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Aus der Klinik für Anästhesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin und Schmerzmedizin
(Direktor Univ.- Prof. Dr. med. Klaus Hahnenkamp)
der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Thema: Tierexperimentelle Untersuchung des Einflusses von aktiviertem Protein C auf die
mesenteriale Plasmaextravasation und Leukozyten- Endothel- Interaktion bei Endotoxinämie
Inaugural – Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades
Doktor der Medizin
(Dr. med.)
der
Universitätsmedizin
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2015
Vorgelegt von: Michael Schade geb. am: 13.03.1983 in: Greiz
2
Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reiner Biffar
1. Gutachter: Prof. Dr. Christian Lehmann
2. Gutachter: PD Dr. Birnbaum
Ort, Raum: Greifswald, Seminarraum L02.22
Tag der Disputation: 16.12.2015
3
Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG..............................................................................................................................................71.1 GESCHICHTEDERSEPSIS........................................................................................................................................71.2 BEGRIFFSDEFINITIONEN........................................................................................................................................71.3 EPIDEMIOLOGIEDERSEPSIS.................................................................................................................................81.4 PATHOPHYSIOLOGIEDERSEPSIS.......................................................................................................................11
Überblick..........................................................................................................................................................111.4.1 DieMikrozirkulationwährendderSepsis.........................................................................................161.4.2 AktiviertesProteinC...................................................................................................................................261.4.3
2 AUFGABENSTELLUNG.........................................................................................................................283 MATERIALUNDMETHODEN.............................................................................................................293.1 VERSUCHSTIERE...................................................................................................................................................293.2 VERSUCHSABLAUF................................................................................................................................................29
OperativeTechniken...................................................................................................................................303.2.13.3 UNTERSUCHUNGSMETHODEN............................................................................................................................31
Endotoxinmodell...........................................................................................................................................313.3.1 Intravitalmikroskopie................................................................................................................................323.3.2 Extravasation.................................................................................................................................................333.3.3 Leukozyten-Endothel-Interaktion........................................................................................................333.3.4 Laborparameter...........................................................................................................................................343.3.5 StatistischeMethoden................................................................................................................................353.3.6
4 ERGEBNISSE...........................................................................................................................................364.1 INTRAVITALMIKROSKOPIE..................................................................................................................................36
Extravasation.................................................................................................................................................364.1.1 Leukozyten-Endothel-Interaktion........................................................................................................384.1.2
4.2 LABORPARAMETER..............................................................................................................................................41 Laktat................................................................................................................................................................414.2.1 Zytokine............................................................................................................................................................434.2.2
4.3 HÄMODYNAMIK....................................................................................................................................................47 MittlererarteriellerBlutdruck...............................................................................................................474.3.1 Herzfrequenz..................................................................................................................................................484.3.2 Atemfrequenz.................................................................................................................................................504.3.3 Temperatur.....................................................................................................................................................514.3.4
5 DISKUSSION............................................................................................................................................535.1 INTRAVITALMIKROSKOPIE..................................................................................................................................53
Plasmaextravasation..................................................................................................................................535.1.1 Leukozyten-Endothel-Interaktion........................................................................................................555.1.2
5.2 LABORPARAMETER..............................................................................................................................................58 Laktat................................................................................................................................................................585.2.1 Zytokine............................................................................................................................................................595.2.2
5.3 HÄMODYNAMISCHEPARAMETER......................................................................................................................63 MittlererarteriellerBlutdruck...............................................................................................................635.3.1 Herzfrequenz..................................................................................................................................................645.3.2 Atemfrequenz.................................................................................................................................................655.3.3 Temperatur.....................................................................................................................................................665.3.4
5.4 LIMITATIONEN......................................................................................................................................................676 ZUSAMMENFASSUNG...........................................................................................................................707 LITERATURVERZEICHNIS..................................................................................................................71
4
Abbildungsverzeichnis
Abb.1:Leukozyten-Endothel-Interaktionen.......................................................................................18
Abb.2:Gerinnungskaskade..........................................................................................................................22
Abb.3:Versuchsablauf...................................................................................................................................30
Abb.4:Plasmaextravasation........................................................................................................................36
Abb.5:TemporäradhärentenLeukozyten............................................................................................38
Abb.6:FestadhärenteLeukozyten...........................................................................................................39
Abb.7:Laktatkonzentration........................................................................................................................41
Abb.8:TNF-αKonzentration.......................................................................................................................43
Abb.9:IL-1βKonzentration.........................................................................................................................44
Abb.10:Interleukin-6Konzentration.....................................................................................................45
Abb.11:Interleukin-10Konzentration...................................................................................................46
Abb.12:MittlererarteriellerBlutdruck.................................................................................................47
Abb.13:Herzfrequenz....................................................................................................................................48
Abb.14:Atemfrequenz...................................................................................................................................50
Abb.15:Temperatur.......................................................................................................................................51
Abkürzungsverzeichnis
ACCP American College of Chest Physicians
ADDRESS Administration of Drotrecogin Alfa (Activated) in Early Stage Severe
Sepsis
ALI Acute Lung Injury
AP Activating Protein
AT Antithrombin
ARDS Acute Respiratory Distress Syndrome
BPM Beats Per Minute
CAM Cellular Adhesion Molecule
CASP Colon Ascendens Stent Peritonitis
CARS Compensatory Antiinflammatory Response Syndrome
CD Cluster of Differentiation
CDC Center for Disease Control
CLP Cecal Ligation and Puncture
DAMP Danger- Associated Molecular Patterns
DIC Disseminated Intravascular Coagulation
DNA Deoxyribonucleic Acid
ENHANCE Extended Evaluation of Recombinant Human Activated Protein C
eNOS endothelial Nitric Oxide Synthease
EPCR Endothelial Protein C Receptor
EPIC Extended Prevalence of Infection in the ICU
FITC Flouroescinisothiocyanat
HIV Humanes Immundefizienz Virus
ICAM Intercellular Adhesion Molecule
IFN Interferon
IL Interleukin
IL-1ra Interleukin-1 Receptor Antagonist
iNOS inducible Nitric Oxide Synthease
IRF Interferon- Regulating Factor
IVM Intravitalmikroskopie
KG Körpergewicht
LBP LPS- Binding Protein
6
LPS Lipopolysaccharid
MAP Mean Arterial Pressure
MODS Multiple Organ Dysfunction Syndrome
MOV Multiorganversagen
mmHG Millimeter Quecksilbersäule
NaCl Natriumchlorid
NO Stickstoffmonoxid
NOD Nucleotide- binding Oligomerization Domain
NF-κB Nuclear Factor Kappa- light- chain- enhancer of activated B-cells
PAF Platelet- Activating Factor
PAI-1 Plasminogen Activator Inhibitor-1
PAMP Pathogen- Associated Molecular Patterns
PAR Protease Activated Receptors
PC Protein C
PIRO Predisposition, Infection, Response, Organ failure
PROWESS Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis
PRR Pattern Recognition Receptor
PSGL-1 P-Selektin Glykoprotein Ligand
RIG-1 Retinoic acid Inducible Gene 1
RNS Reactive Nitrogen Species
ROS Reactive Oxygen Species
S1P Sphingosin-1-Phosphat
S1P1 Sphingosin-1-Phosphat Receptor 1
SCCM Society of Critical Care Medicine
SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome
T-PA Tissue Plasminogen Activator
TAFI Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor
TF Tissue Factor
TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor
TLR Toll- Like Receptors
TM Thrombomodulin
TNF Tumor Necrosis Factor
U-PA Urokinase- type Plasminogen Activator
VCAM vascular adhesion molecule
7
1 Einleitung
1.1 Geschichte der Sepsis
Obwohl die Sepsis, von der Millionen von Patienten betroffen sind, eine der größten
Herausforderungen der modernen Medizin darstellt, ist sie kein Phänomen der Neuzeit. Eine
altägyptische Fallsammlung von 3.000 vor Christus ist die älteste bekannte Abhandlung in der
Symptome der Sepsis wie Fieber und Eiterbildung als sekundäre Komplikationen nach
Verletzungen und Frakturen beschrieben werden. Das Wort Sepsis ist griechischen Ursprungs
und bedeutet „Dekomposition von tierischem oder pflanzlichem organischem Material“. Im
Mittelalter verschwand das Wort aus dem medizinischen Sprachgebrauch Europas und wurde
erst in der Renaissance „wiederentdeckt“. Mit dem Aufkommen von Pasteurs Theorie, dass
mikrobiologische Organismen für die Entstehung von Krankheiten verantwortlich sind, wurde
der Begriff Sepsis gleichbedeutend mit Septikämie, Pyämie oder Saprämie verwendet (1). Da
keine einheitliche Definition der Sepsisbegriffe bestand, führte das American College of
Chest Physicians (ACCP) und die Society of Critical Care Medicine (SCCM) 1991 eine
einheitliche Nomenklatur ein. Dabei wurden die Begriffe Systemic Inflammatory Response
Syndrome (SIRS), Sepsis, schwere Sepsis, septischer Schock und Multi Organ Dysfunction
Syndrome (MODS) geprägt (2).
1.2 Begriffsdefinitionen
Unter dem Begriff SIRS versteht man eine systemische Reaktion des Körpers auf einen
entzündlichen Stimulus, der infektiöser (z. B. Bakteriämie, Fungämie, Virämie) und nicht
infektiöser (z.B. Trauma, Verbrennung, Pankreatitis) Natur sein kann. Diese systemische
Reaktion ist definiert als das Vorliegen von mindestens zwei der folgenden vier Parameter:
1. Körpertemperatur über 38°C oder unter 36°C
2. Herzfrequenz über 90 Schläge pro Minute
3. Tachypnoe (Atemfrequenz über 20 Atemzüge pro Minute) oder Hyperventilation (PaCO2
unter 32 mmHg)
4. Leukozytose (über 12.000 Zellen/µL Blut) oder Leukopenie (unter 4000 Zellen/µL Blut)
oder über 10% unreife neutrophile Granulozyten im Differenzialblutbild
8
Kann bei einem SIRS eine infektiöse Ursache z.B. durch Blutkulturen nachgewiesen werden,
liegt eine Sepsis vor. Wenn zusätzlich Zeichen einer Einschränkung der Organfunktion wie
z.B. Laktatazidose, Oligurie oder eine akute Verschlechterung des Geisteszustandes eintreten,
spricht man von einer schweren Sepsis. Entwickelt sich außerdem eine Hypotension, die
nicht auf Flüssigkeitsgaben reagiert, ist ein septischer Schock eingetreten.
Tritt neben dem septischen Schock noch eine Organdysfunktion oder ein Organversagen in
mehr als einem Organsystem ein spricht man von Multiorgandysfunktionssyndrom (MODS)
oder Multiorganversagen (MOV).
Diese 1991 definierten Stadien beschreiben das Kontinuum einer Krankheit deren Übergänge
fließend sind und dienen vor allem dazu, die Behandlung und Erforschung der Sepsis zu
verbessern. 2001 erfolgte eine Revision und Erweiterung dieser Kriterien, die eine bessere
und schnellere Diagnose der Sepsis ermöglichen sollte, jedoch die eigentlichen Definitionen
nicht veränderte. Weiterhin wurde das PIRO-System zum Staging der Sepsis analog zu
Krebserkrankungen eingeführt (2).
1.3 Epidemiologie der Sepsis
Aufgrund nationaler Unterschiede in der Dokumentation der Sepsis sind epidemiologische
Daten schwer zu vergleichen. Viele Studien untersuchen oft nur die Inzidenz auf
Intensivstationen oder in bestimmten Patientenpopulationen. In den Industrieländern wie der
USA stellten Martin et al. im Jahr 2000 eine Inzidenz von 240 Fällen pro 100.000 Einwohner
fest, in Europa bewegt sich die Inzidenz der Sepsis je nach Land zwischen 40 und 110 Fälle
pro 100.000 Einwohner und in Australien kommt es zu 77 Fällen pro 100.000 Einwohner (3-
7). Bisher gibt es kaum belastbare Studien die Rückschlüsse auf die Inzidenz in
Entwicklungs- und Schwellenländer zulassen. In Deutschland liegt die Inzidenz der Sepsis bei
116 Fällen pro 100.000 Einwohner und die der schweren Sepsis bei 110 Fällen pro 100.000
Einwohner (5). Die Inzidenz der Sepsis ist von einer Reihe von Faktoren wie Alter und
Komorbiditäten (Onkologische Erkrankungen, HIV, Diabetes) abhängig. Martin et al.
konnten nachweisen, dass in den USA Patienten über 65 fast ein Drittel aller Sepsispatienten
ausmachen (8). Während die allgemeine Inzidenz bei pädiatrischen Patienten mit 56 Fällen
pro 100.000 Einwohner niedrig ist, ist sie bei Neugeborenen und Kleinkindern bis einem Jahr
mit 516 Fälle pro 100.000 Einwohner besonders hoch (9).
9
Einige Untersuchungen legen nahe, dass die allgemeine Inzidenz der Sepsis in den letzten
Jahrzehnten angestiegen ist. Während das Center for Disease Control (CDC) in den USA
1979 noch von 73,6 Fällen pro 100.000 Einwohner ausging, waren es 1989 bereits 175,9 Fälle
auf 100.000 Einwohner (10). Hartman et al. haben ebenfalls einen Anstieg der Sepsisinzidenz
bei pädiatrischen Patienten festgestellt (11).
Die hohe gesellschaftliche Relevanz erschließt sich aus der Mortalität, die international auf
Intensivstationen auf 5- 80% (je nach Sepsisgrad) geschätzt wird (12). Die Mortalität ist von
mehreren Faktoren abhängig wie Alter, Geschlecht, Schwere der Sepsis und Komorbiditäten.
Sowohl sehr junge als auch sehr alte Patienten weisen eine überproportional höhere Mortalität
auf (9,13). Frauen haben eine höhere Wahrscheinlichkeit an einer schweren Sepsis oder einem
septischem Schock zu versterben, trotz einer höheren Inzidenz bei männlichen Patienten (14).
Eine Erklärung für diese höhere Mortalität konnte noch nicht gefunden werden. Mit
zunehmender Schwere der Sepsis, steigt auch das Risiko zu versterben. In der Literatur wird
die Mortalität der Sepsis mit bis zu 30%, der schweren Sepsis mit bis zu 50% und des
septischen Schocks mit bis zu 80% angegeben (15).
Auf deutschen Intensivstationen beträgt die Mortalität der schweren Sepsis 55%. Sie ist damit
höher als in anderen europäischen Ländern und wird darauf zurückgeführt, dass das
Patientenkollektiv in Deutschland älter ist (5).
Der häufigsten Infektionsherde sind die Lunge, der Urogenitaltrakt und das Abdomen, häufig
können Erreger im Blut isoliert werden ohne das ein infektiöser Fokus nachgewiesen werden
kann (15).
Die Erreger, die eine bakterielle Sepsis hervorrufen können, sind starken regionalen
Unterschieden unterworfen. Studienergebnisse von Martin et al. aus dem Jahr 2003 belegen,
dass in den USA Erreger aus dem gram-positiven Spektrum dominieren. Die 2009 in Europa
durchgeführte EPIC II Studie zeigt hingegen eine höhere Prävalenz von gram-negativen
Erregern. Daten aus Entwicklungsländer legen nahe, dass auch dort die gram-negativen
Organismen dominieren, während eine große Erhebung im Schwellenland China kein
Überwiegen einer besonderen Spezies aufweisen (3,16-20). Gram-negative septische
Erkrankungen scheinen mit einer höheren Mortalität vergesellschaftet zu sein (21). Fungi
nehmen weiter an Bedeutung zu und können in 20% als ursächliche Erreger isoliert werden
(3,22). Es ist aber anzumerken das nur in 10-20% aller Fälle Erreger nachgewiesen werden
können (23).
Überlebt ein Patient eine Sepsis, ist seine Lebensqualität danach deutlich eingeschränkt (24).
Die Wahrscheinlichkeit zu versterben ist noch 5 Jahre nach durchgemachter Sepsis erhöht,
10
besonders bei älteren Patienten besteht die Gefahr dauerhafte kognitive, psychische und
funktionelle Defizite zu entwickeln (25,26).
Die Festlegung von einheitlichen Definitionen durch die ACCP/SCCM soll eine bessere
epidemiologische Einschätzung der Inzidenz, Mortalität und Morbidität ermöglichen. Gaieski
et al. geben in ihrer Studie jedoch zu bedenken, dass die Auswahl der statistischen Methoden
großen Einfluss auf die festgestellte Inzidenz und Mortalität haben können (27).
Angus et al. bezifferten 2001 die Kosten für das US-amerikanische Gesundheitssystem auf
jährlich 16,7 Mrd. Dollar (13). Zwischen 1997 und 2008 stiegen die Behandlungskosten der
Sepsis dreimal stärker an als die Gesamtbehandlungskosten aller anderen Krankheiten. Laut
Elixhauser et al. stellte die Septikämie in US-amerikanischen Krankenhäusern im Jahre 2009
den sechsthäufigsten Aufnahmegrund dar und verursachte Kosten von 15,4 Mrd. US-Dollar,
was 4,3% des nationalen Krankenhausbudgets entsprach (28). In Deutschland verursacht die
schwere Sepsis jährlich Kosten zwischen 3,6 und 7,9 Millionen Euro. Beim größten Teil
dieser Kosten handelt es sich um indirekte Kosten, die durch Minderung der Erwerbsfähigkeit
aufgrund von frühem Tod oder dem Verlust der Produktivität entstehen (29).
11
1.4 Pathophysiologie der Sepsis
Überblick 1.4.1
Unser Verständnis der Pathophysiologie der Sepsis erweitert sich ständig und ist trotzdem
immer noch unvollständig. Nach dem heutigen Wissensstand handelt es sich bei der Sepsis
per Definition um eine systemische Reaktion des Organismus auf eine Infektion (12).
Die derzeit vorherrschende Theorie besagt, dass nicht die Pathogenität der eindringenden
Organismen die Hauptursache für die Morbidität und Mortalität dieses Krankheitsbildes
darstellt, sondern eine Dysregulation der Immunantwort und deren Einfluss auf viele weitere
Stoffwechselprozesse im Körper. Eindringende Mikroorganismen lösen eine
inflammatorische Reaktion des Immunsystems aus um sie zu bekämpfen. Um eine
Generalisierung der Immunantwort zu verhindern und auf den Ort der Infektion zu
beschränken, kommt es zu einer kompensatorischen anti-inflammatorischen Reaktion (30).
Die Dysregulation von pro- und anti-inflammatorischen Reaktionen ist für die Entstehung der
Sepsis verantwortlich. Der Anfang einer septischen Erkrankung ist durch einer
überschießenden Entzündungsreaktion, die nicht auf den Ort der Infektion beschränkt bleibt,
gekennzeichnet. Wenn dieses Initialstadium überwunden ist, kommt es oft zu einer
prolongierten Immunsuppression, wobei vermutet wird, dass diese Immunsuppression für die
hohe Sterblichkeit der Sepsis verantwortlich ist (31).
Wenn Pathogene in den Körper eindringen wird das Immunsystem aktiviert. Das
Immunsystem wird in zwei große Komplexe unterteilt: das angeborene (unspezifische) und
das adaptive (spezifische) Immunsystem. Die angeborene Immunabwehr ist darauf ausgelegt,
eindringende Organismen lokal und schnell zu bekämpfen. Die spezifische Abwehr wird erst
später aktiviert, sie koordiniert die angeborene Immunabwehr und ermöglicht eine
spezifischere und schnellere Bekämpfung bei wiederholten Infektionen (32).
Das Endothel der Gefäße koordiniert während einer Infektion die lokalen
Abwehrmechanismen des Immunsystems, indem es die Einwanderung weiterer Abwehrzellen
ermöglicht und die Pathogene über die Aktivierung der Gerinnung und durch die Regulation
des Gefäßtonus vom Rest des Körpers abschottet.
12
Die erste Verteidigungslinie des Körpers gegen eindringende Organismen ist die angeborene
Abwehr. Die Zellen der angeborenen Abwehr erkennen sogenannte danger-associated
molecular patterns (DAMPs), Gefahrensignale die Gewebsschäden oder –stress anzeigen, um
eine schnelle Reaktion auf eine Gefahr für den Organismus zu ermöglichen. Zu diesen
DAMPs gehören unspezifische Bestandteile pathogener Organismen (pathogen-associated
molecular patterns, PAMPs) und Moleküle die bei Verbrennung, Trauma, Ischämie oder
anderen Gewebsschädigungen entstehen (Alarmine) (32). Zu den PAMPs gehören unter
anderem Peptidoglykane, Endotoxin, Lipoteichonsäuren, Lipopeptide und DNA-Fragmente
(33). Die Erkennung dieser Gefahrensignale wird über eine Reihe von Rezeptoren vermittelt
(Pattern-recognition receptors, PRRs), die sich der Oberfläche der Zellen der angeborenen
Abwehr befinden (34). Zu den zellulären Bestandteilen des angeborenen Immunsystems
zählen die neutrophilen Granulozyten, Monozyten und die Natürliche Killerzellen (35). Die
neutrophilen Granulozyten sind vor allem für die Zerstörung von eindringenden Organismen
zuständig. Sie nehmen diese mittels Phagozytose in sich auf und generieren sogenannte
reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS), um diese zu zersetzen. Monozyten
differenzieren sich abhängig von dem Gewebe in das sie einwandern entweder in
gewebsständige Makrophagen oder dendritische Zellen. (32). Bei den Makrophagen handelt
es sich um Auslöser und Regulatoren der angeborenen Immunantwort, da sie neben der
Phagozytose von pathogenen Erregern, eine Vielzahl von entzündlichen Mediatoren
produzieren können. Dendritische Zellen sind antigen-präsentierende Zellen, welche
Bestandteile zerstörter Mikroorganismen auf ihrer Oberflächeexprimieren und so T- und B-
Zellen des adaptiven Immunsystems aktivieren somit stellen sie das Bindeglied zwischen
angeborenem und adaptivem Immunsystem dar (36). Natürliche Killerzellen produzieren
Entzündungsmediatoren und können infizierte Zellen zerstören. Zu den PRRs gehören die
Familien der toll-like receptors (TLRs), C-type lectin receptors (CLRs), nucleotide-binding
oligomerization domain (NOD) und retinoic acid inducible gene I (RIG-I)- like receptors
(34). Binden diese Rezeptoren an ihre entsprechenden Liganden wird eine Reihe von Stoffen
freigesetzt, die die Entzündungsreaktion im Körper vermitteln. Dazu gehören Zytokine,
Chemokine, Akute-Phase Proteine, Lipid Mediatoren, reaktive Sauerstoffspezies (reactive
oxygen species, ROS), reaktive Stickstoffspezies (reactive nitrogen species, RNS) und die
Enzyme der Koagulation, Fibrinolyse, Komplementkaskade und des Kinin-Kallikreinsystems,
sie werden auch als Entzündungsmediatoren bezeichnet (32). Bei den TLR handelt es sich um
Oberflächenrezeptoren von denen beim Menschen bis heute 10 verschiedene Subtypen
13
identifiziert worden sind. Besonders hervorzuheben sind hier TLR2, der Lipoteichonsäuren
und Peptidoglykane erkennt, und TLR4, der das Endotoxin bindet (37).
Das Endotoxin (synonym: Lipopolysacharid (LPS)) ist ein prototypischer PAMP. Es ist ein
Bestandteil der Zellwand vor allem von gram-negativen aber auch von einigen gram-positiven
Bakterien und ist bei jedem Bakterienstamm unterschiedlich. Es besteht aus einem
Polysaccharid das kovalent an das sogenannte Lipid A gebunden ist. Die
Polysaccharidstruktur wird in ein Kern-Antigen und das O-Antigen eingeteilt, woraus sich die
Benennung der verschieden LPS-Formen ergibt (38). Mit Hilfe des LPS-binding protein
(LBP) bindet LPS an den Oberflächenrezeptor CD14, der die Dimerisierung von TLR4
bewirkt (39). Die Dimerisierung des TLR löst eine intrazelluläre Signalkaskade aus, die über
verschiede Adapterproteine und Kinasen eine Translokation von Transkriptionsfaktoren wie
nuclear factor-kappa B (NF-κB), interferon-regulating factors (IRF) und activating protein-1
(AP-1) aus dem Zytosol in den Zellkern bewirkt. Der Transkriptionsfaktor NF-κB nimmt
dabei eine Schlüsselrolle in der Regulation der angeborenen Abwehr und in der Pathogenese
der Sepsis ein, denn er aktiviert die Transkription von über 200 Genen, dazu gehören vor
allem die Mediatoren der Entzündungsreaktion wie Zytokine, Chemokine,
Adhäsionsmoleküle, Enzyme und Akute-Phase Proteine (32).
