atividade antimicrobiana do extrato etanÓlico de folhas de ... · joão carlos luzzi atividade...
TRANSCRIPT
CENTRO UNIVERSITÁRIO UNIVATES
CURSO DE GRADUAÇÃO EM QUÍMICA INDUSTRIAL
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO ETANÓLICO DE
FOLHAS DE LOURO – Laurus nobilis L. – FRENTE ÀS BACTÉRIAS
Escherichia coli E Salmonella enteritidis.
João Carlos Luzzi
Lajeado, dezembro de 2010.
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
João Carlos Luzzi
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO EXTRATO ETANÓLICO DE
FOLHAS DE LOURO – Laurus nobilis L. – FRENTE ÀS BACTÉRIAS
Escherichia coli E Salmonella enteritidis.
Monografia apresentada na disciplina de Tabalho de Conclusão, do Curso de Química Industrial, como parte da exigência para obtenção do título de Bacharel em Química Industrial.
Orientador: Eduardo Miranda Ethur
Lajeado, dezembro de 2010.
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos a todos que fizeram parte de mais esta etapa
de minha vida. A meus pais, Félix e Nercy, pelo apoio e confiança que nunca deixaram de
dar em todos os momentos.
A minha esposa, Fabiane, que nunca deixou de acreditar e confiar em min
sempre me apoiando e entendendo. A minha filha, Michele, que nesta última etapa
veio trazer mais felicidade e ânimo para concluir o curso.
A empresa Fontana S.A. que muito me ajudou propiciando apoio técnico em
muitos momentos e possibilitando aplicabilidade de muitos conhecimentos
adquiridos ao longo do curso.
Ao Sr. Rogério Dorigon representante da empresa R.R. Indústria e Comércio
de Alimentos Ltda que nesta última etapa (TCC) foi fundamental para que o estágio
fosse concluído. Desde o início e em nenhum momento o Sr. Rogério deixou de me
dar condições para que o trabalho fosse feito adequadamente.
A Natália (laboratório Univates) que me deu apoio durante a realização das
análises.
A todos os professores que fizeram parte desta caminhada. Em especial a
meu orientador, professor Eduardo Miranda Ethur pelo apoio, paciência, dedicação e
confiança que foram fundamentais para que este trabalho fosse realizado.
A todos, muiiiiiito obrigado!!!!!
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
RESUMO
Apesar da variedade de especiarias e condimentos que possuem atividade antimicrobiana (pimenta, alho, cravo, canela, orégano e louro entre outros) ser grande, suas atividades não se dão de forma irrestrita e linear. Fatores ligados as características do alimento e do microrganismo atuante interferem diretamente na atuação desta substância antimicrobiana. Desta forma, neste trabalho, foram realizados testes para a verificação da atividade antimicrobiana do extrato etanólico de folhas de louro (Laurus nobilis L.) frente às bactérias Escherichia coli e Salmonella enteritidis. Realizados os testes de CIM (concentração inibitória mínima) verificou-se que o extrato não possui atividade antimicrobiana nas concentrações testadas frente a estas bactérias. Conforme verificado em outros trabalhos e pesquisas, estas bactérias Gram-negativas também apresentaram baixa (ou nenhuma) sensibilidade as substâncias antimicrobianas do louro ou de outros condimentos. O forte odor, cheiro e coloração verde escura intensa da folha natural foi verificada no extrato.
PALAVRAS-CHAVE: Atividade antimicrobiana, extrato etanólico de folhas de louro (Laurus nobilis L.), bactérias Gram-negativas.
