aula hplc
TRANSCRIPT
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Cromatografia lquida
de alta eficincia
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O que cromatografia lquida?
A cromatografia fundamenta-se na migrao
diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido
a diferentes interaes entre duas fases imiscveis, sendo uma
fase fixa que tem uma grande rea superficial chamada fase
estacionria, e a outra um fluido que se move atravs da fase
estacionria sendo chamada de fase mvel. Na cromatografia
lquida a fase mvel lquida! (LANAS, 1993; DEGANI; CASS;
VIEIRA, 1998).
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Principio da cromatografia lquida
Tempo
AMOSTRA
Coluna
contendo fase
estacionria.
SOLVENTE
Ao da
gravidade!
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CROMATOGRAFIA LQUIDA
PLANAR
CCD CP CONVENCIONAL
COLUNA
HPLC
ADOSRO PARTIO INICA EXCLUSO
Tipos de cromatografia lquida:
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Primeiro, o que HPLC?
HPLC uma abreviao do nome em ingls : High Performance (Pressure) Liquid Cromatography.
Historia da HPLC:
- Dcada de 60 : O comeo da HPLC como High pressure LC!
- Dcada de 70 : Com a melhora do material da coluna e da
instrumentao, HPLC passa a ser High Performance LC!
- Dcada de 80: A partir dessa dcada houve um boom do HPLC
- 2006- Evoluo da tcnica: UPLC, RRLC, UFLC...
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Vantagens da HPLC
FE utilizada inmeras vezes.
Versatilidade: nico requisito a solubilidade na FM.
Tempo reduzido de anlise.
Alta resoluo.
Anlise qualitativa: tR , espectro de absoro no UV (DAD), MS.
Anlise quantitativa: desvios menores do que 5%.
Boa detectabilidade:
Absoro de UV-Vis de comprimento de onda varivel 10-10 g;
Fluorescncia: 10-12 g;
Automatizao
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Limitaes da HPLC
Alto custo do instrumento
Alto custo de manuteno
Alto custo de operao
Falta de detector universal sensvel
ndice de refrao: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco estvel.
Espectrmetro de massas: ~US$ 150.000,00
Necessidade de experincia no seu manuseio
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Como um HPLC comercial?
Reservatrios dos
solventes e
sistema de
degaseificao.
Bomba.
Injetor.
Coluna.
Detector.
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Instrumentao para HPLC
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Instrumentao para HPLC
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Reservatrio para a fase mvel
Filtro do reservatrio : Captar a fase mvel e evitar que partculas suspensas na FM obstruam
os capilares ou contaminem a bomba.
Filtros de 10 a 40 um
Limpeza peridica!!
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Caractersticas da fase mvel
Ser de alto grau de pureza ou fcil purificao
Dissolver a amostra sem decompor seus componentes
No decompor ou dissolver a fase estacionria
Ter baixa viscosidade
Compatvel com o tipo de detector
Polaridade adequada para permitir a separao dos componentes da amostra.
Degaseificao da FM:
Garanti a reprodutibilidade da vazo
Estabilidade da linha base.
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Mtodos de degaseificao
Ultrassom: Muito lento, pouco eficiente, requer agitao, em geral o pior mtodo quando usado sozinho
Vcuo + ultrassom: Rpido, eficiente, refazer a cada 12 hrs.
Purga com Hlio: Contnuo, hlio razoavelmente caro, leva a
aumento de vazamentos, maior custo operacional.
Degaseificador on-line: Contnuo, remove o ar logo antes de entrar na bomba, investimento alto inicial (melhor opo a longo prazo)
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Instrumentao para HPLC
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Sistema de bombeamento
Tm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutvel de FM para o
sistema cromatogrfico
REQUISITOS:
Ser de material inerte
Presses de at 6000 psi (~400 atm)
Vazo contnua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)
Vazes de 0,1 a 10 ml/min (aplicaes analticas)
Controle de vazo e reprodutibilidade melhor que 1 %
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Sistema de bombeamento
Tipos de bombas:
Pneumtica
Deslocamento
Recproca
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Bomba pneumtica
Vantagens:
Baixo custo
Livre de pulsaes
Desvantagens:
Baixa presso (at 2000 psi)
Baixo volume
No permite gradiente
Vazo depende da presso de retorno e viscosidade da fase mvel
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Bomba de deslocamento
Vantagens:
Vazo independe da presso de retorno e viscosidade da fase mvel
Livre de pulsaes
Desvantagens:
Baixo volume
No permite gradiente
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Bomba recproca
Vantagens:
Presso elevada (at 10 000 psi)
Pequeno volume interno (35 a 400 L)
Permite gradiente
Desvantagem:
Fluxo pulsado
Alto custo
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Sistema de bombeamento
Isocrtico :
+ A composio da fase mvel permanece constante ao longo da
anlise.