Zytokine sind niedermolekulare Proteine, die die Entzündungsreaktion regulieren und von
besonderer Bedeutung in der Entstehung der Sepsis sind. Entsprechend ihrer Wirkung werden
sie in pro- und anti-inflammatorische Zytokine eingeteilt (40). Pro-inflammatorische Zytokine
wie Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), tumor necrosis factor- beta (TNF-β), Interleukin-
1beta (IL-1β), Interleukin-2,-3,-5,-12 und-18 aktivieren und verstärken die
Entzündungsreaktion. Anti-inflammatorischen Zytokine wie Interleukin-4,-6 und -10
wiederum vermindern die Entzündungsreaktion, um nach stattgehabter Bekämpfung wieder
die Homöostase herzustellen (41). Diese Unterteilung ist allerdings umstritten, da einige
Zytokine sowohl pro- als auch anti-inflammatorisch wirken, abhängig von Stimulus und
produzierender Zelle (39). Ein weiterer Bestandteil der die Zytokinwirkung reguliert sind die
löslichen Zytokinrezeptoren im Plasma, die die zirkulierenden Zytokine binden und
neutralisieren (39).
Die ersten Zytokine die bei einer Entzündungsreaktion im Blut nachgewiesen werden können
sind TNF-α und IL-1β, sie werden weshalb sie als „proximale“ Zytokine bezeichnet werden.
Sie wirken vor allem auf die Zellen des Immunsystems, Endothelzellen und Zellen in Lunge,
Darm und Leber und induzieren die Produktion weiterer Entzündungsmediatoren (32).
14
TNF-α wird überwiegend aus den aktivierten Makrophagen und Natürlichen Killerzellen
freigesetzt. Während die normale Serumkonzentration von TNF-α unbekannt ist und auch in
gesunden Probanden erhöht sein kann, konnte in mehreren Studien gezeigt werden, dass die
TNF-α-Konzentration nach Endotoxinapplikation stark ansteigt (42). Die generelle Wirkung
von TNF-α ist eine lokale Entzündungsreaktion, Fieber, die Aktivierung des Endothels und
der neutrophilen Granulozyten (39). Im Experiment konnte bei Gabe von rekombinantem
TNF-α die Entwicklung von SIRS-Symptomen, Leukopenie, Koagulopathie und
Organschäden (Gastrointestinale Nekrosen, Nebenniereneinblutung, ARDS) beobachtet
werden, während bei niedriger Zytokinkonzentration Kachexie und Toleranzentwicklungen
auftraten (41,43). TNF-α führt zu einer verstärkten Produktion, Aktivierung und
Differenzierung von Makrophagen und erhöht so die Konzentration an pro-inflammatorischen
Mediatoren. Weiterhin bewirkt TNF-α, dass Endothelzellen und neutrophile Granulozyten
vermehrt Adhäsionsmoleküle exprimieren, was zu einer vermehrten Einwanderung von
Abwehrzellen ins Gewebe führt. (40).
IL-1 ist die Bezeichnung für die beiden Proteine IL-1α und IL-1β, die an dieselben
Rezeptoren binden, wobei IL-1β in weit höherer Konzentration im Körper vorkommt als IL-
1α (41). IL-1 wird ebenfalls hauptsächlich von den Zellen der Abwehr sezerniert. IL-1β
aktiviert Makrophagen, B- und T-Zellen, sowie die Synthese von Akute-Phase Proteinen in
den Leberzellen (39). Im Experiment führt IL-1β ebenfalls zur Entwicklung von
Schocksymptomen, erhöhter Produktion von Kortisol und vermehrter Freisetzung von
Leukozyten und Thrombozyten (44).
IL-6 ist eines der später synthetisierten „distalen“ Zytokine, welches nach Stimulation durch
LPS, IL-1 und TNF-α aus Makrophagen, Fibroblasten und Lymphozyten sezerniert wird. IL-6
aktiviert neben den B- und T-Lymphozyten auch das Gerinnungssystem und induziert, wie
auch IL-1, die Bildung von Akute-Phase Proteinen (41,45). IL-6 kann bei einer Vielzahl
akuter Störungen des Organismus (Trauma, Verbrennungen, große Operationen) im Blut
nachgewiesen werden und gilt zudem als prognostischer Marker um die Mortalität der Sepsis
abzuschätzen (46). Die Rolle von IL-6 in der Pathogenese der Sepsis ist umstritten, da es auch
anti-inflammatorische Eigenschaften besitzt. IL-6 führt sowohl zu einer Verminderung von
pro-inflammatorischen Mediatoren wie TNF-α, IFN-γ und Stickstoffmonoxid, als auch zum
Anstieg von anti-inflammatorischen Mediatoren wie IL-10, welches eines der wichtigsten
anti-inflammatorischen Mediatoren ist (45,47). IL-10 wird von Makrophagen, Lymphozyten
und Natürlichen Killerzellen produziert und inhibiert hauptsächlich die Produktion von pro-
inflammatorischen Zytokinen wie TNF-α, IL-1,-6 und -8 in den Makrophagen (48,41).
15
Weiterhin induziert es die Produktion von löslichen TNF-α und IL-1- Rezeptoren, die die
Wirkung dieser pro-inflammatorischen Zytokine neutralisieren (40).
Das adaptive Immunsystem besteht aus B- und T-Lymphozyten. Die B-Lymphozyten
produzieren spezifische Antikörper gegen eindringende Organismen. Diese Antikörper setzen
sich auf die entsprechenden Oberflächenantigene der eindringenden Organismen und
ermöglichen somit eine schnelle Phagozytose und deren Zerstörung. Die T- Lymphozyten
erkennen mittels des T-Zell Rezeptors die Antigene die auf der Oberfläche von Makrophagen
und dendritischen Zellen präsentiert werden. Die T-Lymphozyten werden in CD8+
zytolytische T- Zellen, CD4+T-Helferzellen und CD4+ CD25+ T-Regulatorzellen eingeteilt.
CD8+ zytolytische T-Zellen erkennen mit Antikörpern besetzte Zellen und zerstören diese
mittels lytischer Granula oder Induktion des programmierten Zelltods (Apoptose). Die CD4+
T-Helferzellen (TH) können sich, abhängig vom vorherrschenden Milieu der
Entzündungsmediatoren, in zwei unterschiedliche Formen differenzieren. TH1 Zellen
amplifizieren die unspezifische Immunantwort während TH2-Zellen über eine Induktion der
B-Zellen zu einer Verstärkung der adaptiven Immunantwort führen. Die CD4+ CD25+ T-
Regulatorzellen bewirken vor allem eine Begrenzung der Immunantwort (39).
Unter septischen Bedingungen wird die Funktion der Leukozyten beeinflusst. Granulozyten
werden durch die Zytokine und Chemokine, die während der Sepsis verstärkt von
Abwehrzellen und Endothelzellen produziert werden, in erhöhtem Maße rekrutiert und
aktiviert (49,50). Dies führt paradoxerweise zu einer verminderten Anzahl an neutrophilen
Granulozyten am Ort der Infektion und einer erhöhten Konzentration in nicht betroffenen
Organen (51).
Nach dem die neutrophilen Granulozyten Mikroorganismen bekämpft haben wird, um die
entzündliche Reaktion einzudämmen, ihr programmierter Zelltod (Apoptose) eingeleitet.
Während einer Sepsis hingegen werden verstärkt anti-apoptotische Signale ausgelöst, sodass
die neutrophilen Granulozyten länger überleben (52). Ihre verstärkte Aktivierung und längere
Überlebensdauer führen zu einer Gewebsschädigung, da vermehrt ROS und RNS produziert
werden, die die umliegenden Zellen und Gewebe schädigen (53). In der späten Phase der
Sepsis ist die Fähigkeit der neutrophilen Granulozyten auf chemotaktische Signale zu
reagieren vermindert, weswegen weniger proteolytische Enzyme und ROS freigesetzt werden
(54). Lymphozyten werden verstärkt apoptotisch und schränken damit die Fähigkeit des
Organismus ein, die bestehende Infektion weiter zu bekämpfen oder opportunistische Erreger
abzuwehren (32).
16
Während die Entwicklung der Immunantwort sehr gut erforscht ist, gibt es zurzeit noch
wenige Ansätze, die erklären, wie die Dysregulation von pro- und anti-inflammatorischer
Immunantwort zum Multiorganversagen führt. Während der Sepsis ist die
Sauerstoffversorgung der Organe kompromittiert, Ursache dafür ist ein Missverhältnis
zwischen Sauerstoffangebot und Sauerstoffbedarf. Die Versorgung der Organe mit Sauerstoff
kann auf der Ebene der Makrozirkulation, Mikrozirkulation und auf zelluläre Ebene gestört
sein. Pneumonien sind die häufigsten primären Infektionsherde, aber auch sekundär
entwickelt sich bei einer Sepsis oft eine akute Lungenschädigung (acute lung injury, ALI)
und/oder ein Lungenversagen, die den Gasaustausch behindern (acute respiratory distress
syndrome, ARDS) (55,56). Weiterhin ist bei 50% aller Patienten mit schwerer Sepsis und
septischem Schock eine Einschränkung des Herzzeitvolumens aufgrund myokardialer
Dysfunktion festzustellen, was zusätzlich zu einer Verschlechterung des Sauerstoffangebots
für die Organe führt (57). Diese Verschlechterung des Sauerstoffangebots hat eine Reihe von
Kompensationsmechanismen zur Folge, die die Versorgung kritischer Organe wie Herz und
Gehirn erhalten sollen, jedoch die Störung der Mikrozirkulation der Organe zur Folge haben
(58). Zudem entsteht in den Organen eine verminderte Sauerstoffausschöpfung, da die
Mitochondrien in den Zellen den angebotenen Sauerstoff schlechter umsetzen können, was
von Fink et al. als zytopathische Hypoxie bezeichnet wird (59).
Die Mikrozirkulation während der Sepsis 1.4.2
Die Mikrozirkulation bezeichnet die Durchblutung und den Stoffaustausch in Blutgefäßen die
kleiner als 100µm sind. Tyagi et al. teilen die Bestandteile der Mikrozirkulation nach ihrer
Funktion ein; es gibt Widerstandsgefäße, Austauschgefäße und Kapazitätsgefäße (60). Die
Funktion der Mikrozirkulation ist es die Sauer- und Nährstoffversorgung der Organe und die
Abwehrfunktion des Körpers zu gewährleisten. Um die Organe adäquat versorgen zu können
messen die Endothelzellen den Blutfluss und metabolische Signale, um den Vasotonus
anzupassen oder mehr Gefäße des Kapillarbettes zu rekrutieren (61).
Diese Regulationsmechanismen der Mikrozirkulation der Organe sind während einer Sepsis
gestört und die Sauerstoffversorgung der Organe ist kompromittiert, was laut Ince et al. eine
der Hauptursachen für die Entwicklung des Multiorganversagens darstellt (61). Ursächlich für
das Versagen der Mikrozirkulation ist unter anderem die geringere Verformbarkeit der
Erythrozyten, vermehrte Einwanderung von Leukoyzten, Ablagerung von Fibrin und
Mikrothromben, Störung der Barrierenfunktion, Dysregulation des Vasotonus und
17
Ausbildung arteriovenöser Shunts (58). Diese Veränderungen führen zu einer verminderten
Flussgeschwindigkeit in den Kapillaren bis hin zum kompletten Stopp des Blutflusses.
Das Endothel ist der zentrale Bestandteil der Mikrozirkulation, es besteht aus einer
Zellschicht die die Innenseite sämtlicher Blutgefäße auskleidet und ist das größte Organ des
Körpers. Die Schädigung es Endothels während der Sepsis der Hauptgrund für das Versagen
der Mikrozirkulation (62). Die Hauptaufgaben des Endothels sind die Regulation des
Nährstofftransports, des Gefäßtonus, der Zellmigration, des Gerinnungssystems und des
Immunsystems (63). Das Endothel ist ein integraler Bestandteil der angeborenen Abwehr von
Pathogenen, da Endothelzellen, genauso wie Monozyten und Makrophagen, mikrobielle
Strukturen erkennen, Entzündungsmediatoren freisetzen, die Einwanderung von
Abwehrzellen koordinieren und die Ausbreitung der Entzündung durch Vasokonstriktion und
lokale Aktivierung der Gerinnung eindämmen (63,64).
Durch bakterielle Bestandteile und einer Vielzahl von körpereigenen Mediatoren wird
während der Sepsis das Endothel unkontrolliert aktiviert. Das dysfunktionale Endothel
verändert sich in seiner Struktur (Schwellung, Fragmentierung und Ablösung von Zellen) und
Funktion (65), was zu einer verstärkten Einwanderung von Leukozyten, Störung des
Gefäßtonus, vermehrten Blutgerinnung, erhöhten Permeabilität der Gefäßwände und
Apoptose von Endothelzellen führt (63).
Die verminderte Verformbarkeit von Erythrozyten hat mehrere Ursachen: die erhöhte
intrazelluläre Konzentration von 2,3- Diphosphoglycerat (2,3-DPG) und Calcium, die
erniedrigte intrazelluläre Konzentration von ATP und die erhöhte extrazelluläre
Konzentration von Stickstoffmonoxid und reaktiver Sauerstoffspezies (66).
Die ausführenden Zellen des Immunsystems, wie neutrophile Granulozyten und
Lymphozyten, sind nur in geringer Zahl in den Organgeweben vorhanden, sie finden sich
hauptsächlich im Knochenmark und als ständig zirkulierende Masse im Blut. Damit die
Leukozyten in die betroffenen Gewebe einwandern können, ist die Aktivierung des Endothels
und der Leukozyten notwendig. Im aktivierten Zustand können beide eine Verbindung
eingehen, die den Übertritt von Leukozyten vom Blut ins Gewebe ermöglicht. Der Übertritt
von Leukozyten erfolgt hauptsächlich in den postkapillären Venolen, da die
Strömungsverhältnisse zu einer Verlagerung der Leukozyten von der Mitte des Blutstromes
nach Außen führen. Zudem werden deutlich mehr Adhäsionsmoleküle auf der Oberfläche von
Endothelzellen in postkapillären Venolen exprimiert als an jeder anderen Stelle des
18
Gefäßsystems (49). Die Wanderung der Leukozyten ins Gewebe erfolgt in 4
aufeinanderfolgenden Schritten.
Abb.1: Leukozyten-Endothel- Interaktionen (modifiziert nach (67))
Der erste Schritt ist das Tethering: die Leukozyten und das Endothel exprimieren lange
Molekülketten, die Selektine, die an glykosylierten Liganden auf der jeweils anderen
Oberfläche binden, um die Geschwindigkeit der Leukozyten zu reduzieren. Auf der
Oberfläche der Leukozyten wird L-Selektin exprimiert, das aktivierte Endothel ist exprimiert
es P- und E-Selektin. Die Bindung ist nur von kurzer Dauer, was zur Folge hat, dass die
Leukozyten an der Gefäßwand entlang rollen. Der wichtigste Ligand für die Selektine ist der
P-Selektin Glykoprotein Ligand 1 (PSGL1) (67).
Der zweite Schritt ist das Triggering: Um eine feste Bindung einzugehen, müssen die
Leukozyten aktiviert werden. Chemokine und Zytokine (z.b. TNF-α, IL-1, IL-8), die vom
aktivierten Endothel selbst oder von den Abwehrzellen im Gewebe gebildet werden, binden
an G-Protein gekoppelte Rezeptoren auf der Oberfläche der Leukozyten und bewirken so die
Aktivierung. Der Arrest oder „Sticking“ ist der dritte Schritt, Leukozyten und Endothel gehen
dabei eine feste Bindung ein. Auf der Oberfläche der Leukozyten wird die Bindung an die
19
Endothelzelle von den Integrinen vermittelt, die in α- und β-Intergine unterteilt sind. Sie
binden an zellulären Adhäsionsmoleküle (cellular adhesion molecules, CAM) auf der
Oberfläche der Endothelzellen (49). Die CAM sind vom Aufbau den Immunglobulinen
ähnlich, die wichtigsten CAM sind intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) und
vaskular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), auch sie werden erst nach Aktivierung auf der
Endothelzelloberfläche exprimiert. Die Integrine liegen in zusammengerollter, niedrig affiner
Form vor. Die Aktivierung der Leukozyten führt zu einer Konformationsänderung der
Integrine, zu einer geraden hoch-affinen Form. Da nun ihre Bindungsstellen freigelegt sind,
rollen die Leukozyten nicht mehr, sondern werden fest an ihrem Platz gehalten (67). Die
Bindung der Adhäsionsmoleküle führt nicht nur zur einer Verbindung zwischen Leukozyten
und Endothelzellen, sondern löst auch intrazelluläre Signalkaskaden aus, die Zellverformung,
Proliferation und Apoptose regulieren (68). Der letzte Schritt ist die Diapedese, die
Leukozyten können auf para- oder intrazellulären Weg durch die Barriere aus Endothelzellen
und Basalmembran treten. Sowohl Leukozyten als auch Endothelzellen verformen sich dabei
und gehen Bindungen mit verschiedenen Oberflächenmolekülen ein (67).
Unter septischen Bedingungen werden auf der Oberfläche von Endothelzellen NF-κB-
abhängig, vermehrt Adhäsionsmoleküle wie ICAM-1 und E-Selektin exprimiert (69). Dies
führt zu einer vermehrten Einwanderung und Akkumulation von aktivierten Leukozyten in
die Gewebe und auf der Oberfläche der Endothelzellen (70). Die Beeinträchtigung der
Mikrozirkulation führt lokal zu einer erniedrigten Flussgeschwindigkeit des Blutes und
reduzierten Scherkräften, die eine weitere Akkumulation von Leukozyten unterstützen (71).
Aktivierte adhärente neutrophile Granulozyten setzen verstärkt reaktive Sauerstoffspezies,
proteolytische Enzyme und andere Stoffe frei, die die Endothelzellen und die Basalmembran
zerstören (72). Das geschädigte Endothel exprimiert verstärkt Adhäsionsmoleküle und
Zytokine, sodass in einer sich selbst verstärkenden Feedbackschleife immer mehr Leukozyten
einwandern und aktiviert werden (49). Die hohe Anzahl an Leukozyten kann die kleine
Gefäße der Mikrozirkulation verstopfen und zu lokalen Gewebsischämien führen (32).
Das bezeichnende Merkmal der schweren Sepsis und des septischen Schocks ist die
zunehmende hämodynamische Instabilität, die aus der Dysregulation des Vasotonus und der
Verschiebung von intravasalen Volumen in den Extravasalraum resultiert (64,73). Der
Vasotonus wird über mehrere Wege reguliert, wie zum Beispiel das vegetative Nervensystem
oder Mediatoren, die von verschiedenen Zellen (Mastzellen, Fibrozyten) produziert werden
(49). Das Endothel reguliert auf lokaler Ebene den Vasotonus mittels der Produktion von
20
vasodilatierenden Substanzen wie Stickstoffmonoxid (NO) und Prostacyclin sowie von
vasokonstriktorischen Substanzen wie Endothelin, Thromboxan A2 und dem Plättchen-
aktivierenden Faktor (PAF) (64). Der wichtigste Vasodilatator ist NO welcher enzymatisch
mittels NO-Syntheasen (NOS) aus der Aminosäure L-Arginin gebildet wird (74). In der
Frühphase der Sepsis überwiegt die Suppression der endothelialen NOS (eNOS) durch
Mediatoren wie TNF-α oder Endotoxin und die Bindung von NO durch ROS, sodass die
Vasokonstriktion dominiert. Im weiteren Verlauf wird die induzierbare NO-Synthetase
(iNOS) vermehrt aktiviert, was zu einer Überproduktion von NO führt und damit zur
charakteristischen Hypotension (64).
Eine wichtige Funktion des Endothels ist die Regulation des Austausches von Wasser,
gelösten Stoffen, Makromolekülen und Zellen zwischen dem Intra- und Extravasalraum.
Diese Barriere besteht aus zellulären (Zonula occludens und Zonula adherens) und nicht-
zellulären Bestandteilen (Glykokalyx) (75). Die erhöhte Konzentration von Thrombin,
Komplement, Bradykinin, PAF und Zytokinen führt zu einer vermehrten Internalisierung,
Phosphorylation und vermehrten Abbau der Verbindungen zwischen den Endothelzellen.
Nicht nur die Verbindungen zwischen den Endothelzellen ist für die Barrierefunktion des
Endothels wichtig, sondern auch ihre Form, die durch das Zytoskelett aufrecht erhalten wird.
Bei entzündlichen Prozessen werden innerhalb der Endothelzellen Aktinfilamente abgebaut
oder verkürzt, was eine Formveränderung der Zellen zur Folge hat (76). Der Abbau und die
Kontraktion von Zell-Zellverbindungen führt zur Vergrößerung der Lücken zwischen den
einzelnen Endothelzellen, was die Permeabilität der Gefäße erhöht. Diese Permeabilität
ermöglicht es Plasmaproteine wie Albumin und Blutzellen aus dem Blut ins Gewebe
übertreten zu können. Die Vasodilatation während der Sepsis vergrößert diesen Effekt noch
weiter. Der in der Adventia reichlich vorhandene Tissue Factor (TF) und Collagenfasern
erhalten so Kontakt zum Intravasalraum was die weitere Aktivierung der Gerinnung und
Anlagerung von Plättchen ermöglicht (77).
Davon betroffen sind inbesondere die postkapillären Venolen, da sie sowohl eine hohe
Anzahl an interzellulären Verbindungen und Fenestrae als auch eine hohe Dichte an
Rezeptoren für Entzündungsmediatoren, wie z.B. TNF-α, IL-1b und Histamin, besitzen
(49,76). Der Übertritt von Plasmaproteinen in den Extravasalraum steigert den onkotischen
Druck des Interstitiums, was den überhöhten Übertritt von Flüssigkeit weiter verstärkt (49).
Dieser Verlust von intravasaler Flüssigkeit trägt zur Hypotonie und Dysfunktion der
Mikrozirkulation bei (61).
21
Während eines Entzündungsprozesses wird die das Gerinnungssystem aktiviert, um die
Pathogene und die Immunantwort des Körpers räumlich zu begrenzen (78). In einem Großteil
septischer Patienten können Störungen des Gerinnungssystems nachgewiesen werden. Diese
Störungen reichen von Thrombozytopenie bis hin zur disseminierten intravasalen Koagulation
(DIC), einem Syndrom bei dem gleichzeitig Thrombosen und Blutungsereignisse auftreten
(79).
Der Tissue Factor (TF) ist das Enzym, das hauptsächlich für die Initiierung der Blutgerinnung
bei Entzündung verantwortlich ist. TF ist normalerweise gewebsständig und beginnt seine
Wirkung erst, wenn es mit dem im Blut zirkulierenden aktivierten Faktor VII (FVIIa) in
Kontakt kommt und den TF-FVIIa Komplex bildet. Dieser Komplex aktiviert wiederum den
Faktor Xa (FXa), der zusammen mit dem Faktor Va (FVa) Prothrombin (FII) in Thrombin
(FIIa) spaltet. Thrombin spaltet seinerseits das zirkulierende Fibrinogen zu Fibrin, welches
das Grundgerüst eines Thrombus bildet (63). Die Thrombinproduktion verstärkt sich selbst
mittels der Aktivierung weiterer Faktoren wie Faktor IX, XI und den Kofaktoren V und VIII
(80).
22
Abb.2: Gerinnungskaskade TF= Tissue Factor, FII= Faktor II (Prothrombin), FIIa= aktivierter Faktor II (Thrombin), FV= Faktor V (Proakzelerin), FVa= aktivierter
Faktor V (Akzelerin), FVII= Faktor VII (Proconvertin), FVIIa= aktivierter Faktor VII (Convertin), FVIII(a)= (aktivierter) Faktor VIII
(antihämophiles Globulin A), FIX(a)= (aktivierter) Faktor IX (Christmas- Faktor), FX(a)= (aktivierter) Faktor X (Stuart- Prower- Faktor),
FXI(a)= (aktivierter) Faktor XI (Rosenthal- Faktor), FXII(a)= aktivierter Faktor XII (Hageman- Faktor)
Die Regulation der Thrombusbildung erfolgt über drei Enzyme: Antithrombin (AT), Tissue
Factor Pathway Inhibitor (TFPI) und Protein C (PC). Antithrombin bindet und inaktiviert die
Faktoren Thrombin, IXa, Xa und den TF-FVIIa Komplex. TFPI inaktiviert ebenfalls den TF-
FVIIa- Komplex, kann diesen jedoch erst binden, nachdem es Faktor Xa gebunden hat (81).