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Extrato etanólico amostra íntegra.............................................................44
Figura 2 – Extrato etanólico amostra desidratada .....................................................44
Figura 3 – Placas de CIM da primeira etapa após aplicação TTC ............................47
Figura 4 – Placas de CIM da segunda etapa após aplicação TTC............................48
Figura 5 – Placa de confirmação de crescimento......................................................51
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Surtos de DTA por sorovar de Salmonella..............................................26
Gráfico 2 – Surtos de DTA por microrganismo causador ..........................................30
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Principais parâmetros intrínsecos e extrínsecos que afetam o crescimento
microbiano.................................................................................................................15
Tabela 2 – Valores mínimos aproximados de aw para o crescimento microbiano.....16
Tabela 3 – Microrganismos mais freqüentes causadores de DTA. ...........................26
Tabela 4 - Alimentos causadores de DTA mais freqüentes. ....................................27
Tabela 5 – Resultados de concentração inibitória mínima (CIM) do microrganismo
Escherichia coli. ........................................................................................................45
Tabela 6 – Resultados de concentração inibitória mínima (CIM) do microrganismo
Samonella enteritidis. ................................................................................................46
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ................................................................................8
1.1 Objetivo geral.......................................................................................................9
1.2 Objetivos específicos..........................................................................................9
2 MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS...............................................................10
2.1 Microrganismos deteriorantes .........................................................................12
2.2 Fatores intrínsecos e extrínsecos ...................................................................14
2.2.1 Fatores intrínsecos ........................................................................................15
2.2.1.1 Atividade de água (aw) ................................................................................15
2.2.1.2 pH..................................................................................................................16
2.2.1.3 Potencial de oxi-redução............................................................................17
2.2.1.4 Composição química ..................................................................................17
2.2.1.5 Fatores antimicrobianos naturais..............................................................17
2.2.1.6 Interações entre microrganismos..............................................................18
2.2.2 Fatores extrínsecos........................................................................................19
2.2.2.1 Temperatura ambiente ................................................................................19
2.2.2.2 Umidade relativa do ambiente....................................................................20
2.2.2.3 Composição gasosa do meio.....................................................................20
2.2.2.4 Conceito de obstáculos de barreiras.........................................................21
3 DOENÇAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS...................................................22
3.1 Salmonella enteritidis .......................................................................................24
3.2 Escherichia coli .................................................................................................27
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
3.3 Avaliação da atividade antimicrobiana............................................................30
4 A INDÚSTRIA DE PRODUTOS CÁRNEOS ..........................................................32
4.1 Condimentos e especiarias ..............................................................................34
4.2 Louro – uma erva condimentar ........................................................................36
5 MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................39
5.1 Material vegetal .................................................................................................39
5.2 Extração do extrato etanólico ..........................................................................39
5.3 Avaliação da atividade antimicrobiana............................................................40
5.3.1 Procedimentos ...............................................................................................40
6 RESULTADOS E DISCUSSÕES...........................................................................44
7 CONCLUSÃO ........................................................................................................53
REFERÊNCIAS.........................................................................................................54
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
Nas últimas décadas, o homem tem passado por mudanças e
transformações profundas em seu estilo de vida. Até poucos anos atrás os
consumidores, de modo geral, não observavam conceitos ecológicos ou naturais nos
produtos muito menos características ou composição química dos alimentos.
Atualmente, estes conceitos já deixaram de ser um simples modismo e estão
totalmente absorvidos na cultura do consumidor de modo que estes fatores podem
ser perfeitamente os responsáveis pelo sucesso ou fracasso de um produto junto ao
consumidor.