+ Capaz de separa um nmero limitado de analitos.
Gradiente
+ A composio da fase mvel varia durante a anlise.
+ Sistema aplicado com a polaridade dos compostos presentes
na amostra , muito diferente.
+ Separao de amostras complexas.
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Separao isocrtica e por gradiente
A eluio isocrtica feita com um nico solvente (ou mistura de
solventes). Se um solvente no propiciar uma eluio suficientemente
rpida de todos os componentes, ento pode ser utilizada uma eluio
por gradiente.
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Com base nas eluies isocrticas foi elaborado o gradiente a seguir.
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Instrumentao para HPLC
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INJEO MANUAL
- As amostras so introduzidas com seringas.
- Aps virar a ala, a amostra carregada pela fase mvel at o incio
da coluna.
AMOSTRADOR AUTOMTICO
- As amostras so postas em um frasco localizado
dentro do amostrador.
- O amostrador automtico :
1- Mede o volume correto para injeo.
2- Injeta a amostra.
3 Prepara o injetor para uma prxima amostra
Sistema de Injeo
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Sistema de Injeo Injetor Rheodyne Diagrama de fluxo
Bomba
Coluna
Bomba
Coluna
LO
AD
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Sobrecarga de Volume da amostra
Para aproveitar de todos os pratos que uma
colina possui, no se deve injetar um volume
maior que 1% do volume da coluna vazia.
(L)=(raio)2(comprimento)(0,01)
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Instrumentao para HPLC
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Coluna Geralmente em ao inox ( mais popular, maior presso)
+ Coluna de vidro reforado (at 600 psi, utilizada para biomoleculas)
+ PEEK polmero ( biocompatvel e quimicamente inerte com a maioria
dos solventes)
+ Preo: > US$ 200.00
Tipos de colunas
+ Analticas : dimetro interno (i.d) 1,0-4,6 mm, comprimento 15 - 250
mm.
+ Preparativas: i.d 4,6 mm, comprimento 50 -250 mm.
A escolha de uma coluna apropriada o ponto crtico para o sucesso
da anlise.
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Pr-coluna
Localizada entre o injetor e a coluna
Colunas de 2 a 5 cm, i.d igual ao da coluna.
Mesma FE da coluna de separao.
Protege a coluna
Custo reduzido
Pr-coluna!
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Fase estacionria.
+ As colunas so recheadas com partculas porosas com dimetro de 1,8 5 m.
+ Estas partculas porosas na coluna tm geralmente uma fase ligada
quimicamente sobre a sua superfcie, que interage com os componentes da
amostra para separ-los um do outro.
Coluna
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Condicionamento da Coluna
Necessrio para que haja um perfeito equilbrio
da FM e da FE.
Coluna nova: 4- 8 horas
Coluna parada h alguns dias: 2 horas
Coluna de uso dirio: 15 minutos.
Lembre-se: a coluna deve ser
guardada em solvente orgnico.
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LC com fase quimicamente ligada
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Sntese da FE.
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Modos de HPLC
HPLC
Partio Inica Excluso Adsoro
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Tipos de cromatografia lquida:
Adsoro: O mecanismo de separao: competio entre molculas da
amostra e da fase mvel em ocupar os stios ativos da fase estacionria,
slido. (Slica)
Fase estacionria (polar) afetada com frequncia pela
reteno de molculas de alta polaridade como lcoois, gua.
Partio: (CLL ou CFL) CLL: O mecanismo de separao: baseia-se nas diferentes
solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase
mvel e na fase estacionria.(slica purificada)
O maior inconveniente desta tcnica a solubilidade da fase
estacionria na fase mvel.
