aula 5- espectrofotometria uv.vis

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MÉTODOS ESPECTROFOTOMÉTRICOS

Profª Dra. Elaine de Arruda Oliveira Coringa

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE MATO GROSSO

CAMPUS CUIABÁ – BELA VISTA

CURSO – ENGENHARIA DE ALIMENTOS

DISCIPLINA: ANÁLISE INSTRUMENTAL MÉTODOS ÓTICOS DE ANÁLISE

Os métodos óticos ou

fotométricos, como diz o

nome, usa a luz

(foto), para medir

algo (métrico),

geralmente a

concentração de uma

substância que tem

capacidade de interagir

com a luz.

MÉTODOS ÓTICOS DE ANÁLISE

•Espectrofotometria = técnicas baseadas na

interação da matéria com a radiação

eletromagnética, na forma de emissão e absorção.

• tipos: espectrofotometria no ultravioleta

(UV) e visível (VIS), infravermelho (IR).

Espectro eletromagnético

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•Radiação eletromagnética = luz, forma de

energia que tem o comportamento de uma onda e

de uma partícula de energia:

• difração, refração = propriedade

ondulatória

• absorção/emissão = propriedade

corpuscular


•Espectrofotometria UV,Vis e de fluorescência

medem a radiação absorvida.

•Uso em alimentos:

• análise de componentes do alimento que

absorvem na região UV ou Vis (corantes,

nutrientes inorgânicos, vitaminas);

• análise de moléculas orgânicas por

fluorescência (detecção de contaminantes como

bactérias e alguns resíduos de pesticidas).


•Espectrofotometria de Infravermelho (IR)

•Uso em alimentos:

• grupos funcionais moleculares absorvem luz

em do IR identificação positiva (proteínas,

ácidos graxos, umidade)

• Análise quantitativa (FTIR = infrared transform

Fourier)

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Espectrofotometria de

Absorção no UV/Vis

ESPECTROFOTOMETRIA UV / VIS

SÃO MÉTODOS ÓTICOS QUANTITATIVOS

BASEADOS NA ABSORÇÃO DE LUZ

VISÍVEL (380 A 760 nm) E

ULTRAVIOLETA (200 a 380 nm) POR UMA

AMOSTRA MATERIAL

EMPREGO EM ANÁLISE DE ALIMENTOS

• determinação de aditivos conservantes

(nitrito, nitrato, sorbatos)

• determinação de corantes artificiais

• análise de metais, fluoreto, fósforo

• determinação da cafeína, carotenóides,

vitaminas (A, B, C).

Interação da luz com a matéria

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O processo de absorção da luz: Quando a amostra é estimulada pela aplicação de uma

fonte de radiação eletromagnética externa, muitos processos são possíveis de ocorrer:

1. A radiação pode ser espalhada ou refletida.

2. Uma parte da radiação incidente pode ser absorvida e promover algumas das espécies do analito para um estado excitado, como pode ser visto na Figura 24-5b

3. Na espectroscopia de absorção, medimos a quantidade de luz absorvida em função do comprimento de onda.

Cada espécie molecular é capaz de absorver suas próprias frequências características da radiação eletromagnética, e esse processo resulta em um decréscimo da intensidade da radiação eletromagnética incidente. Dessa forma, a absorção da radiação atenua o feixe de luz incidente.

PARÂMETROS DE ANÁLISE:

• amostras líquidas e límpidas

• coloridas: absorção visível

• incolores: absorção no ultravioleta

• comprimento de onda de absorção:

• Visível 380 – 760 nm

• Ultravioleta 200 – 380 nm

Qual a importância do comprimento de onda?

• Cada substância química presente na amostra

interage com a luz de determinados comprimentos

de onda parâmetro de análise instrumental

•Absorção ou emissão de luz ocorre em maior

intensidade no comprimento de onda da substância

em análise precisão e exatidão do método

• Usado no ESPECTROFOTÔMETRO e COLORÍMETRO

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Comprimento de onda x elemento químico

Elemento Comprimento de onda (em nm)

Na 589

Li 671

Ca 616

Sr 707

Ba 624

Cor Intervalo de comprimentos de onda (nm)

vermelha 780 – 622

alaranjada 622 – 597

amarela 597 – 577

verde 577 – 492

azul 492 – 455

violeta 455 – 380

Teste de chama – emissão de luz de comprimento de onda característico:

ESPECTROFOTOMETRIA

MÉTODOS ÓTICOS DE ABSORÇÃO DE LUZ

ABSORÇÃO X CONCENTRAÇÃO

LEI DE BEER-LAMBERT

Quando a luz é absorvida pela substância (AMOSTRA) a intensidade do feixe de luz diminui. Essa diminuição é

proporcional à Concentração da solução. AMOSTRA

ABSORVENTE

FONTE DE LUZ

DETECTOR DE LUZ

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SOLUÇÃO AMOSTRA C (mol/L)

Luz incidente

I0

Luz emergente

I1

LEI DE BEER-LAMBERT A Figura mostra a atenuação de um feixe

paralelo de radiação monocromática quando

este passa por uma solução absorvente de

espessura de l cm e de concentração igual a c mols por litro.

