S/S R/R 100%
Pers5 H/H V/V T/T R/R H/H C/C G/G Positiv V/V N/N G/G 100%
Pers6 R/R V/M M/M R/R H/Y C/C G/G Positiv L/L S/S R/R 100%
Pers7 R/R V/V T/T R/R H/H C/C G/G Positiv L/V N/S R/G 100%
Pers8 R/R V/M T/M P/P H/Y Y/C D/G Negativ V/V N/N G/G 100%
Beispielgelbilder:
Abbildung 12: Gelelektrophorese Pers2 Abbildung 13: Gelelektrophorese Pers3
54
Nach erfolgreicher Validierung wurden mithilfe dieses Testkits die 320 Patienten-Spender-
Paare auf die mHag HA-1, HA-2, HA-3, HA-8, HB-1, ACC-1, ACC-2, CD31 (Codon 125,
563 und 670), CD62L (Codon 206 und 213), PANE-1 und UGT2B17 getestet.
3.2 Allel- und Genotypverteilung der untersuchten mHag
3.2.1 Allel- und Genotyphäufigkeiten der mHag und Vergleich mit dem Hardy-
Weinberg-Gleichgewicht
Tabelle 12 zeigt die relativen Allelhäufigkeiten und die absoluten, sowie relativen
Genotyphäufigkeiten der in dieser Arbeit untersuchten mHag in den Gruppen der
Patienten, Spender und einer von uns gewählten Gruppe von Vergleichspersonen (aus
Spierings et al, 2007); dazu den p-Wert und die χ2-Statistik des Vergleichs der
Allelfrequenzen in den jeweiligen Gruppen mit der Verteilung im Hardy-Weinberg-
Gleichgewicht (HWE). Das HWE beschreibt die Verteilung zweier Allele in einer idealen
Population (große Anzahl Individuen, keine Selektion, Panmixie) nach der
Binomialfunktion p2 + 2pq + q
2=1, wobei p und q die jeweiligen Allelfrequenzen
darstellen.
Tabelle 12: Genotyp- und Allelfrequenzen der untersuchten mHag-Polymorphismen nach
Testung von Patienten (n=320), deren gesunden, unverwandten Spendern (n=320) und
einem US-Referenzkollektiv (n=2011). HWE: Analyse der Übereinstimmung der
Allelverteilung mit dem HWE in den jeweiligen Gruppen mittels χ2
–Test
Patienten (n=320) Spender (n=320) US Referenzkollektiv
1
(white caucasien) (n=2011)
Genotyp Verteilung Frequenz Verteilung Frequenz Verteilung Frequenz
HA-1 H,H 41 0,13 40 0,13 261 0,13
HA-1, H,R 148 0,46 158 0,49 925 0,46
HA-1, R,R 131 0,41 122 0,38 825 0,41
Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00
Allelfrequenz HA-1 H 0,36
0,37
0,36
Allelfrequenz HA-1 R 0,64 0.63 0,64
Vergleich mit HWE P=0,94
χ2=0,006
P=0,31
χ2=1,04
P=0,95
χ2=0,005
55
Tabelle 12: Fortsetzung
HA-2 VV 210 0,66 192 0,60 1146 0,57
HA-2 VM 100 0,31 111 0,35 764 0,38
HA-2 MM 10 0,03 17 0,05 101 0,05
Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00
Allelfrequenz HA-2 V 0,81
0,77
0,76
Allelfrequenz HA-2 M 0,19 0,23 0,24
Vergleich mit HWE P=0,65
χ2=0,21
P=0,85
χ2=0,03
p=0,07
χ2=3,36
HA-3 TT 126 0,39 114 0,35 865 0,43
HA-3 TM 153 0,48 156 0,49 885 0,44
HA-3 MM 41 0,13 50 0,16 261 0,13
Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00
Allelfrequenz HA-3 T 0,63
0,60
0,65
Allelfrequenz HA-3 M 0,37 0,40 0,35
Vergleich mit HWE P=0,61
χ2=0,27
P=0,78
χ2=0,08
P=0,14
χ2=2,13
HA-8 RR 53 0,16 51 0,16 402 0,2
HA-8 RP 156 0,49 173 0,54 1006 0,5
HA-8 PP 111 0,35 96 0,30 603 0,3
Gesamt 320 1,00 320 1,0 2011 1,0
Allelfrequenz HA-8 R 0,41
0,43
0,45
Allelfrequenz HA-8 P 0,59 0,57 0,55
Vergleich mit HWE P=0,88
χ2=0,02
P=0,07
χ2=3,4
P=0,63
χ2=0,23
HB-1 HH 170 0,53 187 0,58 1086 0,54
HB-1 HY 139 0.44 115 0,36 825 0,41
HB-1 YY 11 0,03 18 0,06 100 0,05
Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00
Allelfrequenz HB-1 H 0,75
0,76
0,75
Allelfrequenz HB-1 Y 0,25 0,24 0,25
Vergleich mit HWE P=0,006
χ2=7,5
P=0,95
χ2=0,003
P=0,0003
χ2=12,9
56
Tabelle 12: Fortsetzung
ACC-1 Y,Y 12 0,04 26 0,08 141 0,07
ACC-1, Y,C 127 0,40 114 0,36 804 0,40
ACC-1, C,C 181 0,56 180 0,56 1066 0,53
Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00
Allelfrequenz ACC-1 Y 0,24
0,26
0,27
Allelfrequenz ACC-1 C 0,76 0,74 0,73
Vergleich mit HWE P=0,07
χ2=3,25
P=0,19
χ2=1,69
P=0,52
χ2=0,40
ACC-2 DD 12 0,04 24 0,08 121 0,06
ACC-2 DG 123 0,38 112 0,35 764 0,38
ACC-2 GG 185 0,58 184 0,57 1126 0,56
Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00
Allelfrequenz ACC-2 D 0,23
0,25
0,25
Allelfrequenz ACC-2 G 0,77 0,75 0,75
Vergleich mit HWE P=0,12
χ2=2,4
P=0,23
χ2=1,42
p=0,57
χ2=0,33
CD31-Cd125 LL 60 0,19 74 0,23 **
CD31-Cd125 LV 154 0,48 156 0,49
CD31-Cd125 VV 106 0,33 90 0,28
Gesamt 320 1,00 320 1,00
Allelfrequenz CD31-Cd125 L 0,43
0,48
Allelfrequenz CD31-Cd125 V 0,57 0,52
Vergleich mit HWE P=0,76
χ2=0,09
P=0,69
χ2=0,16
CD31 Cd563 NN 98 0,31 85 0,27 **
CD31 Cd563 NS 155 0,48 160 0,50
CD31 Cd563 SS 67 0,21 75 0,23
Gesamt 320 1,00 320 1,0
Allelfrequenz CD31 Cd563 N 0,55
0,52
Allelfrequenz CD31 Cd563 S 0,45 0,48
Vergleich mit HWE P=0,69
χ2=0,16
P=0,99
χ2=0,0003
57
Tabelle 12: Fortsetzung
CD31 Cd670 RR 67 0,21 77 0,24 **
CD31 Cd670 RG 154 0,48 157 0,49
CD31 Cd670 GG 99 0,31 86 0,27
Gesamt 320 1,00 320 1,00
Allelfrequenz CD31 Cd670 R 0,45
0,49
Allelfrequenz CD31 Cd670 G 0,55 0,51
Vergleich mit HWE P=0,62
χ2=0,25
P=0,75
χ2=0,10
CD62L Cd206 FF 171 0,53 172 0,54 **
CD62L Cd206 FL 129 0,4 132 0,41
CD62L Cd206 LL 20 0,06 16 0,05
Gesamt 320 1,00 320 1,00
Allelfrequenz CD62L Cd206 F 0,74
0,74
Allelfrequenz CD62L Cd206 L 0,26 0,26
Vergleich mit HWE P=0,51
χ2=0,44
P=0,14
χ2=2,16
CD62L-Cd213 PP 235 0,73 242 0,76 **
CD62L-Cd213 PS 80 0,25 69 0,22
CD62L-Cd213 SS 5 0,02 9 0,03
Gesamt 320 1,00 320 1,00
Allelfrequenz CD62L
Cd213 P 0,86
0,86
Allelfrequenz CD62L
Cd213 S 0,14 0,14
Vergleich mit HWE P=0,54
χ2=0,38
P=0,14
χ2=2,16
PANE-1 RR 154 0,48 169 0,53 945 0,47
PANE-1 R/stop 133 0,42 125 0,39 905 0,45
PANE-1 Stop/stop 33 0,1 26 0,08 161 0,08
Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00
Allelfrequenz PANE-1 R 0,69 0,72 0,69
Allelfrequenz PANE-1 Stop 0,31 0,28 0,31
58
Vergleich mit HWE P=0,59
χ2=0,29
P=0,67
χ2=0,18
P=0,006
χ2=7,57
* UGT2B17 pos 276 0,86 281 0,88 1931 0,96
UGT2B17 neg 44 0,14 39 0,12 80 0,04
Gesamt 320 1,00 320 1,00 2011 1,00
1: Spierings et al, 2007, *: Mit der PCR-SSP-Testung wurde der heterozygote Genotyp nicht erfasst; das
mHag wurde nur auf vorhanden („positiv“ – hierin enthalten sind homozygote und heterozygote
Merkmalsträger) oder nicht vorhanden („negativ“) getestet; deswegen konnten die Allelfrequenzen nicht
berechnet und somit auch kein Vergleich mit dem HWE stattfinden, **: keine Angaben zu
Vergleichspersonen vorhanden
Bis auf HB-1 in der Patientengruppe befinden sich alle anderen von uns untersuchten
mHag-Allele in Übereinstimmung mit dem HWE. Bei unseren Patienten ist das
Gleichgewicht zugunsten von HB-1 HH (53%) und HB-1 HY (44%) verschoben, HB-1
YY ist mit nur 3% zu selten vorhanden. Um dies genauer zu charakterisieren, haben wir
die HB-1-Patientengruppe nach den einzelnen Krankheitsbildern aufgeteilt und die
Verteilung der Allel- bzw. Genotypfrequenzen in den einzelnen Subgruppen mit dem
HWE verglichen (siehe hierzu Tabelle 13). Hierbei lässt sich eine signifikante Abweichung
vom HWE in der Gruppe der CML-Patienten nachweisen (p=0,04). CML-Patienten weisen
HB-1 HH und HY vermehrt auf, im Gegensatz zur homozygoten HB-1YY Form. In der
Referenzgruppe der weißen US-Amerikaner wird unser Ergebnis für HB-1 bestätigt: auch
hier besteht eine Abweichung vom HWE (p=0,0003) mit nur 5% homozygoten HB-1 YY
Trägern. Zudem weicht in der Referenzgruppe auch PANE-1 vom HWE ab (p=0,006),
siehe hierzu Tabelle 12.
Tabelle 13: Genotyphäufigkeiten und Allelfrequenzen von HB-1 aufgeteilt nach
Krankheitsgruppen; p-Wert und χ2 –Statistik des Vergleichs mit dem HWE
HB-1 Genotyp ALL
(n=58)
AML
(n=98)
CML
(n=88)
MDS
(n=28)
Andere
(n=48)
HB-1 HH 32 (55,2%) 52 (53,1%) 45 (51,1%) 15 (53,5%) 26 (54,2%)
HB-1 HY 25 (43,1%) 40 (40,8%) 41 (46,6%) 12 (42,9%) 21 (43,7%)
HB-1 YY 1 (1,7%) 6 (6,1%) 2 (2,3%) 1 (3,6%) 1 (2,1%)
Vergleich mit
HWE
P=0,11
χ2=2,48
P=0,64
χ2=0,21
P=0,04
χ2=4,42
P=0,45
χ2=0,57
P=0,16
χ2=1,93
59
3.2.2 Vergleich der relativen mHag-Genotyphäufigkeiten zwischen den
einzelnen Gruppen
Darüber hinaus haben wir die Genotypverteilungen der mHag in den Gruppen Spender,
Patienten und US-Vergleichpersonen mittels χ2
–Test miteinander verglichen, um die
Eignung unserer Referenzgruppe zu bestätigen. Hierbei zeigte sich eine signifikante
Abweichung (p<0,0001) der Häufigkeit von UGT2B17 zwischen den von uns untersuchten
Spendern bzw. Patienten und dem Referenzkollektiv der weißen US-Amerikaner. Bei den
Vergleichspersonen (96%) ist UGT2B17 um 10% häufiger als bei unseren Patienten (86%)
und um 8% häufiger als bei unseren gesunden Spendern (88%). Dagegen zeigte sich beim
Vergleich zwischen unseren Patienten und Spendern keine signifikante Abweichung
(p=0,55). Es gab auch für keine anderen mHag signifikante Unterschiede zwischen den
Genotyphäufigkeiten von Spendern und Patienten.
3.3 Verteilung der HLA-Merkmale in der untersuchten Kohorte
Als Studieneinschlusskriterium für Patienten-Spender-Paare wurde festgelegt, dass
mindestens ein HLA-Merkmal vorhanden ist, in dem nachweislich mindestens eins der von
uns untersuchten mHag exprimiert wird (siehe Kapitel 2.1, Abschnitt 2). Für CD31 und
CD62L, bei denen bisher keine genaue MHC-Restriktion bekannt ist, werden HLA-
Superfamilien mit bestimmten Peptidbindungseigenschaften vermutet, die diese mHag
möglicherweise binden können (siehe Kapitel 1.3, Abschnitt 5, Tabelle 4). Neben der
Analyse in den dadurch gebildeten Subgruppen wurden CD31 und CD62L außerdem in der
Gruppe aller vorhandenen HLA-Merkmale untersucht. Patienten-Spender-Paare mit HLA-
Mismatchen wurden nur unter der Bedingung, dass die HLA-Mismatche außerhalb des
Restriktionsmoleküls für das jeweilige untersuchte mHag liegen in eine Subgruppe mit
eingeschlossen.
Eingeteilt nach HLA-Merkmalen ergaben sich die in Tabelle 14 dargestellten Subgruppen,
die somit auch für die spätere statistische Analyse relevant sind.
60
Tabelle 14: Subgruppen nach HLA-Merkmalen mit den jeweils in ihnen exprimierten
mHag und der Anzahl Paare (n) aus unserer Kohorte, die dieses HLA-Merkmal besitzen
HLA-
Merkmal HLA-A*01 HLA-A*02 HLA-A*03
HLA-A*03-
Superfamilie HLA-A*24 HLA-A*29
mHag HA-3 HA-1, HA-2,
HA-8 PANE-1 CD62L ACC-1 UGT2B17
Anzahl
Paare n=112 n=166 n=88 n=140 n=69 n=15
HLA-
Merkmal HLA-B*44
HLA-B*44-
Superfamilie
HLA-B*07-
Superfamilie Alle HLA
mHag HB-1
ACC-2
CD31,
CD62L CD31
CD31,
CD62L
Anzahl
Paare n=77 n=107 n=166 n=320
3.4 Bestimmung der Einflussfaktoren und Zielgrößen für die
Subgruppenanalyse
3.4.1 Zielgrößen
Um den Einfluss von mHag-Mismatchen auf die HSCT messbar zu machen, wurden, den
Empfehlungen der EBMT folgend, Zielgrößen (Endpunkte) definiert (Labopin et al, 2009).
Für alle diese Endpunkte wurden Patienten, die während der Beobachtungszeit verloren
gingen (loss to follow up) zensiert. Unsere primäre Zielgröße ist das Gesamtüberleben,
unsere sekundären, gegenseitig konkurrierenden Zielgrößen sind aGvHD-Inzidenz,
Relapseinzidenz und TRM/NRM (siehe hierzu Tabelle 15). Eine genauere Beschreibung
der Zielgrößen findet sich in Kapitel 2.2, Abschnitt 6.1.
61
3.4.2 Einflussfaktoren/Risikofaktoren
Die Heterogenität unserer Kohorte (siehe Kapitel 2.1.2 und Tabelle 6) erforderte die
Identifikation und Prüfung diverser Risikofaktoren, die bei der Analyse des Einflusses von
mHag auf die von uns festgelegten Zielgrößen als Störfaktoren auftreten können, da sie
möglicherweise ihrerseits diese Zielgrößen beeinflussen. Diese patienten–, spender-, und
therapieabhängigen Risikofaktoren wurden an Hand der gängigen Literatur (Appelbaum,
2003; Hart and Peggs, 2007; Aschan, 2006; Spellman et al, 2009) definiert und je nach
ihrer Signifikanz in die multivariaten Analysenmodelle mit oben genannten Endpunkten
mit einbezogen (siehe hierzu Tabelle 15). Eine genauere Beschreibung der Risikofaktoren
findet sich in Kapitel 2.2, Abschnitt 6.1.
Tabelle 15: Risikofaktoren und Zielgrößen; HLA: humanes Leukozyten Antigen, GvH:
Graft-versus-host, aGvHD: akute Graft-versus-host-disease, TRM: Transplant related
mortality, NRM: Non relapse mortality
Risikofaktoren (unabhängige Variablen) Zielgrößen (abhängige Variablen)
Diagnose Gesamtüberleben
Krankheitsstadium Inzidenz eines Relapses
Patientenalter Inzidenz einer aGvHD
Patientengeschlecht Inzidenz von TRM/NRM
Geschlechtsmatch
Stammzellquelle
HLA-Match
Konditionierung
GvH-Prophylaxe
Spenderalter und -geschlecht
62
3.5 Quantitative Ergebnisse des Gesamtkollektivs
3.5.1 Gesamtüberleben
Nach einer medianen Nachbeobachtungszeit von 334,5 Tagen (11,1 Monaten) lebten noch
161 (50,3%) von 320 Patienten. Die Drei-Jahres-Überlebensrate beträgt 38,1% (122 von
320 Patienten), die Fünf-Jahres-Überlebensrate 32,8% (105 von 320 Patienten).
3.5.2 Todesursache
Insgesamt sind 204 Patienten während der Nachbeobachtungszeit verstorben (63,8%).
Hiervon sind 57 (27,9%) an einem Krankheitsrückfall, 132 (64,7%) durch therapiebedingte
Nebenwirkungen (TRM/NRM), 2 (1%) durch Sekundärmalignome, 2 (1%) aufgrund
anderer Todesursachen und 11 (5,4%) durch unbekannte Ursachen verstorben.
3.5.3 Relapseinzidenz
Während des gesamten Beobachtungszeitraumes erlitten 91 Patienten (28,4%) einen
Rückfall ihrer Grunderkrankung.