Esta realidade na qual o consumidor exige cada vez mais alimentos
nutricionalmente balanceados e sobretudo com elevado grau de segurança tem feito
com que cada vez mais busquem-se novas tecnologias de processamento e
sobretudo substâncias naturais que possibilitem diminuir ou minimizar a utilização
de substâncias sintéticas utilizadas principalmente para a conservação dos
alimentos. É neste contexto que a utilização de compostos ou substâncias naturais
provenientes de condimentos ou especiarias vem despertando cada vez mais
interesse. Apesar deste interesse recente, vários relatos históricos confirmam a
utilização de condimentos desde a Idade Média quando eram utilizados
principalmente para realçar e potencializar sabores e aromas nos alimentos
(BAKKALI et al., 2008). Atualmente sabe-se que além destas qualidades, alguns
destes condimentos possuem atividade antimicrobiana que atuam evitando possíveis
degradações devido às contaminações microbianas nos alimentos possibilitando
assim prolongar a validade do alimento e tornando-o mais seguro. (SHAN et al.,
2007).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
9
A segurança alimentar, além do fator relacionado a utilização de substâncias
naturais, é observada e questionada pelo consumidor no dia-a-dia quando observa-
se cada vez mais casos e surtos de intoxicações alimentares causadas por
microrganismos patogênicos devido a deterioração dos alimentos (MARINO et al.,
2001). No Brasil, conforme dados da Secretaria de Vigilância em Saúde do
Ministério da Saúde (SVS/MS), de 1999 à 2009 foram registrados 6.349 surtos de
doenças transmitidas por alimentos (DTA) envolvendo a contaminação de
aproximadamente 124.000 pessoas. Estes dados somente reforçam a necessidade
da utilização de substâncias naturais ou sintéticas a fim de conservar-se o alimento
da melhor forma possível.
Neste contexto, a seleção e aplicação da melhor substância de origem
natural torna-se um desafio pois a complexidade do alimento, suas propriedades
químicas e físicas e os microrganismos que possam estar presentes naturalmente
(ou não) no alimento podem influenciar diretamente nas propriedades
antimicrobianas destas substâncias.
Assim, pesquisas e testes envolvendo estes compostos naturais mostram-se
de extrema importância.
1.1 Objetivo geral
Fazer a verificação da eficiência antimicrobiana do extrato etanólico de
folhas de louro (Laurus nobilis L.) frente aos microrganismos Escherichia coli e
Salmonella enteritidis.
1.2 Objetivos específicos
- Verificar se ocorrem diferenças de atuação entre uma amostra de folhas
de louro colhida recentemente e outra de amostra comercial de folhas
desidratadas;
- Realizar os testes de concentração inibitória mínima (CIM) e verificar a
eficiência do extrato frente as bactérias;
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
MICRORGANISMOS NOS ALIMENTOS
Desde o início da civilização humana, o homem conviveu com os
microrganismos presentes naturalmente nos alimentos apesar de em grande parte
de sua história desconhecer ou ignorar estes microrganismos. A partir do momento
em que o homem deixou de ser nômade e que a necessidade de plantar, produzir,
conservar e armazenar seu próprio alimento tornou-se indispensável, os problemas
decorrentes destas necessidades também surgiram. Acredita-se que as doenças
transmitidas por alimentos, principalmente devido à conservação tenham iniciado
juntamente neste período (JAY, 2005).
A partir destas necessidades antigas, o homem passou a preparar e
manipular o alimento buscando uma melhor conservação deste. Atualmente sabe-se
de evidências sobre a existência de ordenha de vacas datadas de 9.000 a.C., de
relatos que indicam que na Babilônia antiga (7.000 a.C.) o homem já fabricava a
cerveja e que os sumérios (3.000 a.C.) foram os primeiros criadores de gado de
corte e leite tendo sido os primeiros a fabricar a manteiga. Nesta época também,
judeus, chineses e gregos, utilizavam o sal para conservação dos alimentos e os
romanos (1.000 a.C.) utilizavam a neve para conservação da carne e frutos do mar
(FRANCO; LANDGRAF, 2008).
Apesar destas técnicas e métodos inovadores, o conhecimento a respeito
dos mecanismos e agentes causadores das doenças alimentares não evoluiu tão
rapidamente. Durante a Idade Média, milhares de pessoas morreram de ergotismo
devido não saber-se que o fungo que produz esta toxina cresce em cereais. Apesar
disto, procedimentos de limpeza e higiene no preparo e manipulação de alimentos
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
11
demoraram muito para serem implantados e exigidos (por volta do século XIII). A
partir disto, em 1.658 A. Kircher teria sido a primeira pessoa a sugerir a deterioração
dos alimentos por microrganismos; em 1.765 L. Spallanzani através de experimentos
(caldo de carne fervido em recipiente fechado) desmentiu a teoria da geração
espontânea mantendo o alimento em condições de consumo por muito mais tempo,
mas, somente em 1.809 o confeiteiro François Nicolas Appert aprimorou e
comprovou esta técnica conservando carne em recipientes de vidro que foram
fervidos em água por longos períodos. Este processo, com muitos aprimoramentos
nas técnicas é à base dos processos atuais de enlatamento de alimentos (FRANCO;
LANDGRAF, 2008).