Thrombin inaktiviert sich in einer negativen Feedbackschleife, in dem es an das
endothelständige Thrombomodulin (TM) bindet. Dieser Thrombomodulin- Thrombin-
Komplex überführt Protein C in seine aktivierte Form. Diese Reaktion wird um den Faktor 20
verstärkt, wenn sich PC an den endothelialen Protein C Rezeptor (EPCR) bindet (82). Das
aktivierte Protein C (aPC) bindet und inaktiviert mit seinem Kofaktor Protein S die Faktoren
Va und VIIIa. Ohne diese Faktoren kann die Gerinnungskaskade nicht ablaufen und kein
neues Thrombin gebildet werden (83).
Der Abbau des Fibrinthrombus, auch Fibrinolyse genannt, erfolgt durch das Enzym Plasmin,
das durch Spaltung des Vorläuferproteins Plasminogen gebildet wird. Die wichtigsten
23
Spaltenzyme sind der tissue-type plasminogen activator (t-PA) und der urokinase-type
plasminogen activator (u-PA), die aus den Endothelzellen freigesetzt werden (79).
Während einer Sepsis entstehen vermehrt Thromben, da gerinnungshemmende Enzyme und
Fibrinolyse eingeschränkt sind.
Inflammatorische Mediatoren aktivieren vor allem die Blutgerinnung, deren Bestandteile
aktivieren wiederum Entzündungskaskaden was zu einer exzessiven Bildung von Thromben
und zu einem Verbrauch von zellulären und enzymatischen Bestandteilen der Gerinnung
führt.
Der wichtigste Aktivator der Gerinnung während eines entzündlichen Prozesses ist der TF.
Aufgrund der Schädigung des Endothels wird vermehrt subendotheliales TF freigelegt. LPS,
TNF-α, IL-1 und IL-6 stimulieren die erhöhte Expression von TF auf der Oberfläche von
Monozyten, Makrophagen, Endothelzellen und im Blut zirkulierender Mikropartikel (81,84).
Bei diesen Mikropartikeln handelt es sich um Zellfragmente, die von aktivierten oder
apoptotischen Zellen, wie z.B. Thrombozyten, Monozyten und Endothelzellen, abgesondert
wurden. Diese Mikropartikel wirken selbst prothrombotisch, da sie mit den Membranen
anderer Zellen verschmelzen und so die Konzentration von TF auf der Oberfläche dieser
Zellen erhöhen (84). Das gebildete Thrombin und Entzündungsmediatoren wie Zytokine,
platelet- activating factor (PAF) und Endotoxin aktivieren die Thrombozyten (85). Das
aktivierte Endothel führt zu einer vermehrten Anlagerung von Thrombozyten, indem es große
von- Willebrand- Faktor- Moleküle auf seiner Oberfläche exprimiert. Durch die
Formveränderungen der Endothelzellen werden auch subendotheliale Kollagene freigelegt,
die ebenfalls zu einer vermehrten Aggregation von Thrombozyten führen (84). Die aktivierten
Thrombozyten unterstützen die Koagulation indem sie weitere Gerinnungsfaktoren freisetzen
und die Bildung des Fibrinthrombus verstärken (80). Auf der Oberfläche der aktivierten
Thrombozyten wird auch verstärkt P-Selektin exprimiert, dadurch binden und aktivieren sie
Leukozyten und Endothelzellen (85). Entzündliche Mediatoren wie IL-6 erhöhen die
Produktion der Thrombozyten aus dem Knochenmark, die durch geringere Mengen Thrombin
aktiviert werden können (86).
Die Aktivität sämtlicher gerinnungshemmender Kaskaden ist während einer Sepsis
vermindert. Aufgrund von gesteigertem Verbrauch, reduzierter Synthese und
proteasebedingtem Abbau ist die Konzentration von Antithrombin vermindert. Zudem werden
sich auf der Oberfläche von Endothelzellen befindliche Heparin-ähnliche Moleküle, die die
Funktion von Antithrombin unterstützen, bei einer Inflammation in geringerer Anzahl
synthetisiert (82). Die Konzentration von Protein C ist während eines entzündlichen Prozesses
24
stark vermindert (87). Durch die verstärkte Bildung von Thrombin wird mehr Protein C
aktiviert und verbraucht, weiterhin wird weniger Protein C durch die Leber synthetisiert (84).
Die Aktivierung von Protein C ist stark gestört da die wichtigen Kofaktoren für die
Aktivierung TM und ECPR in ihrer Funktion gestört sind(89). Yan et al haben nachweisen
können, das eine niedrige Konzentration von Protein C mit einer höheren Mortalität und
Morbidität einhergehen (88). Die Funktion der Kofaktoren TM und ECPR ist während einer
Sepsis aus mehreren Gründen eingeschränkt. Zum einen führen Entzündungsmediatoren wie
TNF-α zu einer verminderten Expression von TM auf der Oberfläche von Endothelzellen.
Zum anderen kann TM durch die Enzyme von aktivierten neutrophilen Granulozyten von der
Oberfläche des Endothels abgespalten oder oxidiert werden, was seine Aktivität senkt. Der
EPCR wird ebenfalls von der Oberfläche der Endothelzellen abgespalten und ist in seiner
gelösten Form weniger aktiv (90). Die Konzentration des TFPI verändert sich unter
entzündlichen Bedingungen kaum oder ist allenfalls leicht erhöht, jedoch kann es die hohe
prothrombotische Konzentration von TF nicht neutralisieren (91).
Die Bildung von Fibrin aus Fibrinogen ist durch die generelle Aktivierung der Gerinnung
erhöht. Fibrinogen ist zudem ein Akute Phase Protein, das als Reaktion der Körpers auf eine
Entzündung vermehrt in der Leber synthetisiert wird, damit mehr Substrat für die
Fibrinthrombusbildung zur Verfügung steht (81).
Die Auflösung der gebildeten Fibrinthromben ist während einer Sepsis gestört. Plasminogen
wird in verringertem Maße zu Plasmin gespalten, da die Enzyme t-PA und u-PA durch
Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) inaktiviert werden. TNF-α und IL-1β führen zu
einer länger anhaltenden Freisetzung von PAI-1 aus den Endothelzellen (92). Die Ablagerung
von Mikrothromben in der Mikrozirkulation können zur Entwicklung, Hypoxie und
Organschäden führen, die im weiteren Verlauf zum multiplen Organversagen beitragen
können (61).
Die Gerinnung und die Inflammation beeinflussen sich gegenseitig. Dabei haben
prothrombotische Faktoren der Gerinnungskaskade eine pro-inflammatorische Wirkung und
anti-koagulatorischen Faktoren auch eine anti-inflammatorische Wirkung.
Thrombin wirkt an vielen Stellen der Entzündungsreaktion, indem es Endothelzellen,
Makrophagen, Thrombozyten und Mastzellen aktiviert. Dies führt zu einer erhöhten
Produktion von Zytokinen, Adhäsionsmolekülen und Aktivatoren der Gerinnung (80). Eines
der wichtigsten Bindeglieder zwischen Koagulation und Inflammation sind die Protease-
aktivierten Rezeptoren (PAR), die auf der Oberfläche von Endothelzellen, Thrombozyten,
25
Lymphozyten, Monozyten und Fibroblasten exprimiert werden (89). Die Aktivierung der
PARs durch Enzyme der Gerinnung, wie Thrombin oder dem TF-FVIIa-Komplex führen zu
einer verstärkten Aktivierung der Plättchen, einer verstärkten Produktion von pro-
inflammatorischen Mediatoren und einer verstärkten Apoptose von Endothelzellen und
Lymphozyten (84). Die vermehrt aktivierten Thrombozyten setzen Mediatoren wie CD40
Ligand frei, das die Bildung von TF und pro-inflammatorischen Zytokinen induziert und
somit die Entzündungsreaktion weiter verstärkt (81).
Die antikoagulatorischen Enzyme Antithrombin, Thrombomodulin und aktviertes Protein C
besitzen eine anti-inflammatorische Wirkung. Antithrombin vermindert Leukozytenadhäsion
und Faktor X Aktivierung indem es die Expression von CD11b/CD18 auf der Oberfläche von
Leukozyten inhibiert. Des Weiteren führt Antithrombin zu einer erhöhten Produktion von
Prostazyklin, was den Transkriptionsfaktor NF-κB in den Endothelzellen supprimiert und die
Produktion von IL-6 und TF in den Monozyten vermindert (93,94). Auf der Oberfläche der
Leukozyten führt Antithrombin zu einer verminderten Expression von Integrinen und
Aktivierung durch Chemokine, wodurch weniger Leukozyten an den Ort der Inflammation
rekrutiert werden (95). Thrombomodulin wirkt anti-inflammatorisch, da es ein wichtiger
Aktivator von Protein C ist. Zudem bildet Thrombomodulin mit Thrombin den Thrombin-
Thrombomodulin Komplex, wodurch die pro-inflammatorische Wirkung von Thrombin
unterbunden wird. Der Thrombin-Thrombomodulin-Komplex aktiviert thrombin activatable
fibrinolysis inhibtor (TAFI). TAFI stabilisiert Fibrinthromben und inhibiert die Bildung von
Bradykinin und die Aktivierung des Komplementsystems, was zur hämodynamischen
Stabilisierung der Mikrozirkulation beiträgt (96). Im Mäusemodell inhibiert TM aPC-
unabhängig die Rekrutierung von Neutrophilen in der Lunge (97). Aktiviertes Protein C
beeinflusst die Expression von Genen und inflammatorischen Mediatoren, die Apoptose von
Immunzellen und stabilisiert zudem die endotheliale Barriere. Diese Eigenschaften des
aktivierten Protein C beschränken die Inflammation und sind unabhängig von der
antikoagulatorischen Funktion (98). Das in der Mikrozirkulation vermehrt abgelagerte Fibrin
hat pro-inflammatorische Eigenschaften indem es über die Freisetzung von pro-
inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen die Adhäsion von Makrophagen stimuliert
(99). Sowohl der Aktivator der Fibrinolyse u-PA, als auch der Inhibitor der Fibrinolyse PAI-1
inhibieren die Freisetzung von TNF-α (80).
26
Aktiviertes Protein C 1.4.3
Protein C wurde erstmals 1976 von Stenflo et al. charakterisiert (100). Ein hereditärer Mangel
an Protein C führt zu einem gehäuften Auftreten von venösen Thrombembolien (101). 1987
haben Taylor et al. nachgewiesen, dass die Gabe von aktiviertem Protein C die Häufigkeit
thrombotischer Ereignisse und die Mortalität nach Escherichia coli Infusion deutlich
minderte, dies geschah allerdings noch unter der Annahme, dass aPC die Hämostase in der
Mikrozirkulation stabilisiert (83). In den folgenden Jahren konnte in mehreren Arbeiten
nachgewiesen werden, dass die anti-inflammatorischen Effekte von aPC unabhängig von
seiner antikoagulatorischen Funktion sind (102-105). 2001 haben Bernard et al. in der
PROWESS (Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis)–Studie bewiesen, dass die
Behandlung mit rekombinanten aktivierten Protein C die Mortalität der schweren Sepsis bei
Patienten mit einer hohen Sterbewahrscheinlichkeit absolut um 6,1% reduziert (106). Die
Ergebnisse der PROWESS-Studie führten zu der Zulassung von aPC, unter dem
Wirkstoffnamen Drotrecogin-alfa (aktiviert) (Handelsname: Xigris™) unter der Auflage,
weitere Studien durchzuführen, die die Wirksamkeit von aPC bestätigen sollten. Die
ADDRESS (Drotrecogin Alfa (Activated) for Adults with Severe Sepsis and a Low Risk of
Death)- Studie sollte die Wirksamkeit von aPC bei schwerer Sepsis und niedriger
Wahrscheinlichkeit des Patienten zu versterben untersuchen, fand aber keine signifikante
Reduktion der Mortalität und eine signifikante Zunahme an Blutungskomplikationen (107).
Auch bei pädiatrischen Patienten mit schwerer Sepsis konnte keine Verbesserung der
Überlebenswahrscheinlichkeit nachgewiesen werden, bei Kindern die weniger als 60 Tage alt
waren zeigte sich eine erhöhte Rate intrakranieller Blutungen (108). Andere Studien wie die
ENHANCE- Studie konnten die Ergebnisse von PROWESS reproduzieren, sodass auf
Anweisung der European Medicines Agency (EMA) die PROWESS- SHOCK Studie
durchgeführt wurde, um die Wirksamkeit von aPC zu bestätigen (109,110). Auch hier konnte
keine Verbesserung der Mortalität nachgewiesen werden, so dass die Herstellerfirma Eli Lilly
Xigris™ wieder vom Markt nahm. 2012 publizierte die Cochrane Library eine Metaanalyse,
die die Wirkung von aPC anhand der Daten aus sämtlichen prospektiven randomisierten
Studien untersuchen sollte. Es konnte ebenfalls keine Verbesserung der Mortalität
nachgewiesen werden (111). Kalil et al. untersuchten dafür in ihrer Metaanalyse die
Beobachtungstudien, die von den Autoren der Cochrane Library nicht einbezogen wurden und
fanden eine Reduktion der Mortalität die vergleichbar mit den Ergebnissen von PROWESS
war (112). Die Erklärungen für diese unterschiedlichen Ergebnisse sind vielschichtig.
27
Prospektive randomisierte Studien sind Beobachtungsstudien überlegen, da sie den Einfluss
von Störfaktoren durch Randomisierung minimiert. Dies kann bedeuten, dass in den
Beobachtungstudien Patienten aPC appliziert bekamen, die eine höhere Chance hatten zu
überleben, oder das durch die Randomisierung Patientenkollektive ausgeschlossen wurden,
die von aPC profitiert hätten. Durch die Implementierung der Surviving Sepsis Campaign
Guidelines wurden weltweit Diagnostik- und Behandlungsstandards geschaffen, die die
Mortalität der Sepsis verminderten. Diese Richtlinien, die eine frühzeitige Diagnose und
Behandlung vereinfachen, haben dazu beigetragen, dass die Patientengruppe der besonders
schwer erkrankten und erst verspätet behandelten Patienten kleiner geworden ist. Bei dieser
Patientengruppe jedoch handelt es sich um diejenigen Patienten, die von der Gabe von aPC
am meisten profitiert haben, weswegen anzunehmen ist, dass die Verkleinerung dieser
Patientengruppe auch die Bedeutung von aPC für die Behandlung der Sepsis minimiert hat
(113).
28
2 Aufgabenstellung
An der Entstehung des Organversagens während der Sepsis ist die Mikrozirkulation
maßgeblich beteiligt. Die Störungen in der Mikrozirkulation sind in der Regel mit einer
pathologisch aktivierten Gerinnung verbunden. Es lässt sich also vermuten, dass der Einsatz
von antikoagulatorischen Substanzen von Vorteil sein könnte.
Das aktivierte Protein C ist ein gerinnungshemmendes Protein, das während der Sepsis in
verminderter Konzentration vorhanden ist. Dies bedingt eine vermehrte Thrombusbildung, die
wiederum zur Minderperfusion von Organen führt.
Folgende Fragen sollten in dieser tierexperimentellen Studie beantwortet werden:
1. Hat die Gabe von aktiviertem Protein C einen Einfluss auf die mesenteriale
Plasmaextravasation und die Leukozytenadhärenz bei experimenteller
Endotoxinämie?
2. Wie wird die Freisetzung der Entzündungsmediatoren TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-10
bei Endotoxinämie durch die Gabe von aktiviertem Protein C beeinflusst?
3. Lässt sich bei Endotoxinämie durch die Gabe von aktiviertem Protein C eine
Veränderung klinischer Parameter, wie Blutdruck, Herzfrequenz, Atemfrequenz und
Temperatur messen?
29
3 Material und Methoden
3.1 Versuchstiere
Es wurden für die Untersuchungen 40 männliche Lewis-Ratten im Alter von 6-7 Wochen mit
einem Gewicht von 200-270g verwendet (Charles River, Deutschland). Die Experimente
entsprachen den Richtlinien für die Durchführung von Tierversuchen nach Art.2, Abs.8 des
Tierschutzgesetzes und wurden vom Gesundheitsamt Mecklenburg-Vorpommern genehmigt.
Sie wurden von April bis September 2007 durchgeführt. Die Einteilung der Versuchstiere
erfolgte randomisiert in 4 Gruppen zu je 10 Tieren:
1. Kontrollgruppe (Kontrolle) keine Intervention
2. Kontrollgruppe mit aktiviertem Protein C (aPC) aPC 2mg/kg KG
3. Endotoxingruppe (LPS) LPS 15mg/kg KG
4. LPS-Gruppe mit aktiviertem Protein C (aPC+LPS) LPS 15mg/kg KG, aPC 2mg/kg KG
3.2 Versuchsablauf
Wir führten die Versuche bei jedem Versuchstier nach einem einheitlichen Protokoll durch.
Nach der Anästhesie präparierten wir das Versuchstier für das Experiment mittels Einlage von
Kathetern in die Halsgefäße, Tracheotomie und medianer Laparotomie. Nach einer
Erholungspause von 15 Minuten führten wir die erste Intravitalmikroskopie mit
Videoaufzeichnung durch. Dann erfolgte zum Zeitpunkt 0 die Einleitung der Endotoxinämie
mittels Applikation von LPS und unmittelbar danach die Gabe von aktiviertem Protein C
(Drotrecogin alfa (aktiviert) – Xigris®, Lilly, Germany). In den Kontrollgruppen wurden die
jeweiligen Medikamente durch die gleiche Menge Kochsalzlösung ersetzt. Sowohl 60 als
auch 120 Minuten nach der initialen Gabe der Medikamente wurden weitere
intravitalmikroskopische Aufnahmen durchgeführt. Blutabnahmen erfolgten bei allen
Gruppen unmittelbar vor der ersten und nach der dritten Intravitalmikroskopie (IVM). Nach
der letzten Blutabnahme wurde das Tier mittels einer intravenösen Pentobarbitalüberdosis
euthanasiert.
30
Abb.3: Versuchsablauf
Operative Techniken 3.2.1
Um die Vergleichbarkeit zwischen den Gruppen gewährleisten zu können, wurden sämtliche
Operationsmaßnahmen bei jedem Tier einer jeden Gruppe gleich durchgeführt. Die Operation
dauerte, von Halsschnitt bis Ende der Katheterisierungen, zwischen 30 bis 40 Minuten.
Die Einleitung der Anästhesie erfolgte durch gewichtsadaptierte Injektion von 60 mg/kg KG
Pentobarbital (Synopharm GmbH, Barsbüttel, Deutschland). Die Narkosetiefe war
ausreichend, wenn der Cornealreflex erloschen war und das Setzen eines Schmerzreizes am
Schwanz keinen Beugereflex auslöste. Danach wurde das Tier auf einer Platte, die auf 37°
vorgeheizt war, fixiert. Zum Überwachen der Körpertemperatur wurde eine Temperatursonde
rektal eingeführt (Thermosonde, W223, RFT, Strassfurt, Deutschland).
Nach Positionierung des Versuchstieres wurde zuerst ein kleiner submentaler Querschnitt
gefolgt von einem medianen Längsschnitt durchgeführt, wobei die Hautlappen mittels
Klemmen fixiert wurden. Zuerst erfolgte das Aufsuchen und Darstellen der Vena jugularis
externa, danach wurde die Vene mittels Metallclip nach proximal und distal abgeklemmt. Der
distale Abschnitt wurde mittels Faden legiert, in den proximalen Teil wurde der PVC Katheter
31
(PE 50, Innendurchmesser 0,58 mm, Portex, Hythe, Kent UK) mittels Venae-Sectio- Technik
eingeführt und per Faden fixiert. Über den zentralvenösen Zugang applizierten wir zur
Aufrechterhaltung der Narkose Pentobarbital im Bolus und eine Vollelektrolytlösung
(Sterofundin, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) in gewichtsadaptierter
Dauerinfusion. Danach wurde die Arteria carotis communis analog zur Vene katheterisiert.
Das Versuchstier atmete weiter Raumluft, zur Tracheotomie wurde ein kleiner Querschnitt
zwischen zwei Knorpelspangen auf Höhe des 6.-8. Ringknorpels durchgeführt und ein
Plastikröhrchen (18 G Flexüle, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) als Tubus
eingeführt, welches per Faden fixiert wurde. Die Halswunde wurde anschließend mit einem in
NaCl-getränkten Tupfer abgedeckt, um eine Austrocknung zu verhindern. Zur Vorbereitung
der Intravitalmikroskopie wurde ein Längsschnitt entlang der Linea Alba durchgeführt, auch
diese Wunde wurde mit einem in Elektrolytlösung getauchten Tupfer abgedeckt.
Anschließend folgte für das Versuchstier eine fünfzehnminütige Ruhephase, um eine
Erholung vom Operationsstress zu ermöglichen.
Damit die Intravitalmikroskopie durchgeführt werden konnte musste der Darm ausgelagert
werden. Hierfür wurde das Versuchstier auf ein Mikroskop überführt und ein 4 cm langes
Stück des präterminalen Ileums mittels no-touch Technik in ein Wasserbad ausgelagert. Das
Wasserbad besaß eine Temperatur von 37°C und wurde durch eine kontinuierliche Infusion
von 0,9 prozentigem NaCl gespeist, um nicht untersuchte, ausgelagerte Darmabschnitte vor
der Austrocknung zu bewahren. Der zu untersuchende Darmabschnitt wurde auf eine speziell
erhöhte Haltungsvorrichtig, die Stage, gelegt und mit einem Objektträger abgedeckt, um die
Mikroskopie zu ermöglichen, ohne den zu untersuchenden Abschnitt unnötig zu
traumatisieren.
3.3 Untersuchungsmethoden
Endotoxinmodell 3.3.1
Die LPS-Dosis, die benötigt wird, um den Einfluss der Endotoxinämie auf die
Mikrozirkulation zu untersuchen, wurde in Vorversuchen ermittelt. Zur Induktion der
Endotoxinämie entschieden wir uns für die Bolusapplikation von 15 mg/kg KG LPS (E. coli,
Serotyp O111:B4 , Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) über den zentralvenösen
32
Zugang, beginnend nach der ersten IVM-Untersuchung. Um die Vergleichbarkeit zu
gewährleisten wurde bei den Kontrollgruppen diese Dosis als Elektrolytinfusion appliziert.
Intravitalmikroskopie 3.3.2
Wir benutzten zur Durchführung der Intravitalmikroskopie folgende Gerätekonfiguration:
Technik:
− Mikroskop: Epifloureszenzmikroskope, Axiotech Vario, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena,
Deutschland
− Lichtquelle: HBO 50, Osram, Berlin, Deutschland
− Okulare: 10x, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland
− Objektive: 20x/0,5 Achroplan, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland
− Filter: Zeiss Filtersatz Nr. 20 (Anregung: BP 546/12; Strahlteiler: FT560 ; Emission:
BP 575-640) für Beobachtung im Rhodamin-6G-Kontrast
Zeiss Filtersatz Nr.10 (Anregung: BP 450-490; Strahlteiler: FT 510; Emission:
BP 515-565
− Videokamera: Pieper FK 6990 IQ, Pieper GmbH, Berlin, Deutschland
− Videorecorder: Panasonic NV-SV120EG-S, Matsushita Electric Ind. Co. Ltd., Japan
− Monitor: Hewlett Packard Modell 66s, Hewlett Packard, Saronno, Italien
− Video Timer: VTG-22, For-A-Company, Tokyo, Japan, finale Monitorvergrößerung
500fach
Zu Anfang wurde lichtmikroskopisch eine geeignete Venole im Mesenterium mit einem
Durchmesser zwischen 25-40 µm aufgesucht und Flourescein- isothiocyanat- Albumin
(FITC-Albumin) sowie Rhodamin-6G appliziert. FITC-Albumin dient der Darstellung des
Blutplasmas, während Rhodamin 6G benutzt wurde, um Leukozyten anzufärben. Mit Hilfe
respektiver Filter für FITC-Albumin und Rhodamin wurden je eine 30-sekündige
Videoaufzeichnung durchgeführt. Die Auswertung wurde verblindet und in zeitlicher
Versetzung vom Versuch durchgeführt.