3.5.4 NRM/TRM
Insgesamt sind 132 Patienten (41,3%) verstorben, ohne einen Krankheitsrückfall/ -progress
zu erleiden bzw. an transplantationsbedingten Komplikationen.
3.5.5 Inzidenz der akuten GvHD
Während des Nachbeobachtungszeitraumes entwickelten 140 Patienten (43,8%) eine akute
GvHD Grad II oder höher.
63
3.6 Statistische Auswertung der Einflussfaktoren
Folgende Risikofaktoren zeigen signifikant nachweisbare Einflüsse auf die von uns
untersuchten Endpunkte und werden deswegen in den multivariaten Analysemodellen
berücksichtigt:
3.6.1 Patientenalter
Das Alter eines Patienten spielt beim Gesamtüberleben eine entscheidende Rolle: So
nimmt die Überlebenswahrscheinlichkeit mit steigendem Alter zum Zeitpunkt einer HSCT
ab (p=0,02). Signifikant schlechter als die Referenzgruppe der 18-40jährigen Patienten
überleben zudem die 51-60jährigen (p=0,006, HR: 1,67, 95%CI: 1,16-2,41); bei den 41-
50jährigen und den über 60jährigen lässt sich eine Tendenz feststellen (p=0,17 bzw.
p=0,10), siehe hierzu Tabelle 16 und Abbildung 14.
Der Einfluss des Patientenalters auf die Relapseinzidenz verfehlt zwar knapp eine
Signifikanz (p=0,05); jedoch zeigen Patienten in höherem Alter tendenziell häufiger
Krankheitsrückfälle.
Tabelle 16: Patientenalter klassifiziert in Gruppen mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert) des
Einflusses auf das Gesamtüberleben in Tagen, HR und 95% Konfidenzintervall;
Referenzgruppe ist die Gruppe der 18-40jährigen; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad
df
Signifikanz
(p-Wert) HR
95,0% Konfidenzintervall für HR
Untere Grenze Obere Grenze
Patientenalter (gesamt) 3 0,023
Patientenalter (41-50 Jahre) 1 0,170 1,253 0,908 1,729
Patientenalter (51-60 Jahre) 1 0,006 1,670 1,160 2,405
Patientenalter (>60Jahre) 1 0,102 2,310 0,847 6,300
64
Abbildung 14: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit vom
Patientenalter in Jahren (kategorial: 18-40 Jahre, 41-50 Jahre, 51-60 Jahre, >60 Jahre)
3.6.2 Diagnose
Die Diagnose beeinflusst signifikant das Gesamtüberleben (p<0,001). Für das
Gesamtüberleben gilt dabei eine zunehmend ungünstige Beeinflussung in der Reihenfolge
CML - MDS – sonstige– ALL– AML, siehe hierzu Tabelle 17 und Abbildung 15.
Außerdem beeinflusst die Diagnose das Auftreten eines Relapses signifikant (p=0,03): die
Relapsewahrscheinlichkeit steigt in der Reihenfolge MDS – CML – ALL – AML –
sonstige.
Tabelle 17: Diagnosen klassifiziert in Gruppen mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert) des
Einflusses auf das Gesamtüberleben in Tagen, HR und 95% Konfidenzintervall,
Referenzgruppe ist die Gruppe der CML-Patienten; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad
df
Signifikanz
(p-Wert) HR
95,0% Konfidenzintervall für HR
Untere Grenze Obere Grenze
Diagnose (gesamt) 4 <0,001
Diagnose AML 1 <0,001 2,434 1,643 3,604
Diagnose ALL 1 <0,001 2,235 1,443 3,461
Diagnose sonstige 1 0,006 1,922 1,204 3,067
Diagnose MDS 1 0,312 1,361 0,749 2,475
65
Abbildung 15: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit der
verschiedenen Diagnosen (CML, MDS, sonstige, ALL, AML); „sonstige“ umfasst:
Lymphome, Multiples Myelom/Plamsozytom, aplastische Anämie und CLL
3.6.3 Krankheitsstadium
Auch das Krankheitsstadium beeinflusst signifikant das Gesamtüberleben. So überleben
Patienten, die im Krankheitsstadium 2 und 3 transplantiert werden signifikant schlechter,
als diejenigen, die im ersten Stadium ihrer Erkrankung transplantiert werden (p<0,001),
siehe hierzu Tabelle 18 und Abbildung 16.
Tabelle 18: Krankheitsstadium klassifiziert in Gruppen mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert)
des Einflusses auf das Gesamtüberleben in Tagen, HR und 95% Konfidenzintervall,
Referenzgruppe ist Krankheitsstadium 1; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad, ges: gesamt
df
Signifikanz
(p-Wert) HR
95,0% Konfidenzintervall für HR
Untere Grenze Obere Grenze
Stadium (ges) 2 <0,001
Stadium 2 1 <0,001 1,919 1,367 2,694
Stadium 3 1 <0,001 2,552 1,717 3,793
66
Abbildung 16: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit der
verschiedenen Krankheitsstadien (Stadium 1-3)
Der Einfluss des Krankheitsstadiums auf die Inzidenz eines Krankheitsrückfalles verfehlt
nur knapp eine Signifikanz (p=0,09), weist aber auf eine Tendenz hin. Somit zeigen in
höheren Krankheitsstadien transplantierte Patienten tendenziell häufiger einen
Krankheitsrückfall.
3.6.4 Stammzellquelle
Periphere Blutstammzellen zeigen eine höhere Relapseinzidenz (p=0,005; HR: 2,09;
95%CI: 1,2-3,5) als Knochenmark. Zusätzlich zeigen PBSZ ein schlechteres
Gesamtüberleben mit schwacher Signifikanz (p=0,04). Außerdem zeigen PBSZ, auch hier
mit schwacher Signifikanz, eine geringere Wahrscheinlichkeit zur Entwicklung einer
aGvHD (p=0,04) im Vergleich zu Knochenmark.
67
3.6.5 HLA-Match
Das HLA-Match hat zwar auf das Gesamtüberleben (p=0,46), die Inzidenz einer aGvHD
(p=0,6) oder eines Relapses (p=0,15) keinen Einfluss, spielt jedoch beim Tod durch
transplantationsassoziierte Ursachen (TRM/NRM) eine signifikante Rolle (p=0,009; HR:
1,8; 95%CI: 0,8-4,12), sodass Patienten mit HLA-Mismatch häufiger an
transplantationsbedingten bzw. non relapse bedingten Ursachen versterben, als deren
gematchte Gegenüber.
3.6.6 Geschlechtsmismatch
Bei Transplantationen mit weiblichen Spendern für männliche Patienten (positives
Geschlechtsmismatch) tritt häufiger ein Krankheitsrückfall auf. So haben Paare mit
Geschlechtsmismatch ein signifikant höheres Risiko ein Relapse zu erleiden (p=0,01; HR:
1,98; 95%CI: 1,15- 3,40).
3.6.7 Konditionierungsregime
Patienten mit reduziertem Konditionierungsregime (RIC) haben eine signifikant höhere
Relapseinzidenz (p<0,001; HR: 2,56; 95%CI: 1,5- 4,4) als Patienten, die eine
myeloablative Konditionierung (MAC) erhalten.
3.6.8 Nicht relevante Faktoren
Die Faktoren Patientengeschlecht, Spendergeschlecht und –alter, sowie Art der GvHD-
Prophylaxe nehmen keinen signifikanten Einfluss auf die von uns untersuchten Zielgrößen.
68
3.7 Statistische Auswertung der mHag
Um die Einflüsse der einzelnen mHag-Mismatche univariat oder zusammen mit den
jeweiligen Risikofaktoren (multivariat) auf die genannten Outcomes zu messen, werden
Subgruppen anhand der MHC-Restriktion der verschiedenen mHag eingeteilt (siehe
Kapitel 3.3).
3.7.1 Analyse des Gesamtüberlebens
Da der längste Nachbeobachtungszeitraum bei unseren Patienten acht Jahre beträgt, haben
wir die Überlebenszeitanalyse auf 3000 Tage nach HSCT begrenzt.
3.7.1.1 Univariate Analyse
Die univariate Überlebensanalyse wird mittels Cox-Regressionsanalyse durchgeführt
(siehe Kapitel 2.2, Abschnitt 6.2). Es wird nur der Einfluss von mHag-Match/-Mismatch
auf das Überleben berücksichtigt. Tabelle 19 zeigt die Signifikanzen, Hazard Ratios und
deren 95% Konfidenzintervalle der unterschiedlichen Überlebenskurven bei match und
mismatch für jedes mHAg in seinen möglichen Mismatchrichtungen:
Folgende signifikante Ergebnisse zeigen sich nach univariater Analyse:
a) In der Gesamtgruppe (alle HLA-Merkmale) zeigen Patienten, die mit ihrem
Spender ein CD31 Codon 563 Mismatch in HvG-Richtung aufweisen, ein
signifikant besseres Überleben als die gematchten Patienten (p=0,03; HR: 0,72;
95%CI: 0,54- 0,96).
b) In der HLA-B7-Superfamilie zeigen Patienten mit GvHoderHvG-Mismatches zu
ihren Spendern in sowohl CD31 Codon 563 als auch Codon 670 ein signifikant
besseres Überleben als die gematchten Patienten (jeweils p=0,04; HR: 0,66;
95%CI: 0,45- 0,97).
c) In der HLA-A3-Superfamilie zeigen Patienten mit einem CD62L Codon 206 GvH-
Mismatch zu ihrem jeweiligen Spender ein signifikant besseres Überleben als ihre
gematchten Gegenüber (p=0,04; HR: 0,58; 95%CI: 0,35-0,97). Dagegen überleben
Patienten mit einem CD62L Codon 213-Mismatch in GvH-Richtung signifikant
schlechter als die in diesem Codon gematchten Patienten (p=0,04; HR: 1,65;
69
95%CI: 1,02- 2,66). Dies lässt sich auch in den für Codon 213 in GvHoderHvG-
Richtung gemismatchten Paaren bestätigen: Auch hier ist das Überleben der
Mismatch-Patienten signifikant schlechter als das der gematchten (p=0,03; HR:
1,62; 95%CI: 1,06-2,50).
Einen nicht signifikanten, aber geringfügig eine Signifikanz verfehlenden Einfluss
(0,1≥p>0,05) auf das Gesamtüberleben zeigen: HB-1 Mismatch in HvG-Richtung
(p=0,07), ACC-2 Mismatch in GvH-Richtung (p=0,09), sowie, in der Gruppe aller HLA-
Merkmale, CD31 Codon 125 Mismatch in GvHundHvG-Richtung (p=0,08), Codon 563
sowohl in GvHoderHvG-Richtung (p=0,1) als auch in GvHundHvG-Richtung (p=0,08),
und Codon 670 in HvG-Richtung (p=0,05). Diese werden somit in eine multivariate
Analyse des Gesamtüberlebens miteinbezogen.
Keinen Einfluss auf das Gesamtüberleben zeigen HA-1, HA-2, HA-3, ACC-1, CD31 in der
HLA-B44-Superfamilie-Gruppe, CD62L in der Gruppe aller HLA Merkmale, PANE-1 und
UGT2B17.
70
Tabelle 19: Signifikanzen (p-Wert), HR und 95% CI der Unterschiede der jeweiligen Überlebenskurven (mismatch vs. match) für alle mHag in ihren jeweiligen möglichen
Mismatch-Richtungen, GvH: graft-versus-host, HvG: Host-versus-graft, GvHoderHvG: Graft-versus-host oder Host-versus-graft, GvHundHvG: Graft-versus-host und
Host-versus-graft, HR: Hazard Ratio, CI: Konfindezintervall; sup: Superfamilie, Rote Werte: signifikant (p<0,05), blaue Werte:geringfügig nicht signifikant (0,05<p≤0,1).
Kein Wert: hier gab es in der Mismatch-Gruppe (GvHundHvG) keine Paare, sodass folglich kein Vergleich stattfinden konnte
Mismatch - Richtung
GvH HvG GvHoderHvG GvHundHvG
mHag (HLA-Restriktion)
n=Gruppengröße p-Wert HR 95% CI p-Wert HR 95% CI p-Wert HR 95% CI p-Wert HR 95% CI
HA-1 (HLA-A2) n=166 0,33 1,27 0,78-2,07 0,96 0,99 0,64- 1,52 0,39 0,85 0,58- 1,24 - - -
HA-2 (HLA-A2) n=166 0,12 0,4 0,13- 1,26 0,58 1,38 0,44- 4,36 0,25 0,62 0,27- 1,4 - - -
HA-3 (HLA-A1) n=112 0,72 0,88 0,42 -1,82 0,5 1,26 0,65- 2,47 0,81 1,07 0,62- 1,81 - - -
HA-8 (HLA-A2) n=166 0,32 0,79 0,49- 1,26 0,53 0,86 0,54- 1,37 0,16 0,76 0,52- 1,12 - - -
HB-1 (HLA-B44) n=77 0,23 0,66 0,34- 1,30 0,07 1,77 0,97- 3,24 0,66 1,14 0,64- 2,01 1,00 1,0 0,31- 3,23
ACC-1 (HLA-A24) n=69 0,82 0,91 0,41- 2,05 0,13 1,68 0,87- 3,25 0,29 1,38 0,76- 2,50 - - -
ACC-2 (HLA-B44) n=77 0,09 0,55 0,27- 1,10 0,11 1,73 0,88- 3,42 0,64 0,87 0,49- 1,55 - - -
CD31 Cd125 (alle HLA) n=320 0,35 0,87 0,65- 1,16 0,36 0,87 0,66- 1,16 0,55 1,09 0,83- 1,43 0,08 0,66 0,41- 1,05
CD31 Cd563 (alle HLA) n=320 0,25 0,84 0,63- 1,13 0,03 0,72 0,54- 0,96 0,1 0,79 0,60- 1,04 0,08 0,66 0,41- 1,05
CD31 Cd670 (alle HLA) n=320 0,36 0,87 0,66- 1,17 0,05 0,75 0,56- 1,00 0,11 0,8 0,60- 1,05 kein
Wert
kein
Wert kein Wert
CD31 Cd125 (HLA-B44sup) n=107 0,39 0,80 0,49- 1,32 0,62 0,89 0,55- 1,42 0,4 1,22 0,77- 1,95 0,19 0,64 0,32- 1,24
CD31 Cd563 (HLA-B44sup) n=107 0,55 0,86 0,53- 1,41 0,11 0,68 0,42- 1,09 0,22 0,74 0,46- 1,19 0,56 0,83 0,45- 1,55
CD31 Cd670 (HLA-B44sup) n=107 0,69 0,90 0,56- 1,47 0,18 0,72 0,45- 1,17 0,25 0,75 0,47- 1,21 kein
Wert
kein
Wert kein Wert
CD31 Cd125 (HLA-B7sup) n=166 0,68 0,92 0,62- 1,37 0,74 0,93 0,63- 1,39 0,49 0,87 0,60- 1,28 0,97 0,99 0,54- 1,81
CD31 Cd563 (HLA-B7sup) n=166 0,29 0,80 0,53- 1,21 0,52 0,88 0,59- 1,31 0,04 0,66 0,45- 0,97 0,7 1,12 0,62-2,06
CD31 Cd670 (HLA-B7sup) n=166 0,29 0,80 0,53- 1,21 0,52 0,88 0,59- 1,31 0,04 0,66 0,45- 0,97 kein
Wert
kein
Wert kein Wert
CD62L Cd206 (alle HLA) n=320 0,63 0,93 0,68- 1,26 0,87 0,97 0,72- 1,33 0,83 1,03 0,78- 1,36 0,41 0,77 0,41- 1,45
CD62L Cd213 (alle HLA) n=320 0,54 1,10 0,80- 1,52 0,9 0,98 0,69- 1,40 0,5 1,10 0,83- 1,46 0,74 0,86 0,35- 2,08
CD62L Cd206 (HLA-A3sup) n=140 0,04 0,58 0,35- 0,97 0,94 1,02 0,64- 1,62 0,32 0,80 0,52- 1,23 0,37 0,63 0,23- 1,73
CD62L CD213 (HLA-A3sup)
n=140 0,04 1,65 1,02- 2,66 0,53 1,18 0,70- 1,99 0,03 1,62 1,06- 2,50 1,00 1,00 0,25- 4,1
PANE-1 (HLA-A3) n=88 0,43 0,57 0,14- 2,34 0,45 1,36 0,61- 3,00 0,93 1,03 0,51- 2,11 - - -
UGT2B17 (HLA-A29) n=15 0,73 1,45 0,18- 11,88 0,28 2,14 0,54- 8,45 0,25 2,14 0,59- 7,69 - - -
71
3.7.1.2 Multivariate Analyse
Die multivariate Analyse wird auch mittels des Cox-Regressionsverfahrens durchgeführt.
In die multivariate Analyse werden nur mHag einbezogen, die signifikanten oder
geringfügig an einer Signifikanz vorbei gehenden Einfluss in der univariaten Analyse
aufweisen. Als Einschlussgrenze für die multivariate Analyse wählen wir p≤0,1.
Zudem werden in die multivariate Analyse die Risikofaktoren Patientenalter, Diagnose,
Krankheitsstadium und Stammzellquelle miteinbezogen, da diese einen signifikanten
Einfluss auf das Gesamtüberleben zeigen. Auch hier werden die verschiedenen möglichen
Richtungen des Mismatches berücksichtigt (GvH, HvG, GvHoderHvG, evtl.
GvHundHvG). Folgende mHag zeigen nach multivariater Analyse einen Einfluss auf das
Gesamtüberleben in ihrer jeweiligen Subgruppe:
ACC-2
Wie in nachfolgender Abbildung 17 ersichtlich, haben Patienten mit einem ACC-2 GvH-
Match (blaue Kurve) eine niedrigere Überlebenswahrscheinlichkeit als Patienten, die für
ACC-2 einen Mismatch in GvH-Richtung mit ihrem Spender aufweisen (grüne Kurve)
(p=0,04; HR: 2,43; 95%CI: 1,06- 5,62). Weiteren Einfluss auf das Gesamtüberleben zeigen
Krankheitsstadium (p=0,04) und Diagnose (p=0,02). Patientenalter (p=0,56),
Stammzellquelle (p=0,86) und HLA-Match (p=0,57) beeinflussen diese Analyse nicht
(siehe hierzu Tabelle 20 und Abbildung 17).