Apesar de todos os experimentos atuarem diretamente sobre os
microrganismos (inativando-os), foi o médico francês L. Pasteur o primeiro cientista a
analisar e descrever a importância dos microrganismos nos alimentos quando em
1.837 este observou e demonstrou que o azedamento do leite era causado por
microrganismos. Após isto, em 1.860 o mesmo L. Pasteur utilizou calor para inativar
microrganismos indesejáveis no vinho e cerveja, processo que, mais tarde foi
denominado de pasteurização (JAY, 2005).
A partir destes eventos, a ciência e o homem passaram a avaliar e estudar
os mais diversos microrganismos e as implicações positivas ou negativas que estes
possuíam na conservação dos alimentos. Desta forma, novas técnicas e processos
foram criados e aprimorados, indústrias de processamento e matérias primas
surgiram além de indústrias químicas e de aditivos (naturais ou sintéticos) que vem
desenvolvendo-se de forma extremamente rápida (FRANCO; LANDGRAF, 2008).
Da mesma forma que a população mundial cresce, o interesse pelos
microrganismos ligados aos alimentos também cresce. Pode-se dizer que os
microrganismos estão diretamente ligados à disponibilidade, quantidade e qualidade
dos alimentos disponíveis ao homem (PELCZAR et al., 1997). Atualmente, sabe-se
que a interação que ocorre entre os microrganismos e o alimento pode ser benéfica
ou maléfica podendo desta forma, ser divididos em três grandes grupos:
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
12
- Microrganismos causadores de modificações químicas prejudiciais que
resultam em deteriorações microbianas podendo causar alterações de cor,
odor, sabor, textura e aspecto do alimento. Estes tipos de alterações ocorrem
naturalmente devido ao metabolismo dos microrganismos que utilizam o
substrato do alimento como fonte de energia;
- Microrganismos patogênicos que podem causar doenças tanto no homem
quanto em animais. Em geral, estes microrganismos chegam ao alimento
devido a condições precárias de produção, armazenamento, distribuição ou
manipulação;
- Microrganismos que causam modificações positivas no alimento alterando
características originais. Estes tipos de microrganismos estão presentes
naturalmente ou são adicionados propositalmente ao substrato para que uma
série de reações ocorram. Muitas vezes é necessário apenas estimular
seletivamente (temperatura, pH, tempo) para que estas reações ocorram
(FRANCO; LANDGRAF, 2008).
2.1 Microrganismos deteriorantes
A contaminação microbiana dos alimentos, quando ocorre, apresenta
diferencialmente uma característica: o alimento (ou substrato) serve como meio de
cultura para o microrganismo desenvolver-se e multiplicar-se. Isto pode ser
comparado com a inoculação de um determinado microrganismo em um meio de
cultura com caldo nutriente ou um ágar (PELCZAR et al., 1997). Ocorrida a
contaminação, os microrganismos atuam de duas formas distintas: multiplicam-se no
alimento obtendo deste os nutrientes essenciais para a sua proliferação ou utilizam o
alimento apenas como um veículo para a sua disseminação para outros indivíduos.
As contaminações alimentares podem ocorrer de duas maneiras distintas:
direta quando a contaminação ocorre nos tecidos animais ou vegetais ainda vivos
(antes do abate ou colheita) ou indireta quando a contaminação ocorre após o abate
ou colheita do alimento (EVANGELISTA, 2002).