33
Extravasation 3.3.3
Um den Austritt von Plasma aus den Gefäßen in das Gewebe darzustellen, injizierten wir 10
Minuten vor Messung FITC-Albumin, welches das Plasma unter Blauanregung darstellt und
bei einer Wellenlänge von 528 nm seine maximale Fluoreszenz hat. Dadurch kann bei
Benutzung entsprechender Filter der Intravasalraum (hell) vom Extravasalraum (dunkel)
unterschieden werden. Durch Feststellung des Helligkeitsunterschiedes zwischen Intra- und
Extravasalraum mittels computertechnischer Auswertung der digitalisierten Aufnahmen kann
die im Laufe des Experimentes auftretende Änderung der Plasmaextravasation objektiviert
werden. Der Helligkeit im Intra- und Extravasalraum wurden Werte von 0 (schwarz, keine
Fluoreszenz) bis 255 (weiß, maximale Fluoreszenz) zugewiesen. Wir führten pro IVM zu den
Messzeitpunkten 0, 60 und 120 Minuten fünf Messungen der Lichtintensität in der Venole
und dem sie umgebenden Gewebe durch. Danach bildeten wir den Mittelwert für jeden
Messzeitpunkt und errechneten den Quotienten aus den Mittelwerten des Intravasalraums und
des Extravasalraumes Ip/Ie.
Leukozyten-Endothel-Interaktion 3.3.4
Die Darstellung der Leukozyten erfolgte mit Rhodamin 6G, einem Fluoreszenzfarbstoff,
welcher bei einer Wellenlänge von 610 nm sein Fluoreszenzmaximum erreicht. 15 Minuten
vor der Untersuchung injizierten wir 0,2 ml 0,05g% Rhodamin 6G intravenös.
3.3.4.1 Temporär adhärente Leukozyten
Temporär adhärente Leukozyten weisen ein einfach zu erkennendes Verhalten in der
Fluoreszenzmikroskopie auf, da sie nur kurz andauernde Bindungen mit der
Endotheloberfläche eingehen, “rollen” sie an der Gefäßwand entlang. Es wurden alle
rollenden Leukozyten, die innerhalb der 30-sekündigen Aufnahme mit einer
durchschnittlichen Geschwindigkeit von 50 µm/s das untersuchte Areal passierten, gezählt
und als Anzahl pro Minute erfasst: Roller Flow= n/min.
34
3.3.4.2 Endothel-adhärente Leukozyten
In unserem Versuch wurden alle Leukozyten, die innerhalb der 30-sekündigen Aufnahme in
einer definierten Fläche an der Gefäßwand verweilten, erfasst. Um die Gefäßinnenfläche zu
berechnen, bezogen wir uns auf ein Zylindermodell:
Zylinderfläche: A=I*U (I= Länge des Gefäßes)
Zylinderumfang: U= π*d (d= Durchmesser des Gefäßes)
Adhärente Leukozyten pro Fläche: n/mm²
Laborparameter 3.3.5
Blutentnahmen erfolgten vor der Applikation der Medikamente und Kontrastmittel am
Zeitpunkt T= 0 min und am Ende des Versuchs zum Zeitpunkt T= 120 min.
3.3.5.1 Laktat
Zur Laktatbestimmung füllten wir 55 µl des gewonnenen Blutes in eine heparinisierte Pipette
(PICO 50, Radiometer Medical ApS, Åkandevej 21, DK-2700 Brønshøj, Denmark) und
werteten es maschinell aus (Radiometer ABL 330, Radiometer, Hamburg, Deutschland). Die
Eichung des Gerätes erfolgte entsprechend der Vorschrift der Herstellerfirma. Die Messung
fand innerhalb von 15 Minuten nach Gewinnung der Probe statt.
3.3.5.2 Zytokine
Zur Bestimmung der TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-10- Konzentration füllten wir eine
Microvette (500, Ca-EDTA, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) mit 500 µl Blut und
zentrifugierten die Probe für 10 Minuten bei 6.000 Umdrehungen pro Minute. Der
Plasmaüberstand wurde abpippetiert, auf 4 Eppendorfgefäße verteilt und anschließend
tiefgefroren. Nach Abschluss aller Versuche ermittelten wir die Konzentration der Zytokine
mit Hilfe eines standardisierten Ratten-spezifischen Test-Kits (TNA-α, IL-1β, IL-6 und IL-10
Rat-Quantikine ELISA Kits, R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland).
35
Statistische Methoden 3.3.6
Da in unserem Versuch mit 40 Tieren eine kleine Fallzahl vorlag und die Ergebnisse im
Kolmogoroff-Smirnow-Test nicht normal verteilt waren, benutzten wir nicht-parametrische
Maßzahlen und Methoden zur Darstellung und Auswertung. Alle Ergebnisse wurden mittels
Kruskal-Wallis- bzw. Friedmantest auf Signifikanz überprüft und post hoc mit dem Student-
Newman-Keuls-Test analysiert. Mittlerer arterieller Blutdruck, Temperatur, Herz- und
Atemfrequenz wurden mittels zweifaktorieller Varianzanalyse überprüft, da hier mehrere
Messwerte über die Zeit vorlagen. Bei Signifikanz wurden diese Ergebnisse mittels Student-
Newman- Keuls-Test weiter analysiert.
Das Signifikanzniveau wurde bei p < 0,05 angesetzt.
Für die statistische Analyse nutzen wir das Statistikpaket SPSS 15.0 (SPSS GmbH Software,
München). Bei den Ergebnissen wurde Median, 25. und 75. Perzentile, Minimum und
Maximum dargestellt.
36
4 Ergebnisse
4.1 Intravitalmikroskopie
Extravasation 4.1.1
Abb.4: Plasmaextravasation (Quotient intra-/extravasal) zu den Messzeitpunkten 0, 60 und
120 Minuten.
Kontrolle = unbehandelte Kontrollgruppe; aPC = nur mit aktiviertem Protein C behandelte
Kontrollgruppe; LPS = nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; aPC+LPS = mit
aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10; #P<0,05 versus LPS
Zeitpunkt der Intravitalmikroskopie [min]120600
Plas
mae
xtra
vasa
tion
[Quo
tient
intr
a-/ e
xtra
vasa
l]
1,0000000
,9000000
,8000000
,7000000
,6000000
,5000000
,4000000
115
38
58
4778
82
87
88
#
aPC+ LPSLPSaPCKontrolle
Gruppen
Page 3
37
In keiner Gruppe kam es im Verlauf zu einer signifikanten Zu- oder Abnahme der
Plasmaextravasation gegenüber ihrem Ausgangswert. Bei der ersten Intravitalmikroskopie
unterschieden sich die Gruppen nicht signifikant voneinander. Bei der zweiten
Intravitalmikroskopie, eine Stunde nach Medikamentengabe, unterschied sich keine Gruppe
nicht signifikant von der unbehandelten Kontrollgruppe, allerdings war die
Plasmaextravasation in der LPS-Gruppe signifikant höher als in der nur mit aPC behandelten
Kontrollgruppe. Während der dritten Intravitalmikroskopie, 120 Minuten nach Beginn des
Experiments, konnten wir feststellen, dass die Plasmaextravasation in der aPC-
Kontrollgruppe signifikant niedriger ausfiel als in den restlichen Gruppen. In der mit LPS
behandelten aPC-Gruppe verzeichneten wir eine signifikant niedrigere Plasmaextravasation
als in der LPS-Gruppe, einen Unterschied zur Kontrollgruppe konnten wir jedoch nicht
nachweisen.
38
Leukozyten-Endothel-Interaktion 4.1.2
4.1.2.1 Temporär adhärente Leukozyten
Abb.5: Temporär adhärenten Leukozyten (n/min) zu den Zeitpunkten 0, 60 und 120 Minuten.
Kontrolle = unbehandelte Kontrollgruppe; aPC = nur mit aktiviertem Protein C behandelte
Kontrollgruppe; LPS = nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; aPC+LPS = mit
aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10; *P<0,05 versus
Kontrolle, #P<0,05 versus LPS
Im Vergleich zu den Ausgangswerten konnte in der mit LPS behandelten Gruppe ein
wesentlicher Anstieg der Anzahl von temporär adhärenten Leukozyten nach 60 und 120
Minuten verzeichnet werden. In den anderen Gruppen gab es gegenüber den Ausgangswerten
hingegen keine Veränderungen hinsichtlich der Anzahl der temporär adhärenten Leukozyten.
Nach 120 Minuten, zum Zeitpunkt der 3. Intravitalmikroskopie, wies die LPS-Gruppe eine
Zeitpunkt der Intravitalmikroskopie [min]120600
tem
porä
r adh
ären
te L
euko
zyte
n [n
/min
]
50,00
40,00
30,00
20,00
10,00
,00
11939 42
10aPC+ LPSLPSaPCKontrolle
Gruppen
#
*
Page 2
39
signifikant höhere Anzahl temporär adhärenter Leukozyten auf als die Kontrollgruppe. Des
Weiteren zeigte sich, dass in der mit aPC behandelten LPS-Gruppe die Anzahl der temporär
adhärenten Leukozyten signifikant niedriger ausfiel, als in der LPS-Gruppe.
4.1.2.2 Fest adhärente Leukozyten
Abb.6: Fest adhärente Leukozyten (n/mm2) zu den Zeitpunkten 0, 60 und 120 Minuten.
Kontrolle = unbehandelte Kontrollgruppe; aPC = nur mit aktiviertem Protein C behandelte
Kontrollgruppe; LPS = nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; aPC+LPS = mit
aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10; *P<0,05 versus
Kontrolle, #P<0,05 versus LPS
Die Anzahl der fest adhärenten Leukozyten in der Kontrollgruppe veränderte sich während
des Experiments nicht signifikant, jedoch war ein leicht ansteigender Trend zu beobachten. In
der mit aPC behandelten Gruppe war ebenfalls keine signifikante Veränderung in der Anzahl
Zeitpunkt der Intravitalmikroskopie [min]120600
fest
adh
ären
te L
euko
zyte
n [n
/mm
2]
1200,00
1000,00
800,00
600,00
400,00
200,00
,00
111
79102
30 62
42
#
#
aPC+ LPSLPSaPCKontrolle
Gruppen
**
Page 1
40
der fest adhärenten Leukozyten gegenüber den Ausgangswerten festzustellen, jedoch zeigte
sich eine abfallende Tendenz.
Sowohl nach 60 als auch nach 120 Minuten war die Anzahl der fest adhärenten Leukozyten in
der aPC-Gruppe signifikant niedriger als in allen anderen Gruppen. In der mit LPS
behandelten Gruppe stieg die Anzahl der fest adhärenten Leukozyten nach 60 Minuten
signifikant gegenüber dem Ausgangswert an. Zum letzten Messzeitpunkt, 120 Minuten nach
Versuchsbeginn, hatte sich der Wert gegenüber dem Ausgangswert vervierfacht. In der mit
LPS und aPC behandelten Gruppe nahm nach 60 Minuten die Stickeranzahl gegenüber den
Ausgangswerten zu, fiel aber nach 120 wieder auf den jeweiligen Ausgangswert ab. Sowohl
nach 60, als auch nach 120 Minuten konnte bei der aPC+LPS-Gruppe im Vergleich zur LPS-
Gruppe eine signifikant niedrigere Anzahl an fest adhärenten Leukozyten festgestellt werden.
41
4.2 Laborparameter
Laktat 4.2.1
Abb.7: Laktatkonzentration (mmol/l) zu den Messzeitpunkten 0 und 120 Minuten.
Kontrolle = unbehandelte Kontrollgruppe; aPC = nur mit aktiviertem Protein C behandelte
Kontrollgruppe; LPS = nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; aPC+LPS = mit
aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10; *P<0,05 versus
Kontrolle; #P<0,05 versus LPS
In den mit LPS behandelten Gruppen war ein Anstieg der Laktatkonzentration zu
verzeichnen, der sich signifikant von den Ausgangswerten unterschied. Die
Laktatkonzentration wich, sowohl in der Kontroll-, als auch in der aPC-Gruppe nicht
signifikant von ihrem jeweiligen Ausgangswert ab.
Zeitpunkt der Blutentnahme [min]1200
Lakt
atko
nzen
trat
ion
[mm
ol/l]
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
,00
32
37
2370
#
aPC+LPSLPSaPCKontrolle
Gruppen
*
Page 1
42
Nach 120 Minuten konnten wir feststellen, dass die Laktatkonzentration sowohl in der LPS-,
als auch in der aPC+LPS-Gruppe signifikant höher war, als in der Kontroll- und aPC-Gruppe.
Im Vergleich zu der Gruppe der ausschließlich LPS verabreicht wurde, wies die aPC+LPS-
Gruppe eine signifikant geringere Laktatkonzentration auf.
43
Zytokine 4.2.2
4.2.2.1 TNF-α
Abb.8: TNF-α Konzentration (pg/ml) zu den Zeitpunkten 0 und 120 Minuten.
TNF-α = Tumor necrosis Faktor-Alpha; Kontrolle = unbehandelte Kontrollgruppe; aPC = nur
mit aktiviertem Protein C behandelte Kontrollgruppe; LPS = nur mit Lipopolysaccharid
behandelte Gruppe; aPC+LPS = mit aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte
Gruppe; n=10; *P<0,05 versus Kontrolle; #P<0,05 versus LPS
Zum Zeitpunkt der 1. Blutentnahme wiesen die Tiere der unbehandelten Kontrollgruppe eine
signifikant höhere TNF-α Konzentration auf als die Tiere der anderen Gruppen.
120 Minuten nach Medikamentenapplikation war die Konzentration von TNF-α in der
Kontroll- und aPC-Gruppe gleichbleibend niedrig. Bei den Tieren der beiden LPS-Gruppen
war ein signifikanter Anstieg der TNFα-Freisetzung zu beobachten. Die TNFα-Konzentration
Zeit der Blutentnahme[min]1200
TNF-
alph
a K
onze
ntra
tion
[pg/
ml]
1250,00
1000,00
750,00
500,00
250,00
,00
3354
63
61
50
46*
*
aPC+ LPSLPSaPCKontrolle
Gruppen#
Page 1
44
in der mit aPC behandelten LPS-Gruppe war dabei signifikant höher als in der nur mit LPS
behandelten Gruppe.
4.2.2.2 Interleukin-1β
Abb.9: IL-1β Konzentration (pg/ml) zu den Zeitpunkten 0 und 120 Minuten.
IL-1β= Interleukin-1Beta; Kontrolle= unbehandelte Kontrollgruppe; aPC= nur mit
aktiviertem Protein C behandelte Kontrollgruppe; LPS= nur mit Lipopolysaccharid
behandelte Gruppe, aPC+LPS= mit aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte
Gruppe n=10; *P<0,05 versus Kontrolle; #P<0,05 versus LPS.
In den beiden mit LPS behandelten Gruppen konnte gegen über den Ausgangswerten nach
120 Minuten eine signifikante Erhöhung der IL-1β-Konzentration festgestellt werden.) Die
IL-1β-Konzentration in den mit LPS behandelten Gruppen war nach 120 Minuten signifikant
Zeitpunkt der Blutentnahme [min]1200
IL-1
bet
a K
onze
ntra
tion
[pg/
ml]
5000,00
4000,00
3000,00
2000,00
1000,00
,00
3620
22
4
50
8
#
*aPC+ LPSLPSaPCKontrolle
Gruppen
Page 2
45
höher als in der Kontroll- und der aPC-Gruppe, allerdings war sie in der mit aPC behandelten
LPS-Gruppe signifikant niedriger als in der nur mit LPS behandelten Gruppe.
4.2.2.3 Interleukin-6
Abb.10: Interleukin-6 Konzentration (pg/ml) zu den Zeitpunkten 0 und 120 Minuten.
IL-6= Interleukin-6; Kontrolle= unbehandelte Kontrollgruppe; aPC= nur mit aktiviertem
Protein C behandelte Kontrollgruppe; LPS= nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe;
aPC+LPS= mit aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10;
*P<0,05 versus Kontrolle.
In den mit LPS behandelten Gruppen konnte 120 Minuten nach Endotoxingabe eine 25-fach
höhere IL-6 Konzentration als in der Kontrollgruppe gemessen werden, zwischen den beiden
LPS-Gruppen bestand jedoch zum gleichen Messzeitpunkt kein Unterschied in den IL-6
Konzentrationen.
Zeitpunkt der Blutentnahme [min]1200
IL-6
Kon
zent
ratio
n [p
g/m
l]
12000,00
10000,00
8000,00
6000,00
4000,00
2000,00
,00
76
79
33
5460
1218
63
4341
aPC+ LPSLPSaPCKontrolle
Gruppen*
Page 3
46
Im Gegensatz zu den beiden mit LPS behandelten Gruppen unterschied sich die IL-6
Konzentration in der Kontroll- und aPC-Gruppe nicht signifikant vom jeweiligen
Ausgangswert.
4.2.2.4 Interleukin-10
Abb.11: Interleukin-10 Konzentration (pg/ml) zum Zeitpunkt 0 und 120 Minuten.
IL-10= Interleukin-10; Kontrolle= unbehandelte Kontrollgruppe; aPC= nur mit aktiviertem
Protein C behandelte Kontrollgruppe; LPS= nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe;
aPC+LPS= mit aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe, n=10,
*P<0,05 versus Kontrolle, #P>0,05 versus LPS.
In allen Gruppen konnten wir einen signifikanten Anstieg der IL-10 Konzentrationen
gegenüber den Ausgangswerten beobachten.
Die IL-10 Konzentration zum Zeitpunkt 0 war in der aPC+LPS-Gruppe im Vergleich zu den
anderen Gruppen signifikant erhöht.
Zeitpunkt der Blutentnahme[min]1200
IL-1
0 K
onze
ntra
tion
[pg/
ml]
2000,00
1500,00
1000,00
500,00
,00
38152429
#
*aPC+ LPSLPSaPCKontrolle
Gruppen
Page 4
47
Nach 120 Minuten konnten wir feststellen, dass die IL-10 Konzentration in beiden mit LPS
behandelten Gruppen signifikant höher war als in der Kontroll- und aPC-Gruppe. Die IL-10
Konzentrationen in beiden LPS-Gruppen unterschieden sich jedoch nicht signifikant
voneinander.
4.3 Hämodynamik
Mittlerer arterieller Blutdruck 4.3.1
Abb.12: Mittlerer arterieller Blutdruck (mmHg).
Kontrolle = unbehandelte Kontrollgruppe; aPC = nur mit aktiviertem Protein C behandelte
Kontrollgruppe; LPS = nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; aPC+LPS = mit
aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10; *P<0,05 versus
Kontrolle
Zeit [min]1209060300-30
mitt
lere
r art
erie
ller B
lutd
ruck
[mm
Hg]
175,00
150,00
125,00
100,00
75,00
112
100
93
265268
183
3
*
aPC+ LPSLPSaPCKontrolle
Gruppen
*
**
Seite 1
48
In unserer Untersuchung lagen die Ausgangswerte des mittleren arteriellen Blutdrucks in
allen Gruppen bei durchschnittlich 125 mmHg. In der Kontrollgruppe blieb der Blutdruck
während des ganzen Versuches stabil bei durchschnittlich 130 mmHG. In den beiden
Endotoxingruppen und der nur mit aPC behandelten Gruppe kam es im Vergleich zur
Kontrollgruppe 30 Minuten nach Applikation der Medikamente zu einem signifikanten Abfall
des mittleren Blutdrucks. Während in der LPS- und aPC+LPS-Gruppe der Blutdruckabfall
anhielt, stabilisierte sich der Blutdruck in der aPC-Gruppe nach 90 Minuten wieder. Zwischen
den Werten der LPS- und der mit aPC behandelten LPS-Gruppe bestand während des
gesamten Messzeitraumes kein signifikanter Unterschied.
Herzfrequenz 4.3.2
Abb.13: Herzfrequenz (n/min).
Kontrolle = unbehandelte Kontrollgruppe; aPC = nur mit aktiviertem Protein C behandelte
Kontrollgruppe; LPS = nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; aPC+LPS = mit
Messzeitpunkt [min]120 min.90 min.60 min.30 min.0 min.-30 min.
Her
zfre
quen
z [n
/min
]
600,00
550,00
500,00
450,00
400,00
350,00
300,00
193
191
197
177
179
97
186
187
185
405
162
10
*
*aPC+ LPSLPSaPCKontrolle
Gruppen
*
#
Seite 2
49
aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10; *P<0,05 versus
Kontrolle, #P<0,05 versus LPS.
In der Kontrollgruppe und der aPC-Gruppe blieb die Herzfrequenz bei durchschnittlich
400/min und zeigte während des gesamten Experimentes keine signifikanten Veränderungen.
In den beiden mit LPS behandelten Gruppen stieg die Herzfrequenz nach 90 Minuten im
Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant an.
Während 60 und 90 Minuten nach Substanzgabe zwischen beiden LPS-Gruppen kein
signifikanter Unterschied in der Herzfrequenz bestand, konnten wir nach 120 Minuten
feststellen, dass in der aPC+LPS-Gruppe die Herzfrequenz mit durchschnittlich 451 Schlägen
pro Minuten signifikant niedriger war als in der nur mit LPS behandelten Gruppe mit 513
Schlägen pro Minute.
50
Atemfrequenz 4.3.3
Abb.14: Atemfrequenz (n/min).
Kontrolle = unbehandelte Kontrollgruppe; aPC = nur mit aktiviertem Protein C behandelte
Gruppe; LPS = nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; aPC+LPS = mit aktiviertem
Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10; *P<0,05 versus Kontrolle;
#P<0,05 versus LPS.
Bei unserem Experiment konnten wir 60 Minuten nach Beginn des Experiments bei der LPS-
und aPC+LPS-Gruppe einen signifikanten Anstieg der Atemfrequenz feststellen, während
sich die Atemfrequenz in der Kontroll- und aPC-Gruppe nicht signifikant veränderte. Nach 90
Minuten war die Atemfrequenz der LPS-Gruppe höher als die der mit aPC behandelten LPS-
Gruppe. Die Atemfrequenz in der aPC+LPS-Gruppe unterschied sich nach 120 Minuten nicht
signifikant von den beiden Kontrollgruppen.
Messzeitpunkt [min]1209060300-30
Ate
mfr
eque
nz [n
/min
]
150,00
125,00
100,00
75,00
50,00
355
196
195
97
98
264
24
**
aPC+ LPSLPSaPCKontrolle
Gruppen
*
#
#
Seite 3
51
Temperatur 4.3.4
Abb.15: Temperatur (°C).
Kontrolle = unbehandelte Kontrollgruppe; aPC = nur mit aktiviertem Protein C behandelte
Kontrollgruppe; LPS = nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; aPC+LPS = mit
aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10; *P<0,05 versus
Kontrolle; #P<0,05 versus LPS.
Es konnte über den gesamten Zeitverlauf des Versuches ein signifikanter Temperaturanstieg
in der LPS-, aPC- und aPC+LPS-Gruppe festgestellt werden. Bei der Kontrollgruppe kam es
30 Minuten nach Beginn des Versuches zu einem signifikanten Temperaturanstieg, der sich
jedoch stabilisierte und nach 90 Minuten wieder abfiel und sich am Ende des Experiments
nicht mehr wesentlich vom Ausgangswert unterschied. Nach 60 Minuten war die Temperatur
in beiden mit LPS behandelten Gruppen signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Während
die Temperatur in der LPS-Gruppe weiter anstieg, fiel sie in der mit aPC behandelten LPS-
Gruppe wieder ab und war 90 Minuten nach Medikamentengabe signifikant niedriger als in
Messzeitpunkt [min]1209060300-30
Tem
pera
tur [
°C]
42,00
41,00
40,00
39,00
38,00
37,00
36,00
419
338
97
430270
*
*aPC+ LPSLPSaPCKontrolle
Gruppen
* # #
Seite 4
52
der LPS-Gruppe. Nach 120 Minuten konnte ein signifikanter Temperaturunterschied
zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Die Tiere der Kontrollgruppe hatten mit
durchschnittlich 37,9°C die niedrigste Temperatur, gefolgt von den Tieren der aPC-Gruppe
mit 38,6°C, der aPC+LPS-Gruppe mit 39,7°C und der LPS-Gruppe mit 40,5°C.
53
5 Diskussion
5.1 Intravitalmikroskopie
Plasmaextravasation 5.1.1
Die Plasmaextravasation ist ein wichtiger Faktor in der Pathogenese der Sepsis, da sie zum
Organversagen durch Störung der Mikrozirkulation beiträgt. Durch die inflammatorische
Reaktion des Körpers verliert das Endothel seine Barrierefunktion, was einen unkontrollierten
Austritt von proteinreicher intravasaler Flüssigkeit in den Extravasalraum zur Folge hat.
Dieser Verlust des Plasmas führt zu einem relativen Volumenmangel, zur Hypotension und
zur Ödembildung in den Geweben.