Em virtude das interações entre os fótons e as

partículas absorventes, a potência radiante do

feixe decresce de Io a I1.

I1 = luz transmitida = TRANSMITÂNCIA

Inverso da Transmitância = ABSORBÂNCIA

(luz absorvida pela amostra)

LEI DE BEER-LAMBERT

Lei de Beer-Lambert

• TRANSMITÂNCIA = qtde. de luz que passou pela amostra (%T) – escala porcentual (0-100%)

• ABSORBÂNCIA = qtde. de luz absorvida pela amostra (A) – escala logarítmica (0 – 2)

A = - log (T/100)

LEI DE BEER: padrões de Fe+2 para análise espectrofotométrica, com

concentrações variando de 1 mg/L (esquerda) a 10 mg/L (direita). A

absorbância da solução é evidenciada pela intensidade da cor, que é

proporcional à concentração do ferro em solução.

LEI DE BEER-LAMBERT

Proporcionalidade Cor x Concentração

A

T

A

T

C C

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Importância da Transmitância: como

percebemos a cor de uma solução

Por que uma Solução Vermelha é Vermelha?

Porque transmite a radiação vermelha:

Em geral, a radiação empregada em uma análise colorimétrica deve ser a cor complementar da solução do analito

Desvios da Lei de Beer: Limitações da Lei de Beer:

Desvios químicos:

A lei de Beer descreve o comportamento da

absorção somente para soluções diluídas (até 0,01

mol/L);

desvios da lei de Beer aparecem quando a espécie

absorvente sofre associação, dissociação ou reação

com o solvente para gerar produtos que absorvem

de forma diferente do analito.

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Limitações da Lei de Beer:

Desvios instrumentais:

Radiação policromática: A lei de Beer se aplica estritamente somente quando as medidas forem feitas com a radiação monocromática.

Correção: instrumentos com maior precisão na seleção do comprimento de onda.

INSTRUMENTAÇÃO

LEITURA INSTRUMENTAL

• ESPECTROFOTÔMETRO / COLORÍMETRO:

Aparelho usado para medir absorção de luz por uma solução na região do Visível e Ultravioleta;

ESCALAS DE LEITURA:

•% Transmitância (T) - 0 a 100%

•Absorbância (A) - 0 a 2 (adimensional)

Espectrofotômetro de Absorção UV/Vis:

Muitos instrumentos espectroscópicos para uso nas regiões

do UV/visível e IV apresentam cinco componentes:

1. uma fonte estável de energia radiante;

2. um seletor de comprimento de onda que isola uma região

limitada do espectro para a medida;

3. um ou mais recipientes para a amostra;

4. um detector de radiação, o qual converte a energia

radiante para um sinal elétrico mensurável;

5. uma unidade de processamento e de leitura do sinal,

geralmente constituída por um circuito eletrônico e, nos

instrumentos modernos, por um computador.

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Detector

cubeta lâmpada

Mono-cromador

Espectrofotômetro de Absorção UV/Vis:

MODO DE OPERAÇÃO:

“A luz vinda de uma fonte contínua passa por um

monocromador que seleciona uma estreita faixa

de comprimento de onda, passa pela amostra

contida na cubeta de comprimento b e a

intensidade de luz transmitida é medida num

detector.”

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1. Fonte de radiação – lâmpadas:

Fontes são lâmpadas que emitem feixes de luz na região do espectro visível, ultravioleta e

infravermelho.

Tipos:

Fonte de radiação UV: lâmpada de H2 – D2 – Xe2.

Emitem radiação na faixa de 180 a 350 nm.

Fonte de radiação VIS: lâmpada de W. Emitem radiação na faixa de 350 a 2.500 nm.

1. Fonte de radiação – lâmpadas:

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2. Seletor de comprimento de onda – monocromador:

Monocromador: Selecionam bandas mais

estreitas de comprimentos onda através da

dispersão da luz por um elemento de dispersão da

luz:

prisma ótico

rede (grade) de difração.