Em geral, os alimentos na sua forma natural, possuem pouca ou nenhuma
carga microbiana prejudicial a estes de modo que, em sua grande maioria, carregam
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
13
em seu interior ou na sua superfície floras normais e específicas que não lhes
causam prejuízos. Porém, a partir do momento do abate ou colheita, o alimento
perde suas defesas naturais permitindo que microrganismos estranhos e
oportunistas passem a se utilizar deste substrato para desenvolver-se ou promover a
sua destruição. Em geral, a contaminação microbiana do alimento não ocorre por
uma condição específica mas, por uma série de condições e fatores que possibilitam
que este contaminante predomine ou cresça. Condições como a composição
química (lipídios, carboidratos, proteínas, água), processos de moagem ou
trituração, condições de temperatura, umidade e pH, carga microbiana pré-existente,
manipulações inadequadas e condições inadequadas de conservação,
armazenagem ou de transporte são fatores que influenciam diretamente na
contaminação do alimento (EVANGELISTA, 2002; EVANGELISTA, 2008).
Apesar deste conjunto de fatores preponderantes, os microrganismos
apresentam como principais fontes de contaminação e disseminação:
- Solo e água: os microrganismos presentes nestes meios apresentam
características em comum. Através de um ciclo contínuo (solo – água – solo)
faz com que os microrganismos sejam quase sempre os mesmos com
algumas poucas exceções como as Alteromonas spp. que necessitam da
salinidade do mar para sobreviverem,
- Plantas: alguns microrganismos possuem formas de fixação às planta
possibilitando que obtenham nutrientes necessários para sua sobrevivência.
São denominados fitopatogênicos isto é, causadores de doenças as plantas,
- Utensílios: a contaminação cruzada (de um alimento para outro) por falta ou
higienização inadequada representa uma das principais fontes de
contaminação. Utensílios como bandejas, recipientes, facas, tábuas,
espátulas, mesas e moedores entre outros são os principais causadores de
contaminações,
- Manipuladores de alimentos: a flora microbiana de mãos e roupas
(principalmente) pode ser bastante vasta em quantidade e variedade.
Microrganismos presentes na água, solo, poeira ou ar além das fossas
nasais, boca e trato gastrintestinal em condições de falta de higiene podem
facilmente contaminar as mãos dos manipuladores;
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
14
- Rações animal: representa um importante ponto de controle uma vez que é
uma das principais fontes de contaminação nos animais. A Salmonella,
principalmente em aves e a Listeria monocytogenes em silagens são
exemplos;
- Pele dos animais: principal fonte de contaminação do leite. Em condições
precárias de higiene, os microrganismos presentes naturalmente na pele e
úbere do animal podem facilmente contaminar produto, manipuladores e
ambiente;
- Ar e pó: bactérias Gram-positivas e fungos são as principais fontes de
contaminação (FRANCO; LANDGRAF, 2008).
Ocorrida a contaminação e degradação do alimento, estes geralmente
passam a apresentar sabores e odores desagradáveis devido a substâncias voláteis
produzidas pelos microrganismos e que podem ser facilmente detectadas pelo
olfato e paladar humano. A degradação do alimento está relacionada com qualquer
modificação de suas características que torne este inaceitável para o consumo
humano. Estas modificações não estão relacionadas somente com os
microrganismos, mas também com danos causados por insetos, danos físicos
devido a batidas, congelamento, secagem, atividade de enzimas dos próprios
tecidos animais e vegetais ou mesmo alterações químicas que não são induzidas
por microrganismos. Além do aspecto visual, outra conseqüência da deterioração é a
diminuição da vida de prateleira do alimento (FORSYTHE, 2002).