Bei den Tieren der Kontrollgruppe blieb der Grad der Plasmaextravasation über den gesamten
Versuchszeitraum hinweg konstant. Aufgrund unserer Versuchsanordnung konnten wir die
Plasmaextravasation erst nach Präparation und Auslagerung des Darmes untersuchen,
weswegen es uns nicht möglich war, den Grad der Plasmaextravasation am nicht
traumatisierten Darmgewebe zu ermitteln. Auslagerung, Präparation und UV-Lichtexposition
während der Mikroskopie verursachen eine Entzündungsreaktion am Gewebe, die zu einer
Störung der endothelialen Barriere und somit zur Zunahme der Plasmaextravasation führen
kann. Bei den Tieren der aPC-Kontrollgruppe war interessanterweise eine signifikante
Reduktion der Plasmaextravasation zu beobachten. Es ist zu vermuten, dass die Gabe von
aPC die durch das experimentelle Setup ausgelöste Störung der Barrierefunktion reduziert.
Des Weiteren konnten wir feststellen, dass die Gabe von LPS zu einer starken Zunahme der
Plasmaextravasation führte, was mit den Angaben der Literatur übereinstimmt. Van
Lambalgen et al. haben gezeigt, dass im Intestinum die Extravasation unter Endotoxinämie
um bis zu 380% zunimmt (114).
In unserem Versuch haben wir zum ersten Mal in vivo nachweisen können, dass aPC die
Plasmaextravasation im Mesenterium während der Endotoxinämie signifikant verringert.
Zeng et al. haben mittels in vitro Untersuchungen an menschlichen Endothelzellen ebenfalls
eine konzentrationsabhängige Reduktion der endothelialen Permeabilität durch aPC
festgestellt (115). Aktiviertes Protein C führt über indirekte und direkte Mechanismen zu
einer Stabilisierung der endothelialen Barriere. Die direkte barrierestabilisierende Wirkung
von aPC wird durch die Aktivierung des Sphingosin-1-phosphat Rezeptor 1 (S1P1) vermittelt.
Der sich auf der Oberfläche der Endothelzellen befindende Protease-aktivierte Rezeptor 1
54
(PAR-1) wird ECPR-vermittelt von aPC aktiviert und induziert die Bildung von Sphingosin-
1-phosphat (S1P), das an S1P1 bindet (116). Die Aktivierung von S1P1 führt zu einer
Stabilisierung des Zytoskeletts und der Zell-Zellverbindungen und kann die durch Thrombin
verursachten Schäden an der endothelialen Barriere teilweise wieder rückgängig machen
(117,118). Bei entzündlichen Prozessen verliert die Glykokalyx ihre Struktur und ihre negativ
geladenen Bestandteile. Dies trägt zur erhöhten Plasmaextravasation bei, da die Gefäßwände
nun durchlässiger für Proteine wie Albumin sind (119). Marechal et al. haben am
Rattenmodell nachweisen können, dass aPC die LPS-bedingte Reduktion der
Glykokalyxstruktur vermindert (120). Ein weiterer Faktor der ebenfalls zur
Barrierendysfunktion beiträgt, ist die durch inflammatorische Mediatoren ausgelöste
Apoptose von Endothelzellen. Die Gabe von aPC wirkt dieser Apoptose entgegen, da es eine
vermehrte Expression anti-apoptotischer Proteine hervorruft (121,122). Wie weiter unten
näher ausgeführt, reduziert aPC die Anzahl an temporär und fest adhärenten Leukozyten an
der Gefäßwand im Mesenterium und könnte somit indirekt zur Reduktion der Extravasation in
unserem Versuch beigetragen haben. In der Literatur finden sich allerdings unterschiedliche
Aussagen zur Rolle der endothel-adhärenten Leukozyten in der Genese der erhöhten
Plasmaextravasation während der Sepsis. Yi und Kurose et al. haben in ihren Versuchen
festgestellt, dass ohne adhärente Leukozyten kein vaskuläres Leck entsteht (123,124). Im
Gegensatz dazu haben Walther et al.in ihrem Versuchen die Adhärenz der Leukozyten
unterbunden und konnten keine signifikante Minderung der Plasmaextravasation feststellen
(125). Ein wichtiger Faktor in der Entstehung der endothelialen Barrierestörung sind die
Thrombozyten, da ihre Inhibition sowohl in vivo als auch in vitro die Plasmaextravasation
verringert (126,127). Thrombin führt zu einer erhöhten Freisetzung und Aktivierung von
Thrombozyten, welche vermehrt Leukozyten auf der Oberfläche der Endothelzellen binden
und Aggregate bilden (128). Die Thrombozyten setzen Serotonin frei, was die Permeabilität
der Gefäße erhöht (129). Die Einschränkung der Thrombinproduktion durch aPC könnte
damit auch zu einer verminderten Aktivierung von Thrombozyten führen. Weiterhin wird
durch aPC auch vermehrt Cyclooxygenase in den Endothelzellen produziert, wodurch mehr
Prostacycline freigesetzt werden, die die Thrombozytenfunktion hemmen (130,131). Während
der Endotoxinämie werden im erhöhten Maße Mastzellen gebildet und aktiviert, dadurch wird
Histamin freigesetzt, das die Permeabilität der Gefäße erhöht (132). Marakova et al. konnte
am Rattenmodell nachweisen, dass aktiviertes Protein C die Freisetzung der histaminhaltigen
Mastzellgranula senkt (133).
55
Erhöhte Scherkräfte an den Gefäßwänden erhöhen die Permeabilität der Gefäße (134,135). In
unserem Versuchsaufbau haben wir die Scherkräfte nicht bestimmt, sodass sie nicht als
Erklärung für die Unterschiede in der Plasmaextravasation ausgeschlossen werden können.
Wie weiter unten dargestellt, konnten wir bei der aPC+LPS-Gruppe im Vergleich zur LPS-
Gruppe einen signifikant höheren mittleren arteriellen Blutdruck (MAP) messen. Da der MAP
jedoch nicht strikt mit der Durchblutung in der Mikrozirkulation korreliert, ist eine MAP-
bedingte Beeinflussung unserer Untersuchungsergebnisse unwahrscheinlich (136,137).
Leukozyten-Endothel-Interaktion 5.1.2
Um eine adäquate Immunantwort zu ermöglichen, müssen Immunzellen an den Ort der
Infektion gelangen. Sie wandern über den Blutstrom in das betroffenen Gewebe ein, indem
sie erst temporär und dann fest adhärieren bis sie ihren Bestimmungsort erreicht haben (138).
Während der Sepsis schädigen die einwandernden Leukozyten die Zellmembranen der
Endothelzellen durch Freisetzung von lytischen Enzymen und Sauerstoffradikalen, wodurch
die Funktion des Endothels gestört wird. Die Folgen sind eine erhöhte Gefäßpermeabilität und
die Aktivierung entzündlicher Kaskadensysteme (124).
5.1.2.1 Temporär adhärente Leukozyten
Bereits während der ersten Intravitalmikroskopie vor Applikation der Medikamente konnten
wir „rollende“ Leukozyten an den Gefäßwänden im Mesenterium feststellen. Dies lässt sich
dadurch erklären, dass auch unter physiologischen Bedingungen immer eine geringen Anzahl
an Leukozyten am Endothel entlangrollen (139,140). Des Weiteren führt die Präparation des
Mesenteriums trotz gewebsschonender Maßnahmen wie Lagerung des Darms in erwärmter
Lösung, möglichst kurzer Belichtung des Untersuchungsgebiets und wenig Manipulation am
Darm zu einer Traumatisierung des Gewebes, die ihrerseits eine entzündliche Reaktion
auslösen und damit zu einer Ausschüttung von DAMPs und einer vermehrte Expression von
Adhäsionsmolekülen führen kann. Die Gabe von LPS führte zu einer starken Erhöhung der
Anzahl rollender Leukozyten, was von vielen Studien bestätigt wird (141).
Mittels unseres Versuches konnten wir zeigen, dass die Gabe von aPC die Anzahl temporär
adhärenter Leukozyten während der Endotoxinämie verringert, wodurch wir die Ergebnisse
von Iba und Hoffmann et al. bestätigen (139,142). Abraham et al. haben bei menschlicher
56
Endotoxinämie ebenfalls eine Reduktion der Akkumulation von neutrophilen Granulozyten in
der Lunge bei Behandlung mit aPC festgestellt (143).
APC beeinflusst die Anzahl temporär und fest adhärenter Leukozyten während der
Endotoxinämie auf direktem und indirektem Weg mittels Reduktion chemotaktischer Signale,
inflammatorischer Zytokine und von Adhäsionsmolekülen (144).
Aktiviertes Protein C wirkt indirekt auf die Adhärenz der Leukozyten indem es die pro-
inflammatorische Wirkung von Thrombin neutralisiert (87). Eine weitere indirekte Wirkung
ist die Veränderung der Genexpression des Transkriptionsfaktors NF-κB. Zudem werden
geringere Mengen an inflammatorischen Mediatoren wie TNF-α und IL-1β produziert, die die
Expression von Adhäsionsmolekülen auf der Oberfläche von Leukozyten und Endothelzellen
stimulieren (102). Joyce et al. haben nachgewiesen, dass aPC eine Reduktion der Translation
von Genen, welche für E-Selektin, ICAM und VCAM codieren, bewirkt (145). Der EPCR
wird nicht nur auf der Oberfläche der Endothelzellen, sondern auch auf der Oberfläche von
neutrophilen Granulozyten exprimiert. Bindet aPC an den EPCR führt dies zu einer
verminderten Aktivierung und Expression von Adhäsionsmolekülen (146). Aktivierte
Thrombozyten auf der Oberfläche des Endothels verstärken die Bindung von Leukozyten,
indem sie Thrombozyten-Leukozyten Aggregate bilden (128). Es ist zu vermuten, dass durch
die aPC-vermittelte verminderte Thrombinproduktion auch weniger Thrombozyten aktiviert
werden, die zur weiteren Bindung von Leukozyten beitragen. In sehr hohen, nicht-
physiologischen Konzentrationen fungiert aPC auch als alternativer Ligand für das
Adhäsionsmolekül E-Selektin (147).
Die Zahl der rollenden Leukozyten wird durch die Scherkräfte an der Gefäßwand, dem
Durchmesser der Gefäße und die Leukozytenzahl im Blut beeinflusst. Eine Erhöhung der
Scherkräfte führt zu einer reduzierten Anzahl an rollenden Leukozyten, da diese ihre
Pseudopoden zurückziehen und weniger Adhäsionsmoleküle exprimieren (148). In unserem
Versuch haben wir keine Messung der Scherkräfte an den Gefäßwänden durchgeführt und
konnten somit auch nicht deren Einfluss auf unsere Messergebnissen bestimmen. Weiterhin
ist in kleineren Gefäßen eine höhere Anzahl an Leukozyten an den Gefäßwänden temporär
adhärent. Fiebig et al. haben festgestellt, dass eine Reduktion von 5µm zu einer Verdopplung
der Anzahl der rollenden Leukozyten führt (149). In unserem Versuch untersuchten wir
Gefäße mit einem Durchmesser zwischen 25-40 µm, allerdings nicht die Verteilung der
Durchmesser auf die verschiedenen Versuchsgruppen, sodass wir auch hier eine mögliche
Beeinflussung unserer Ergebnisse nicht erfassen konnten.
57
Abraham et al. konnten mittels ihrer Untersuchungen nachweisen, dass es während der Sepsis
zu einer vermehrte Einwanderung von Leukozyten in die Organe kommt (150,151). Die
erhöhte Anzahl an Leukozyten trägt zum Versagen der Mikrozirkulation bei, was einer der
Hauptursachen für die Entwicklung einer Organdysfunktion ist (61). Donati et al. haben
nachgewiesen, dass die Gabe von aPC die Mikrozirkulation während der schweren Sepsis
verbessert, ein Grund dafür könnte die APC-induzierte reduzierte Leukozytenadhärenz sein
(104,136,152). Wenn weniger Leukozyten am Endothel anhaften ist dies auch ein indirekter
Nachweis für eine verminderte Aktivierung von Endothelzellen und Leukozyten.
5.1.2.2 Fest-adhärente Leukozyten
Neben den temporär adhärenten Leukozyten konnten wir zum Messzeitpunkt 0 auch fest
adhärente Leukozyten an den Gefäßwänden feststellen. Auch hierfür könnte die Ursache die
weiter oben beschriebene versuchsbedingte Traumatisierung des Gewebes sein. Wir konnten
nachweisen, dass aPC während der Endotoxinämie die Anzahl der fest adhärenten
Leukozyten an der Gefäßwand vermindert. Damit bestätigen wir die Ergebnisse anderer
Autoren und unserer Arbeitsgruppe (139,140).
Um eine feste Bindung mit dem Endothel eingehen zu können, müssen die Leukozyten
aktiviert werden (153). In mehreren Versuchen konnte gezeigt werden, dass aPC die
Aktivierung von Leukozyten verringert (104,152). Die Adhäsionsmoleküle, die die feste
Adhärenz der Leukozyten an die Gefäßwand vermitteln, sind die Integrine und deren
Liganden, die CAMs. Wie im vorherigen Kapitel dargestellt, führt aPC über eine Reihe von
direkten und indirekten Mechanismen zu einer verminderten Aktivierung von Leukozyten und
Endothelzellen und damit zu einer geringeren Expression von ICAM und VCAM (122).
Elphick et al. konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass aPC direkt an die β1- und β3-
Integrine auf der Oberfläche von neutrophilen Granulozyten bindet und somit ihre feste
Bindung und Migration vermindert (154). Weiterhin wurde nachgewiesen, dass aPC die
Reaktion von Lymphozyten, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten auf chemotaktische
Signale, die die Migration von Leukozyten in die Gewebe steuern, vermindert (155,156). Die
Leukozyten an den Gefäßwänden produzieren Enzyme und reaktive Sauerstoff- und
Stickstoffspezies, die das Endothel weiter schädigen können und damit zum Versagen der
Mikrozirkulation beitragen können. Aus diesen Gründen ist davon auszugehen, dass eine
Reduktion der Anzahl fest adhärenter Leukozyten zu einem günstigeren Verlauf der Sepsis
beiträgt.
58
5.2 Laborparameter
Laktat 5.2.1
Die Laktatkonzentration im Blut ist ein wichtiger prognostischer Faktor für die Behandlung
einer Sepsis und korreliert mit der Schwere der Erkrankung und der Mortalität (157). Laktat
entsteht, wenn die Organe nicht genügend Sauerstoff erhalten und die Zellen auf den
anaeroben Stoffwechsel zur Energiegewinnung umstellen. Während einer Sepsis kommt es
oftmals zu einer erhöhten Laktatkonzentration im Blut, diese entsteht durch eine verstärkte
Laktatproduktion aufgrund einer gestörten Sauerstoffversorgung auf makro- und
mikrohämodynamischer Ebene sowie einer gestörten Sauerstoffverwertung auf zellulärer
Ebene. Zusätzlich kann der Abbau des Laktats durch die Leber, Niere und Skelettmuskulatur
vermindert sein (157,158).
In unserer Versuchsreihe konnten wir in der Kontroll- und aPC- Gruppe keine Veränderung
der Laktatkonzentration feststellen. In der LPS-Gruppe hingegen hatte sich die
Laktatkonzentration nach 2 Stunden verdreifacht. Auch bei der aPC+LPS-Gruppe konnten
wir nach 120 Minuten eine Erhöhung der Laktatkonzentration feststellen, diese fiel jedoch
signifikant niedriger aus als in LPS-Gruppe.
De Backer et al. konnten in ihrer Studie am Menschen ebenfalls feststellen, dass die Gabe von
aPC bei Endotoxinämie eine Reduktion der Laktatkonzentration bewirkt (137). Ob aPC eine
direkte Auswirkung auf die Produktion oder die Clearance von Laktat hat ist nicht bekannt.
Severin et al. haben im Rattenmodell festgestellt, dass vor allem die Clearance von Laktat bei
Endotoxinämie eingeschränkt ist, da bedingt durch die eingeschränkte Durchblutung weniger
Laktat von den Organen aufgenommen werden kann (159). Da wir, wie oben ausgeführt, eine
aPC bedingte Stabilisierung der Makro- und Mikrozirkulation festgestellt haben, lässt sich
vermuten, dass diese Stabilisierung die Laktatclearance verbessert hat. Durch die
Stabilisierung der Mikrozirkulation wird zusätzlich eine bessere Sauerstoffversorgung der
Organe erreicht, was dazu führt, dass weniger Laktat produziert wird. Eine weitere, von der
Sauerstoffversorgung der Organe unabhängige Laktatquelle sind die Leukozyten, Haji-
Michael et al. haben nachweisen können, dass bei Endotoxinämie die Leukozyten eine
signifikante Menge Laktat produzieren (160). Die von uns bereits diskutierte verminderte
Aktivierung und Rekrutierung von Leukozyten durch aPC könnte somit ebenfalls zur
Verminderung der Laktatkonzentration beitragen.
59
Eine erhöhte Laktatkonzentration alleine ist jedoch kein verlässlicher Indikator für eine
Gewebshypoxie und kann den Zustand der Mikrozirkulation nicht verlässlich abbilden (161).
Zytokine 5.2.2
5.2.2.1 TNF-α
In unserem Versuch stieg nach LPS-Gabe die TNF-α Konzentration nach 120 Minuten stark
an. In vielen Versuchen an Menschen und Tieren konnte nach Gabe von Endotoxin ein
Anstieg der Plasmaspiegel von TNF-α verzeichnet werden, der nach 90 Minuten sein
Maximum erreichte (42,162-164). In der mit aPC behandelten LPS- Gruppe war die TNF-α
Konzentration nach 120 Minuten sogar etwas höher als in der LPS-Gruppe, was konträr zur
derzeitigen Studienlage ist.
Aktiviertes Protein C inhibiert die Produktion von TNF-α indem es die Translokation von NF-
κB in den Zellkern verhindert. NF-κB wird bei Aktivierung aus dem Zytosol in den Zellkern
überführt, wo er zu einer vermehrten Transkription von inflammatorischen Mediatoren wie
TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 und ICAM führt (165). In mehreren in vitro- und in vivo-Studien
wurde nachgewiesen, dass aPC die LPS-induzierte Aktivierung von NF-κB in Monozyten
reduziert (102,166,167). Die Inhibition von NF-κB scheint in vivo zu einer höheren
Überlebenswahrscheinlichkeit, nicht nur bei Endotoxinsepsis, sondern auch bei
polymikrobieller Sepsis, zu führen (168). Fibrin und Fibrinogen verstärken die Expression
von TNF-α, die fibrinolytische Wirkung von aPC könnte demnach ebenfalls eine
Verringerung der TNF-α Konzentration bewirken (81).
Die verminderte Ausschüttung von pro-inflammatorischen Mediatoren durch aPC bedeutet
eine direkte Wirkung auf die Entstehung der Entzündungsreaktion. Neben den direkten
Wirkungen von TNF-α, wie zum Beispiel die Aktivierung der Abwehrzellen und der
Koagulation, hat dieses Zytokin eine besondere Bedeutung für den Verlauf einer Sepsis (169).
Indem es Makrophagen zur Ausschüttung weiterer Zytokine, Lipid-Mediatoren und reaktiver
Sauerstoffspezies stimuliert, fungiert es als Hauptaktivator der weiteren Zytokinkaskade und
der pro-inflammatorischen Ausrichtung der Immunantwort (40). Die TNF-α Konzentration
korreliert beim Menschen mit der Schwere und dem Ausgang einer Sepsis, was die
Vermutung nahe legt, dass eine Reduktion dieses Zytokins einen günstigeren
Krankheitsverlauf bedingen könnte (41). Es muss aber beachtet werden, dass Zytokine sehr
wichtig sind für die Abwehr von Mikroorganismen und dass die Behandlung mit spezifischen
60
TNF-α-Antikörpern im Rahmen einer Sepsistherapie keine Reduktion der Mortalität erzielen
konnte (30,170). Bei der menschlichen Endotoxinämie konnte kein Wirkung von aPC auf die
Konzentration von TNF-α nachgewiesen werden (112,171). In unserer Versuchsreihe haben
wir lediglich die globale Konzentration von TNF-α im Blut bestimmt, weswegen wir keine
Aussage über Veränderungen in der lokalen TNF-α-Konzentration machen können. Da es
sich bei der Sepsis um ein sehr komplexes Krankheitsbild handelt, dessen Pathophysiologie
noch nicht vollständig erforscht ist, lässt sich kein abschließendes Urteil fällen, ob eine
Änderung der TNF-α Konzentration positive oder negative Effekte hat.
5.2.2.2 IL-1β
IL-1β ist ein weiterer Mediator, welcher von aktivierten Makrophagen und Endothelzellen am
Anfang der Zytokinkaskade freigesetzt wird. In den Gruppen, die kein LPS verabreicht
bekommen hatten, veränderte sich die Konzentration von IL-1β nicht. Die Gabe von LPS
hingegen verursachte einen Anstieg der IL-1β Konzentration um den Faktor 10. In unserem
Versuch konnten wir zeigen, dass aPC die Konzentration von IL-1β während der
Endotoxinämie deutlich reduziert. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der gegenwärtigen
Studienlage am Rattenmodell, Keller et al. konnten zum Beispiel nach der Gabe von aPC
während einer Endotoxinämie ebenfalls eine deutliche Reduktion von IL-1β feststellen (172).
Auch beim Menschen konnte eine Verminderung der IL-1β-Konzentration durch die Gabe
von aPC nachgewiesen werden (173).
Die Reduktion der IL-1β-Konzentration kann auf die aPC bedingte Hemmung des
Transkriptionsfaktors NF-κB zurückgeführt werden (167). Auch die fibrinolytische Funktion
von aPC führt zu Verminderung der Fibrin und Fibrinogen bedingten Produktion von IL-1β
(174). Während der Sepsis hat IL-1β einen inhibitorischen Effekt auf die Aktivierung von
Protein C. IL-1β vermindert die Produktion von EPCR und Thrombomodulin, zwei
membranständige Enzyme die potente Aktivatoren der Konversion von Protein C in seine
aktivierte Form sind. EPCR vermittelt zudem viele zelluläre Wirkungen von aktiviertem
Protein C (87). IL-1β vermindert die Konzentration von Thrombomodulin und des EPCR auf
zellulärer Ebene, indem es die Transkription herabsetzt. Weiterhin wird der auf den
Endothelzellen membranständige EPCR freigesetzt, in dieser Form ist seine Wirkung
vermindert (82). Somit lässt sich vermuten, dass die aPC bedingte Verminderung der IL-1β
Produktion auch die Freisetzung und Wirkung des körpereigenen aPC verstärkt.
61
IL-1β ist ein proximales Zytokin, das die Immunantwort des Körpers aktiviert und reguliert.
Deshalb hat IL-1β, wie TNF-α, eine Schlüsselrolle in der Pathophysiologie der Sepsis inne
(40). Es ist davon auszugehen, dass die verminderte Ausschüttung von IL-1β den Verlauf der
Sepsis positiv beeinflusst, da im Mausmodell bei Applikation eines Rezeptorantagonisten von
IL-1 (IL-1ra) eine höhere Überlebenswahrscheinlichkeit festgestellt werden konnte (175), Es
war allerdings nicht möglich diese Ergebnisse beim Menschen zu reproduzieren (176). Bei
der rheumatischen Arthritis, einer chronisch inflammatorischen Krankheit, hat sich die Gabe
von IL-1ra jedoch als Therapie etabliert (177).
5.2.2.3 Interleukin- 6
Ein wichtiger distaler Mediator der Sepsis ist das Interleukin-6, dessen Produktion von TNF-α
und IL-1β stimuliert wird (178).
In unserem Versuch konnten wir keinen Effekt von aPC auf die Produktion von IL-6 während
der Endotoxinämie zeigen. Die Wirkung von aPC auf die IL-6 Konzentration ist in der
Literatur noch umstritten. Iba et al. haben bei einer Versuchsanordnung, die unserer ähnlich
ist, eine und drei Stunden nach aPC-Gabe eine deutliche Reduktion der IL-6 Konzentration
gemessen, jedoch wurde eine deutlich geringere LPS-Dosis verwendet (139). Derhaschnig
und Kalil et al. haben bei der menschlichen Endotoxinämie keinen Einfluss von aPC auf die
IL-6-Konzentration nachgewiesen (171,179). Im Gegensatz dazu wurde in der PROWESS-
Studie bei septischen Patienten eine signifikante Reduktion der IL-6-Konzentration durch aPC
festgestellt (180).