CFL: A fase estacionria est imobilizada por meio de ligaes
qumicas. (Normal ou Reversa)
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Fase normal x Fase reversa
Fase normal:
fase estacionria polar;
fase mvel apolar (n-alcanos, clorofrmio, acetato de etila);
solutos neutros;
polaridade soluto t. reteno;
mecanismo reteno: adsoro
Fase reversa:
fase estacionria apolar;
fase mvel polar (tampes, gua, metanol, acetonitrila, THF);
solutos apolares, no-inicos;
polaridade f. mvel t. reteno;
mecanismo reteno: interaes apolares com radicais da coluna.
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Fase Normal
Si
OH
silanol livre
Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-(CH3)2R + HCl
Ciano (-C2H4CN)
Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
Amina (C3H6NH2)
R =
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CROMATOGRAFIA DE FASE
NORMAL Nos trabalhos pioneiros usou-se fases altamente polares, como
gua e trietilenoglicol
adsorvidos sobre slica ou
alumina e solventes apolares,
como hexano ou ter
isoproplico, eram usados como
fase mvel; por razes histricas,
este tipo de cromatografia
chamado de fase normal
Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase mvel; aumentando a polaridade da fase mvel tem
o efeito de diminuir o tempo de eluio
Polaridade do soluto: a > b > c
c b a tempo
c b a tempo
Po
lari
dad
e d
a f
ase m
vel
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Fase reversa
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CROMATOGRAFIA DE FASE
REVERSA
Na cromatografia de fase reversa, a fase estacionria apolar, um
hidrocarboneto por exemplo (C18), e a
fase mvel relativamente polar
(gua, metanol, acetonitrila, etc)
Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior solubilidade na fase mvel; aumentando-se a polaridade da fase mvel aumenta-se
o tempo de eluio
Polaridade do soluto: a > b > c
a b c
tempo
a b c
tempo
Po
lari
dad
e d
a f
ase m
vel
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Efeito do comprimento da cadeia na
reteno.
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Tipos de cromatografia lquida:
Inica: A fase estacionria , normalmente, uma resina de poliestireno e
divinilbenzeno, a qual so ligados grupos inicos, como por exemplo,
-SO-3 trocadores fortes de ction
-CO-2 trocadores fracos de ction
-NR+3 trocadores fortes de nions
-NH2R+ trocadores fracos de nions
Os grupos inicos tm um contra-on (com carga oposta) que pode
ser deslocado pelos ons da fase mvel de carga similar a ele.
Excluso: A separao efetuada de acordo com o tamanho efetivo das
molculas.
A coluna recheada com matria inerte cujos poros tm tamanho
controlado. Onde, as molculas menores penetram a maioria dos poros.
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Instrumentao para HPLC
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Caractersticas de um detector
Sensibilidade e seletividade adequada
Ampla faixa linear
Baixo volume interno
Resposta Rpida
Boa estabilidade e reprodutibilidade
No destruir a amostra
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Baixo volume interno
O volume do detector a regio do fluxo cromatogrfico ao qual o detector responde.
Grande volume alargamento dos picos registrados.
Caractersticas de um detector
Resposta Rpida
O sistema de deteco deve idealmente apresentar um sinal que represente um exato instante de uma poro do caminho (volume do detector).
Detector lento picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.
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Caractersticas de um detector
Boa estabilidade e reprodutibilidade
Alta confiabilidade e facilidade de uso
No destruir a amostra para:
Permite coletar o eluato
Utilizar um segundo tipo de detector
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Um feixe de luz ultravioleta dirigido atravs de uma clula de fluxo e um sensor
mede a luz que passa atravs da clula.
Quando um composto que absorve a energia da luz elui da coluna, ocorrer uma
alterao na quantidade de energia que incide sobre o sensor.
Essa alterao da quantidade de energia amplificada e dirigida para um
sistema de registro de dados.
Como resposta, um espectro de UV obtido, o que pode ajudar na identificao
de alguns compostos.