2.2 Fatores intrínsecos e extrínsecos
Seja desde a colheita, o abate, o processamento ou manipulação do
alimento, estes além de uma carga microbiana inicial presente naturalmente, são
expostos a uma série de etapas e processos (processamento, embalagem,
estocagem, distribuição) que se não bem controlados podem facilmente
desencadear os mecanismos deteriorantes. Devido a tudo isto, quais os
microrganismos que irão predominar ou quais reações químicas ou bioquímicas irão
acontecer depende de uma série de fatores intrínsecos e extrínsecos (TABELA 1)
próprios de cada alimento (FORSYTHE, 2002). Os fatores extrínsecos estão
relacionados com as interações entre o alimento e o meio ambiente e os fatores
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
15
intrínsecos representam as características próprias de cada alimento (FRANCO;
LANDGRAF, 2008).
Tabela 1 – Principais parâmetros intrínsecos e extrínsecos que afetam o crescimento microbiano. Parâmetros intrínsecos Parâmetros extrínsecos
Atividade de água temperatura ambiente
pH umidade relativa do ambiente
potencial de oxi-redução composição gasosa do meio
composição química conceito de obstáculos de barreiras
fatores antimicrobianos naturais
interações entre microrganismos
Fonte: Adaptado de Franco, (2008).
2.2.1 Fatores intrínsecos
Estes fatores estão relacionados com as características do próprio alimento
e as interações que estas sofrem.
2.2.1.1 Atividade de água (aw)
A atividade de água representa um fator essencial para os microrganismos
pois estes necessitam de água não só para a sua sobrevivência mas também para o
seu metabolismo e multiplicação. Para que a água possa ser utilizada pelo
microrganismo esta não pode estar ligada a outras moléculas por forcas físicas
(água ligada) ficando assim disponível para atuar como solvente e participar de
reações químicas e conseqüentemente ser utilizada pelos microrganismos
(FRANCO; LANDGRAF, 2008). Os valores de aw variam de 0 a 1 (água pura é 1,0)
sendo que os microrganismos possuem valores máximos, mínimos e valores ótimos
para a sua multiplicação (TABELA 2). A adição de quaisquer sais, açúcares ou
outros solutos ou processos como desidratação, secagem e congelamento reduzem
a aw do alimento (FORSYTHE, 2002; FRANCO; LANDGRAF, 2008).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
16
Tabela 2 – Valores mínimos aproximados de aw para o crescimento microbiano. Microrganismos atividade de água
Clostridium botulinum, tipo E 0,97
Pseudomonas spp. 0,97
Acinetobacter spp. 0,97
Echerichia coli 0,96
Enterobacter aerogenes 0,95
Bacillus subtilis 0,95
Clostridium botulinum, tipos A e B 0,94
Candida utilis 0,94
Salmonella spp. 0,94
Vibrio parahaemolyticus 0,94
Rhizopus stolonifer 0,93
Mucor spinosus 0,93
Fonte: Adaptado de Jay, (2008 p.58).
Geralmente, um valor mínimo de aw não é indicação de que o microrganismo
morrerá (mesmo que ocorra com algumas colônias). Nestes casos o que ocorre é
uma diminuição da fase de multiplicação, aumento da fase de crescimento e
consequentemente uma queda na população final (FORSYTHE, 2002).
2.2.1.2 pH
Valores de pH perto da neutralidade (6,5 a 7,5) são os mais favoráveis a
maioria dos microrganismos para a sua multiplicação. Porém, microrganismos como
bactérias lácticas são favorecidas pelo meio ácido (inibição de microrganismos
competidores), bolores e leveduras são mais tolerantes ao pH enquanto que os
microrganismos patogênicos são os menos tolerantes a variação de pH.
Assim como na aw, o pH adverso provoca um aumento na fase lag de
multiplicação. A capacidade de multiplicação destes microrganismos irá depender da
sua habilidade em adaptar-se e modificar o pH desfavorável. Em pH ácidos,
mecanismos internos produzem substâncias que aumentam o pH externo, em pH
básico são produzidas substâncias que diminuem o pH (FRANCO; LANDGRAF,
2008). Geralmente na deterioração de alimentos, devido a formação de diversos
compostos e substâncias, o meio que antes era totalmente favorável ao
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
17
desenvolvimento do microrganismo torna-se desfavorável diminuindo seu ritmo de
crescimento (EVANGELISTA, 2008).