Mehrere in vivo-Studien haben gezeigt, dass aPC die Produktion von IL-6 in den
Endothelzellen großer Gefäße und Keratinozyten erhöht, während es die Produktion in den
Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und Endothelzellen der Mikrozirkulation
vermindert (173,181-183). Die Ausschalten des IL-6-Gens im Mausmodell machte die
Versuchstiere resistenter gegenüber pulmonaler und abdomineller Inflammation (184,185). In
anderen in vivo-Studien konnte ebenfalls ein protektiver Effekt von IL-6 während der
Endotoxinämie nachgewiesen werden (186). Während einer Meningokokkensepsis ist IL-6 an
der Entstehung der myokardialen Depression beteiligt, die zu einem zirkulatorischen Schock
und kritischer Organperfusion führen kann (187). Die derzeitige Studienlage lässt keine
eindeutigen Schlüsse zu, ob eine Reduktion der IL-6-Konzentration einen positiven Einfluss
auf den Verlauf einer Sepsis hat. Allerdings haben mehrere Studien die Validität von IL-6 als
62
diagnostischen und prognostischen Marker der Sepsis beim menschlichen Erwachsenen und
Neonaten belegt (46,188,189).
5.2.2.4 Interleukin-10
Produktion und Wirkung pro-inflammatorischer Zytokine hemmt und damit zu
hämodynamischer Stabilität und der verminderten Aktivierung der Leukozyten und des
Endothels beiträgt (190-192).
In allen untersuchten Gruppen konnte ein Anstieg der IL-10-Konzentration gemessen werden.
Der Anstieg von IL-10 in der Kontrollgruppe nach 120 Minuten kann auf das
Operationstrauma und die dadurch entstandene inflammatorische Reaktion zurückgeführt
werden (193). In der nur mit aPC behandelten Gruppe stieg die IL-10-Konzentration nach 120
Minuten signifikant an. Weiterhin stellten wir fest, dass sich die IL-10-Konzentration bei der
mit aPC und LPS behandelten Gruppe nicht signifikant von der LPS- Gruppe unterschied.
Lehmann et al. haben bei einem ähnlichen Versuch eine signifikante Erhöhung der IL-10
Konzentration durch die Gabe von aPC bei Endotoxinämie feststellen können (140). Lehmann
und Fijen et al. haben die maximale Konzentration von IL-10 drei Stunden nach LPS-Gabe
gemessen, da wir unser Experiment schon früher beendet haben, ist zu vermuten, dass wir
diesen möglichen Effekt nicht messen konnten (140,194).
Die Applikation von aPC erhöht die Konzentration von IL-10 im Blut, indem es die
Produktion von IL-10 durch LPS-stimulierte Makrophagen induziert (195). Makrophagen
produzieren mehr pro-inflammatorische Mediatoren, wenn sie durch LPS oder den Mediator
Interferon-gamma (IFN-γ) stimuliert werden, aPC und IL-10 hingegen vermindern diese
Reaktion der Makrophagen (196). Eine Erhöhung der IL-10 Konzentration führt im
Mausmodell bei Endotoxinämie zu einer deutlich erhöhten Überlebenswahrscheinlichkeit. In
Modellen der polymikrobiellen Sepsis scheint IL-10 jedoch eher negative Effekte zu haben
(197,198). Einige Autoren gehen davon aus, dass IL-10 in der Anfangsphase der Sepsis durch
seine anti-inflammatorische Wirkung protektiv wirkt, in der Spätphase allerdings zur
Immunsuppression beiträgt, die wesentlich für die Mortalität verantwortlich ist, sodass der
Zeitpunkt der IL-10-Wirkung von Bedeutung ist (198,199).
63
5.3 Hämodynamische Parameter
Mittlerer arterieller Blutdruck 5.3.1
Der mittlere arterielle Blutdruck (MAP) ist eines der diagnostischen Kriterien der Sepsis. Ein
mittlerer arterieller Blutdruck von unter 70 mmHg oder ein Abfall vom Ausgangswert um 40
mmHg wird als pathologisch angesehen (200). Der Blutdruckabfall während einer Sepsis wird
auf eine verminderte Wirksamkeit vasokonstriktorischer Mediatoren zurückgeführt, welche
durch eine vermehrte Produktion von Stickstoffmonoxid (NO), dem potentesten Vasodilatator
des Organismus, verursacht wird (201-203).
Während unseres Versuchs konnten wir in allen Gruppen außer der Kontrollgruppe einen
Abfall des MAP feststellen. In der Kontrollgruppe lag der MAP über den kompletten
Zeitraum des Experiments konstant bei durchschnittlich 125 mmHg, während in den anderen
Gruppen 30 Minuten nach Medikamentenapplikation ein Abfall auf durchschnittlich 100
mmHg zu beobachten war, der bis zum Ende des Experiments anhielt. Lehmann et al.
konnten bei einem vergleichbaren Versuch mit Gabe der gleichen LPS-Dosis einen ähnlich
starken MAP-Abfall in den beiden mit LPS behandelten Gruppen feststellen, allerdings
normalisierten sich diese Werte und entsprachen nach drei Stunden wieder den
Ausgangswerten (140). Wir konnten eine mögliche Rückkehr zu den Ausgangswerten nicht
beobachten, da wir unsere letzte Messung zwei Stunden nach Endotoxingabe durchgeführt
haben. Allerdings befanden sich die MAP-Werte in einem akzeptablen, unteren
Referenzbereich, sodass kein septischer Schock mehr vorlag. De Backer et al. konnten beim
Menschen 4 Stunden nach aPC-Gabe eine Erhöhung des Blutdrucks feststellen, was ebenfalls
über unseren Beobachtungszeitraum hinausgeht (137).
In der nur mit aPC behandelten Gruppe verzeichneten wir ebenfalls einen Abfall des
Blutdruckes nach Medikamentenapplikation, der jedoch von anderen Untersuchungen nicht
bestätigt wird.
Die Stabilisierung des Blutdrucks durch aPC ist umstritten. Während Derhaschnig et al.
keinen Einfluss feststellen konnten, haben Kalil et al. bei gesunden Probanden eine Inhibition
des Endotoxin-vermittelten Blutdruckabfalls nachgewiesen (171,179). Bei Patienten im
septischen Schock hatte aPC einen stabilisierenden Einfluss auf den MAP, was die
Notwendigkeit von Vasopressorengaben reduzierte (204).
64
Die blutdruckstabilisierende Wirkung von aPC wird auf Verbesserung der Mikrozirkulation,
Myokardfunktion und Reaktivität der Widerstandsgefäße zurückgeführt. Die Applikation von
aPC bei Endotoxinämie führt zu einer verminderten Produktion von Stickstoffmonoxid, bei
dem es sich um einen potenten Vasodilatator der Widerstandsgefäße handelt (205). Zytokine,
wie TNF-α und IL-1β, induzieren über NF-κB die vermehrte Expression von iNOS, aPC
vermindert die Aktivität von NF-κB und könnte somit auch die Expression von iNOS
reduzieren (202). Weiterhin bildet Stickstoffmonoxid mit dem von Leukozyten produzierten
Superoxid das Peroxynitrit (206). Sowohl NO als auch Peroxynitrit tragen zur myokardialen
Dysfunktion bei Endotoxinämie bei indem sie die Sauerstoffverwertung in den Mitochondrien
der Herzmuskelzellen stören (207). Sennoun et al. konnten im Rattenmodell nachweisen, dass
die Gabe von aPC die Myokardfunktion erhält (208). Beim Menschen konnte ebenfalls ein
positiver Effekt von aPC auf die Myokardfunktion bei gleichzeitiger Gabe von Dexamethason
nachgewiesen werden (209). Die von uns gezeigte Verminderung der Plasmaextravasation
und der Leukozyten-Endothel-Interaktion könnte ebenfalls zu einer Verbesserung des MAP
aufgrund einer Verbesserung der Mikrozirkulation beitragen (136,137). Auch wenn es sich
beim MAP um einen Marker der Makrohämodynamik handelt, der nicht mit der Funktion der
Mikrozirkulation korreliert, hat sich doch gezeigt, dass eine Stabilisierung des Blutdrucks das
Outcome verbessert, was ein wichtiges Ziel in der Behandlung der Sepsis darstellt (210).
Herzfrequenz 5.3.2
Ein weiteres Kriterium der Sepsis beim Menschen ist der Anstieg der Herzfrequenz auf über
90 Schläge pro Minute (beats per minute, bpm). Die hämodynamischen Veränderungen, wie
Herzfrequenz und Blutdruck, dienen auch als Kontrolle der Effektivität des
Endotoxinmodells.
Wir konnten in beiden mit LPS behandelten Gruppen einen signifikanten Anstieg der
Herzfrequenz messen. Sowohl die Kontroll-, als auch die aPC-Gruppe hatten während des
gesamten Versuches eine durchschnittliche Herzfrequenz von 400 Schlägen pro Minuten. In
der LPS-Gruppe konnte nach zwei Stunden ein ausgeprägter Anstieg auf 500 bpm verzeichnet
werden. In der mit aPC behandelten LPS-Gruppe stieg die Herzfrequenz zuerst wie in der
LPS-Gruppe an, nach 120 Minuten jedoch waren die Werte mit durchschnittlich 450 bpm
signifikant niedriger als bei der Endotoxinämiegruppe.
Der Anstieg der Herzfrequenz nach LPS-Gabe wird von vielen Untersuchungen bestätigt.
Abhängig von der applizierten LPS-Menge stellt sich eine hyper- oder hypodyname
65
Kreislaufsituation ein. Die von uns verwendete Dosis führt zu dem Bild eines hypodynamen
Schocks (105,140,211). In der Literatur konnten wir kein Beispiel finden indem ein Einfluss
von aPC auf die Herzfrequenz beschrieben wurde. Die von uns beobachtete signifikante
Reduktion der Herzfrequenz kann z.B. auf den Einfluss der Zytokine auf das autonome
Nervensystem zurückgeführt werden.
Llaguno et al. haben festgestellt, dass bei Parasitämie die freigesetzten Zytokine das
autonome Nervensystem beeinträchtigen, was zu einer verminderten Aktivität des Nervus
vagus führt (212). Die Verminderung der Zytokinproduktion durch aPC könnte also zu einer
verminderten Herzfrequenz führen, allerdings wurde ein kausaler Zusammenhang zwischen
diesen beiden Faktoren noch nicht untersucht. Eine niedrigere Herzfrequenz kann auch
Ausdruck des besseren Blutdrucks sein, da eine bessere Füllung des Ventrikels nach dem
Frank-Starling-Mechanismus zu einer niedrigeren Herzfrequenz führt.
Eine Reduktion der Herzfrequenz ist von Vorteil, denn eine hohe Herzfrequenz bedeutet mehr
Arbeit für das Herz und damit einen höheren Sauerstoffverbrauch. Hält die erhöhte Arbeit des
Herzens an, kann es zu einer Erschöpfung des Myokards und zu einem Herzversagen
kommen.
Atemfrequenz 5.3.3
Unter septischen Bedingungen ist häufig eine Veränderung der Atemfrequenz zu beobachten,
sodass eine Tachypnoe mit mehr als 20 Atemzügen pro Minute oder ein Abfall des arteriellen
CO2 unter 32 mmHg als Zeichen der Hyperventilation beim Menschen als ein Sepsiskriterium
gesehen wird. Die erhöhte Atemfrequenz ist dabei ein Kompensationsmechanismus für die
latente metabolische Azidose (213).
In der Kontroll- und aPC-Gruppe konnten wir während des gesamten Versuchszeitraums
keine Veränderung der Atemfrequenz messen. Unter Endotoxinämie entstand im Vergleich
zur Kontroll- und aPC-Gruppe ein starker Anstieg der Atemfrequenz, jedoch konnten wir bei
der mit aPC behandelten LPS-Gruppe einen signifikant niedrigeren Anstieg messen als in der
LPS-Gruppe.
Unter entzündlichen Bedingungen wird die Atemfrequenz durch vagale Afferenzen der Lunge
und arterielle Chemorezeptoren gesteuert. Die Chemorezeptoren reagieren dabei auf
Veränderungen von CO2, O2 und des Säure- Base- Haushalt, während die vagalen Afferenzen
durch entzündliche Prozesse und pulmonalarteriellen Embolien ausgelöst werden können.
Tang et al. haben im Rattenmodell festgestellt, dass die vagalen Afferenzen
66
hauptverantwortlich für die Erhöhung der Atemfrequenz während der Sepsis sind und die
arteriellen Chemorezeptoren gegenregulieren. Es wird vermutet, dass entzündliche
Mediatoren wie TNF-α, Bradykinin und Thromboxan für die Stimulation der vagalen
Afferenzen verantwortlich sind (213). Die von aPC über NF-κB vermittelte verminderte
Produktion von entzündlichen Mediatoren könnte damit zur Reduktion der Atemfrequenz
während der Endotoxinämie beigetragen haben. Die oben besprochene Reduktion der
Laktatkonzentration und damit der metabolischen Azidose kann ebenfalls dazu beitragen,
dass die Atemfrequenz niedriger ist.
Temperatur 5.3.4
Ein Anstieg der Körpertemperatur über 38°C gilt als ein Sepsiskriterium (2). In allen Gruppen
konnte während des Experimentes eine Veränderung der Körpertemperatur festgestellt
werden. In der Kontrollgruppe stieg die Temperatur 30 Minuten nach Beginn an und sank
nach 90 Minuten wieder auf den Ausgangswert ab. Die Temperatur in den anderen Gruppen
stieg kontinuierlich. Die Gabe von Endotoxin führte zu einer Erhöhung der Temperatur, die
Applikation von aPC bei Endotoxinämie verminderte den Anstieg jedoch signifikant.
Der Temperaturanstieg in der Kontroll- und aPC-Gruppe lässt sich durch das
Operationstrauma erklären.
Bei Endotoxin handelt es sich um sogenanntes exogenes Pyrogen, also um eine
fieberauslösende Substanz. Dieses führt über die Aktivierung der Abwehrzellen zur
Produktion einer Reihe von endogenen Pyrogenen wie TNF-α, IL-1 und IL-6 (39,214).
Endogene Pyrogene verursachen die Bildung von Prostaglandin E2 im Gehirn, welches zu
einer direkten Erhöhung der Körpertemperatur führt (214). Es ist umstritten, ob sich eine
erhöhte Körpertemperatur positiv oder negativ auf den Verlauf einer Sepsis auswirkt (215).
Die antipyretische Wirkung von aPC kann dadurch erklärt werden, dass, wie oben bereits
ausgeführt, die Supprimierung von NF-κB zu einer verminderten Synthese von Zytokinen
führt, welche auch als endogene Pyrogene fungieren.
Die manuelle Regulation der Temperatur des Versuchsaufbaus stellt jedoch wahrscheinlich
die größte Einschränkung bei der Interpretation des Temperaturverlaufs dar.
67
5.4 Limitationen
Die Ergebnisse aus dem von uns verwendeten Tiermodell können nur bedingt auf den
Menschen übertragen werden, da das Endotoxinmodell die Komplexität der menschlichen
Sepsis nur beschränkt darstellen kann und es signifikante Unterschiede zwischen einem
tierischen und einem menschlichen Organismus gibt (216).
Die Bolusapplikation von Endotoxin führt zu einer ausgeprägten Entzündungsreaktion,
während bei septischen Prozessen ein stetiger entzündlicher Reiz vorherrscht (217). Anstatt
einer massiven Freisetzung von bakteriellen Bestandteilen und damit von entzündlichen
Mediatoren, wird bei einer Infektion eine deutlich niedrigere Konzentration an bakteriellen
Bestandteilen freigesetzt, was auch zu einer deutlich niedrigeren Konzentration von
Mediatoren wie TNF-α und IL-1 führt (217). Es werden verschiedene Serotypen von
Endotoxin in der Forschung verwendet, deren Eigenschaften sehr verschieden sein können.
Nedrebo et al. haben zum Beispiel für die Serotypen 0127:B8 und 0111:B4 zwar eine gleiche
hämodynamische Wirkung, jedoch deutliche Unterschiede in der Plasmaextravasation
festgestellt (218). Da es beim Endotoxinmodell keinen Fokus gibt, der durch die Abwehr
bekämpft werden kann, überwiegt die schädigende Wirkung der induzierten
inflammatorischen Reaktion auf die Organe (219). Der therapeutische Effekt von anti-
inflammatorische Substanzen wie aPC oder Zytokinantagonisten könnte deshalb übertrieben
dargestellt werden. Es ging in unserem Versuch darum, die Wirkungsweise von aPC genauer
zu untersuchen, die Effektivität von aPC bei der Behandlung der Sepsis war nicht Gegenstand
dieser Arbeit. Wir untersuchten die Wirkung von aPC auf die Mikrozirkulation um neue
therapeutische Ansätze zu finden und Patientengruppen zu identifizieren, die von aPC
profitieren könnten.
Seok et al. haben herausgefunden, dass die Genexpression von Mäusen und Menschen bei
Endotoxinämie nicht miteinander korreliert. Es sind noch keine Genanalysen durchgeführt
worden, die die Genexpression von Ratten und Menschen unter inflammatorischen
Bedingungen vergleichen, die Ergebnisse von Seok et al. lassen aber vermuten, dass es
signifikante Unterschiede gibt und die Übertragbarkeit unserer Ergebnisse beschränkt ist.
Andere Sepsismodelle, wie zum Beispiel die Punktion und Ligatur des Zökums (CLP) oder
die Colon-ascendens-Stent-Peritonitis (CASP), sind realitätsnäher, besitzen jedoch auch
Limitationen (216).
Bei den von uns verwendeten Versuchstieren unterschied sich der Verlauf der Sepsis im
Vergleich zum Menschen, da Ratten deutlich resistenter gegenüber Endotoxin sind. Im
68
Vergleich zum Menschen, bei dem die Sepsis vermehrt im höheren Alter auftritt, waren
unsere Versuchstiere außerdem relativ jung und wiesen keine signifikanten Komorbidäten auf
(216). Wir beobachteten die Versuchstiere lediglich 2 Stunden nach LPS-Gabe, um die
Wirkung von aPC auf die Mikrozirkulation im Endotoxinschock zu untersuchen. Oft stellt
sich im Verlauf der Sepsis eine Immunsuppression, mit einem Überwiegen von anti-
inflammatorischen Mediatoren und erhöhter Apoptose, ein. Ob aPC einen Effekt auf diese
späte Phase hat, konnten wir jedoch nicht untersuchen (31).
Bei dem von uns verwendeten aktivierten Protein C handelte es sich um humanes
rekombinantes aktiviertes Protein C, weswegen anzunehmen ist, dass unsere Ergebnisse durch
Speziesunterschiede beeinflusst worden sind. Malm et al. haben in ihren Versuchen
Unterschiede in der antikoagulatorischen Funktion von humanem aPC bei Ratten festgestellt
(220).
Wir applizierten aPC als Bolus von 2 mg pro Kilogramm Körpergewicht, bei der Behandlung
der Sepsis beim Menschen wird aPC als kontinuierliche Infusion von 24 µg pro Kilogramm
Körpergewicht pro Stunde über einen Zeitraum von 96 Stunden verabreicht, um einen
gleichbleibenden aPC-Spiegel im Blut zu gewährleisten (180). Die einmalige Bolusgabe hat
eine andere Pharmakokinetik als eine kontinuierliche Gabe und könnte so unsere Ergebnisse
und ihre Übertragbarkeit beeinflussen. In der Literatur konnten wir nur pharmakokinetische
Studien an Mäusen und Meerschweinen finden, hier zeigte sich nach einmaliger Bolusgabe
ein rapider Anstieg der Plasmakonzentration nach 15 Minuten und anschließend ein
exponentieller Abfall der Plasmakonzentration, sodass nach 24 Stunden kein aPC mehr
nachzuweisen war (221,222). Da wir lediglich einen Zeitraum von 2 Stunden beobachteten,
nehmen wir an, dass die Konzentration von aPC im Blut ausreichend war, um die
supraphysiologischen Konzentrationen zu erreichen, die auch bei der Behandlung des
Menschen angestrebt werden.
Die Applikation von aPC folgte direkt auf die Gabe von LPS, dies entspricht nicht dem
normalen Verlauf einer schweren Sepsis, da ein entzündlicher Prozess oft schon Stunden oder
Tage vorliegt, bevor die Indikation für eine Behandlung mit aPC gestellt wird.
Dank der Intravitalmikroskopie ist es möglich, komplexe Zellinteraktionen in vivo
darzustellen (223). Nachteile dieser Methode sind Atmungs- und Bewegungsartefakte des
lebenden Versuchstieres, die fehlende Visualisierung von Strukturen aufgrund geringer
Tiefenauflösung, Überdeckung, Bildrauschen und Zellschäden (224).
69
Die Auslagerung des Mesenteriums führt zu einer Entzündungsreaktion des ausgelagerten
Abschnitts, was die Anzahl an rollenden Leukozyten erhöhen kann, sodass die
Wahrscheinlichkeit besteht, dass unsere Ergebnisse bezüglich der Anzahl der temporär
adhärenten Leukozyten verfälscht sein könnte (49).
Des Weiteren besteht die Möglichkeit, dass die von uns verwendete Substanz zum Anfärben
des Plasmas und der Leukozyten ebenfalls das Ergebnis beeinflusst hat. Abbitt et al. haben
nachgewiesen, dass Rhodamin-6G die Geschwindigkeit und Migration von Leukozyten
beeinflusst (225).
70
6 Zusammenfassung
Obwohl große Fortschritte in der experimentellen und klinischen Intensivmedizin bezüglich
Pathophysiologie und Diagnose der Sepsis erzielt wurden, bleibt die Letalität weiter nahezu
unverändert hoch. Aufgrund einer immer länger lebenden, multimorbiden Bevölkerung, ist
damit zu rechnen, dass sich die Inzidenz immer weiter erhöht. Eine der Hauptursachen für die
Entwicklung einer Sepsis und eines Multiorganversagens ist das Versagen der
Mikrozirkulation, der Hauptort für den Gas- und Nährstoffaustausch.
Die Ursachen die zum Versagen der Mikrozirkulation führen sind vielfältig und umfassen das
dysfunktionale Endothel, die vermehrte Leukozyten-Endothel-Interaktion,
Gerinnungsstörungen und die Ausbildung von mikrovaskulären Shunts. Eine Verbesserung
der Mikrozirkulation scheint deshalb ein wichtiger therapeutischer Ansatz zu sein. Aktiviertes
Protein C hat neben seiner anti-koagulatorischen Funktion anti-inflammatorische, anti-
apoptotische und barrierestabilisierende Eigenschaften, die während einer Sepsis positiv auf
die Mikrozirkulation wirken.
Wir untersuchten welche Wirkung aPC auf die mesenteriale Mikrozirkulation hat, indem wir
die Plasmaextravasation und die Leukozyten-Endothel-Interaktionen beobachteten.
In unserem Versuch stellten wir fest, dass aPC die Anzahl temporärer und fest adhärenter
Leukozyten, sowie die Plasmaextravasation bei Endotoxinämie signifikant verringerte. Durch
die Gabe von aPC konnte die Freisetzung von IL-1β signifikant reduziert werden, während
wir eine Erhöhung der TNF-α Konzentration und keinen Einfluss auf die IL-6 und IL-10
Konzentration feststellen konnte.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass aktiviertes Protein C die Mikrozirkulation im Mesenterium
verbessert hat. Da die Mikrozirkulation in der Pathogenese der Sepsis eine wesentliche Rolle
spielt, lässt sich vermuten, dass aPC den Verlauf einer Sepsis positiv beeinflussen und somit
von Vorteil für die Patienten sein könnte.
71
7 Literaturverzeichnis
1. Botero J, Pérez M. The History of Sepsis from Ancient Egypt to the XIX Century. Edited by Luciano Azevedo. 2012.
2. Levy MM, Fink MP, Marshall JC, Abraham E, Angus D, Cook D, et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. 2003. pp. 1250–6.
3. Martin GS, Mannino DM, Eaton S, Moss M. The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000. N Engl J Med. 2003 Apr 17;348(16):1546–54.
4. Záhorec R, Firment J, Straková J, Mikula J, Malík P, Novák I, et al. Epidemiology of severe sepsis in intensive care units in the Slovak Republic. Infection. 2005 Jun;33(3):122–8.
5. Engel C, Brunkhorst FM, Bone H-G, Brunkhorst R, Gerlach H, Grond S, et al. Epidemiology of sepsis in Germany: results from a national prospective multicenter study. Intensive Care Med. 2007 Apr;33(4):606–18.