Tabelle 20: Variablen der multivariaten Analyse (ACC-2-Match vs. Mismatch in GvH-
Richtung sowie Kovariaten) mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert), HR und 95%
Konfidenzintervall des HR; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad, GvH: graft-versus-host,
Tx: Transplantation
df
Signifikanz
(p-Wert) HR
95% Konfidenzintervall für HR
Untere Grenze Obere Grenze
Patientenalter bei Tx 1 0,547 1,010 0,978 1,042
Stammzellquelle 1 0,864 1,060 0,544 2,065
Diagnose 1 0,018 0,688 0,505 0,939
Krankheitsstadium 1 0,039 1,540 1,021 2,321
ACC2_GvH 1 0,037 2,434 1,055 5,615
72
Abbildung 17: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit vom ACC-2-
Match in GvH(graft-versus-host)-Richtung, multivariate Analyse, Gruppe: HLA-B44
positive Paare, grüne Kurve: ACC-2-Mismatch in GvH n=17, blaue Kurve: ACC-2-Match
in GvH n=44
CD31
Bei der Analyse des Adhäsionsmoleküls CD31 haben wir drei verschiedene polymorphe
Codons (Codon 125, 563 und 670) untersucht. Bei multivariater Betrachtung von Codon
563 in der Gruppe aller HLA-Merkmale fällt auf, dass die in HvG-Richtung gematchten
Transplantationspaare mit einem signifikant schlechteren Patientenüberleben als die
gemismatchten assoziiert sind (p=0,03, HR: 1,42, 95%CI: 1,03-1,95), siehe hierzu
Abbildung 18 und Tabelle 21. Darüber hinaus sind Krankheitsstadium (p<0,001),
Diagnose (p=0,003), Stammzellquelle (p=0,049) und Patientenalter (p=0,02) signifikante
Einflussfaktoren.
73
Abbildung 18: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit vom CD31
Codon 563-Match in HvG(host-versus-graft)-Richtung, multivariate Analyse, Gruppe: alle
HLA- Merkmale, grüne Kurve: Codon 563-Mismatch in HvG n=108, blaue Kurve: Codon
563-Match in HvG n=165
Tabelle 21: Variablen der multivariaten Analyse (CD31 Codon 563-Match vs. Mismatch in
HvG-Richtung und Kovariate) mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert), HR und 95%
Konfidenzintervall des HR; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad, HvG: host-versus-graft,
Tx: Transplantation
df
Signifikanz
(p-Wert) HR
95% Konfidenzintervall für HR
Untere Grenze Obere Grenze
Patientenalter bei Tx 1 0,021 1,017 1,003 1,031
Stamzellquelle 1 0,049 0,737 0,545 0,998
Diagnose 1 0,003 0,808 0,704 0,929
Krankheitsstadium 1 <0,001 1,676 1,380 2,034
CD31Cd563_HvG 1 0,030 1,418 1,034 1,945
74
Sowohl ein CD31 Codon 125-Match (p=0,03; HR: 1,75; 95%CI: 1,05-2,90) als auch ein
Codon 563-Match (p=0,04; HR: 1,61; 95%CI: 1,01- 2,58) in beiden Richtungen
(GvHundHvG) verschlechtern das Überleben nach unverwandter, allogener HSCT.
Interessanterweise können wir die in der univariaten Analyse errechneten Signifikanzen für
CD31 Codon 563 und 670 in der HLA-B7-Superfamilie multivariat nicht bestätigen.
CD62L
Bei der Analyse des Adhäsionsmoleküls CD62L haben wir zwei verschiedene polymorphe
Codons (Codon 206 und 213) in der HLA-A3-Superfamilie untersucht.
Für Codon 206 zeigt sich Folgendes:
Abbildung 19 zeigt die Überlebenskurve von Patienten, die mit ihren Spendern in Cd62L
Codon 206 in GvH-Richtung gematcht waren und die Überlebenskurve der gemismatchten
Patienten: Gematchte Patienten überleben hierbei deutlich schlechter (p=0,003; HR: 2,44;
95%CI: 1,35- 4,39). Außerdem spielten bei dieser multivariaten Analyse
Krankheitsstadium (p<0,001) und Diagnose (p=0,014) eine signifikante Rolle; zu
vernachlässigen sind Patientenalter (p=0,4) und Stammzellquelle (p=0,35), siehe Tabelle
22.
Tabelle 22: Variablen der multivariaten Analyse (CD62L Codon 206-Match vs. Mismatch
in GvH-Richtung und Kovariate) mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert), HR und 95%
Konfidenzintervall des HR; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad, GvH: Graft-versus-host,
Tx: Transplantation
df
Signifikanz
(p-Wert) HR
95,0% Konfidenzintervall für HR
Untere Grenze Obere Grenze
Patientenalter bei Tx 1 0,406 1,010 0,987 1,033
Stammzellquelle 1 0,350 0,797 0,495 1,283
Diagnose 1 0,014 0,761 0,611 0,947
Krankheitsstadium 1 <0,001 1,882 1,410 2,511
CD62LCd206_GvH 1 0,003 2,435 1,351 4,390
75
Abbildung 19: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit vom CD62L
Codon 206-Match in GvH(graft-versus-host)-Richtung, multivariate Analyse, Gruppe:
HLA-A3 positive Paare, grüne Kurve: Codon 206-Mismatch in GvH n=32, blaue Kurve:
Codon 206-Match in GvH n=87
Für Codon 213 zeigt sich Folgendes:
Bei CD62L Codon 213 lässt sich ein gegenteiliger Effekt beobachten: Ein Match in
GvHoderHvG-Richtung ist für ein besseres Überleben verantwortlich (p=0,03; HR: 0,59;
95%CI: 0,37- 0,95), zudem spielen Diagnose (p=0,016) und Krankheitsstadium (p<0,001)
signifikante Rollen, siehe hierzu Abbildung 20 und Tabelle 23.
Die in der univariaten Analyse festgestellte signifikante Verschlechterung der
Überlebenswahrscheinlichkeit durch ein CD62L Codon 213 Mismatch in GvH-Richtung
(p=0,04) lässt sich multivariat nicht bestätigen.
76
Abbildung 20: Überlebenswahrscheinlichkeit von Patienten in Abhängigkeit vom CD62L
Codon 213-Match in GvHoderHvG(graft-versus-host oder host-versus-graft)-Richtung,
multivariate Analyse, Gruppe: HLA-A3 positive Paare, grüne Kurve: Codon 213-
Mismatch in GvHoderHvG n=45, blaue Kurve: Codon 213-Match in GvHoderHvG n=74
Tabelle 23: Variablen der multivariaten Analyse (CD62L Codon 213-Match vs. Mismatch
in GvHoderHvG-Richtung und Kovariate) mit jeweiliger Signifikanz (p-Wert), HR und
95% Konfidenzintervall des HR; HR: Hazard Ratio, df: Freiheitsgrad, GvHoderHvG:
graft-versus-host oder host-versus-graft, Tx: Transplantation
df
Signifikanz
(p-Wert) HR
95,0% Konfidenzintervall für HR
Untere
Grenze
Obere
Grenze
Patientenalter bei Tx 1 0,381 1,011 0,987 1,035
Stammzellquelle 1 0,374 0,805 0,499 1,298
Diagnose 1 0,016 0,766 0,617 0,952
Krankheitsstadium 1 <0,001 1,692 1,273 2,250
CD62LCd213GvHoderHvG 1 0,031 0,593 0,369 0,954
77
3.7.2 Analyse der sekundären Outcomes
Der Einfluss von mHag-Mismatchen auf die sekundären Outcomeparameter (Inzidenz von
TRM/NRM, Relapse und aGvHD) wird in einer kompetitiven Risikoanalyse ermittelt
(siehe Kapitel 2.2, Abschnitt 6.3). Analog der Überlebenszeitanalyse werden in der
univariaten Analyse nur der mHag-Status, in der multivariaten Analyse zusätzlich auch
weitere Risikofaktoren berücksichtigt. Untersucht werden auch hier für jedes mHag
Mismatche in GvH, HvG, GvHoderHvG und für HB-1, CD31 und CD62L auch
GvHundHvG-Richtung.
Da eine akute GvHD per Definition nur bis Tag 100 nach HSCT auftritt und auch die
TRM/NRM-Inzidenz in den ersten 2 Jahren am höchsten ist, wird bei deren Analyse die
Zeitachse auf 500 Tage nach HSCT begrenzt. Dagegen wird die Relapseinzidenz bis zu
2000 Tage nach HSCT untersucht, um späte Rückfälle mit einschließen zu können.
3.7.2.1 Univariate Analyse
a) TRM/NRM
Einen signifikanten Einfluss auf die transplantationsassoziierte bzw. non relapse assoziierte
Mortalität (TRM/NRM) zeigen in unserer univariaten Analyse zwei mHag:
ACC-2
Patienten, die mit ihren Spendern für ACC-2 in GvH-Richtung gematcht sind, zeigen eine
signifikant höhere Wahrscheinlichkeit, an TRM/NRM zu versterben (durchgehende
schwarze Kurve) im Vergleich zu den gemismatchten (gestrichelte schwarze Kurve)
(p=0,04). Die roten Kurven zeigen die Auftretenswahrscheinlichkeiten des kompetitiven
Risikos (Relapse und Tod anderer Ursache) für gematchte (durchgehende Kurve) und
gemismatchte (gestrichelte Kurve) Paare, welche sich nicht signifikant unterscheiden (p=
0,73), siehe hierzu Abbildung 21.
78
Abbildung 21: univariate Analyse der kumulativen Inzidenzen für TRM/NRM und für
dessen kompetitives Risiko (Relapse und Tod anderer Ursache) innerhalb von 500 Tagen
nach HSCT; TRM/NRM: schwarze Kurven; kompetitives Risiko: rote Kurven;
durchgezogene schwarze Kurve: kumulative TRM/NRM-Inzidenzen bei ACC-2-Match in
GvH-Richtung (n=31), gestrichelte schwarze Kurve: kumulative TRM/NRM-Inzidenzen
bei ACC-2-Mismatch in GvH-Richtung (n= 6)
CD62L
In der HLA-A3-Superfamilie zeigen die Patienten, die für CD62L Codon 206 in GvH-
Richtung mit ihrem Spender gematcht sind (durchgehende schwarze Kurve) eine
signifikant höhere TRM/NRM-Inzidenz (p=0,02) als ihre gemismatchen Gegenüber
(gestrichelte schwarze Kurve). Dahingegen lässt sich dieses Ergebnis nicht im
Gesamtkollektiv (alle HLA-Merkmale) bestätigen. Analog zu ACC-2 zeigen die roten
Kurven die Wahrscheinlichkeiten des kompetitiven Risikos (Relapse und Tod anderer
Ursache) an, welche sich nicht signifikant zwischen Match und Mismatchsituation
unterscheiden (p=0,44), siehe hierzu Abbildung 22.
ACC-2 match in GvH: TRM/NRM ACC-2 mismatch in GvH: TRM/NRM ACC-2 match in GvH: Relapse + Tod anderer Ursache ACC-2 mismatch in GvH: Relapse + Tod anderer Ursache
79
Abbildung 22: univariate Analyse der kumulativen Inzidenzen für TRM/NRM und für
dessen kompetitives Risiko (Relapse und Tod anderer Ursache) innerhalb von 500 Tagen
nach HSCT; TRM/NRM: schwarze Kurven; kompetitives Risiko: rote Kurven;
durchgezogene schwarze Kurve: kumulative TRM/NRM-Inzidenz bei Match für CD62L
Codon 206 in GvH-Richtung (n=44), gestrichelte schwarze Kurve: kumulative
TRM/NRM-Inzidenz bei Mismatch für CD62L Codon 206 in GvH-Richtung (n= 9)
b) aGvHD Grad II oder höher
Das einzige mHag mit signifikanter Auswirkung auf die Entstehung einer aGvHD
innerhalb der ersten 500 Tage nach HSCT ist HA-8. Bei Patienten, die mit ihren Spendern
für HA-8 in HvG-Richtung (gestrichelte schwarze Kurve) gemismatcht sind, zeigt sich ein
erhöhtes Risiko eine aGvHD zu entwickeln, gegenüber dem Risiko bei gematchten
Patienten (durchgehende schwarze Kurve) (p=0,01). Die roten Kurven zeigen die
Inzidenzen des kompetitiven Risikos (Relapse, TRM/NRM und Tod anderer Ursache) für
gematchte (durchgehende Kurve) und gemismatchte (gestrichelte Kurve) Patienten, welche
sich nicht signifikant voneinander unterscheiden (p=0,24), siehe hierzu Abbildung 23.
CD62L Cd206 match in GvH: TRM/NRM CD62L Cd206 mismatch in GvH: TRM/NRM CD62L Cd206 match in GvH: Relapse+Tod anderer Ursache CD62L Cd206 mismatch in GvH: Relapse+Tod anderer Ursache
80
Abbildung 23: univariate Analyse der kumulativen Inzidenzen für aGvHD und für dessen
kompetitives Risiko (Relapse, TRM/NRM und Tod anderer Ursache) innerhalb von 500
Tagen nach HSCT; aGvHD: schwarze Kurven; kompetitives Risiko: rote Kurven;
durchgezogene schwarze Kurve: kumulative Inzidenz von aGvHD ≥Grad II bei Match für
HA-8 in HvG-Richtung (n=46), gestrichelte schwarze Kurve: kumulative Inzidenz von
aGvHD ≥Grad II bei Mismatch für HA-8 in HvG-Richtung (n= 24)
c) Relapse
Einen signifikanten Einfluss auf ein Relapse zeigen in unserer univariaten Analyse
folgende mHag:
ACC-1
Bei Patienten mit einem Mismatch in GvHoderHvG-Richtung erhöht sich signifikant die
Wahrscheinlichkeit eines Relapses gegenüber den für ACC-1 gematchten Patienten
(p=0,03); dahingegen unterscheiden sich die Inzidenzen für die kompetitiven Risiken
(TRM/NRM und Tod anderer Ursache) nicht (p=0,71) (ohne Abbildung).
HA-8 match in HvG: aGvHD HA-8 mismatch in HvG: aGvHD HA-8 match in HvG: Relapse,TRM/NRM, Tod anderer Urs. HA-8 mismatch in HvG: Relapse,TRM/NRM, Tod anderer Urs.
81
CD62L
Mismatche im Codon 206 des Adhäsionsmoleküls CD62L wirken sich in der
Gesamtkohorte (alle HLA-Merkmale) sowohl in GvH-Richtung als auch in HvG-Richtung
auf die Wahrscheinlichkeit eines Krankheitsrückfalls aus, siehe Abbildung 24 und 25.
Wie Abbildung 24 verdeutlicht, haben Patienten, die mit ihrem Spender ein Mismatch in
GvH-Richtung in Codon 206 aufweisen (schwarze gestrichelte Kurve) eine höhere
Wahrscheinlichkeit, einen Rückfall zu erleiden, als gematchte Patienten (schwarze
durchgezogen Kurve) (p=0,03).
Abbildung 24: univariate Analyse der kumulativen Inzidenzen eines Relapses und des
kompetitiven Risikos (TRM/NRM und Tod anderer Ursache) innerhalb von 2000 Tagen
nach HSCT; Relapse: schwarze Kurven; kompetitives Risiko: rote Kurven;
durchgezogene schwarze Kurve: kumulative Inzidenz eines Relapses bei Match für CD62L
Codon 206 in GvH-Richtung (n=55), gestrichelte schwarze Kurve: kumulative Inzidenz
eines Relapses bei Mismatch für CD62L Codon 206 in GvH-Richtung (n=30)
CD62L Cd206 match in GvH: Relapse CD62L Cd206 mismatch in GvH: Relapse CD62L Cd206 match: TRM/NRM + Tod anderer Ursache CD62L Cd206 mismatch: TRM/NRM + Tod anderer Ursache
82
Im Gegensatz zum Mismatch in GvH-Richtung zeigen, wie Abbildung 25 verdeutlicht, bei
einem Mismatch in HvG-Richtung die gematchten Patienten (schwarze durchgehende
Kurve) eine höhere Relapseinzidenz als die gemismatchten (schwarze gestrichelte Kurve)
(p=0,02).
Abbildung 25: univariate Analyse der kumulativen Inzidenzen eines Relapses und des
kompetitiven Risikos (TRM/NRM und Tod anderer Ursache) innerhalb von 2000 Tagen
nach HSCT; Relapse: schwarze Kurven; kompetitives Risiko: rote Kurven;
durchgezogene schwarze Kurve: kumulative Inzidenz eines Relapses bei Match für CD62L
Codon 206 in HvG-Richtung (n=70), gestrichelte schwarze Kurve: kumulative Inzidenz
eines Relapses bei Mismatch für CD62L Codon 206 in HvG-Richtung (n=15)
CD31
In der Gesamtkohorte (alle HLA-Merkmale) sinkt die Inzidenz eines Relapses bei
Patienten mit einem Mismatch für CD31 Codon 563 in GvHundHvG-Richtung im
Gegensatz zu gematchten Patienten (p=0,04) (ohne Abbildung).
CD62L Cd206 match in HvG: Relapse CD62L Cd206 mismatch in HvG: Relapse CD62L Cd206 match: TRM/NRM + Tod anderer Ursache CD62L Cd206 mismatch: TRM/NRM + Tod anderer Ursache
83
PANE-1
Auch die für PANE-1 mit ihren Spendern in HvG-Richtung gemismatchten Patienten
(gestrichelte schwarze Kurve) zeigen eine signifikant höhere Wahrscheinlichkeit, einen
Krankheitsrückfall zu erleiden als deren gematchte Gegenüber (durchgezogene schwarze
Kurve) (p=0,005), siehe hierzu Abbildung 26.
Abbildung 26: univariate Analyse der kumulativen Inzidenzen eines Relapses und des
kompetitiven Risikos (TRM/NRM und Tod anderer Ursache) innerhalb von 2000 Tagen
nach HSCT; Relapse:schwarze Kurven; kompetitives Risiko: rote Kurven;
durchgezogene schwarze Kurve: kumulative Inzidenzen eines Relapse bei Match für
PANE-1 in HvG-Richtung (n=17), gestrichelte schwarze Kurve: kumulative Inzidenzen
eines Relapses bei Mismatch für PANE-1 in HvG-Richtung (n=6)
PANE-1 match in HvG: Relapse PANE-1 mismatch in HvG: Relapse PANE-1 match in HvG: TRM/NRM + Tod anderer Ursache PANE-1 mismatch in HvG: TRM/NRM + Tod anderer Ursache
84
3.7.2.2 Multivariate Analyse
Alle mHag-Mismatche, die sich in der univariaten Analyse als signifikant erwiesen haben,
werden außerdem in einem multivariaten Modell unter Berücksichtigung aller zusätzlichen
signifikanten Einflussfaktoren (siehe hierzu Kapitel 3.6) untersucht. Auch hier haben wir
eine kompetitive Risikoanalyse durchgeführt.
a) TRM/NRM
Auch unter Berücksichtigung der anderen Risikofaktoren konnte festgestellt werden, dass
die beiden mHag ACC-2 und CD62L Codon 206 (beide im Mismatch in GvH-Richtung)
einen signifikanten Einfluss auf TRM/NRM besitzen. Beide verringern mit einem
Mismatch in GvH-Richtung die Auftretenswahrscheinlichkeit für TRM/NRM (ACC-2:
p=0,02; HR: 0,34; 95%CI: 0,13-0,87; CD62L Codon206: p=0,03; HR: 0,45; 95%CI: 0,22-
0,91); siehe hierzu Tabelle 24.