2. Seletor de comprimento de onda – monocromador:

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3. Recipiente para amostras:

• CUBETA DE ABSORÇÃO:

•Recipientes para conter a amostra, os quais são geralmente denominados células ou cubetas, devem ter janelas que sejam transparentes na região espectral de interesse

•Tipos:

De vidro para operar nos comprimentos de

onda de 340 a 1.000 nm (visível);

De quartzo para operar em comprimentos de

onda mais baixos (até 185 nm, UV)

b = caminho ótico

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Para a obtenção da informação espectroscópica, a potência radiante transmitida, fluorescente ou emitida deve ser detectada de alguma forma e convertida em uma quantidade mensurável.

Um detector é um dispositivo que indica a existência de algum fenômeno físico e o transforma em um sinal elétrico (leitura).

4. Detector:

CALIBRAÇÃO

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• ABSORÇÃO COM O “BRANCO” 1ª CALIBRAÇÃO

- Com água destilada:

leitura em A = zero

leitura em %T = 100

• CURVA DE CALIBRAÇÃO da substância 2ª CALIBRAÇÃO

- Com no mínimo 5 soluções padrão da substância

-Construção da curva de calibração no EXCEL o obtenção da equação da reta

-Uso da equação da reta para determinação da Ca (x)

CALIBRAÇÃO Operação do instrumento:

Operação do instrumento:

INTERFERENTES NA ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA

Quanto ao método:

• Proporcionalidade entre COR e CONCENTRAÇÃO (visível)

• Estabilidade da cor

• Limpidez da solução

• Diluição adequada (amostra = padrão) fator de

diluição (f = Vsolvente/Vsolução)

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• Vida útil da fonte de luz

• Comprimento de onda ajustado

• Calibração correta (1º - solução “branco” e 2º - “padrão”)

• Curva de calibração pré-preparada para cada tipo de análise

• Cubetas impecáveis

INTERFERENTES NA ANÁLISE ESPECTROFOTOMÉTRICA

Quanto ao instrumento:

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DA AMOSTRA

1. Comparação com uma solução padrão, usando a equação (Fator de Calibração):

Ca = Aa . Cp

Ap

- Ca = concentração da amostra (?) - Aa = absorbância da amostra - Cp = concentração da solução padrão - Ap = absorbância da solução padrão

Exemplo – Fator de calibração:

Determine a concentração de uma substância na amostra (Aamostra = 0,90) através do uso de uma solução padrão, cujos dados foram:

Apadrão = 0,73

Cpadrão = 0,00046 mol/L

2. Pela Curva de Calibração: mínimo 5 soluções padrão uso da EQUAÇÃO DA

RETA obtida pelo EXCEL (y = ax+b)

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Exemplo – Curva de calibração: Espectrofotometria de

Absorção no IR

Absorção no IR:

A porção do espectro percebida pelo olho humano (região visível) está compreendida entre comprimentos de onda de 380 nm e 780 nm e, acima desse limite, até cerca de 50.000 nm (faixa entre as regiões do visível e das microondas), a radiação é chamada infravermelha (IV).

É dividida em infravermelho próximo (1-25mm), infravermelho médio (25-50mm) e infravermelho afastado (> 25mm).

Absorção no IR:

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Absorção no IR:

O objetivo da espectroscopia de absorção no IV é a determinação dos grupos funcionais de um dado material. Cada grupo absorve em frequência característica de radiação na região do IV.

Assim, um gráfico de intensidade de radiação versus frequência, o espectrograma de IV, permite caracterizar os grupos funcionais de um padrão ou de um material desconhecido.

A posição de absorção de uma banda no espectro pode ser expressa em número de onda (cm-1) = 1/

Absorção no IR:

A absorção no IR varia com o comprimento de onda selecionado, e é geralmente apresentada na forma de um ESPECTRO DE ABSORÇÃO.

Absorção no IR x Absorção UV/Vis

Absorção no IR resulta de transições energéticas vibracionais enquanto que a absorção no UV/Vis são transições eletrônicas;

IR analisa gases e substâncias sólidas, além de soluções; UV/Vis só soluções.