6. Brun-Buisson C, Meshaka P, Pinton P, Vallet B, EPISEPSIS Study Group. EPISEPSIS: a reappraisal of the epidemiology and outcome of severe sepsis in French intensive care units. Intensive Care Med. 2004 Apr;30(4):580–8.
7. Blanco J, Muriel-Bombín A, Sagredo V, Taboada F, Gandía F, Tamayo L, et al. Incidence, organ dysfunction and mortality in severe sepsis: a Spanish multicentre study. Crit Care. 2008;12(6):R158.
8. Martin GS, Mannino DM, Moss M. The effect of age on the development and outcome of adult sepsis. Crit Care Med. 2006 Jan;34(1):15–21.
9. Watson RS, Carcillo JA, Linde-Zwirble WT, Clermont G, Lidicker J, Angus DC. The epidemiology of severe sepsis in children in the United States. Am J Respir Crit Care Med. American Thoracic Society; 2003 Mar 1;167(5):695–701.
10. Angus DC, Wax RS. Epidemiology of sepsis: an update. Crit Care Med. 2001 Jul;29(7 Suppl):S109–16.
11. Hartman ME, Linde-Zwirble WT, Angus DC, Watson RS. Trends in the epidemiology of pediatric severe sepsis*. Pediatr Crit Care Med. 2013 Sep;14(7):686–93.
12. Moerer O, Quintel M. [Sepsis in adult patients - definitions, epidemiology and economic aspects]. Internist (Berl). 2009 Jul;50(7):788–790–4–796–8.
13. Angus DC, Linde-Zwirble WT, Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky MR. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med. 2001 Jun 22;29(7):1303–10.
72
14. Pietropaoli AP, Glance LG, Oakes D, Fisher SG. Gender differences in mortality in patients with severe sepsis or septic shock. Gend Med. 2010 Oct;7(5):422–37.
15. Mayr FB, Yende S, Angus DC. Epidemiology of severe sepsis. Virulence. 2014 Jan 1;5(1):4–11.
16. Vincent JL. EPIC II: sepsis around the world. Minerva Anestesiol. 2008 Jun;74(6):293–6.
17. Berkley JA, Maitland K, Mwangi I, Ngetsa C, Mwarumba S, Lowe BS, et al. Use of clinical syndromes to target antibiotic prescribing in seriously ill children in malaria endemic area: observational study. BMJ. BMJ Publishing Group Ltd; 2005 Apr 30;330(7498):995–0.
18. Chen X-C, Yang Y-F, Wang R, Gou H-F, Chen X-Z. Epidemiology and microbiology of sepsis in mainland China in the first decade of the 21(st) century. Int J Infect Dis. 2015 Feb;31:9–14.
19. Baharoon S, Al-Jahdali H, Hashmi Al J, Memish ZA, Ahmed QA. Severe sepsis and septic shock at the Hajj: etiologies and outcomes. Travel Med Infect Dis. 2009 Jul;7(4):247–52.
20. Weiss SL, Fitzgerald JC, Pappachan J, Wheeler D, Jaramillo-Bustamante JC, Salloo A, et al. Global Epidemiology of Pediatric Severe Sepsis: the Sepsis PRevalence, OUtcomes, and Therapies Study. Am J Respir Crit Care Med. 2015 Mar 3;:150303124249002.
21. Cohen J, Brun-Buisson C, Torres A, Jorgensen J. Diagnosis of infection in sepsis: an evidence-based review. Crit Care Med. 2004 Nov;32(11 Suppl):S466–94.
22. Vincent J-L, Rello J, Marshall J, Silva E, Anzueto A, Martin CD, et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. American Medical Association; 2009 Dec 2;302(21):2323–9.
23. Previsdomini M, Gini M, Cerutti B, Dolina M, Perren A. Predictors of positive blood cultures in critically ill patients: a retrospective evaluation. Croat Med J. 2012 Feb 15;53(1):30–9.
24. Heyland DK, Hopman W, Coo H, Tranmer J, McColl MA. Long-term health-related quality of life in survivors of sepsis. Short Form 36: a valid and reliable measure of health-related quality of life. Crit Care Med. 2000 Nov;28(11):3599–605.
25. Quartin AA, Schein RM, Kett DH, Peduzzi PN. Magnitude and duration of the effect of sepsis on survival. Department of Veterans Affairs Systemic Sepsis Cooperative Studies Group. JAMA. 1997 Apr 2;277(13):1058–63.
26. Winters BD, Eberlein M, Leung J, Needham DM, Pronovost PJ, Sevransky JE. Long-term mortality and quality of life in sepsis: a systematic review. Crit Care Med. 2010 May;38(5):1276–83.
27. Gaieski DF, Edwards JM, Kallan MJ, Carr BG. Benchmarking the incidence and mortality of severe sepsis in the United States. Crit Care Med. 2013 May;41(5):1167–74.
73
28. Elixhauser A, Friedman B, Stranges E. Septicemia in U.S. Hospitals, 2009: Statistical Brief #122. Rockville (MD): Agency for Health Care Policy and Research (US); 2006.
29. Schmid A, Burchardi H, Clouth J, Schneider H. Burden of illness imposed by severe sepsis in Germany. Eur J Health Econ. 2002;3(2):77–82.
30. Bone RC, Grodzin CJ, Balk RA. Sepsis: a new hypothesis for pathogenesis of the disease process. Chest. 1997 Jul;112(1):235–43.
31. Oberholzer A, Oberholzer C, Moldawer LL. Sepsis syndromes: understanding the role of innate and acquired immunity. Shock. 2001 Aug;16(2):83–96.
32. Castellheim A, Brekke O-L, Espevik T, Harboe M, Mollnes TE. Innate immune responses to danger signals in systemic inflammatory response syndrome and sepsis. Scand J Immunol. Blackwell Publishing Ltd; 2009 Jun;69(6):479–91.
33. Beutler B. Science review: key inflammatory and stress pathways in critical illness - the central role of the Toll-like receptors. Crit Care. 2003 Feb;7(1):39–46.
34. Weber GF, Swirski FK. Immunopathogenesis of abdominal sepsis. Langenbecks Arch Surg. Springer Berlin Heidelberg; 2014 Jan;399(1):1–9.
35. Weiterer S, Uhle F, Siegler BH, Lichtenstern C, Bartkuhn M, Weigand MA. [Epigenetic regulation in sepsis : current state of knowledge]. Anaesthesist. Springer Berlin Heidelberg; 2015 Jan;64(1):42–55.
36. Cavaillon J-M, Adib-Conquy M. Monocytes/macrophages and sepsis. Crit Care Med. 2005 Dec;33(12 Suppl):S506–9.
37. Kawai T, Akira S. TLR signaling. Cell Death Differ. 2006 May;13(5):816–25.
38. Watson RW, Redmond HP, Bouchier-Hayes D. Role of endotoxin in mononuclear phagocyte-mediated inflammatory responses. J Leukoc Biol. 1994 Jul;56(1):95–103.
39. Oberholzer A, Oberholzer C, Moldawer LL. Cytokine signaling--regulation of the immune response in normal and critically ill states. Crit Care Med. 2000 Apr;28(4 Suppl):N3–12.
40. Schulte W, Bernhagen J, Bucala R. Cytokines in sepsis: potent immunoregulators and potential therapeutic targets--an updated view. Mediators Inflamm. 2013;2013:165974.
41. Blackwell TS, Christman JW. Sepsis and cytokines: current status. Br J Anaesth. 1996 Jul;77(1):110–7.
42. Michie HR, Manogue KR, Spriggs DR, Revhaug A, O'Dwyer S, Dinarello CA, et al. Detection of circulating tumor necrosis factor after endotoxin administration. N Engl J Med. 1988 Jun 9;318(23):1481–6.
43. Tracey KJ, Cerami A. Tumor necrosis factor: a pleiotropic cytokine and therapeutic target. Annu Rev Med. 1994;45:491–503.
74
44. Dinarello CA. Biologic basis for interleukin-1 in disease. Blood. 1996 Mar 15;87(6):2095–147.
45. Nandi D, Mishra MK, Basu A, Bishayi B. Protective effects of interleukin-6 in lipopolysaccharide (LPS)-induced experimental endotoxemia are linked to alteration in hepatic anti-oxidant enzymes and endogenous cytokines. Immunobiology. Elsevier; 2009 Sep 19;:1–9.
46. Jekarl DW, Lee S-Y, Lee J, Park Y-J, Kim Y, Park JH, et al. Procalcitonin as a diagnostic marker and IL-6 as a prognostic marker for sepsis. Diagn Microbiol Infect Dis. Elsevier; 2013 Apr;75(4):342–7.
47. van der Poll T, Levi M, Hack CE, Cate ten H, van Deventer SJ, Eerenberg AJ, et al. Elimination of interleukin 6 attenuates coagulation activation in experimental endotoxemia in chimpanzees. J Exp Med. 1994 Apr 1;179(4):1253–9.
48. Latifi SQ, O'Riordan MA, Levine AD. Interleukin-10 controls the onset of irreversible septic shock. Infect Immun. 2002 Aug;70(8):4441–6.
49. Granger DN, Senchenkova E. Inflammation and the Microcirculation. San Rafael (CA): Morgan & Claypool Life Sciences; 2010.
50. Hotchkiss RS, Coopersmith CM, Karl IE. Prevention of lymphocyte apoptosis--a potential treatment of sepsis? Clin Infect Dis. Oxford University Press; 2005 Nov 15;41 Suppl 7(Supplement 7):S465–9.
51. Neto HAP, Kubes P. Platelets, endothelium and shear join forces to mislead neutrophils in sepsis. Crit Care. 2011;15(1):103.
52. Jimenez MF, Watson RW, Parodo J, Evans D, Foster D, Steinberg M, et al. Dysregulated expression of neutrophil apoptosis in the systemic inflammatory response syndrome. Arch Surg. 1997 Dec;132(12):1263–9–discussion1269–70.
53. Cinel I, Dellinger RP. Advances in pathogenesis and management of sepsis. Curr Opin Infect Dis. 2007 Aug;20(4):345–52.
54. Huber-Lang MS, Younkin EM, Sarma JV, McGuire SR, Lu KT, Guo R-F, et al. Complement-induced impairment of innate immunity during sepsis. J Immunol. 2002 Sep 15;169(6):3223–31.
55. Phua J, Badia JR, Adhikari NKJ, Friedrich JO, Fowler RA, Singh JM, et al. Has mortality from acute respiratory distress syndrome decreased over time?: A systematic review. Am J Respir Crit Care Med. American Thoracic Society; 2009 Feb 1;179(3):220–7.
56. Erickson SE, Martin GS, Davis JL, Matthay MA, Eisner MD, NIH NHLBI ARDS Network. Recent trends in acute lung injury mortality: 1996-2005. Crit Care Med. 2009 May;37(5):1574–9.
57. Maeder M, Fehr T, Rickli H, Ammann P. Sepsis-associated myocardial dysfunction: diagnostic and prognostic impact of cardiac troponins and natriuretic peptides. Chest. American College of Chest Physicians; 2006 May;129(5):1349–66.
75
58. Spronk PE, Zandstra DF, Ince C. Bench-to-bedside review: sepsis is a disease of the microcirculation. Crit Care. BioMed Central Ltd; 2004 Dec;8(6):462–8.
59. Fink MP. Bench-to-bedside review: Cytopathic hypoxia. Crit Care. 2002 Dec;6(6):491–9.
60. Tyagi A, Sethi AK, Girotra G, Mohta M. The microcirculation in sepsis. Indian J Anaesth. 2009 Jun;53(3):281–93.
61. Ince C. The microcirculation is the motor of sepsis. Crit Care. BioMed Central Ltd; 2005;9 Suppl 4(Suppl 4):S13–9.
62. Lehr HA, Bittinger F, Kirkpatrick CJ. Microcirculatory dysfunction in sepsis: a pathogenetic basis for therapy? J Pathol. John Wiley & Sons, Ltd; 2000 Feb;190(3):373–86.
63. Aird WC. The role of the endothelium in severe sepsis and multiple organ dysfunction syndrome. Blood. 2003 May 15;101(10):3765–77.
64. Ait-Oufella H, Maury E, Lehoux S, Guidet B, Offenstadt G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Med. Springer-Verlag; 2010 Aug;36(8):1286–98.
65. Lee MM, Schuessler GB, Chien S. Time-dependent effects of endotoxin on the ultrastructure of aortic endothelium. Artery. 1988;15(2):71–89.
66. Piagnerelli M, Boudjeltia KZ, Vanhaeverbeek M, Vincent JL. Red blood cell rheology in sepsis. Intensive Care Med. Springer-Verlag; 2003 Jul;29(7):1052–61.
67. Ley K, Laudanna C, Cybulsky MI, Nourshargh S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 2007 Sep;7(9):678–89.
68. Shattil SJ. Integrins and Src: dynamic duo of adhesion signaling. Trends Cell Biol. 2005 Aug;15(8):399–403.
69. Nooteboom A, van der Linden CJ, Hendriks T. Modulation of adhesion molecule expression on endothelial cells after induction by lipopolysaccharide-stimulated whole blood. Scand J Immunol. Blackwell Science Ltd; 2004 May;59(5):440–8.
70. Granger DN, Kubes P. The microcirculation and inflammation: modulation of leukocyte-endothelial cell adhesion. J Leukoc Biol. 1994 May;55(5):662–75.
71. Perry MA, Granger DN. Role of CD11/CD18 in shear rate-dependent leukocyte-endothelial cell interactions in cat mesenteric venules. J Clin Invest. 1991 May;87(5):1798–804.
72. Weiss SJ. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 1989 Feb 9;320(6):365–76.
73. Bone RC, Balk RA, Cerra FB, Dellinger RP, Fein AM, Knaus WA, et al. Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. The ACCP/SCCM Consensus Conference Committee. American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine. 1992. Chest. 2009. 1 p.
76
74. Kubes P, Suzuki M, Granger DN. Nitric oxide: an endogenous modulator of leukocyte adhesion. Proc Natl Acad Sci USA. 1991 Jun 1;88(11):4651–5.
75. Lüllmann-Rauch R, Paulsen F. Taschenlehrbuch Histologie. Georg Thieme Verlag; 2012. 1 p.
76. Goldenberg NM, Steinberg BE, Slutsky AS, Lee WL. Broken barriers: a new take on sepsis pathogenesis. Sci Transl Med. American Association for the Advancement of Science; 2011 Jun 22;3(88):88ps25–5.
77. Opal SM, van der Poll T. Endothelial barrier dysfunction in septic shock. J Intern Med. 2015 Mar;277(3):277–93.
78. Opal SM, Esmon CT. Bench-to-bedside review: functional relationships between coagulation and the innate immune response and their respective roles in the pathogenesis of sepsis. Crit Care. 2003 Feb;7(1):23–38.
79. Levi M, Poll TVD. Coagulation in patients with severe sepsis. Semin Thromb Hemost. Thieme Medical Publishers; 2015 Feb;41(1):9–15.
80. Esmon CT. Coagulation and inflammation. J Endotoxin Res. 2003;9(3):192–8.
81. Esmon CT. The interactions between inflammation and coagulation. Br J Haematol. Blackwell Science Ltd; 2005 Nov;131(4):417–30.
82. Esmon CT. The protein C pathway. Chest. 2003 Sep;124(3 Suppl):26S–32S.
83. Taylor FB, Chang A, Esmon CT, D'Angelo A, Vigano-D'Angelo S, Blick KE. Protein C prevents the coagulopathic and lethal effects of Escherichia coli infusion in the baboon. J Clin Invest. 1987 Mar;79(3):918–25.
84. Schouten M, Wiersinga WJ, Levi M, van der Poll T. Inflammation, endothelium, and coagulation in sepsis. J Leukoc Biol. 2008 Mar;83(3):536–45.
85. Shebuski RJ, Kilgore KS. Role of inflammatory mediators in thrombogenesis. J Pharmacol Exp Ther. 2002 Mar;300(3):729–35.
86. Burstein SA. Cytokines, platelet production and hemostasis. Platelets. Informa UK Ltd UK; 1997;8(2-3):93–104.
87. Esmon CT. Inflammation and the activated protein C anticoagulant pathway. Semin Thromb Hemost. 2006 Apr;32 Suppl 1:49–60.
88. Yan SB, Helterbrand JD, Hartman DL, Wright TJ, Bernard GR. Low levels of protein C are associated with poor outcome in severe sepsis. Chest. 2001 Sep;120(3):915–22.
89. Levi M, van der Poll T, Büller HR. Bidirectional relation between inflammation and coagulation. Circulation. Lippincott Williams & Wilkins; 2004 Jun 8;109(22):2698–704.
90. Liaw PCY, Esmon CT, Kahnamoui K, Schmidt S, Kahnamoui S, Ferrell G, et al. Patients with severe sepsis vary markedly in their ability to generate activated protein C. Blood. 2004 Dec 15;104(13):3958–64.
77
91. DelGiudice LA, White GA. The role of tissue factor and tissue factor pathway inhibitor in health and disease states. J Vet Emerg Crit Care (San Antonio). Blackwell Publishing Inc; 2009 Feb;19(1):23–9.
92. van der Poll T, Levi M, Büller HR, van Deventer SJ, de Boer JP, Hack CE, et al. Fibrinolytic response to tumor necrosis factor in healthy subjects. J Exp Med. 1991 Sep 1;174(3):729–32.
93. Oelschläger C, Römisch J, Staubitz A, Stauss H, Leithäuser B, Tillmanns H, et al. Antithrombin III inhibits nuclear factor kappaB activation in human monocytes and vascular endothelial cells. Blood. 2002 Jun 1;99(11):4015–20.
94. Souter PJ, Thomas S, Hubbard AR, Poole S, Römisch J, Gray E. Antithrombin inhibits lipopolysaccharide-induced tissue factor and interleukin-6 production by mononuclear cells, human umbilical vein endothelial cells, and whole blood. Crit Care Med. 2001 Jan;29(1):134–9.
95. Kaneider NC, Egger P, Dunzendorfer S, Wiedermann CJ. Syndecan-4 as antithrombin receptor of human neutrophils. Biochem Biophys Res Commun. 2001 Sep 14;287(1):42–6.
96. Myles T, Nishimura T, Yun TH, Nagashima M, Morser J, Patterson AJ, et al. Thrombin activatable fibrinolysis inhibitor, a potential regulator of vascular inflammation. J Biol Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology; 2003 Dec 19;278(51):51059–67.
97. Conway EM, Van de Wouwer M, Pollefeyt S, Jurk K, Van Aken H, De Vriese A, et al. The lectin-like domain of thrombomodulin confers protection from neutrophil-mediated tissue damage by suppressing adhesion molecule expression via nuclear factor kappaB and mitogen-activated protein kinase pathways. J Exp Med. 2002 Sep 2;196(5):565–77.
98. Mosnier LO, Zlokovic BV, Griffin JH. The cytoprotective protein C pathway. Blood. 2007 Apr 15;109(8):3161–72.
99. Szaba FM, Smiley ST. Roles for thrombin and fibrin(ogen) in cytokine/chemokine production and macrophage adhesion in vivo. Blood. 2002 Feb 1;99(3):1053–9.
100. Stenflo J. A new vitamin K-dependent protein. Purification from bovine plasma and preliminary characterization. J Biol Chem. 1976 Jan 25;251(2):355–63.
101. Griffin JH, Evatt B, Zimmerman TS, Kleiss AJ, Wideman C. Deficiency of protein C in congenital thrombotic disease. J Clin Invest. 1981 Nov;68(5):1370–3.
102. White B, Schmidt M, Murphy C, Livingstone W, O'Toole D, Lawler M, et al. Activated protein C inhibits lipopolysaccharide-induced nuclear translocation of nuclear factor kappaB (NF-kappaB) and tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) production in the THP-1 monocytic cell line. Br J Haematol. 2000 Jul;110(1):130–4.
103. Hancock WW, Tsuchida A, Hau H, Thomson NM, Salem HH. The anticoagulants protein C and protein S display potent antiinflammatory and immunosuppressive effects relevant to transplant biology and therapy. Transplant Proc. 1992 Oct;24(5):2302–3.
78
104. Murakami K, Okajima K, Uchiba M, Johno M, Nakagaki T, Okabe H, et al. Activated protein C prevents LPS-induced pulmonary vascular injury by inhibiting cytokine production. Am J Physiol. 1997 Feb;272(2 Pt 1):L197–202.
105. Xu D, Qi L, Guillory D, Cruz N, Berg R, Deitch EA. Mechanisms of endotoxin-induced intestinal injury in a hyperdynamic model of sepsis. J Trauma. 1993 May;34(5):676–82–discussion682–3.
106. Bernard GR, Vincent JL, Laterre PF, LaRosa SP, Dhainaut JF, Lopez-Rodriguez A, et al. Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis. N Engl J Med. 2001 Mar 8;344(10):699–709.
107. Abraham E, Laterre P-F, Garg R, Levy H, Talwar D, Trzaskoma BL, et al. Drotrecogin alfa (activated) for adults with severe sepsis and a low risk of death. N Engl J Med. 2005 Sep 29;353(13):1332–41.
108. Nadel S, Goldstein B, Williams MD, Dalton H, Peters M, Macias WL, et al. Drotrecogin alfa (activated) in children with severe sepsis: a multicentre phase III randomised controlled trial. Lancet. 2007 Mar 10;369(9564):836–43.
109. Vincent J-L, Bernard GR, Beale R, Doig C, Putensen C, Dhainaut J-F, et al. Drotrecogin alfa (activated) treatment in severe sepsis from the global open-label trial ENHANCE: further evidence for survival and safety and implications for early treatment. Crit Care Med. 2005 Oct;33(10):2266–77.
110. Ranieri VM, Thompson BT, Barie PS, Dhainaut J-F, Douglas IS, Finfer S, et al. Drotrecogin alfa (activated) in adults with septic shock. N Engl J Med. 2012 May 31;366(22):2055–64.
111. Martí-Carvajal AJ, Solà I, Lathyris D, Cardona AF. Human recombinant activated protein C for severe sepsis. Cochrane Database Syst Rev. 2012;3:CD004388.
112. Kalil AC, LaRosa SP. Effectiveness and safety of drotrecogin alfa (activated) for severe sepsis: a meta-analysis and metaregression. Lancet Infect Dis. 2012 Sep;12(9):678–86.
113. Lai PS, Thompson BT. Why activated protein C was not successful in severe sepsis and septic shock: are we still tilting at windmills? Curr Infect Dis Rep. Springer US; 2013 Oct;15(5):407–12.
114. van Lambalgen AA, van den Bos GC, Thijs LG. Changes in regional plasma extravasation in rats following endotoxin infusion. Microvasc Res. 2003 Oct 29;34(1):116–32.
115. Zeng W, Matter WF, Yan SB, Um SL, Vlahos CJ, Liu L. Effect of drotrecogin alfa (activated) on human endothelial cell permeability and Rho kinase signaling. Crit Care Med. 2004 May;32(5 Suppl):S302–8.
116. Feistritzer C, Riewald M. Endothelial barrier protection by activated protein C through PAR1-dependent sphingosine 1-phosphate receptor-1 crossactivation. Blood. 2005 Apr 15;105(8):3178–84.
117. Xiong Y, Hla T. S1P control of endothelial integrity. Curr Top Microbiol Immunol.
79
Cham: Springer International Publishing; 2014;378(Chapter 4):85–105.
118. Garcia JG, Liu F, Verin AD, Birukova A, Dechert MA, Gerthoffer WT, et al. Sphingosine 1-phosphate promotes endothelial cell barrier integrity by Edg-dependent cytoskeletal rearrangement. J Clin Invest. American Society for Clinical Investigation; 2001 Sep;108(5):689–701.
119. Chelazzi C, Villa G, Mancinelli P, De Gaudio AR, Adembri C. Glycocalyx and sepsis-induced alterations in vascular permeability. Crit Care. BioMed Central Ltd; 2015 Dec;19(1):741.
120. Marechal X, Favory R, Joulin O, Montaigne D, Hassoun S, Decoster B, et al. Endothelial glycocalyx damage during endotoxemia coincides with microcirculatory dysfunction and vascular oxidative stress. Shock. 2008 May;29(5):572–6.
121. Oberholzer C, Oberholzer A, Clare-Salzler M, Moldawer LL. Apoptosis in sepsis: a new target for therapeutic exploration. FASEB J. 2001 Apr;15(6):879–92.
122. Joyce DE, Grinnell BW. Recombinant human activated protein C attenuates the inflammatory response in endothelium and monocytes by modulating nuclear factor-kappaB. Crit Care Med. 2002 May;30(5 Suppl):S288–93.