Obwohl im kompetitiven Risikomodell aller Kovariaten nur das HLA-Matching als
unabhängiger Risikofaktor eine Auswirkung auf die Inzidenz der TRM/NRM hat (siehe
Kapitel 3.6, Abschnitt 5), spielen in den multivariaten Analysen auch andere Faktoren eine
Rolle:
Im ACC-2-Modell hat die Diagnose (p=0,02) einen signifikanten Einfluss. Zusätzlich zu
Codon 206 von CD62L beeinflussen Diagnose (p=0,04), Stadium der Erkrankung (p=0,04)
und HLA-Match (p=0,01) die Wahrscheinlichkeit einer TRM/NRM.
85
Tabelle 24: TRM/NRM, multivariate Analyse; p-Werte, HR und 95% CI
ACC-2 MM in GvH
CD62L Cd206 MM in GvH
(HLA-A3-Superfamilie)
N 77 140
Parameter Vergleich 1
p-Wert HR 95%CI p-
Wert HR 95% CI
mHag mismatch/match 0,02 0,34 0,13-0,87 0,03 0,45 0,22-0,91
Patientenalter 2
0,48 0,98 0,94-1,02 0,65 1,0 0,98-1,03
Diagnose 3
0,02 - - 0,04 - -
Geschlechtsmatch mismatch/match 0,42 0,51 0,09-2,62 0,56 0,76 0,29-1,92
Krankheitsstadium 3
0,31 - - 0,04 - -
Konditionierung RIC/MAC 0,28 1,75 0,63-4,82 0,7 1,29 0,36-4,65
Stammzellquelle PBSZ/KM 0,18 0,56 0,24-1,31 0,21 0,71 0,41-1,22
HLA-Match mismatch/match 0,12 2,17 0,82-5,7 0,01 2,25 1,18-4,3
N: Gruppengröße; MM: Mismatch; Parameter: untersuchter Risikofaktor, TRM/NRM:
Transplant related mortality / Non relapse mortality, GvH: graft-versus-host, RIC:
reduzierte Konditionierung, MAC: myeloablative Konditionierung, PBSZ: periphere
Blutstammzellen, KM: Knochenmark, HLA: Humanes Leukozytenantigen, HR: Hazard
ratio, CI: Konfidenzintervall
1: Als Baseline (Referenzgruppe) in dieser Spalte gilt immer die zweitgenannte Kategorie
in jedem Feld (z.B. match bei mismatch/match).
2: Patientenalter ist eine stetige Variable, p-Wert ist ein Mittelwert, HR und 95% CI
beziehen sich auf diesen Mittelwert.
3: Baseline sind AML (Diagnose) und Stadium 1 (Krankheitsstadium), beide p-Werte sind
durch den Wald-Test (Chi-Quadrat-Statistik) ermittelt.
86
b) aGvHD
Im multivariaten Modell zur Analyse der aGvHD-Inzidenz zeigt sich als einziges
signifikantes Kriterium ein Mismatch im mHag HA-8 in HvG-Richtung (p=0,01). Dieses
erhöht das Risiko der Entstehung einer aGvHD um das 1,8fache (p=0,01, HR: 1,85;
95%CI: 1,14-3,0); siehe hierzu Tabelle 25.
Tabelle 25: aGvHD, multivariate Analyse; p-Werte, HR und 95% CI
HA-8 MM in HvG
N 166
Parameter Vergleich1 p-Wert HR 95%CI
mHag mismatch/match 0,01 1,85 1,14-3,0
Patientenalter 2
0,12 1,01 0,99-1,04
Diagnose 3
0,46 - -
Geschlechtsmatch mismatch/match 0,41 1,32 0,68-2,53
Stadium 3
0,43 - -
Konditionierung RIC/MAC 0,19 0,58 0,26-1,31
Stammzellquelle PBSZ/KM 0,72 0,90 0,52-1,57
HLA-Match mismatch/match 0,74 1,10 0,62-1,95
N: Gruppengröße, MM: Mismatch, Parameter: untersuchter Risikofaktor, aGvHD: akute
Graft-versus-Host Erkrankung, HvG: host-versus-graft, RIC: reduzierte Konditionierung,
MAC: myeloablative Konditionierung, PBSZ: periphere Blutstammzellen, KM:
Knochenmark, HLA: Humanes Leukozytenantigen HR: Hazard ratio, CI:
Konfidenzintervall
1: Als Baseline (Referenzgruppe) in dieser Spalte gilt immer die zweitgenannte Kategorie
in jedem Feld (z.B. match bei mismatch/match).
2: Patientenalter ist eine stetige Variable, p-Wert ist ein Mittelwert, HR und 95% CI
beziehen sich auf diesen Mittelwert.
3: Baseline sind AML (Diagnose) und Stadium 1 (Krankheitsstadium), beide p-Werte sind
durch den Wald-Test (Chi-Quadrat-Statistik) ermittelt
87
Tabelle 26: Relapse, multivariate Analyse; p-Werte, HR und 95% CI
ACC-1 MM in GvHoderHvG
CD31 Cd563 MM
in GvHundHvG
(alle HLA-Merkmale)
CD62L Cd206 MM in GvH
(alle HLA-Merkmale)
CD62L Cd206 MM in HvG
(alle HLA-Merkmale) PANE-1 MM in HvG
N 68 308 308 308 83
Parameter Vergleich 1 p-Wert HR 95%CI p-Wert HR 95% CI p-Wert HR 95%CI p-Wert HR 95%CI p-Wert HR 95%CI
mHag mismatch/
match 0,01 3,36 1,28-8,81 0,08 0,44 0,18-1,12 0,01 1,83
1,14-
2,95 0,03 0,53
0,31-
0,92 0,001 8,26
2,30-
29,6
Pat.alter 2 0,05 1,05 1,0-1,11 0,10 1,01 0,99-1,0 0,19 1,01 0,99-
1,03 0,12 1,01
0,99-
1,03 0,72 0,99
0,94-
1,04
Diagnose 3 0,07 - - 0,05 - - 0,11 - - 0,06 - - 0,42 - -
Geschlechtsmatch mismatch/
match 0,09 4,86 0,78-30,3 0,02 1,98 1,14-3,43 0,007 2,11
1,23-
3,65 0,02 1,88
1,12-
3,19 0,16 1,92
0,77-
4,77
Stadium 3 0,29 - - 0,1 - - 0,03 - - 0,01 - - 0,09 - -
Konditionierung RIC/MA 0,13 1,56 1,56-3,4 0,001 2,46 1,43-4,24 <0,001 2,72 1,53-
4,83 <0,001 2,75
1,63-
4,64 <0,001 13,0
2,91-
58,7
Stammzellquelle PBSZ/KM 0,04 3,02 1,07-8,5 0,02 1,9 1,11-3,26 0,004 2,26 1,3-3,93 0,003 2,13 1,29-
3,51 0,16 2,19
0,74-
6,56
HLA-Match mismatch/
match 0,39 0,58 0,17-1,98 0,66 0,90 0,58-1,41 0,60 0,88
0,57-
1,38 0,35 0,80
0,51-
1,27 0,92 0,93
0,26-
3,41
N: Gruppengröße; MM: Mismatch; Parameter: untersuchter Risikofaktor, GvH: Graft-versus-host, HvG: Host-versus-graft, GvHoderHvG: Graft-versus-host oder Host-
versus-graft, GvHundHvG: Graft-versus-host und Host-versus-graft, Pat.alter: Patientenalter, RIC: reduzierte Konditionierung, MAC: myeloablative Konditionierung,
PBSZ: periphere Blutstammzellen, KM: Knochenmark, HLA: Humanes Leukozytenantigen, HR: Hazard Ratio, 95% CI: Konfidenzintervall
1: Als Baseline (Referenzgruppe) in dieser Spalte gilt immer die zweitgenannte Kategorie in jedem Feld (z.B. match bei mismatch/match).
2:
Patientenalter ist eine stetige Variable, p-Wert ist ein Mittelwert, HR und 95% CI beziehen sich auf diesen Mittelwert
3: Baseline sind AML (Diagnose) und Stadium 1 (Krankheitsstadium), beide p-Werte sind durch den Wald-Test (Chi-Quadrat) ermittelt
88
c) Relapse
Multivariat zeigen folgende mHag einen Einfluss auf einen Krankheitsrückfall (siehe
hierzu Tabelle 26):
Ein ACC-1-Mismatch in GvHoderHvG-Richtung vervielfacht das Risiko eines
Relapses durchschnittlich 3,4fach (p=0,01; 95%CI: 1,28-8,81), daneben wird die
Relapsewahrscheinlichkeit noch durch den Einsatz von peripheren
Blutstammzellen als Transplantat begünstigt (p=0,04; HR: 3,02; 95%CI: 1,07-8,5).
CD62L Codon 206: Ein Mismatch in GvH-Richtung begünstigt (p=0,01; HR: 1,83;
95%CI: 1,14-2,95), ein Mismatch in HvG-Richtung reduziert (p=0,03; HR:0,53;
95%CI: 0,31-0,92) die Wahrscheinlichkeit des Krankheitsrückfalls. Daneben
beeinflussen folgende Kovariate die Entstehung eines Relapses: ein
Geschlechtsmismatch zwischen Spender und Patient (p=0,007; HR: 2,11; 95%CI:
1,23-3,65 bzw. p=0,02; HR: 1,88, 95%CI: 1,12-3,19), ein höheres klinisches
Stadium bei HSCT (p=0,03 bzw. p=0,01), reduziertes Konditionierungsregime
(p<0,001; HR:2,72; 95%CI: 1,53-4,83 bzw. p<0,001; HR: 2,75; 95%CI: 1,63-4,64)
sowie PBSZ als Stammzellquelle (p=0,004; HR: 2,26; 95%CI: 1,3-3,93 bzw.
p=0,003; HR: 2,13; 95%CI: 1,29-3,51) begünstigen die Entstehung eines Relapses.
Ein PANE-1-Mismatch in HvG-Richtung erhöht die Wahrscheinlichkeit eines
Krankheitsrückfalls (p=0,001; HR: 8,26; 95%CI: 2,30-29,6), in diesem Modell
wirkt die reduzierte Konditionierung außerdem begünstigend auf ein Relapse
(p<0,001; HR: 13,0; 95%CI: 2,91-58,7).
Der signifikante Einfluss eines CD31 Codon 563-Mismatches in GvHundHvG-Richtung in
der univariaten Analyse auf die Relapsewahrscheinlichkeit konnte in der multivariaten
Analyse nicht bestätigt werden.
3.7.3 Tabellarische Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse
Aufgrund der Vielzahl und Komplexität der durchgeführten Analysen wurden die
wichtigsten Ergebnisse noch einmal in Tabelle 27 zusammengefasst.
89
Tabelle 27: Zusammenfassung der wichtigsten Ergebnisse mit jeweiligen p-Werten, aGvHD: akute Graft-versus-host Erkankung, TRM: Transplant-related mortality,
NRM: Non relapse mortality, MM: Mismatch, : erhöht, : vermindert, GvH: Graft-versus-host, HvG: Host-versus-graft, GvHoderHvG: Graft-versus-host oder Host-
versus-graft, GvHundHvG: Graft-versus-host und Host-versus-graft
mHag Codon/
Subgruppe
Gesamtüberleben aGvHD TRM/NRM Relapse
Univariat Multivariat Univariat Multivariat Univariat Multivariat Univariat Multivariat
HA-8 HLA-A2 - -
durch MM
inHvG
(p=0,01)
durch MM
inHvG
(p=0,01)
- - - -
ACC-1 HLA-A24 - - - - - - durch MM in
GvHodHvG(p=0,03)
durch MM in
GvHodHvG(p=0,01)
ACC-2 HLA-B44 durch MM in GvH
(p=0,09)
durch MM in GvH
(p=0,04) - -
durch MM in
GvH (p=0,04)
durch MM in GvH
(p=0,02) - -
CD31
Cod 125 (alle
HLA)
durchMM in
GvHundHvG (p=0,08)
durch MM in
GvHundHvG (p=0,03) - - - - - -
Cod 563 (alle
HLA)
durch MM inHvG
(p=0,03); durch MM
inGvHundHvG (p=0,08)
durch MM inHvG
(p=0,03); durch MM
inGvHundHvG (p=0,04)
- - - -
durch MM in
GvHundHvG
(p=0,04)
durch MM in
GvHundHvG
(p=0,08)
Cod 563 und 670
(HLAB7Superfam)
durch MM in
GvHodHvG (p=0,04) - - - - - - -
CD62L
Cod 206 (alle
HLA) - - - - - -
durch MM in GvH
(p=0,03);
durch MM in HvG
(p=0,02)
durch MM inGvH
(p=0,01);
durch MM in HvG
(p=0,03)
Cod 206(HLA-A3
Superfam)
durch MM in GvH
(p=0,04)
durch MM in GvH
(p=0,003) - -
durch MM in
GvH (p=0,02)
durch MM in
GvH (p=0,03) - -
Cod 213(HLA-A3
Superfam)
durch MM in GvH
(p=0,04); durch MM
GvHodHvG (p=0,03)
durch MM in
GvHodHvG (p=0,03) - -
durch MM in
GvH (p=0,04)
durch MM in GvH
(p=0,08) - -
PANE-
1 HLA-A3 - - - - - -
durch MM inHvG
(p=0,005)
durch MM
inHvG(p=0,001)
90
4. Diskussion
Dass bis heute zahlreiche widersprüchliche Publikationen zu den verschiedenen mHag und
deren Einfluss auf den klinischen Verlauf einer allogenen HSCT veröffentlicht wurden,
lässt die Komplexität dieses Themas vermuten und zeigt den Bedarf nach dessen weiterer
Klärung (Behar et al, 1996; Goulmy et al, 1996b; Maruya et al, 1998; Tseng et al, 1999;
Gallardo et al, 2001; Grumet et al, 2001; Lin et al, 2001; Akatsuka et al, 2003b;
Heinemann et al, 2004; Nishida et al, 2004; Cavanagh et al, 2005; Terakura et al, 2005;
Pérez-García et al, 2005; Katagiri et al, 2006; Markiewicz et al, 2009; McCaroll et al,
2009; Spellman et al, 2009).
Um die Bedeutung von mHag in der HSCT zu untersuchen, wurde in dieser Studie die
Assoziation zwischen Kompatibilität der einzelnen mHag in Patienten-Spender-Paaren und
dem Erreichen definierter klinischer Endpunkte nach allogener, nicht verwandter HSCT
eruiert. Ziel war es, eine hohe Fallzahl an Patienten-Spender-Paaren zu gewinnen, um den
Einfluss möglichst vieler etablierter mHag an dieser Kohorte untersuchen zu können.
Durch die hohe Fallzahl wurde unsere Kohorte sehr heterogen, und in unseren Analysen
mussten mehrere bekannte patienten-, spender- und therapieabhängige Risikofaktoren
berücksichtigt werden, um danach den alleinigen Effekt der mHag-Disparitäten
herauszufiltern. Darüber hinaus ist zu beachten, dass die in dieser Studie inkludierten
Transplantationen zwischen 1997 und 2002 durchgeführt wurden, eine Zeit, zu der weder
die reduzierte Konditionierung (RIC), noch die GvH-Prophylaxe, noch die intensiven
Nachbehandlungs- und infektionsprophylaktischen Methoden auf dem heutigen klinischen
Stand waren, so dass, mit heute verglichen, eine prozentuale Verschiebung in den
Todesursachen zu Gunsten des TRM/NRM und zu Ungunsten der Relapseinzidenz
festzustellen ist (siehe Kapitel 3.5, Abschnitt 2).
Ausführlich diskutiert wurden neben der Bedeutung der mHag für die HSCT auch die
verschiedenen Nachweismethoden für mHag, sowie die von uns verwendeten statistischen
Verfahren zur Datenauswertung.
91
4.1 Validierung des Testverfahrens
Zunächst galt es, ein zuverlässiges und praktikables Testverfahren zur parallelen Testung
möglichst vieler mHag-Polymorphismen zu validieren und in unserem Labor zu etablieren.
Dazu haben wir das PCR-SSP Kit der Universität Heidelberg erworben und an acht
bekannten, gesunden und in Heidelberg vortypisierten Probanden in unserem Labor
validiert. Die Typisierungsergebnisse stimmten zu 100% mit den Vorergebnissen überein,
so dass wir davon ausgehen können, dass die technischen Voraussetzungen für eine
korrekte Typisierung gegeben sind. Als Alternative zur SSP-Testung steht bis dato ein
Multiplex-SSO Verfahren zur Verfügung, welches z. B. Spellman et al 2009 benutzt
haben. Dieses beruht auf der Luminex-Technologie: Auf eine Multiplex-PCR folgt eine
allelspezifische PCR, das resultierende Produkt wird daraufhin mittels DNA-Sonden
hybridisiert, diese werden an durch UV-Farbstoff markierte Antikörper gebunden und
sichtbar gemacht. Dies ermöglicht die simultane Analyse mehrerer mHag in einer Probe.
Da diese Technologie jedoch weitaus kostenintensiver als die SSP-Testung ist, entschieden
wir uns für letztere. Bisher gibt es keine vergleichende Analyse zwischen beiden
Verfahren, jedoch werden in beiden die gleichen mHag erfasst.
Die Hardy-Weinberg-Analyse der Allelverteilung der von uns untersuchten Kohorte,
aufgeteilt in Patienten-, Spender- und Kontrollgruppe wurde als zusätzliche
Validitätsüberprüfung unserer Daten eingesetzt. Die Allelverteilung der mHag aller
gesunden Stammzellspender befand sich in Übereinstimmung mit dem HWE. Bis auf HB-
1 befanden sich auch alle mHag der Patientengruppe in Übereinstimmung mit dem HWE.