Detector por espectrofotometria UV-
visvel
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Detector por espectrofotometria UV-
visvel
-
Detector por espectrofotometria
UV-visvel
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Detector por arranjo de diodos
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Detector por arranjo de diodos
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Detector por espectrofotometria UV-
visvel
Princpio de operao Absorvncia de luz na faixa UV-visvel
tipo Seletivo, depende de propriedades do
composto
Min. quanti. detectvel
(g/mL)
10-9
Sensib. a temperatura Baixa
Sensib. a vazo da f. mvel No
til com gradientes Sim
Aplicabilidade Compostos que absorvem no selecionado
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Detector por fluorescncia
Em comparao com detectores de UV-Vis, os detectores de
fluorescncia oferecem uma maior sensibilidade e seletividade, que
permite quantificar e identificar compostos e impurezas em matrizes
complexas em nveis extremamente baixos.
Os detectores de fluorescncia detectam apenas substncias que
apresentam fluorescncia.
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Detector por fluorescncia
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Detector por fluorescncia
Princpio de operao Excitao com luz produz emisso
fluorescente
tipo Altamente seletivo
Min. quanti. detetvel (g/mL) 10-9 (excitao a laser: 10-12)
Sensib. a temperatura Baixa
Sensib. a vazo da f. mvel No
til com gradientes Sim
Aplicabilidade Compostos ou derivados que fluorescem
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Detector por ndice de refrao
A capacidade de um composto ou solvente para desviar a luz, fornece uma
maneira de detect-lo.
O IR uma medida da capacidade de uma molcula em desviar a luz em
uma fase lquida.
A quantidade de deflexo proporcional concentrao.
O detector IR considerado universal porm, pouco sensvel e sofre com a
variao da temperatura.
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Detector por ndice de refrao
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Detector por ndice de refrao
Princpio de operao Mudana no ndice de refrao da fase mvel
tipo Universal, depende de propriedade da f.
mvel
Min. quanti. detetvel (g/mL) 10-7
Sensib. a temperatura alta
Sensib. a vazo da f. mvel No
til com gradientes No
Aplicabilidade Geral
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Detector eletroqumico
Princpio de operao Oxidao ou reduo em potencial fixo
tipo Seletivo, depende de propriedades do
composto
Min. quanti. detetvel (g/mL) 10-12
Sensib. a temperatura Mdia
Sensib. a vazo da f. mvel Sim
til com gradientes No
Aplicabilidade Espcies que oxidam ou reduzem
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Detector por condutividade eltrica
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Detector por condutividade eltrica
Princpio de operao Condutividade eltrica devida a presena de
ons
tipo Seletivo, depende de propriedades do
composto
Min. quanti. detetvel (g/mL) 10-8
Sensib. a temperatura Mdia
Sensib. a vazo da f. mvel Sim
til com gradientes No
Aplicabilidade Solues aquosas com compostos inicos
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E aqui termina a aula,
!!!!!
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Referncias bibliogrficas
http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html
SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A.
Princpios de anlise instrumental. 5. Ed., 2002.
COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S.
Introduo a mtodos cromatogrficos.
WESTON, A., BROWN, P. R. HPLC and CE - principles
and practice. 1997.
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ESCOPO DA CROMATOGRAFIA A LQUIDO
Figura 28-1 Skoog p642 vp
espcies MM>104: cromatografia por excluso
espcies inicas de baixa MM: cromatografia por troca inica
espcies pequenas e polares, mas no-inicas: mtodos de
partio (srie homloga)
espcies no-polares: cromatografia por adsoro
(ismeros estruturais,
hidrocarbonetos alifticos)
TROCA INICA
PARTIO ADSORO
fase normal
fase reversa
EXCLUSO
filtrao em gel
permeao em gel
insolvel em gua solvel em gua
no-polar inico
polar no-inico
POLARIDADE DO SOLUTO
102
103
104
105
106
mas
sa m
olecu
lar
aplicaes
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HPLC x GC
Fator GC HPLC
Requisito p/ amostra voltil e termicamente
estvel solvel na fase mvel
Tipos de amostra gases, lquido e slidos lquidos e slidos
Quantidade mnima
detectvel 10-12 g (ECD) 10-9 g (UV)
Tempo de anlise minutos at poucas
horas
minutos at muitas
horas
Pratos tericos por
coluna 2.000-300.000 500-25.000
Capacidade analtica at 200 componentes at 50 componentes
Tempo de treinamento
do operador cerca de 3 meses pelo menos 6 meses
Comparao entre as caractersticas de GC e HPLC
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(a) (b)
(d) (c)