123. Yi ES, Ulich TR. Endotoxin, interleukin-1, and tumor necrosis factor cause neutrophil-dependent microvascular leakage in postcapillary venules. Am J Pathol. 1992 Mar;140(3):659–63.
124. Kurose I, Suematsu M, Miura S, Fukumura D, Sekizuka E, Nagata H, et al. Oxyradical generation from leukocytes during endotoxin-induced microcirculatory disturbance in rat mesentery--attenuating effect of cetraxate. Toxicol Appl Pharmacol. 1993 May;120(1):37–44.
125. Walther A, Weihrauch M, Schmidt W, Gebhard MM, Martin E, Schmidt H. Leukocyte-independent plasma extravasation during endotoxemia. Crit Care Med. 2000 Aug;28(8):2943–8.
126. Walther A, Czabanka M, Gebhard MM, Martin E. Glycoprotein IIB/IIIA-inhibition and microcirculatory alterations during experimental endotoxemia--an intravital microscopic study in the rat. Microcirculation. 2004 Jan;11(1):79–88.
127. Pu Q, Wiel E, Corseaux D, Bordet R, Azrin MA, Ezekowitz MD, et al. Beneficial effect of glycoprotein IIb/IIIa inhibitor (AZ-1) on endothelium in Escherichia coli endotoxin-induced shock. Crit Care Med. 2001 Jun;29(6):1181–8.
128. Kirschenbaum LA, McKevitt D, Rullan M, Reisbeck B, Fujii T, Astiz ME. Importance of platelets and fibrinogen in neutrophil-endothelial cell interactions in septic shock. Crit Care Med. 2004 Sep;32(9):1904–9.
129. Walther A, Peter C, Secchi A, Gebhard MM, Martin E, Schmidt H. Selective serotonin receptor antagonism and leukocyte-independent plasma extravasation during endotoxemia. Microvasc Res. 2002 Jan;63(1):135–8.
130. Brueckmann M, Horn S, Lang S, Fukudome K, Schulze Nahrup A, Hoffmann U, et al. Recombinant human activated protein C upregulates cyclooxygenase-2 expression
80
in endothelial cells via binding to endothelial cell protein C receptor and activation of protease-activated receptor-1. Thromb Haemost. 2005 Apr;93(4):743–50.
131. Weiss HJ, Turitto VT. Prostacyclin (prostaglandin I2, PGI2) inhibits platelet adhesion and thrombus formation on subendothelium. Blood. 1979 Feb;53(2):244–50.
132. Kubes P, Gaboury JP. Rapid mast cell activation causes leukocyte-dependent and -independent permeability alterations. Am J Physiol. 1996 Dec;271(6 Pt 2):H2438–46.
133. Makarova AM, Rusanova AV, Gorbacheva LR, Umarova BA, Strukova SM. Effect of activated protein C on secretory activity of rat peritoneal mast cells. Bull Exp Biol Med. 2006 Oct;142(4):403–5.
134. Yuan Y, Granger HJ, Zawieja DC, Chilian WM. Flow modulates coronary venular permeability by a nitric oxide-related mechanism. Am J Physiol. 1992 Aug;263(2 Pt 2):H641–6.
135. Zilberberg J, Harris NR. Role of shear and leukocyte adherence on venular permeability in the rat mesentery. Microvasc Res. 2001 Nov;62(3):215–25.
136. Donati A, Damiani E, Botticelli L, Adrario E, Lombrano MR, Domizi R, et al. The aPC treatment improves microcirculation in severe sepsis/septic shock syndrome. BMC Anesthesiol. BioMed Central Ltd; 2013;13(1):25.
137. De Backer D, Verdant C, Chierego M, Koch M, Gullo A, Vincent J-L. Effects of drotrecogin alfa activated on microcirculatory alterations in patients with severe sepsis. Crit Care Med. 2006 Jul;34(7):1918–24.
138. Adams DH, Shaw S. Leucocyte-endothelial interactions and regulation of leucocyte migration. Lancet. 1994 Apr 2;343(8901):831–6.
139. Iba T, Kidokoro A, Fukunaga M, Nagakari K, Shirahama A, Ida Y. Activated protein C improves the visceral microcirculation by attenuating the leukocyte-endothelial interaction in a rat lipopolysaccharide model. Crit Care Med. 2005 Feb;33(2):368–72.
140. Lehmann C, Meissner K, Knöck A, Diedrich S, Pavlovic D, Gründling M, et al. Activated protein C improves intestinal microcirculation in experimental endotoxaemia in the rat. Crit Care. 2006;10(6):R157.
141. Miura S, Tsuzuki Y, Kurose I, Suematsu M, Shigematsu T, Kimura H, et al. Endotoxin stimulates lymphocyte-endothelial interactions in rat intestinal Peyer's patches and villus mucosa. Am J Physiol. 1996 Aug;271(2 Pt 1):G282–92.
142. Hoffmann JN, Vollmar B, Laschke MW, Inthorn D, Fertmann J, Schildberg FW, et al. Microhemodynamic and cellular mechanisms of activated protein C action during endotoxemia. Crit Care Med. 2004 Apr;32(4):1011–7.
143. Abraham E. Effects of recombinant human activated protein C in human models of endotoxin administration. Proc Am Thorac Soc. American Thoracic Society; 2005;2(3):243–7.
144. Esmon CT. Protein C anticoagulant system--anti-inflammatory effects. Semin Immunopathol. 2012 Jan;34(1):127–32.
81
145. Joyce DE, Gelbert L, Ciaccia A, DeHoff B, Grinnell BW. Gene expression profile of antithrombotic protein c defines new mechanisms modulating inflammation and apoptosis. J Biol Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology; 2001 Apr 6;276(14):11199–203.
146. Sturn DH, Kaneider NC, Feistritzer C, Djanani A, Fukudome K, Wiedermann CJ. Expression and function of the endothelial protein C receptor in human neutrophils. Blood. 2003 Aug 15;102(4):1499–505.
147. Grinnell BW, Hermann RB, Yan SB. Human protein C inhibits selectin-mediated cell adhesion: role of unique fucosylated oligosaccharide. Glycobiology. 1994 Apr;4(2):221–5.
148. Moazzam F, DeLano FA, Zweifach BW, Schmid-Schönbein GW. The leukocyte response to fluid stress. Proc Natl Acad Sci USA. 1997 May 13;94(10):5338–43.
149. Fiebig E, Ley K, Arfors KE. Rapid leukocyte accumulation by “spontaneous” rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery. Int J Microcirc Clin Exp. 1991 May;10(2):127–44.
150. Abraham E. Neutrophils and acute lung injury. Crit Care Med. 2003 Apr;31(4 Suppl):S195–9.
151. Abraham E, Carmody A, Shenkar R, Arcaroli J. Neutrophils as early immunologic effectors in hemorrhage- or endotoxemia-induced acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2000 Dec;279(6):L1137–45.
152. Mizutani A, Okajima K, Uchiba M, Noguchi T. Activated protein C reduces ischemia/reperfusion-induced renal injury in rats by inhibiting leukocyte activation. Blood. 2000 Jun 15;95(12):3781–7.
153. Ley K. Molecular mechanisms of leucocyte rolling and adhesion to microvascular endothelium. Eur Heart J. 1993 Nov;14 Suppl I:68–73.
154. Elphick GF, Sarangi PP, Hyun Y-M, Hollenbaugh JA, Ayala A, Biffl WL, et al. Recombinant human activated protein C inhibits integrin-mediated neutrophil migration. Blood. 2009 Apr 23;113(17):4078–85.
155. Feistritzer C, Sturn DH, Kaneider NC, Djanani A, Wiedermann CJ. Endothelial protein C receptor-dependent inhibition of human eosinophil chemotaxis by protein C. J Allergy Clin Immunol. 2003 Aug;112(2):375–81.
156. Feistritzer C, Mosheimer BA, Sturn DH, Riewald M, Patsch JR, Wiedermann CJ. Endothelial protein C receptor-dependent inhibition of migration of human lymphocytes by protein C involves epidermal growth factor receptor. J Immunol. 2006 Jan 15;176(2):1019–25.
157. James JH, Luchette FA, McCarter FD, Fischer JE. Lactate is an unreliable indicator of tissue hypoxia in injury or sepsis. Lancet. 1999 Aug 7;354(9177):505–8.
158. Michaeli B, Martinez A, Revelly J-P, Cayeux M-C, Chioléro RL, Tappy L, et al. Effects of endotoxin on lactate metabolism in humans. Crit Care. BioMed Central Ltd; 2012;16(4):R139.
82
159. Severin PN, Uhing MR, Beno DWA, Kimura RE. Endotoxin-induced hyperlactatemia results from decreased lactate clearance in hemodynamically stable rats. Crit Care Med. 2002 Nov;30(11):2509–14.
160. Haji-Michael PG, Ladrière L, Sener A, Vincent JL, Malaisse WJ. Leukocyte glycolysis and lactate output in animal sepsis and ex vivo human blood. Metab Clin Exp. 1999 Jun;48(6):779–85.
161. De Backer D. Lactic acidosis. Minerva Anestesiol. 2003 Apr;69(4):281–4.
162. Cannon JG, Tompkins RG, Gelfand JA, Michie HR, Stanford GG, van der Meer JW, et al. Circulating interleukin-1 and tumor necrosis factor in septic shock and experimental endotoxin fever. J Infect Dis. 1990 Jan;161(1):79–84.
163. Suffredini AF, Fromm RE, Parker MM, Brenner M, Kovacs JA, Wesley RA, et al. The cardiovascular response of normal humans to the administration of endotoxin. N Engl J Med. 1989 Aug 3;321(5):280–7.
164. Hesse DG, Tracey KJ, Fong Y, Manogue KR, Palladino MA, Cerami A, et al. Cytokine appearance in human endotoxemia and primate bacteremia. Surg Gynecol Obstet. 1988 Feb;166(2):147–53.
165. DiDonato J, Mercurio F, Rosette C, Wu-Li J, Suyang H, Ghosh S, et al. Mapping of the inducible IkappaB phosphorylation sites that signal its ubiquitination and degradation. Mol Cell Biol. 1996 Apr;16(4):1295–304.
166. Yuksel M, Okajima K, Uchiba M, Horiuchi S, Okabe H. Activated protein C inhibits lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-alpha production by inhibiting activation of both nuclear factor-kappa B and activator protein-1 in human monocytes. Thromb Haemost. 2002 Aug;88(2):267–73.
167. Okajima K. Regulation of inflammatory responses by natural anticoagulants. Immunol Rev. 2001 Dec;184:258–74.
168. O'Sullivan AW, Wang JH, Redmond HP. NF-κB and P38 MAPK Inhibition Improve Survival in Endotoxin Shock and in a Cecal Ligation and Puncture Model of Sepsis in Combination With Antibiotic Therapy. YJSRE. Elsevier Inc; 2009 Mar 1;152(1):46–53.
169. Parameswaran N, Patial S. Tumor necrosis factor-α signaling in macrophages. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 2010;20(2):87–103.
170. Reinhart K, Karzai W. Anti-tumor necrosis factor therapy in sepsis: update on clinical trials and lessons learned. Crit Care Med. 2001 Jul;29(7 Suppl):S121–5.
171. Derhaschnig U, Reiter R, Knöbl P, Baumgartner M, Keen P, Jilma B. Recombinant human activated protein C (rhAPC; drotrecogin alfa [activated]) has minimal effect on markers of coagulation, fibrinolysis, and inflammation in acute human endotoxemia. Blood. 2003 Sep 15;102(6):2093–8.
172. Keller SA, Moore CC, Evans SL, McKillop IH, Huynh T. Activated protein C alters inflammation and protects renal function in sepsis. J Surg Res. 2011 Jun 1;168(1):e103–9.
83
173. Baltch AL, Bopp LH, Ritz WJ, Michelsen PB, Yan SB, Um S, et al. Effect of recombinant human activated protein C on the bactericidal activity of human monocytes and modulation of pro-inflammatory cytokines in the presence of antimicrobial agents. J Antimicrob Chemother. 2007 Jun;59(6):1177–81.
174. Perez RL, Roman J. Fibrin enhances the expression of IL-1 beta by human peripheral blood mononuclear cells. Implications in pulmonary inflammation. J Immunol. 1995 Feb 15;154(4):1879–87.
175. Alexander HR, Doherty GM, Venzon DJ, Merino MJ, Fraker DL, Norton JA. Recombinant interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra): effective therapy against gram-negative sepsis in rats. Surgery. 1992 Aug;112(2):188–93–discussion193–4.
176. Opal SM, Fisher CJ, Dhainaut JF, Vincent JL, Brase R, Lowry SF, et al. Confirmatory interleukin-1 receptor antagonist trial in severe sepsis: a phase III, randomized, double-blind, placebo-controlled, multicenter trial. The Interleukin-1 Receptor Antagonist Sepsis Investigator Group. Crit Care Med. 1997 Jul;25(7):1115–24.
177. Fiocco U, Vezzù M, Cozzi L, Todesco S. [IL-1Ra (recombinant human IL-1 receptor antagonist) in the treatment of rheumatoid arthritis: the efficacy]. Reumatismo. 2004 Jan;56(1 Suppl 1):62–73.
178. Song M, Kellum JA. Interleukin-6. Crit Care Med. 2005 Dec;33(12 Suppl):S463–5.
179. Kalil AC, Coyle SM, Um JY, LaRosa SP, Turlo MA, Calvano SE, et al. Effects of drotrecogin alfa (activated) in human endotoxemia. Shock. 2004 Mar;21(3):222–9.
180. Bernard GR, Macias WL, Joyce DE, Williams MD, Bailey J, Vincent J-L. Safety assessment of drotrecogin alfa (activated) in the treatment of adult patients with severe sepsis. Crit Care. 2003 Apr;7(2):155–63.
181. Hooper WC, Phillips DJ, Renshaw MA, Evatt BL, Benson JM. The up-regulation of IL-6 and IL-8 in human endothelial cells by activated protein C. J Immunol. 1998 Sep 1;161(5):2567–73.
182. Franscini N, Bachli EB, Blau N, Leikauf M-S, Schaffner A, Schoedon G. Gene expression profiling of inflamed human endothelial cells and influence of activated protein C. Circulation. 2004 Nov 2;110(18):2903–9.
183. Galley HF, Sakka El NE, Webster NR, Lowes DA, Cuthbertson BH. Activated protein C inhibits chemotaxis and interleukin-6 release by human neutrophils without affecting other neutrophil functions. Br J Anaesth. 2008 Jun;100(6):815–9.
184. Cuzzocrea S, de Sarro G, Costantino G, Mazzon E, Laurà R, Ciriaco E, et al. Role of interleukin-6 in a non-septic shock model induced by zymosan. Eur Cytokine Netw. 1999 Jun;10(2):191–203.
185. Cuzzocrea S, Costantino G, Zingarelli B, Mazzon E, Micali A, Caputi AP. The protective role of endogenous glutathione in carrageenan-induced pleurisy in the rat. Eur J Pharmacol. 1999 May 14;372(2):187–97.
186. Xing Z, Gauldie J, Cox G, Baumann H, Jordana M, Lei XF, et al. IL-6 is an
84
antiinflammatory cytokine required for controlling local or systemic acute inflammatory responses. J Clin Invest. American Society for Clinical Investigation; 1998 Jan 15;101(2):311–20.
187. Pathan N, Franklin JL, Eleftherohorinou H, Wright VJ, Hemingway CA, Waddell SJ, et al. Myocardial depressant effects of interleukin 6 in meningococcal sepsis are regulated by p38 mitogen-activated protein kinase. Crit Care Med. 2011 Jul;39(7):1692–711.
188. Shahkar L, Keshtkar A, Mirfazeli A, Ahani A, Roshandel G. The role of IL-6 for predicting neonatal sepsis: a systematic review and meta-analysis. Iran J Pediatr. 2011 Dec;21(4):411–7.
189. Noor MK, Shahidullah M, Mutanabbi M, Barua C, Mannan MA, Afroza S. Comparison between CRP and IL-6 as early markers of neonatal sepsis. Mymensingh Med J. 2008 Jul;17(2 Suppl):S72–6.
190. Hickey MJ, Issekutz AC, Reinhardt PH, Fedorak RN, Kubes P. Endogenous interleukin-10 regulates hemodynamic parameters, leukocyte-endothelial cell interactions, and microvascular permeability during endotoxemia. Circ Res. 1998 Nov 30;83(11):1124–31.
191. Fiorentino DF, Zlotnik A, Vieira P, Mosmann TR, Howard M, Moore KW, et al. IL-10 acts on the antigen-presenting cell to inhibit cytokine production by Th1 cells. J Immunol. 1991 May 15;146(10):3444–51.
192. Fiorentino DF, Zlotnik A, Mosmann TR, Howard M, O'Garra A. IL-10 inhibits cytokine production by activated macrophages. J Immunol. 1991 Dec 1;147(11):3815–22.
193. Klava A, Windsor AC, Farmery SM, Woodhouse LF, Reynolds JV, Ramsden CW, et al. Interleukin-10. A role in the development of postoperative immunosuppression. Arch Surg. 1997 Apr;132(4):425–9.
194. Fijen J, Kobold A, de Boer P, Jones C, van der Werf TS, Tervaert J, et al. Leukocyte activation and cytokine production during experimental human endotoxemia. Eur J Intern Med. 2000 Apr;11(2):89–95.
195. Toltl LJ, Beaudin S, Liaw PC, Canadian Critical Care Translational Biology Group. Activated protein C up-regulates IL-10 and inhibits tissue factor in blood monocytes. J Immunol. 2008 Aug 1;181(3):2165–73.
196. Pereira C, Schaer DJ, Bachli EB, Kurrer MO, Schoedon G. Wnt5A/CaMKII signaling contributes to the inflammatory response of macrophages and is a target for the antiinflammatory action of activated protein C and interleukin-10. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2008 Mar;28(3):504–10.
197. Howard M, Muchamuel T, Andrade S, Menon S. Interleukin 10 protects mice from lethal endotoxemia. J Exp Med. 1993 Apr 1;177(4):1205–8.
198. Song GY, Chung CS, Chaudry IH, Ayala A. What is the role of interleukin 10 in polymicrobial sepsis: anti-inflammatory agent or immunosuppressant? Surgery. 1999 Aug;126(2):378–83.
85
199. Hotchkiss RS, Coopersmith CM, McDunn JE, Ferguson TA. The sepsis seesaw: tilting toward immunosuppression. Nat Med. 2009 May;15(5):496–7.
200. Levy MM, Fink MP, Marshall JC, Abraham E, Angus D, Cook D, et al. 2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS International Sepsis Definitions Conference. 2003. pp. 530–8.
201. Sessler CN, Shepherd W. New concepts in sepsis. Curr Opin Crit Care. 2002 Oct;8(5):465–72.
202. Szabó C, Mitchell JA, Thiemermann C, Vane JR. Nitric oxide-mediated hyporeactivity to noradrenaline precedes the induction of nitric oxide synthase in endotoxin shock. Br J Pharmacol. 1993 Mar;108(3):786–92.
203. Vallet B. Bench-to-bedside review: endothelial cell dysfunction in severe sepsis: a role in organ dysfunction? Crit Care. 2003 Apr;7(2):130–8.
204. Monnet X, Lamia B, Anguel N, Richard C, Bonmarchand G, Teboul JL. Rapid and beneficial hemodynamic effects of activated protein C in septic shock patients. Intensive Care Med. 2005 Nov;31(11):1573–6.
205. Isobe H, Okajima K, Uchiba M, Mizutani A, Harada N, Nagasaki A, et al. Activated protein C prevents endotoxin-induced hypotension in rats by inhibiting excessive production of nitric oxide. Circulation. 2001 Sep 4;104(10):1171–5.
206. Huie RE, Padmaja S. The reaction of no with superoxide. Free Radic Res Commun. 1993;18(4):195–9.
207. Lancel S, Tissier S, Mordon S, Marechal X, Depontieu F, Scherpereel A, et al. Peroxynitrite decomposition catalysts prevent myocardial dysfunction and inflammation in endotoxemic rats. J Am Coll Cardiol. 2004 Jun 16;43(12):2348–58.
208. Sennoun N, Nacira S, Meziani F, Dessebe O, Cattan V, Collin S, et al. Activated protein C improves lipopolysaccharide-induced cardiovascular dysfunction by decreasing tissular inflammation and oxidative stress. Crit Care Med. 2009 Jan;37(1):246–55.
209. Lemarie J, Blet A, Bouazza Y, Boisramé-Helms J, Meziani F, Levy B. Dexamethasone and recombinant human activated protein C improve myocardial function and efficiency during experimental septic shock. Shock. 2014 Jun;41(6):522–7.
210. Rivers E, Nguyen B, Havstad S, Ressler J, Muzzin A, Knoblich B, et al. Early goal-directed therapy in the treatment of severe sepsis and septic shock. N Engl J Med. 2001 Nov 8;345(19):1368–77.
211. Schmidt H, Schmidt W, Müller T, Böhrer H, Gebhard MM, Martin E. N-acetylcysteine attenuates endotoxin-induced leukocyte-endothelial cell adhesion and macromolecular leakage in vivo. Crit Care Med. 1997 May;25(5):858–63.
212. Llaguno M, Pertili LAR de R, da Silva MV, Bunazar P, Reges AM, Faleiros ACG, et al. The relationship between heart rate variability and serum cytokines in chronic chagasic patients with persistent parasitemia. Pacing Clin Electrophysiol. 2011
86
Jun;34(6):724–35.
213. Tang GJ, Kou YR, Lin YS. Peripheral neural modulation of endotoxin-induced hyperventilation. Crit Care Med. 1998 Sep;26(9):1558–63.
214. Harrison C. Sepsis: calming the cytokine storm. Nat Rev Drug Discov. 2010 May;9(5):360–1.
215. Schaffner A. [Fever--useful or noxious symptom that should be treated?]. Ther Umsch. 2006 Mar;63(3):185–8.
216. Dyson A, Singer M. Animal models of sepsis: why does preclinical efficacy fail to translate to the clinical setting? Crit Care Med. 2009 Jan;37(1 Suppl):S30–7.
217. Remick DG, Ward PA. Evaluation of endotoxin models for the study of sepsis. Shock. 2005 Dec;24 Suppl 1:7–11.
218. Nedrebø T, Reed RK. Different serotypes of endotoxin (lipopolysaccharide) cause different increases in albumin extravasation in rats. Shock. 2002 Aug;18(2):138–41.
219. Fink MP. Animal models of sepsis and its complications. Kidney Int. Nature Publishing Group; 2008 Oct;74(8):991–3.
220. Malm K, Arnljots B, Persson I-M, Dahlbäck B. Antithrombotic and anticoagulant effects of wild type and Gla-domain mutated human activated protein C in rats. Thromb Res. 2007;120(4):531–9.
221. Berger H, Kirstein CG, Orthner CL. Pharmacokinetics of activated protein C in guinea pigs. Blood. 1991 May 15;77(10):2174–84.
222. Ishii S, Mochizuki T, Nagao T, Kudo S, Fujita A, Taniguchi K, et al. Pharmacokinetics of human activated protein C. 2nd communication: tissue distribution study of a lyophilized purified human activated protein C after single or repeated intravenous administration in male mice and placental transfer and milk passage study after intravenous administration in pregnant and lactating mice. Arzneimittelforschung. 1995 May;45(5):644–56.
223. Gavins FNE. Intravital microscopy: new insights into cellular interactions. Curr Opin Pharmacol. 2012 Oct;12(5):601–7.
224. Gavins FNE, Chatterjee BE. Intravital microscopy for the study of mouse microcirculation in anti-inflammatory drug research: focus on the mesentery and cremaster preparations. J Pharmacol Toxicol Methods. 2004 Jan;49(1):1–14.
225. Abbitt KB, Rainger GE, Nash GB. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. J Immunol Methods. 2000 May 26;239(1-2):109–19.
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Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig verfasst und keine anderen
als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen wissenschaftlichen
Einrichtung vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine
Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Datum Unterschrift
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Lebenslauf
Angaben zur Person
Name: Michael Schade
Geburtsdatum 13.03.1983
Geburtsort: Greiz
Schulbildung
1989- 1993 Lambert- Steinwich Schule, Stralsund
1993- 2002 Goethe- Gymnasium, Stralsund
Zivildienst
2002- 2003 OP- Lagerungspfleger, Klinikum Stralsund
Studium
2003- 2009 Studium der Humanmedizin
Ernst- Moritz- Arndt- Universität Greifswald
Ärztliche Tätigkeit
2010- heute Assistenzarzt
Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin
Universitätsmedizin Mainz
Datum Unterschrift