In dieser Gruppe war die Verteilung zugunsten von HB-1 HH und HB-1 HY verschoben.
Um die Ursache dafür genauer zu untersuchen, wurden die Allel- und Genotypfrequenzen
von HB-1 aus der Patientengruppe nach den einzelnen Krankheitsbildern getrennt und die
Allelverteilung in den einzelnen Subgruppen mit dem HWE verglichen. Dabei ließ sich ein
signifikanter Unterschied vom HWE in der Gruppe der CML-Patienten nachweisen
(p=0,04). Bei CML-Patienten sind HB-1 HH und HY vermehrt enthalten, zu ungunsten der
seltenen Homozygoten HB-1YY Form, was auf eine Überexpression des HB-1H Allels in
leukämischen CML-Zellen deuten könnte. Die Relevanz dieses molekulargenetischen
Befundes für eine Antigenexpression ist jedoch unklar, da in der Literatur bis heute die
HB-1 Expression nur auf leukämischen B-Zellen (B-ALL) beschrieben ist (Dolstra et al,
1999). Auch in der Kontrollgruppe der weißen US-Amerikaner wich die Allelverteilung
92
von HB-1 vom HWE (p=0,0003) ab und bestätigte das Ergebnis in unserer
Patientengruppe. In dieser Kontrollgruppe weicht auch PANE-1 vom HWE ab. Die
Ursache für diese Abweichungen bei HB-1 und PANE-1 ist unklar und könnte
möglicherweise an methodischen Problemen liegen. So wurde für HB-1 in dem unserem
SSP-Kit beiliegenden Manual über mögliche falsch-positive Reaktionen des Primers zum
Nachweis von HB-1 Y besonders beim gleichzeitigen positiven Nachweis von HB-1 H
berichtet (Tran TH, 2008; Park et al, 2010). Dies könnte, trotz erhöhter Aufmerksamkeit
und Nachtestungen im Zweifelsfall, zu einem erhöhten Anteil von HB-1 HY typisierten
Individuen führen. Auch Spierings et al haben die SSP-Methode, jedoch von einem
anderen Hersteller (invitrogen) verwendet (Spierings et al, 2007); es wäre zu vermuten,
dass auch dort solch unspezifische Reaktionen auftreten.
Beim Vergleich der Genotyp-Häufigkeiten zwischen den jeweiligen Gruppen (Patienten
mit Spendern, Patienten mit Vergleichspersonen, Spendern mit Vergleichspersonen) fiel
ein signifikanter Unterschied zwischen der UGT2B17-Positivität in einer gesunden
Normalbevölkerung US-amerikanischer Herkunft (96% positiv für UGT2B17) und unseren
gesunden Stammzellspendern (88%) sowie unseren Patienten (86%) (jeweils p<0,0001)
auf. Gleichzeitig ließ sich zwischen unseren Spendern und Patienten keine signifikante
Abweichung finden. Laut Spierings et al besteht beim positiven Nachweis von UGT2B17
ein West-Ost-Gefälle: bei einer weißen US-Bevölkerung exprimieren noch 96,5% aller
Individuen UGT2B17, bei der asiatisch-indischen Bevölkerung sind dies noch 58,7%, bei
einer südostasiatischen Population sind dies nur noch 33,3% (Spierings et al, 2007). Somit
ist der von uns gefundene Unterschied zwischen weißen US-Amerikanern und
Europäischen Kaukasiern eher auf ethnische denn auf krankheitsspezifische Ursachen
zurückzuführen.
4.2 Etablierte Risikofaktoren einer Stammzelltransplantation und deren
Auswirkungen auf die klinischen Endpunkte nach allogener,
unverwandter HSCT
Da die von uns untersuchten Patienten- und Spenderpaare außer der Volljährigkeit und
vorhandener vollständiger Daten im DRST (Deutsches Register für
Stammzelltransplantationen) keine patienten- oder spenderspezifischen besonderen
93
Einschlusskriterien erfüllen mussten, wurde unsere Studienpopulation sehr vielfältig. Die
verschiedenen, etablierten Faktoren (siehe Tabelle 15), die den klinischen Ausgang einer
HSCT beeinflussen können, wurden vor der Analyse der mHag-Mismatche auf ihren
Einfluss hin getestet, um je nach Relevanz später im multivariaten Modell berücksichtigt
zu werden (siehe Kapitel 3.6).
4.2.1 Donor- und patientenspezifische Risikofaktoren
4.2.1.1 Patientenalter und -geschlecht
Einen großen Einfluss auf das Gesamtüberleben zeigt das Patientenalter: die
Überlebenswahrscheinlichkeit nimmt mit steigendem Patientenalter zum Zeitpunkt der
HSCT ab (p=0,02). Die höchste Überlebenswahrscheinlichkeit zeigen Patienten im Alter
von 18-40 Jahren. Dies ist kongruent zur bestehenden Literatur (Eapen and Rocha, 2008)
und klinisch erklärbar: ältere Patienten leiden häufiger an Komorbiditäten zu ihrer
malignen Erkrankung, und auch die Konditionierung wird im Alter aufgrund von
nachlassender Nieren- und Leberfunktion noch schlechter vertragen.
Die Haupttodesursache bei älteren Patienten in unserer Studie ist ein Rückfall der
Grunderkrankung. Auch wenn der Einfluss des Patientenalters auf die Relapseinzidenz
knapp eine Signifikanz (p=0,05) verfehlt, steigt die Häufigkeit eines Relapses mit dem
Alter: So ist ein Krankheitsrückfall bei 41-50jährigen noch mit 20,3% relativ selten, steigt
bei den 51-60jährigen schon auf 31,7% und bei den >60jährigen auf 75% Anteil an den
Todesursachen. Jedoch steigt der Anteil der in Stadium 2 und 3 Transplantierten auch mit
dem Alter der Patienten an: Von den 41-50jährigen sind dies 53,1%, von den 51-
60jährigen 61% und von den >60jährigen 100%. Da das Relapserisiko für einen Patienten
steigt, je höher das Krankheitsstadium ist, in welchem er transplantiert wird (Aschan,
2006), ist dies eine zusätzliche Erklärung zum Anstieg der Relapseinzidenz im Alter in
unserer Kohorte.
Ob ein Patient weiblich oder männlich ist, hat in unserer Studie keine Auswirkung auf
Gesamtüberleben, Inzidenz von aGvHD, Rückfall oder TRM/NRM. Bedeutender ist das
Geschlechtsmismatch zwischen Patient und Spender (siehe Abschnitt 1.3,
Geschlechtsmismatch).
94
4.2.1.2 Spenderalter und -geschlecht
Das Spendergeschlecht nahm in unserer Studie keinen signifikanten Einfluss auf die von
uns untersuchten Zielgrößen, wichtiger ist der Geschlechtsunterschied zwischen Patient
und Spender (siehe nächster Abschnitt). In der gängigen Literatur kann ein höheres
Spenderalter zu einem höheren Risiko der Entwicklung einer aGvHD, zu einer höheren
TRM/NRM oder einer erhöhten Gesamtsterblichkeit führen (Eapen and Rocha, 2008). Dies
konnten wir nicht bestätigen.
4.2.1.3 Geschlechtsmismatch
Die auf dem humanen Y-Chromosom kodierten spezifischen Peptide bilden die mit „H-Y“
bezeichneten geschlechtsspezifischen mHag, die durch unterschiedliche HLA-Moleküle
gebunden und in dieser Arbeit nicht speziell typisiert worden sind. Da weibliche T-Zellen
die y-chromosomal kodierten Peptide als fremd erkennen, spielen diese mHAg
hauptsächlich bei der Transplantation eines weiblichen Donors auf einen männlichen
Patienten eine entscheidende Rolle (positives Geschlechtsmismatch). Diesen Effekt haben
wir mit der Einführung der Variablen Geschlechtsmismatch berücksichtigt (siehe Kapitel
1.3.4). Dessen Bedeutung zur Induktion einer GvH- oder GvL-Reaktion ist, wie die
Bedeutung der autosomalen mHag, umstritten (Randolph et al, 2004, Spellman et al,
2009). Es wird zusammenfassend von einem möglicherweise erhöhten aGvHD-Risiko bei
positivem Geschlechtsmismatch gesprochen (Eapen and Rocha, 2008). Die bei uns mit
einem positiven Geschlechtsmismatch (Spender weiblich, Patient männlich)
transplantierten Patienten erlitten signifikant häufiger einen Rückfall ihrer
Grunderkrankung, was damit eher auf einen fehlenden GvH- bzw. GvL-Effekt
zurückzuführen ist, wiesen aber kein erhöhtes aGvHD-Risiko auf. Ein erhöhtes
Rückfallrisiko, wie bei uns beschrieben, wurde bisher in der Literatur nicht beschrieben.
4.2.1.4 Stammzellquelle
Pilot- und klinische Phase-II-Studien zeigen, dass PBSZ nicht nur ein deutlich schnelleres
Engraftment vorweisen, sondern auch die aGvHD-Inzidenz nicht steigern (Bensinger et al,
1995; Bensinger and Storb, 2001). Dies konnten wir auch hier in unserer Analyse
bestätigen: Nur 39,6% der mit PBSZ Transplantierten entwickelten nach HSCT eine
95
klinisch relevante aGvHD, bei KM lag diese bei 51,3% (p=0,04). Somit war in unserer
Studie die aGvHD-Inzidenz bei PBSZ-Transplantaten sogar noch signifikant niedriger als
bei Transplantationen von KM. Bisherige Studienergebnisse zeigen außerdem, dass durch
die schnellere Immunrekonstitution nach PBSZ-Transplantationen und folglich niedrigerer
Relapseinzidenz das Gesamtüberleben und krankheitsfreie Überleben besonders bei
Hochrisikopatienten verlängert werden (Storek et al, 2001). Überraschenderweise zeigte
sich in unserer Studie ein gegenteiliger Effekt: Das Überleben nach Transplantation von
PBSZ war schlechter als das nach KM-Transplantation. Bei genauerer Betrachtung konnte
man jedoch folgendes feststellen: Da PBSZ gerade bei Hochrisikoleukämiepatienten und
Patienten in höheren Krankheitsstadien eine größere Chance auf Lebensverlängerung
versprachen (Bensinger and Storb, 2001), sorgte dies wahrscheinlich auch bei unserer
Kohorte für einen Trend in der Vorauswahl für PBSZ-Patienten. Während bei den
Erkrankungen mit guter Prognose (CML, MDS) in 42,4% KM als Stammzellquelle
gewählt wurde, erhielten bei den Krankheiten mit insgesamt schlechter Prognose (AML,
ALL und sonstige) 70,2% PBSZ (29,8% KM). Auch erhielten vorwiegend ältere Patienten
PBSZ: Bei den 41-50jährigen war das Verhältnis mit 54,4% KM und 45,6% PBSZ noch
ausgeglichen, bei den 51-60jährigen betrug es schon 26% KM zu 74% PBSZ.
Darüber hinaus zeigen in unserer Analyse periphere Blutstammzellen als
Transplantatquelle eine signifikant höhere Relapseinzidenz (p=0,005; HR: 2,09; 95%CI:
1,2-3,5) als Knochenmark. Während 39,4% aller Patienten, die mit PBSZ transplantiert
wurden, ein Relapse erleiden, sind dies bei der Transplantation von KM nur 17,9%. Auch
dies lässt auf eine Vorauswahl der PBSZ-Patienten auf Patienten in höheren
Krankheitsstadien schließen. Laut Aschan et al, korreliert das Risiko eines Relapses mit
Diagnose und Krankheitsstadium (Aschan, 2006).
4.2.1.5 HLA-Match
Die Kompatibilität der HLA-Merkmale auf allelischer Ebene zwischen Spender und
Patient ist im wissenschaftlichen Konsens der wichtigste prädiktive genetische Faktor für
ein verbessertes Outcome nach HSCT (Petersdorf and Malkki, 2005; Perez, 2011; Tait,
2011). In unserer Studie jedoch hat der HLA-Match-Status überraschenderweise weder auf
das Gesamtüberleben, die Inzidenz eines Relapses noch auf die Inzidenz einer aGvHD
einen signifikanten Einfluss. Jedoch ist er signifikant an der Entwicklung der
96
transplantationsassoziierten/Non Relapse Mortalität (TRM/NRM) beteiligt (p=0,009): Ein
HLA-Mismatch erhöht die TRM/NRM-Inzidenz bei Patienten.
TRM/NRM setzt sich zum größten Teil aus Graftversagen (primäres oder protrahiertes)
und Infektionen in der Posttransplantationsphase zusammen. HLA-Inkompatibilitäten
spielen nicht nur für das Graftversagen, wie man vermuten würde, eine Rolle, sondern
auch der nach dem Engraftment bestehende kombinierte funktionelle B- und T-Zell-Defekt
verläuft bei HLA-Inkompatibilitäten deutlich protrahiert (Einsele et al, 2001). Somit
werden Infektionen in der mittleren Posttransplantationsphase durch ein HLA-Mismatch
begünstigt (siehe auch Kapitel 1.2., Abschnitt 3.1c). Auch die in der späten
Posttransplantationsphase auftretenden viralen Infektionen, die durch den kombinierten
humoralen und zellulären Immundefekt bei cGvHD begünstigt werden, sind bei
unverwandten und nicht 10/10 HLA-gematchten Spendern erhöht (Einsele et al, 2001).
Da in unserer Studie die HLA-Mismatche wegen teilweise fehlender Informationen nicht
weiter klassifiziert wurden (Klasse I bzw. II, Antigen- oder Allelebene), kann dies auch
unser Ergebnis sowie die fehlende Signifikanz bei weiteren Endpunkten erklären.
4.2.2 Therapiebezogene (klinische) Risikofaktoren
4.2.2.1 Konditionierung
In unserer Kohorte weisen Patienten mit reduzierter Konditionierungsbehandlung (RIC)
eine signifikant höhere Relapseinzidenz auf (p<0,001; HR: 2,56; 95%CI: 1,5- 4,4) als
Patienten, die eine myeloablative Konditionierung (MAC) erhalten. Dies hat aber in
unserer Kohorte keine Auswirkungen auf das Gesamtüberleben (p=0,6). Da in unserem
Patientenkollektiv die MAC, deren vergleichsweise hohe Toxizität zu hoher TRM/NRM
führen kann (Clift et al, 1990, 163), mit 86,7% stark gegenüber der RIC mit 13,3 %
überwiegt, lässt sich der fehlende Einfluss des erhöhten Relapses auf das Gesamtüberleben
erklären. Außerdem wäre der hohe Anteil an myeloablativ konditionierten Patienten eine
Erklärung für die hohe TRM/NRM-Inzidenz in unserem Kollektiv (64,7% aller Todesfälle)
im Gegensatz zu den Todesfällen durch Relapse (27,9%).
Das Ziel der RIC ist es, auch älteren und komorbiden Patienten, bei denen eine MAC
kontraindiziert gewesen wäre, einen Zugang zur HSCT zu ermöglichen. Deswegen kann
für die Zeit unserer Studie (1997-2002) eine Vorselektion nicht ausgeschlossen werden: In
97
dieser Zeitspanne war die RIC noch in Entwicklung, so dass eine Präselektion der
Patienten für die RIC nicht ausgeschlossen werden kann, die aufgrund ihres Alters oder des
Fortschritts ihrer Grunderkrankung eher zu einem Relapse neigten. Außerdem bestand zu
dieser Zeit noch nicht die Kenntnis, dass vor allem langsam fortschreitende Erkrankungen
(CML, CLL, NHL) gute Ergebnisse nach RIC zeigen, da sie auch am besten auf die
nachfolgenden DLI’s ansprechen, und hochaggressive Leukämien (AML, ALL) besser auf
MAC ansprechen. Eine Studie von 2005 zum Vergleich von MAC und RIC bei CLL-
Patienten fand außer einer niedrigeren TRM/NRM auch eine signifikant höhere
Relapseinzidenz bei den durch RIC vortherapierten Patienten (Dreger et al, 2005), welche
damit auch unser Ergebnis bestätigt. Weitere aussagekräftige Studienergebnisse zur
Langzeit-Relapseinzidenz nach RIC stehen noch aus.
4.2.2.2 GvH-Prophylaxe
In unserer Analyse spielt die Art der GvH-Prophylaxe, die wir in drei frei gewählte
Gruppen: „Cyclosporin und Methotrexat (MTX)“, „Cyclosporin und andere“ und „andere“
eingeteilt haben, keine Rolle auf die von uns gewählten Endpunkte aGvHD-Inzidenz,
Relapseinzidenz, TRM/NRM und Gesamtüberleben. Cyclosporin und MTX ist die
heutzutage am häufigsten gebräuchliche Immunsuppression nach HSCT; MTX wird auch
häufig durch andere Immunsuppressiva (wie z. B. Prednisolon) ausgetauscht. Eine erhöhte
Relapseinzidenz durch eine stärkere Immunsuppression (z. B. durch Kombination von CsA
und MTX), wie in der Literatur beschrieben (Aschan, 2006), können wir nicht beobachten.
4.2.2.3 Diagnose
Die Diagnose beeinflusst das Gesamtüberleben (p<0,001) sowie das Auftreten eines
Krankheitsrückfalls (p=0,03) signifikant. Für das Gesamtüberleben gilt dabei ein
zunehmend schlechteres Überleben in der Reihenfolge: CML - MDS – sonstige – ALL–
AML. Die Wahrscheinlichkeit für ein Rezidiv steigt außerdem in der Reihenfolge MDS –
CML – ALL – AML – sonstige, so dass das schlechtere Gesamtüberleben durchaus durch
die höhere Wahrscheinlichkeit eines Krankheitsrückfalls erklärt werden kann. Da wenige
Studien ein in den Diagnosen so heterogenes Kollektiv aufweisen, konnte oben genannte
Reihenfolge nicht mit Literatur untermauert werden.