IR não usa cubetas, mas sim células amostradoras de líquidos, de comprimento ótico muito pequeno (mm), fabricadas com sais inorgânicos cristalinos;

Absorção no IR em alimentos:

O Infravermelho próximo (FT-NIR) e o médio (FT-IR) aliado à utilização da análise multivariada, foram usados para determinar a autenticidade de alimentos e mostraram ser úteis para detectar problemas de adulterações em puré de framboesa, fiambre, azeite, óleos vegetais, presença de gordura de porco em mistura de gorduras animais, outras gorduras vegetais em manteiga de cacau, café, mel, sumo de laranja, leite, carne, e outros produtos.

Com um Espectrômetro de Infravermelho Próximo, conhecido como NIR (Near Infrared Reflectance), é possível saber em apenas seis segundos, o nível de proteína, fibra, gordura, matéria seca e matéria mineral, elementos que conferem qualidade aos grãos como soja, milho e trigo.

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Espectrofotômetros IR: Espectrofotômetros IR:

Os componentes dos instrumentos IV diferem significativamente daqueles dos instrumentos UV/visível.

As fontes de IV são constituídas por sólidos aquecidos e os detectores IV respondem ao calor em vez de fótons.

Os componentes ópticos dos instrumentos IV são construídos de cristais polidos de sais, tais como o cloreto de sódio e o brometo de potássio.

Esquema do espectrofotômetro IR: Componentes do espectrofotômetro IR:

a) Fonte de radiação: a radiação IV é produzida por uma fonte aquecida eletricamente, que emitem radiação na região do IR: Fonte de Nernst (400–20.000 nm); Fio de níquel-crômio (750–20.000 nm); Globar (1.200–40.000 nm)

b) Área de amostras: composta por uma variedade de acessórios para a medida de gases,

líquidos e sólidos.

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Esquema do espectrofotômetro IR:

c) Monocromador: dispersa a luz proveniente da fonte por um elemento de dispersão, que pode ser um prisma ou uma rede de difração;

d) Detector: utiliza o efeito térmico da radiação para quantificá-la. Um detector térmico apresenta uma superfície pequena enegrecida que absorve radiação infravermelha, aumentando a sua

temperatura. O aumento de temperatura é convertido em um sinal elétrico que é amplificado e medido. Os dois tipos comuns de detectores não seletivos são o termopar e o bolômetro.

Aplicações na Espectrofotometria IR

A espectroscopia no infravermelho tem sido usada nas análises de açúcares em alimentos nas últimas décadas. Esta técnica só não é mais utilizada na análise de alimentos e seus produtos pelas seguintes razões:

a. Os espectros no infravermelho são complexos. Cada grupo funcional contribui para o espectro e isto resulta em sobreposição das bandas de absorção dificultando a interpretação.

b. A água, que é a principal constituinte de produtos biológicos, tem forte absorção no infravermelho.

c. A radiação no infravermelho penetra fracamente nas amostras e, dessa maneira, somente a superfície da amostra pode ser estudada.

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a técnica de espectroscopia no infravermelho médio vem sendo cada vez mais empregada para a análise qualitativa e quantitativa de alimentos;

Análise de leite, carne, óleos, gorduras, manteiga, margarina, leite condensado e frutas, avaliando tanto aspectos quantitativos quanto qualitativos, como a certificação da qualidade.

O emprego das técnicas multivariadas para discriminar ingredientes alimentares por meio de dados de espectroscopia por reflexão difusa no infravermelho com transformada de Fourier (DRIFTS).

Evita-se o emprego de reagentes agressivos ou a geração de resíduos danosos ao ambiente, pois requer pouco ou nenhum tratamento das amostras.


Caracterização físico-química de queijo prato por espectroscopia no infravermelho


Análise exploratória de adoçantes de mesa via espectroscopia no infravermelho (FTIR)


Espectroscopia no infravermelho médio e análise sensorial aplicada à detecção de adulteração de

café torrado por adição de cascas de café

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Material de referência Apostila Instrumental cap. 4

Fundamentos de Química Analítica – SKOOG

Cap. 24: Introdução aos Métodos Espectroquímicos

Cap. 25: Instrumentos para a Espectrometria Óptica

Análise Instrumental – SKOOG:

Cap. 6: Introdução aos métodos espectrométricos

Cap. 7: Componentes dos instrumentos óticos

Cap. 13: Espectrometria de Absorção molecular UV/vis

Cap. 16: Introdução à espectrometria no IV

Análise Instrumental – CIENTIFUEGOS E VAITSMAN:

Cap. 1: Introdução ao UV e Vis.

Cap. 2: Infravermelho

Guia de Estudos 03

Espectrofotometrias de

Absorção UV/Vis/IR

Entrega: 08/10/12

aula 5- espectrofotometria uv.vis

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