98
Die CML hat aufgrund der vielfältigen Therapiemöglichkeiten (Chemotherapie, HSCT,
Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren, siehe Druker et al, 2006), dem guten Ansprechen
auf DLI nach einem Relapse (Mackinnon et al, 1995) und aufgrund ihres generell
langsameren Verlaufs eine günstigere Prognose unter den Leukämien. Das meist langsam
verlaufende myelodysplastische Syndrom hat ebenso eine sehr gute Prognose. Dahingegen
ist man zur Therapie einer akuten Leukämie (AML, ALL) durch das geringfügige
Ansprechen auf DLI und die hochakute, aggressive Verlaufsform auf eine myeloablative
Konditionierung angewiesen, um das Risiko eines frühen Krankheitsrückfalls nach HSCT
zu minimieren (Oran and Lima, 2011). Mehrere Studien weisen auf die Wichtigkeit der
Dosis bei der Konditionierungstherapie einer akuten Leukämie hin (Alyea et al, 2006),
welche durch ihre Toxizität zusätzlich zum aggressiven Verlauf der Erkrankung zur
schlechten Prognose der akuten Leukämien im Erwachsenenalter beiträgt. Auch haben
akute Leukämien eine höhere Relapseinzidenz als chronische, und das MDS hat so gut wie
keine Rückfälle zu verzeichnen.
Die Untergruppe „sonstige“ fasst Erkrankungen zusammen, welche alleine nicht 5% des
Kollektivs ausmachen und ist aus rein statistischer Notwendigkeit entstanden. Somit
werden darin sowohl die langsam verlaufende CLL als auch das hochaggressive NHL
zusammengefasst. Dadurch ist diese Gruppe in ihrer Prognose sehr heterogen. Durch diese
Heterogenität entsteht wohl auch die verschiedenartige Einordnung in die Reihenfolge der
Relapsewahrscheinlichkeit (erster Platz, somit höchste Wahrscheinlichkeit) und des
Gesamtüberlebens (mittlerer Platz zwischen chronischen und akuten Leukämien).
4.2.2.4 Krankheitsstadium bei Tx
Ein weiterer Faktor mit signifikantem Auswirken auf das Gesamtüberleben in unserer
Studie ist das Krankheitsstadium, in welchem der Patient transplantiert wird. Patienten, die
in späteren Krankheitsstadien transplantiert werden, überleben signifikant seltener als
diejenigen im frühen Stadium. Dies ist auch in der gängigen Literatur beschrieben (Eapen
and Rocha, 2008). Das schlechtere Gesamtüberleben ist wesentlich durch den Tod an
einem Krankheitsrückfall bedingt: So erleiden Patienten, die in erster kompletter
Remission (akute Leukämie), erster chronischer Phase (chronische Leukämie) oder
Niedrigrisiko-MDS transplantiert werden, nur in 20% der Fälle einen Rückfall. Von den
Patienten, die in zweiter kompletter Remission oder höherem Stadium (akute Leukämien),
zweiter chronischer Phase oder höherem Stadium (chronische Leukämien) oder Mittel- bis
99
Hochrisiko-MDS transplantiert werden, erleiden über 33% ein Relapse. Auch wenn wir
nur eine Tendenz hin zu höherer Relapseinzidenz bei höheren Krankheitsstadien feststellen
konnten, stimmt dies mit dem aktuellen wissenschaftlichen Konsens überein, laut dem das
Rückfallrisiko streng mit Diagnose und Krankheitsstadium korreliert: So haben z. B. in
der Literatur Patienten, die an CML erkrankt sind, wenn sie in erster chronischer Phase
transplantiert werden, ein Rückfallrisiko von 20-30%, während das Risiko bei denjenigen,
die später transplantiert werden, bei 40-60% liegt; bei Patienten, die in
Chemotherapierefraktion transplantiert werden, sogar bei 70% (Aschan, 2006). In der
ersten kompletten Remission transplantierte AML Patienten haben sogar eine 50-70%ige
Wahrscheinlichkeit, in den ersten 3 Jahren nach HSCT einen Krankheitsrückfall zu
erleiden, 20-40% erreichen sogar keine Remission durch Konditionierung (Robak and
Wierzbowska, 2009).
4.3 Einfluss der untersuchten mHag auf die klinischen Endpunkte nach
allogener, unverwandter HSCT
Durch eine multivariate statistische Auswertung der in der vorliegenden Arbeit
gewonnenen Daten konnten, neben den bekannten Risikofaktoren (siehe hierzu Kapitel
4.2), mehrere mHag-Inkompatibilitäten als weitere Risikofaktoren auf die von uns
gewählten klinischen Endpunkte nach unverwandter, allogener HSCT detektiert werden.
4.3.1 Einfluss auf die aGvHD-Inzidenz
Keiner der bekannten Risikofaktoren wie z. B. Art der GvHD-Prophylaxe, HLA-Match
oder Spenderalter (Eapen and Rocha, 2008) zeigte in unserer Analyse einen signikanten
Einfluss auf die Inzidenz einer aGvHD. Als einziges mHag mit Auswirkungen auf die
Entwicklung einer aGvHD zeigte sich HA-8, mit einem erhöhten Risiko einer aGvHD bei
Mismatch in HvG-Richtung in univariater und multivariater Analyse (jeweils p=0,01).
Akatsuka et al konnten in einer Studie mit 577 verwandten Transplantationen Folgendes
zeigen: Bei 72 Patienten, für die ein Mismatch in HA-8 bestand, wurde nach Korrektur für
andere, bekannte Risikofaktoren eine erhöhte Inzidenz für aGvHD Grad II bis IV im
Gegensatz zur gematchten Kohorte festgestellt; Auswirkungen auf die anderen Outcomes
100
(Relapse, Gesamtüberleben, cGvHD) konnten nicht festgestellt werden (Akatsuka et al,
2003b). Auch Perez-García et al konnten 2005 in einer Studie mit 146 Erwachsenen nach
verwandter HSCT im multivariaten Analysemodell zeigen, dass HA-8-Mismatche mit
einem erhöhten Risiko schwerer aGvHD (Grad III-IV) assoziiert sind und damit unsere
und die Ergebnisse Akatsukas et al von 2003 bestätigen. In der gleichen Studie wurde
festgestellt, dass HA-8-Mismatche das Gesamtüberleben sowie das krankheitsfreie
Überleben signifikant senken (Perez-García et al, 2005). Somit gibt es eindeutige Hinweise
auf eine wichtige Rolle von HA-8 bei der Inzidenz einer klinisch relevanten aGvHD.
Allerdings handelt es sich in unserer Analyse um HA-8-Mismatche in HvG-Richtung,
welche eine erhöhte Inzidenz einer aGvHD nicht wirklich logisch erklären. Im Gegensatz
dazu sind in den oben genannten Studien Mismatche in GvH-Richtung beschrieben, die
eine erhöhte Inzidenz einer aGvHD weitaus besser erklären.
Die mehrfach in vorhergegangenen Studien beschriebene erhöhte aGvHD-Inzidenz durch
HA-1-Mismatche in GvH-Richtung (Goulmy et al, 1996b; Tseng et al, 1999, Gallardo et
al, 2001) konnten wir nicht bestätigen. Unsere Ergebnisse stimmen mit denen von Lin et al
aus dem Jahr 2001 überein: Diese haben bei 613 verwandten Patienten-Spender-Paaren
HA-1-Inkompatibilitäten und deren Auswirkungen auf klinische Endpunkte nach HSCT
untersucht und haben zwischen HA-1-gematchten und -gemismatchten Paaren keinen
Unterschied in Bezug auf Gesamtüberleben, Inzidenz einer aGvHD Grad II bis IV, eines
Rückfalls oder der TRM/NRM gefunden (Lin et al, 2001). Auch Heinemann et al konnten
HA-1-Mismatche nicht als Risikofaktor für eine aGvHD-Inzidenz im multivariaten Modell
identifizieren (Heinemann et al, 2004).
4.3.2 Einfluss auf die Inzidenz eines Krankheitsrückfalls
Für das Auftreten eines Krankheitsrückfalls spielen verschiedene Risikofaktoren eine
wichtige Rolle: Neben der Art der Diagnose (p=0,03), dem Geschlechtsmismatch (p=0,01),
der Art der Konditionierung (p<0,001) und der Stammzellquelle (p=0,005) mit eindeutiger
Signifikanz zeigen auch Patientenalter und Krankheitsstadium Tendenzen, einen
Krankheitsrückfall zu beeinflussen. Der Einfluss von Diagnose, Krankheitsstadium, Art
der Konditionierung sowie Patientenalter wurde auch in aktueller Literatur beschrieben
(Aschan, 2006; Burnett et al, 2011).
101
Wir konnten zeigen, dass sich bei einem ACC-1-Mismatch in GvHoderHvG-Richtung
signifikant (multivariat:p=0,01) die Wahrscheinlichkeit eines Relapses gegenüber den für
ACC-1 gematchten Transplantationen erhöht. Die erhöhte Wahrscheinlichkeit eines
Krankheitsrückfalls wirkte sich aber weder auf das Gesamtüberleben aus (p=0,64), noch ist
dies mit der Theorie zum GvL-Effekt zu erklären: Hiernach begünstigt ein Mismatch in
GvH-Richtung eine Abtötung der nach Chemotherapie übrig gebliebenen Resttumorzellen
durch Spender-T-Zellen und führt somit zum besseren Überleben sowie einer niedrigeren
Krankheitsrückfallrate. Wir haben ein genau gegenteiliges Ergebnis geliefert. Auch steht
dies teilweise im Widerspruch mit den von Nishida et al veröffentlichten Daten von 2004;
hier konnte kein Einfluss von ACC-1 mit den Outcomes nach nicht-verwandter HSCT
festgestellt werden (Nishida et al, 2004), andererseits konnten die von Nishida et al
festgestellten fehlenden Auswirkungen auf aGvHD und Gesamtüberleben bestätigt werden.
Weiterhin haben wir herausgefunden, dass der von Heinold et al beschriebene
Polymorphismus im Codon 206 des Adhäsionsmoleküls CD62L (Heinold et al, 2010) eine
Rolle für einen Krankheitsrückfall spielt: Ein Mismatch in GvH-Richtung in Codon 206
erhöht (multivariat: p=0,01), ein Mismatch in HvG-Richtung mindert (multivariat: p=0,03)
die Wahrscheinlichkeit eines Krankheitsrückfalls, wenn man den Polymorphimus in der
Gesamtkohorte untersucht (alle HLA Merkmale). Auf das Gesamtüberleben hat die
erhöhte bzw. verminderte Relapseinzidenz in der Gesamtkohorte jedoch keine
Auswirkungen (p=0,32 bzw. 0,39). Auch hier steht das Resultat im Widerspruch mit einem
GvL-Effekt. Ein weiterer Polymorphismus von CD62L in Codon 213 ist von Maruya et al
schon 1998 beschrieben worden (Maruya et al, 1998). Durch die räumliche Nähe der
beiden Polymorphismen und durch die Tatsache, dass durch den Codon 213-
Polymorphimus möglicherweise ein antigenes Peptid, welches in der HLA-A3-
Superfamilie gebunden werden kann, gebildet wird, haben wir unsere Untersuchungen des
Codon 206-Polymorphismus auf die Subgruppe der der HLA-A3-Superfamilie
zugehörigen HLA-Merkmale erweitert. Hier konnten wir die Auswirkungen auf einen
Krankheitsrückfall jedoch nicht bestätigen. Bisherige Studienergebnisse zum Codon 206-
Polymorphismus gibt es nur von Heinold et al zur Nierentransplantation: Hier spielt dieser
SNP keine Rolle auf die Dauer des Transplantatüberlebens (Heinold et al, 2010), was
passend zu unseren Ergebnissen - kein Einfluss auf das Gesamtüberleben - im HSCT-
Setting ist.
Ein drittes mHag mit relevantem Einfluss auf die Entstehung eines Relapses ist PANE-1.
Ein Mismatch in HvG-Richtung erhöht die Inzidenz eines Rückfalls der Grunderkrankung
102
signifikant (p=0,001). Da das alternative PANE-1-Transkript, welches für das mHag
kodiert, nur auf ruhenden B-Zellen und B-CLL Zellen exprimiert wird und bei Aktivierung
dieser abnimmt (Brickner et al, 2006), ist fraglich, ob ein Mismatch für die erhöhte
Relapseinzidenz verantwortlich ist. Eher würde bei einem Relapse das Transkript des
mHag in den proliferierenden, leukämischen B-Zellen abnehmen und so ein Mismatch in
GvH-Richtung entstehen. Bisher liegen keine weiteren Studienergebnisse zu Mismatchen
im durch PANE-1 kodierten mHag in Verbindung mit HSCT vor.
Ein interessantes Ergebnis haben de Rijke et al 2003 bei Untersuchungen zu HB-1
gefunden: Da HB-1 selektiv auf u.a. B-ALL-Zellen exprimiert wird und außerdem jedes
der beiden Allele (HB-1H und
Y) durch die jeweils kodierten Peptide eine allogene T-Zell-
Antwort auslöst, haben sie vermutet, dass es sich besonders gut zur Induktion einer GvL-
Reaktion nach allogener HLA-identer HSCT eignen würde. So haben sie erstmals durch
mit antigenem HB-1H Peptid beladene dendritische Zellen spezifische zytotoxische CD-8
+-
T-Zellen in vivo generiert. Von einem generierten CTL-Klon wurde bei Stimulation mit B-
ALL-Zellen IFN- γ sezerniert. Interessanterweise wurde durch Stimulation mit HB-1H-
Antigen gleichzeitig eine CD8+- und eine CD4
+-T-Zell-Antwort induziert. Dies stand in
Übereinstimmung mit bisherigen, präklinischen Studien, die besagten, dass zur effektiven
Antitumorantwort sowohl zytotoxische CD8+-T-Zellen wie auch CD4
+-T-Helferzellen
unabdingbar sind (Pardoll and Topalian, 1998; Ossendorp et al, 1998; Toes et al, 1999;
Wang and Rosenberg, 1999). Somit hat HB-1 die notwendigen Eigenschaften als Target
einer T-Zell-vermittelten B-ALL-Antitumortherapie (de Rijke et al, 2003). Die von de
Rijke et al vorausgesagte Targetfunktion von HB-1 zur Induktion eines GvL-Effektes,
konnten wir insofern nicht bestätigen, als dass ein Mismatch von HB-1 die Inzidenz eines
Relapses nicht wesentlich beeinflusst hat. Andererseits haben wir die Relapseinzidenz
aufgrund der geringen Gruppengröße von HLA-B44 positiven Patienten-Spender-Paaren
(n=77) nur im Gesamtkollektiv und nicht in einer speziellen ALL-Gruppe untersucht.
Der in der univariaten Analyse als signifikant aufgefallene Einfluss eines CD31 Codon
563-Mismatch in GvHundHvG-Richtung (senkt das Relapserisiko univariat in der Gruppe
„alle HLA-Merkmale“, p=0,04) konnte multivariat nicht bestätigt werden.
103
4.3.3 Einfluss auf die Inzidenz von TRM/NRM
Transplant related mortality (TRM) wird definiert als Tod durch transplantationsbedingte
Nebenwirkungen und wird in den neueren Studien eher als Non relapse mortality (NRM),
d. h. Tod, der nicht durch Krankheitsrückfall bzw. -fortschreiten bedingt ist, bezeichnet. In
der von uns durchgeführten Studie beeinflussen neben dem HLA-Match als unabhängigem
Risikofaktor noch zwei weitere mHag das Auftreten von TRM/NRM.
Das erste ist ACC-2, welches bei einem Mismatch in GvH-Richtung die TRM/NRM-
Inzidenz reduziert (p=0,02). Gleichzeitig hat dieses Mismatch einen positiven Effekt auf
das Gesamtüberleben (p=0,04). Eigentlich würde man bei einer Verbesserung des
Gesamtüberlebens durch einen Mismatch in GvH-Richtung eher eine Senkung der
Relapseinzidenz erwarten, dies spräche für einen durch das Mismatch ausgelösten GvL-
Effekt. Dies konnten wir jedoch nicht beobachten: Es bestand kein signifikanter
Zusammenhang zwischen Relapseinzidenz und einem ACC-2 Mismatch in GvH-Richtung
(p=0,31). Andererseits wurden von Einsele et al sowie von Hansen et al auch HLA-
Inkompatibilitäten als wichtiger Faktor für die Entwicklung von TRM/NRM beschrieben,
da diese die hämatopoetische Rekonstitution verlangsamen und somit das Risiko für
Infektionen und tranplantationsassoziierte Organtoxizität erhöhen können (Einsele et al,
2001; Hansen et al, 2008). Dies könnte neben den HLA-Merkmalen auch für
Inkompatibilitäten von mHag, in diesem Falle ACC-2, zutreffen. In der bestehenden
Literatur wurden bislang für ACC-2 noch keine Auswirkungen auf klinische Endpunkte
einer HSCT beschrieben.
Die gleiche Wirkung auf TRM/NRM-Inzidenz und Gesamtüberleben zeigt ein Mismatch in
GvH-Richtung in Codon 206 des Adhäsionsmoleküls CD62L in der Subgruppe der HLA-
A3-Superfamilie. Für ein Mismatch in Codon 213 des gleichen Adhäsionsmoleküls wurde
von Katagiri et al ein verbessertes Gesamtüberleben durch Reduktion der Relapseinzidenz
beschrieben, jedoch wurde die Auswirkung auf die Inzidenz von TRM/NRM in dieser
Studie nicht untersucht (Katagiri et al, 2006). Eine andere interessante Interpretation
unserer Ergebnisse wird durch die Rolle von CD62L als Adhäsionsmolekül, welches nur
auf Leukozyten exprimiert wird und eine wichtige Rolle für Anbinden und Rollen dieser
am Endothel spielt, gegeben. Somit könnte CD62L nicht als mHag, sondern der
Polymorphismus in Codon 206 als solcher im Adhäsionsmolekül ausschlaggebend für eine
verbesserte Infektabwehr durch eine bessere Leukozytenfunktion sein, und dadurch zu
104
einer verminderten TRM/NRM-Inzidenz und einem verbesserten Gesamtüberleben führen.
Erste Hinweise auf eine Rolle von CD62L bei Auftreten und Persistenz bzw. Ausheilen
von Infektionen geben uns Rafiei et al mit dem Zusammenhang des Codon 206
Polymorphimus und Infektionen mit Brucellose (Rafiei et al, 2006).
In der multivariaten kompetitiven Risikoanalyse von ACC-2- und CD62L Codon 206-
Mismatchen fielen, neben dem bekannten Einfluss vom HLA-Match, zusätzliche
Signifikanzen der Risikofaktoren Diagnose und Krankheitsstadium (siehe Kapitel 3.7,
Abschnitt 2.2a)) auf. Da wir dies jedoch in der kompetitiven Risikoanalyse zur
Risikofaktorenanalyse (Modell mit allen bekannten Risikofaktoren ohne mHag) nicht
bestätigen konnten, sind dies vermutlich falsch-positive Ergebnisse (siehe hierzu Kapitel
4.4).
Die von Terakura et al 2005 beschriebene erhöhte Sterblichkeit durch erhöhte TRN/NRM
durch einen für UGT2B17 positiven Donor konnten wir nicht bestätigen, obwohl die Zahl
der UGT2B17 positiven Spender mit 88% deutlich höher ist als in der japanischen
Bevölkerung mit 15% (Terakura et al, 2005). Auch in der von McCaroll et al im Jahre
2009 durchgeführten Studie konnte kein Einfluss von UGT2B17 auf TRM/NRM,
Gesamtüberleben und Krankheitsrückfall gezeigt werden, allerdings stieg bei den 1345
untersuchten Patienten-Spender-Paaren die Inzidenz einer aGvHD bei einem UGT2B17-
Mismatch in GvH-Richtung (McCaroll et al, 2009). Dies konnten wir wiederum in unserer
Kohorte nicht bestätigen.
4.3.4 Einfluss auf das Gesamtüberleben
Neben ACC-2 und Codon 206 von CD62L in der Subgruppe der HLA-A3-Superfamilie,
die beide schon in Kapitel 4.3., Abschnitt 3 diskutiert wurden, haben CD31 (in
Gesamtgruppe aller HLA-Merkmale) und Codon 213 von CD62L (in der HLA-A3-
Superfamilie) einen signifikanten Einfluss auf das Gesamtüberleben nach allogener, nicht-
verwandter HSCT.
CD31 (PECAM-1) gehört ebenso wie CD62L zur Familie der Adhäsionsmoleküle, wird
aber zusätzlich zu Leukozyten auch auf Endothelzellen, Thromobozyten und Monozyten
exprimiert und spielt eine Rolle in der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion,
Leukozytenmigration, T-Zell-Aktivierung und Angiogenese. Bis jetzt sind zwar drei
105
polymorphe Codons bekannt (Codon 125, 563 und 670), das durch diese Polymorphismen
gebildete möglicherweise antigene Peptid jedoch noch nicht. Maruya et al haben ein Peptid
vermutet, welches von der HLA-B7 oder HLA-B44-Superfamilie gebunden werden kann
(Maruya et al, 1998), zusätzlich hierzu haben wir die Auswirkung der Polymorphismen
auch in der gesamten Gruppe untersucht. In unserer Arbeit konnten wir beobachten, dass
ein Mismatch der Codons 125 und 563 in GvHundHvG-Richtung signifikant das
Gesamtüberleben verbesserte (multivariat: p=0,03 bzw. p=0,04). Patienten mit
GvHundHvG-gemismatchten Codons 125 und 563 zeigten auch eine Tendenz zur
niedrigeren Inzidenz eines Krankheitsrückfalls (multivariat beide: p=0,08), diese war
jedoch nicht signifikant. Diese Influenz auf Gesamtüberleben sowie Relapse würde durch
die Aussage von Katagiri et al in 2006 gestützt: Sie fanden heraus, dass ein Mismatch in
GvH-Richtung von CD31 Codon 125 und 563 (nur Tendenz) und CD62L Codon 213
(signifikant) das Gesamtüberleben nach HSCT verbessern, indem die Relapseinzidenz
gesenkt wird (Katagiri et al, 2006). Katagiris et al und unser Ergebnis würden für einen
möglichen GvL-Effekt durch die CD31-Mismatche sprechen.
Unser zweites signifikantes Ergebnis, ein CD31 Codon 563-Mismatch in HvG-Richtung
betreffend, welches zu einer höheren Überlebenswahrscheinlichkeit führt, konnte durch die
gängige Literatur nicht untermauert werden.
Ansonsten gibt es in der Literatur zu den CD31-Polymorphismen bisher gegensätzliche
Aussagen: Behar et al, die 1996 den Codon-125-Polymorphismus als Erste beschrieben,
konnten in der Gruppe aller HLA Merkmale eine erhöhte Inzidenz von aGvHD bei
Patienten feststellen, wenn ein Mismatch in GvH-Richtung oder ein Mismatch in
GvHundHvG-Richtung vorliegen (Behar et al, 1996). Nichols et al konnten im gleichen
Jahr diese Beobachtung in ihrer Multicenterstudie mit 301 Paaren nicht bestätigen (Nichols
et al, 1996). Weiterhin konnten Maruya et al 1998 zusätzlich zum SNP in Exon 3, Codon
125, noch drei weitere Aminosäureaustausche im CD31-Gen identifizieren: Der erste, sehr
seltene befindet sich auch in Exon 3, Codon 80, und führt zum Austausch von Valin zu
Methionin. Die anderen liegen in Exon 8, Codon 563 (Asparagin zu Serin) und Exon 12,
Codon 670 (Glycin zu Arginin). Maruya et al konnten in einer japanischen Kohorte von
118 Patienten und deren HLA-identen Geschwisterspendern zeigen, dass bei Codon-563-
und 670-Mismatch in GvH-Richtung die Inzidenz einer aGvHD bei Patienten der HLA-
B44-Superfamilie signifikant anstieg. Für Codon 125 war dies nicht der Fall (Maruya et al,
1998). Die erste Studie zum Einfluss von CD31 auf aGvHD, cGvHD, Relapse und
Gesamtüberleben nach HSCT mit einer US-amerikanischen Kohorte führten Grumet et al
106
2001 durch. Sie stellten fest, dass sowohl für Codon 125 wie auch für Codon 563 und 670
ein Mismatch in GvHundHvG-Richtung in der multivariaten Analyse in der Gruppe aller
HLA-Merkmale ein unabhängiger, signifikanter Risikofaktor für schwere (Grad III-IV)
akute GvHD und das Gesamtüberleben ist. Außerdem zeigte sich in der multivariaten
Analyse ein (nicht signifikanter) Trend für den Zusammenhang von CD31 Codon 125-,
563- und 670-Mismatchen und erhöhtem Relapse (Grumet et al, 2001). Cavanagh et al
zeigten 2005 in einer Regressionsanalyse der Outcomes aGvHD und Gesamtüberleben,
dass der CD31-Genotyp Valin/Asparagin/Glycin beim Patienten mit einer erhöhten
aGvHD assoziiert war (p=0,004) und Heterozygotie des Spenders in Codon 563 mit
schlechterem Gesamtüberleben (Cavanagh et al, 2005). Somit zeigten mehrere Studien
eine durch CD31-Mismatche erhöhte Inzidenz der aGvHD, manchmal sogar mit
Auswirkung auf das Gesamtüberleben, welche wir in unseren Ergebnissen nicht bestätigen
konnten. Weiterhin konnten wir in den Subgruppen der HLA-B44-Superfamilie sowie der
HLA-B7-Superfamilie keine multivariat signifikanten Ergebnisse finden.
Im Gegensatz zu einem GvH-Mismatch in Codon 206, welches das Gesamtüberleben nach
HSCT verbessert (p=0,003, siehe Kapitel 4.3.3), senkt ein Mismatch in GvHoderHvG-
Richtung in Codon 213 des Adhäsionsmoleküls CD62L das Gesamtüberleben der
Patienten zugehörig zur HLA-A3-Superfamilie signifikant. Auch die Inzidenz der
TRM/NRM, die durch ein Codon 206-Mismatch gesenkt wird, wird durch ein Codon 213-
Mismatch zwar nicht signifikant, aber tendenziell (p=0,09) gesteigert. Somit hat in unserer
Studie ein Codon 213-Mismatch genau den gegenteiligen Effekt zu einem Codon 206-
Mismatch. Maruya et al, die 1998 als erste den Codon 213-Polymorphismus beschrieben
haben, haben diesen in einer japanischen Kohorte, auch in der Gruppe der HLA-A3-
Superfamilie, bei einem Mismatch in GvH-Richtung mit einer erhöhten aGvHD-Inzidenz
in Verbindung gebracht (Maruya et al, 1998). Einen weiteren Effekt eines Codon 213-
Mismatches in GvH-Richtung konnten Katagiri et al in einer japanischen Kohorte von 106
HLA-identen Patienten-Spender-Paaren zeigen: Bei Mismatch für CD31 Codon 125 und
563 (tendenziell) und CD62L (signifikant) hatten die Patienten eine höhere 12-Jahres-
Überlebensrate als in einer Matchsituation. Dies wurde auf eine niedrigere Relapseinzidenz
zurückgeführt, was somit für einen GvL-Effekt sprach (Katagiri et al, 2006). Diese
Beobachtung entspricht zwar unseren Ergebnissen für CD31 (siehe oberer Abschnitt), für
Codon 213 von CD62L jedoch haben wir Gegenteiliges festgestellt. Auch hier könnten die
Ergebnisse möglicherweise, analog der Interpretation zu Codon 206, durch die Funktion
107
von CD62L als Adhäsionmolekül hervorgerufen werden: Der Polymorphismus in Codon
213 könnte an einer für die Funktion von CD62L wichtigen Stelle stehen und somit das
Anbinden und Rollen der Leukozyten behindern, womit Infektionen, ein Hauptgrund für
TRM/NRM, begünstigt wären (siehe Kapitel 4.3, Abschnitt 3).
Neben den erwähnten mHag hatten als unabhängige Risikofaktoren erwartungsgemäß das
Patientenalter, die Diagnose, das Krankheitsstadium und die Stammzellquelle einen
signifikanten Einfluss auf Gesamtüberleben in unserer Kohorte.
4.4 Statistische Auswertung und Interpretation der Ergebnisse
Die aktuelle wissenschaftliche Literatur zeigt, dass die Analysen zum Einfluss einzelner
mHag-Mismatche auf klinische Endpunkte nach hämatopoetischer
Stammzelltransplantation widersprüchliche Ergebnisse zeigen. Zum besseren Verständnis
haben wir die Ergebnisse der bisherigen Studien hier noch einmal übersichtlich zusammen-
gefasst (siehe hierzu Tabelle 28). Neben den verschiedenen Studienpopulationen
(Orientalisch/asiatische Kohorten z.B. bei Maruya et al, 1998; Tseng et al, 1999 gegenüber
Kaukasiern europäischer Abstammung bei Perez-García et al, 2005 oder Kaukasiern US-
amerikanischer Abstammung bei Grumet et al, 2001), der verschieden Kohortengröße und
verschiedenen Art der HSCT (verwandt vs. nicht-verwandt) wurden auch zur statistischen
Analyse der Ergebnisse verschiedene Methoden gewählt (siehe Tabelle 28). Wir haben uns
an die neuesten vom EBMT ausgesprochenen Empfehlungen zur Auswertung von Daten
aus Stammzelltransplantationen gehalten (Szydlo et al, 2008; Gooley et al, 1999, Labopin
et al, 2009) und Einflüsse auf das Gesamtüberleben mittels Cox-Regressionsmodell (uni–
und multivariat) ermittelt, charakterisiert durch Hazard Ratio und 95%CI der Hazard Ratio
(siehe hierzu Kapitel 2.2, Abschnitt 6.2). Die berechneten kumulativen Inzidenzen der
sekundären Outcomes (aGvHD, Relapse und TRM/NRM) haben wir in einer uni- und
multivariaten kompetitiven Risikoanalyse den kumulativen Inzidenzen ihrer jeweiligen
kompetitiven Risiken gegenübergestellt (siehe Kapitel 2.2, Abschnitt 6.3). In diesen
Analysen wird immer die zeitliche Entwicklung der Auftretenswahrscheinlichkeiten der
von uns gewählten Endpunkte mit berücksichtigt und das persönliche Risiko von
Merkmalsträgern gegenüber Nicht-Merkmalsträgern ermittelt. Gerade Daten aus älteren
Studien (z. B. aus Goulmy et al, 1996b; Behar et al, 1996) wurden jedoch entweder ohne
108
Berücksichtigung der Zeitachse in der statistischen Analyse durch Unabhängigkeitstest
(Chi-Quadrat-Test) oder unter Berücksichtigung der Zeitachse mit der Kaplan-Meier-
Methode ermittelt, welche Verhältnisse von Merkmalsträgern zu Nicht-Merkmalsträger zu
bestimmten Zeitpunkten (sog. Survival-Raten) berechnet. Somit sind die so ermittelten
Signifikanzen aufgrund verschiedener Aussagen teilweise gar nicht mit unseren
Signifikanzen zu vergleichen. Neuere Studien (z. B. Akatsuka et al, 2003b; Spellman et al,
2009) verwendeten ebenfalls den vom EBMT empfohlenen Standard, so dass hier der
Vergleich mit unseren Ergebnissen wieder möglich ist.
Einen weitereren Diskussionspunkt in diesem Abschnitt stellt das multiple Testen dar.
Dadurch, dass wir elf verschiedene mHag, dabei jedes mindestens in drei verschiedene
Mismatch-Richtungen (GvH, HvG, GvHoderHvG und evtl. GvHundHvG) und auf vier
verschiedene Endpunkte (OS, aGvHD, TRM/NRM, Relapse) in einer gleichen
Grundgesamtheit getestet haben, wurden insgesamt 132 Tests in der gleichen
Grundgesamtheit durchgeführt. Somit sind bei einem gewählten α-Niveau von 5%
(gewähltes Fehlerniveau, welches in 5% der Testungen falsch-positive Ergebnisse durch
eine falsche Ablehnung der Nullhypothese zulässt) statistisch gesehen 6,6 (5% von 132)
Signifikanzen falsch-positiv, d. h. zufällig signifikant. Um dem entgegenzuwirken, gibt es
die Möglichkeit statistischer Korrekturen, wie z. B. die Bonferroni-Korrektur, die eine
häufig in medizinischen Studien verwendete Methode ist (Bland and Altman, 1995). Bei
allen in Tabelle 28 zusammen gefassten Studien wurde jedoch keine Korrektur für
multiples Testen erwähnt. Bei Studien, die nur ein einzelnes mHag untersuchen, ist dies
durch die geringe Anzahl notwendiger Tests nachzuvollziehen, jedoch wurde dies auch bei
den beiden großen Studien (Spellman et al 2009, Markiewicz et al 2009) nicht
angesprochen, so dass wir uns entschieden haben, die Möglichkeit der statistischen
Korrektur hier zu thematisieren. Spellman et al (2009) haben allerdings die
Signifikanzgrenze auf p<0,01 heruntergesetzt, um multiplen Vergleichen eher gerecht zu
werden.
Zudem haben Spellman et al 2009 in ihrer 730 Patienten-Spender-Paare einschließenden
Studie die mangelnde statistische Teststärke (Power) ihrer Analyse kritisiert, welche u.a.
durch kleine Subgruppen für die Analyse einzelner mHag (gegeben durch die MHC-
Restriktion der mHag, siehe hierzu Kapitel 1.3, Abschnitt 1.1) und auch die relative
Seltenheit von mHag-Disparitäten bedingt ist. Die statistische Teststärke bezeichnet die
Aussagekraft eines statistischen Tests und somit dessen Fähigkeit, eine wahre Signifikanz
eines Unterschieds (Alternativhypothese) auch als solche statistisch zu erkennen und hängt
109
von Kohortengröße, Signifikanzniveau, Merkmalsstreuung und Häufigkeit der zu
detektierenden Unterschiede ab. Auch bei uns lagen kleine Subgruppen vor (z. B. HLA-
B44 Gruppe: n=77, HLA-A3: n=88), was die Aussagekraft (Power) unserer statistischen
Testergebnisse wahrscheinlich genauso einschränkte, jedoch nur durch eine größere
Gesamtkohorte und folglich großen Subgruppenzahlen zu umgehen wäre. Die relative
Seltenheit von mHag-Disparitäten ist genetisch bedingt. Dadurch, dass meist das für das
antigene Peptid kodierende Allel eines mHag seltener ist als sein Gegenspieler, werden
auch relevante Mismatche seltener. Ein Beispiel hierfür liefert ACC-2: Das für das
antigene Peptid kodierende ACC-2 D-Allel ist mit 25,5% Anteil deutlich seltener als sein
Gegenspieler, ACC-2 G mit 74,5%. Hierdurch sinkt die Wahrscheinlichkeit für ein
immunogen relevantes Mismatch von ACC-2. Dies kann man außerdem im Ergebnisteil
dieser Arbeit sehr gut an den Fallzahlen von gemismatchten Paaren gegenüber gematchten
Paaren sowohl bei der Überlebenszeitanalyse als auch bei der Analyse der sekundären
Outcomes beobachten. Auch dieser Faktor erschwert die Detektion von Unterschieden, die
durch mHag-Mismatche bedingt sind und ist leider nicht durch statistische Kalkulationen
auszuschließen.
Insgesamt darf man sowohl bei signifikanten wie auch bei nicht signifikanten Ergebnissen
unserer Studie die verschiedenen statistischen sowie genetischen Bedingungen nicht außer
Acht lassen. Da viele Ergebnisse eher unerwartet aufgefallen sind, ist auch eine
Bestätigung durch weitere Studien erforderlich, bevor endgültige Schlüsse gezogen werden
können.
4.5 Auswirkungen von mHag-Mismatchen auf die allogene HSCT: Stand
der Forschung und Ausblick
In bisherigen Studien zum Effekt einzelner mHag in der Stammzelltransplantation stößt
man oft auf widersprüchliche Ergebnisse (siehe hierzu Tabelle 28) und auch die
vorliegende Arbeit kam meist zu neuen Aussagen, die nicht durch die bestehende Literatur
zu untermauern waren. Die meisten bisherigen Studien jedoch haben entweder eine
überschaubare Anzahl von Transplantationspaaren oder haben nur den Einfluss eines
einzelnen mHag untersucht. Bisher gibt es nur drei Studien, die mit unserer entweder in
ihrer Populationsgröße oder in der Anzahl der untersuchten mHag oder in beidem
vergleichbar wären. Die erste große Studie wurde 1996 durch Goulmy et al durchgeführt.
110
Untersucht wurden die mHag-Mismatche von HA-1 bis HA-5 und deren Auswirkungen
auf die aGvHD in 148 verwandten Transplantationspaaren. Festgestellt wurde eine erhöhte
aGvHD-Inzidenz bei Patienten, die für HA-1 in GvH-Richtung gemismatcht waren
(Goulmy et al, 1996b). Dies konnte in folgenden Studien bestätigt (Tseng et al, 1999;
Gallardo et al, 2001) sowie auch widerlegt (Lin et al, 2001) werden; auch wir konnten
keinen signifikanten Einfluss von HA-1-Mismatchen auf die Inzidenz einer aGvHD finden.
Die weiteren beiden großen Studien zu mHag-Mismatchen und allogener HSCT wurden
im Jahre 2009 publiziert und sind damit noch recht aktuell: Markiewicz et al (2009)
untersuchten 93 nicht-verwandte Patienten-Spender-Paare auf die mHag HA-1, -2, -3, -8,
HB-1, ACC-1, -2, SP110, PANE-1, UGT2B17 und HY. Dabei beeinflusste neben HY nur
ein Mismatch in HvG-Richtung von HA-3 signifikant die Inzidenz einer aGvHD nach
HSCT; Gesamtüberleben und Relapseinzidenz wurden von autosomalen mHag nicht
beeinflusst (Markiewicz et al, 2009). Die Beeinflussung der aGvHD durch ein HA-3-
Mismatch in HvG-Richtung war, laut Markiewicz et al 2009, unerwartet und müsste
bestätigt werden. Dies würde auf ein Überleben von immunkompetenten Empfängerzellen
hinweisen, welche auf gemismatchte Spender-mHag reagieren und damit die Donor-T-
Zellen zur Abwehr und damit zur Entwicklung einer aGvHD anregen. Dies könnte auch für
viele von uns gefundene signifikante mHag-Mismatche in HvG-Richtung gelten, allerdings
konnten wir den von Markiewicz et al 2009 gefundenen Effekt von HA-3 nicht bestätigen,
und mangels statistischer Korrekturen können sowohl diese wie auch unsere Ergebnisse
durchaus aus Zufallssignifikanzen entspringen.
Eine weitere Studie stammt von Spellman et al 2009. Es wurden bei 730 unverwandten
Patienten-Spender-Paaren die Einflüsse von Mismatchen der mHag HA-1, -2, -3, -8, HB-1
und CD31 auf Gesamtüberleben, aGvHD Grad III-IV, TRM und cGvHD untersucht. In
Anbetracht der multiplen Tests wurden nur Ergebnisse mit p<0,01 als signifikant gezählt.
Bei der Analyse einzelner mHag-Mismatche fiel lediglich eine signifikant geringere
aGvHD-Inzidenz bei einem Mismatch von CD31 Codon 563 in HvG-Richtung in der
Gruppe der HLA-A2-positiven auf. Daneben wurden auch multiple mHag-Mismatche in
den bestehenden Subgruppen untersucht und dabei folgende Effekte beobachtet: Für
gemismatchte Paare in HvG-Richtung in der HLA-A2-Subgruppe (HA-1, -2, -8 und/oder
CD31) ergab sich eine verminderte aGvHD-Inzidenz bei >2 Mismatchen verglichen mit
gematchten Paaren. Bei Mismatchen in GvH-Richtung in derselben Gruppe kam es zu
einem verminderten Gesamtüberleben bei >2 Mismatchen im Vergleich zu Gematchten.
Tendenzen (p<0,02) zeigten sich in der Gruppe der HLA-A1 positiven Paare: Hier hatten
111
gemismatchte Paare für CD31 und HA-3 in GvH-Richtung ein vermindertes
Gesamtüberleben durch eine erhöhte Inzidenz von TRM (Spellman et al, 2009).
Dass bei der Analyse von multiplen mHag-Mismatchen deutlich häufiger Signifikanzen
gefunden wurden, spricht für einen additiven Effekt einzelner mHag-Mismatche. Es könnte
durch multiple mHag-Mismatche, die alleine keinen Effekt erzielen, zu einer Potenzierung
und somit einem signifikanten Effekt auf die HSCT kommen, wie Heinold es in seinem
Vortrag beschreibt (Heinold, 2011). Bis jetzt existieren dazu bis auf die Spellman-Studie
jedoch noch keine Studien zu multiplen mHag-Mismatchen. Dies ist daher von großem
Interesse für zukünftige Forschung.
Auch ein möglicher GvL-Effekt durch mHag-Mismatche (siehe Kapitel 1.3, Abschnitt 2.2)
ist von weiterem klinischem Interesse und derzeit Gegenstand der Forschung. So haben
DLI mit für HA-1 und HA-2 spezifischen Donor-T-Zellen schon nachweisbare Erfolge
gezeigt (Marijt et al, 2003) und eine gleichzeitige GvHD-Induktion durch
hämatopoesespezifische mHag für unwahrscheinlich befunden (Goulmy, 1997). Auch eine
weitaus einfacher durchzuführende Methode, die Impfung mit HA-1- und HA-2-Peptiden
zur Verstärkung der Spender-Immunzellen zwecks GvL-Erzielung und Gabe vor einer DLI
bei gemismatchtem Spender, ist auf dem Weg in die klinische Anwendung (Phase I und II
Studie) (Goulmy, 2004).
In der Nieren-Transplantation scheinen mHag-Mismatche keine Rolle zu spielen: In einer
multizentrischen Studie mit über 33785 Nierentransplantationspatienten spielte keins der
untersuchten mHag (HA-1, -2, -3, -8, HB-1, ACC-1 und UGT2B17) oder
Adhäsionsmoleküle (CD31, CD62L) eine Rolle für das 5-Jahres-Transplantatüberleben
(Heinold et al, 2008, 178; Heinold et al, 2010).
Eine Herausforderung für die Zukunft stellt sicherlich die Anzahl an möglichen mHag dar.
Die bisher bekannten mHag sind sicher nicht vollständig: Die im menschlichen Genom
bisher bekannten nicht-synonymen SNP’s übersteigen mittlerweile die Zahl von 50000,
daraus resultieren über 800000 mögliche antigene Peptide. Neue Methoden zur schnellen
Identifizierung neuer mHag wurden in den letzten Jahren entwickelt (Van Bergen et al,
2010; Spaapen et al, 2009). Von der Identifikation neuer möglicher mHag erhofft man sich
auch neue Kenntnisse zur Therapie von GvHD bei gleichzeitiger Nutzung eines GvL-
Effektes (Hinds et al, 2005).
112
Tabelle 28: Übersicht der Studienergebnisse zu mHag Einflüssen auf die verschiedenen
Outcomeparameter nach HSCT (aGvHD Grad II-IV, Relapse, TRM/NRM,
Gesamtüberleben); n.a.: keine Angabe vorhanden/nicht untersucht, mHag: Minor
Histokompatibilitätsantigen, aGvHD: akute Graft-versus-Host Disease, TRM/NRM:
Transplant related mortality bzw. Non relapse mortality, OS: Overall Survival, DFS:
Disease free survival, MM in GvH: Mismatch in GvH-Richtung, MM in HvG: Mismatch
in HvG-Richtung, MM in GvHoderHvG: Mismatch in GvH oder HvG-Richtung, MM in
GvHundHvG: Mismatch in GvH und HvG-Richtung, : erhöht, : vermindert
mHag Fall-
zahl
verwandt
/ nicht
verwandt
aGvHD (Grad
II-IV) Relapse
TRM/
NRM
Gesamt-
überleben Referenz
statistische
Analyse
HA-1, -2, -3,
-4, -5 148 verwandt
durch HA-
1-MM in GvHn.a. n.a. n.a.
Goulmy
et al,
1996b
univariat,
Chi-Quadrat
HA-1 237 verwandt
durch HA-
1-MM in GvH,
univariat
signifikant,
multivariat
Tendenz
(p=0,08)
n.a. n.a. n.a. Tseng et
al, 1999
uni- und
multivariate
Regression
HA-1 215 verwandt durch HA-
1-MM in GvHkein Einfluss n.a. kein Einfluss
Gallardo
et al,
2001
uni- und
multivariate
Regression
HA-1 613 verwandt
kein Einfluss
durch MM in
GvH
kein Einfluss kein
Einfluss kein Einfluss
Lin et al,
2001
uni- und
multivariate
Regression
HA-1, CD31
und CD49b 163
verwandt
und nicht
verwandt
kein Einfluss n.a. n.a. n.a.
Heine-
mann et
al, 2004
multivariate
Regression
HA-8 577 verwandt durch HA-
8-MM in GvHkein Einfluss n.a. kein Einfluss
Akatsu-
ka et al,
2003
uni-und
multivariate
Regression
für OS,
kompetitive
Risiken für
aGvHD und
Relapse
HA-8 146 verwandt
durch HA-
8-MM (in
GvH?) !Nur auf
aGvHD Grad
III-IV!
n.a. kein
Einfluss
durch HA-
8-MM (in
GvH?) plus
verkürztes DFS
Pérez-
Garcia
et al,
2005
multivariate
Regression
(Cox-
Modell)
ACC-1 320 nicht
verwandt kein Einfluss kein Einfluss n.a. kein Einfluss
Nishida
et al,
2004
n.a.
113
UGT2B17 435 nicht
verwandt kein Einfluss kein Einfluss
durch
UGT2-
B17-MM
in HvG
durch
UGT2B17 MM
in HvG, kein
Einfluss durch
MM in GvH
Terakura
et al,
2005
multivariate
Regression
(Cox-
Modell)
UGT2B17 1345 verwandt
durch
UGT2B17 MM
in GvH; kein
Einfluss durch
MM in HvG
n.a. n.a. n.a.
McCaroll
et al,
2009
Cochran-
Mantel-
Haenszel-
Test
(Variante
des Chi-
Quadrat-
Test)
CD31 Codon
125 46 verwandt
durch CD31
Codon125 MM
in
GvHoderHvG,
GvHundHvG
und GvH
(Gruppe: alle
HLA-Merkmale)
n.a. n.a. n.a. Behar et
al, 1996
Chi-
Quadrat-
Test
CD31 Codon
125 301 verwandt
kein Einfluss
(Gruppe: alle
HLA-Merkmale)
n.a. n.a. n.a.
Nichols
et al,
1996
Chi-
Quadrat-
Test
CD31 (Codon
80, 125,
563, 670),
CD49b,
CD62L
(Codon 213)
118 verwandt
durch CD31
Codon 563/670
MM in GvH
(Gruppe: HLA-
B44-Superfam)
durch
CD62L MM in
GvH (Gruppe:
HLA-A3-
Superfam)
n.a. n.a. n.a.
Maruya
et al,
1998
Chi-
Quadrat-
Test,
Korrektur
für multiples
Testen
CD31 (Codon
125, 563 und
670)
120 verwandt
durch CD31
MM in
GvHoderHvG
und
GvHundHvG
(für alle 3
Codons-
Gruppe: alle
HLA-Merkmale)
!Grad III-IV!
n.a. n.a.
durch
CD31 MM in
GvHoderHvG
und
GvHundHvG
(alle 3 Codons
– Gruppe: alle
HLA-
Merkmale),
zusätzl.
verkürzte DFS
Grumet
et al,
2001
multivariate
Regression
(Cox-
Modell)
CD31 (Codon
125, 563 und
670)
74 verwandt
bei
Val/Asn/Gly-
Haplotyp des
Donors
n.a. n.a.
bei CD31
Codon 563
Heterozygotie
des Donors
Cava-
nagh et
al, 2005
multivariate
Regression
(Cox-
Modell)
CD31 (Codon
125) 60 verwandt
durch CD31
Codon125 MM
in GvHoderHvG
und
GvHundHvG
durch
CD31
Codon125
MM in
GvHoderHvG
n.a. n.a.
El-
Chenna-
wi et al,
2006
Chi-
Quadrat-
Test
114
(Gruppe: alle
HLA-Merkmale)
und
GvHundHvG
(Gruppe:
alle HLA-
Merkmale)
HA-1, CD31,
CD49b,
CD62L
(Codon 213)
106 n.a. kein Einfluss
durch
CD62L MM
in GvH
n.a. n.a.
Katagiri
et al,
2006
multivariate
Regression
HA-1, -2, -3,
-8, HB-1,
CD31 (Codon
125 und
563)
730 nicht
verwandt
durch CD31
Codon 563 MM
in HvG
!Nur aGvHD
Grad III-IV!
(Gruppe: HLA-
A2)
durch
multiple mHag
MM
kein Einfluss n.a.
durch
multiple mHag
MM in GvH
Spell-
man et
al, 2009
OS:
multivariate
logistische
Regression;
aGvH,cGvH
und
Relapse:
kompetitive
Risiko-
analyse
HA-1, -2, -3,
-8, HB-1,
ACC-1 und -
2, SP110,
PANE-1,
UGT2B17,
HY
92 nicht
verwandt
durch HA-3
und HY (jeweils
MM in HvG)
durch HY
MM in GvHn.a. kein Einfluss
Markie-
wicz et
al, 2009
OS:
multivariate
logistische
Regression,
aGvH,cGvH
und
Relapse:
kompetitive
Risiko-
analyse
115
5. Zusammenfassung
Die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ist eine etablierte,
kurative Therapie für eine Vielzahl maligner, hämatologischer Erkrankungen. Jedoch ist es
bis heute noch nicht gelungen, ihre schwerwiegenden Nebenwirkungen, allen voran die
akute Graft-versus-Host-Erkrankung (aGvHD), stärker einzugrenzen. Auch bei einer
idealen, komplett für das humane Leukozytenantigen (HLA) gematchten Spender- und
Empfängersituation kommt es in 30-40% zu einer aGvHD. Diese klinischen Daten legen
die Existenz sogenannter Minor Histokompatibilitätsantigene (mHag) nahe, welche durch
Aminosäuredifferenzen zwischen Spender und Empfänger in vom Major
Histokompatibiltätskomplex (MHC) exprimierten Peptiden entstehen. Diese aus
intrazellulären Proteinen entstandenen Peptide sind in der Lage, in Anwesenheit von
fremden T-Zellen eine allogene Reaktion auszulösen und somit eine aGvHD zu
verursachen.
In der vorliegenden Studie werden mittels der PCR-SSP Methode (Polymerase-
kettenreaktion mit sequenzspezifischen Primern) die allelischen Ausprägungen der mHag
HA-1, -2, -3, -8, HB-1, ACC-1 und -2, PANE-1 und UGT2B17 sowie die polymorphen
Zelladhäsionsmoleküle CD31 und CD62L in 320 unverwandten HLA-kompatiblen
Patienten-Spender-Paaren analysiert. Die Methodik wird durch die Testung von 8
bekannten Proben sowie dem nachfolgenden Vergleich der gefundenen Allelfrequenzen
mit einer Gruppe von Normalpersonen (n=2011) und einer Allelverteilung im Hardy-
Weinberg-Equilibrium (HWE) validiert.
Mismatche in den untersuchten mHag zwischen Spender und Patient werden multivariat,
zusammen mit den bekannten therapie-, spender- und patientenbezogenen Risikofaktoren,
statistisch auf die klinischen Endpunkte Gesamtüberleben, Inzidenz von aGvHD,
Krankheitsrückfall (Relapse) und Transplant related bzw. Non relapse mortality
(TRM/NRM) ausgewertet. Ein HA-8-Mismatch in HvG (Host-versus-Graft)-Richtung ist
das einzige mHag, welches die Inzidenz einer aGvHD erhöht. Das Auftreten eines
Krankheitsrückfalls wird signifikant durch ACC-1 (erhöhte Inzidenz bei einem Mismatch
in GvHoderHvG - graft-versus-host- oder host-versus-graft-Richtung), PANE-1 (erhöhte
Inzidenz bei einem Mismatch in HvG-Richtung) und Codon 206 von CD62L in der
116
Gruppe aller HLA-Merkmale (erhöhte Inzidenz bei einem Mismatch in GvH (graft-versus-
host)-Richtung; verminderte Inzidenz bei einem Mismatch in HvG-Richtung) beeinflusst.
ACC-2 und Codon 206 von CD62L, letzteres in der Subgruppe HLA-A3-Superfamilie,
(beide jeweils bei einem Mismatch in GvH-Richtung) senken die Inzidenz für TRM/NRM.
Das Gesamtüberleben wird positiv von ACC-2 (bei einem Mismatch in GvH-Richtung)
beeinflusst. Die beiden Adhäsionsmoleküle CD31 und CD62L beeinflussen das
Gesamtüberleben auf vielfältige Weise. In der Gruppe aller HLA-Merkmale verbessern
Mismatche in Codon 125 und 563 von CD31 signifikant das Gesamtüberleben (jeweils bei
einem Mismatch in GvHundHvG – graft-versus-host- und host-versus-graft-Richtung und
für Codon 563 auch bei einem Mismatch in HvG), teilweise erklärbar durch eine Tendenz
zur verminderten Relapseinzidenz (Codon 563). Die beiden Polymorphismen von CD62L
(Codon 206 und 213), analysiert in der HLA-A3-Superfamilie, haben gegenteilige
Auswirkungen auf das Gesamtüberleben: Ein Mismatch in GvH-Richtung in Codon 206
von CD62L verbessert die Überlebenswahrscheinlichkeit, erklärbar durch eine signifikant
niedrigere TRM/NRM-Inzidenz. Dagegen verschlechtert ein Codon 213-Mismatch in
GvHoderHvG-Richtung von CD62L das Überleben signifikant; hier zeigt sich eine
Tendenz zur einer höheren TRM/NRM-Inzidenz.
Unsere Resultate sind kritisch in Bezug auf die statistische Aussagekraft und
molekulargenetische Besonderheiten von mHag zu interpretieren und sollten aufgrund der
widersprüchlichen Ergebnisse bisheriger Studien zum Einfluss von mHag auf klinische
Outcomes nach allogener HSCT durch weitere Studien an großen Kohorten bestätigt
werden, um sichere Aussagen zur klinischen Relevanz treffen zu können.
117
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Danksagung
Danken möchte ich meinem Doktorvater, Herrn Prof. Hubert Schrezenmeier, und meinem
Betreuer, Herrn PD Joannis Mytilineos, sowie meinem Kollegen Dr. Daniel Fürst, für die
Antworten auf meine vielen Fragen, die allzeitige Hilfe bei Problemen und die vielen
fachlichen Tips und Anregungen.
Dem Team der Abteilung Transplantationsimmunologie danke ich für die wunderbare
Arbeitsatmosphäre, die rege Unterstützung bei der labortechnischen Durchführung und die
moralische Unterstützung beim Schreiben und Verbessern. Eure Unterstützung war mir
eine große Hilfe!
Meinem Kommilitonen und guten Freund, Jens Putzbach, danke ich für die Einarbeitung
ins Labor und die vielen gemeinsamen Abende, die wir dort verbracht haben.
Allen voran möchte ich aber meiner Familie, meinen Freunden und meinem Freund für die
ausdauernde moralische Unterstützung beim Schreiben dieser Arbeit danken, sowie
besonders meinem Vater, Ludwig Recker, und meinem Freund, Jonas Rumpf, für das
unermüdliche und genaue Korrekturlesen! Soviele Fehler hätte ich nicht mehr gefunden :-)
Lebenslauf
Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt.
138