2.2.1.3 Potencial de oxi-redução
O potencial de oxi-redução (Eh) está relacionado com a capacidade que
determinado substrato possui em ganhar ou perder elétrons. A perda de elétrons
indica uma oxidação (valores de Eh positivo) e o ganho indica uma redução (valor de
Eh negativo). Em geral, os microrganismos aeróbios (bolores, leveduras,
Pseudomonas, Moraxella, Acinetobacter, entre outras) necessitam de valores
positivos de Eh para desenvolver-se, microrganismos anaeróbios como Clostridium
botulinum e Desulfotomaculum nitrificans necessitam de valores baixos de Eh,
bactérias como lactobacilos e estreptococos desenvolvem-se em situações
levemente reduzidas (microaerófilas) e bactérias denominadas anaeróbias
facultativas desenvolvem-se em condições de anaerobiose quanto aerobiose (família
Enterobacteriaceae) (FRANCO; LANDGRAF, 2008; JAY, 2005).
2.2.1.4 Composição química
Basicamente, para o microrganismo desenvolver-se satisfatoriamente o
substrato deve possuir: água, fonte de energia, fonte de nitrogênio, vitaminas e sais
minerais. Em sua grande maioria, açúcares, álcoois e aminoácidos fornecem a
energia, o nitrogênio também é fornecido por aminoácidos e outras substâncias
nitrogenadas (nucleotídeos, peptídeos e proteínas complexas), as vitaminas (as
mais importantes são as do complexo B, a biotina e o ácido pantotênico) são
sintetizadas pela maioria dos microrganismos e os minerais (Na, K, Ca e Mg) apesar
de serem necessários em quantidades muito pequenas são indispensáveis uma vez
que são necessários em reações enzimáticas (FRANCO; LANDGRAF, 2008).
2.2.1.5 Fatores antimicrobianos naturais
Na constituição química dos alimentos, em alguns casos estes possuem
substâncias naturais capazes de inibir o crescimento de alguns microrganismos.
Algumas espécies (especialmente vegetais) possuem óleos essenciais que agem
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
18
também como agentes antimicrobianos. Pode-se citar o eugenol (no cravo), alicina
(no alho), aldeído cinâmico e eugenol (na canela), o acil-isotiocianato (na mostarda)
e timol e isotimol (no orégano). Além destes, a clara do ovo é rica e lisozima
(enzima) que é muito ativa contra bactérias Gram-positivas e no leite temos a
lactoferrina que também possui atividade antimicrobiana.
Além de substâncias presentes na constituição química dos alimentos,
existem as estruturas que pode-se denominar de barreiras mecânicas que fornecem
uma excelente proteção contra o ataque de microrganismos. Pode-se citar as cascas
de nozes, de frutas diversas, de ovos e a pele de animais (JAY, 2005).
2.2.1.6 Interações entre microrganismos
A produção de metabólicos por certos microrganismos muitas vezes é capaz
de afetar a sobrevivência e a multiplicação de outros microrganismos presentes no
mesmo ambiente. Como exemplo, pode-se citar as bactérias lácticas que alteram o
pH do meio tornando-o ácido demais e impróprio para o crescimento de uma série
de outras bactérias mas por outro lado algumas bactérias também são capazes de
produzir enzimas que propiciam o aumento do pH do meio e da mesma forma inibem
o desenvolvimento de outros microrganismos (JAY, 2005). Assim como estas
substâncias produzidas são capazes de inibir o crescimento e desenvolvimento de
certos microrganismos, algumas destas substâncias são essenciais para outras.
Pode-se citar a tiamina e o triptofano produzidas pela Pseudomonas aeroginosa que
são essenciais para o Staphylococcus aureus (FRANCO; LANDGRAF, 2008).
Além destes compostos, alguns microrganismos específicos produzem
substâncias denominadas de bacteriocinas que também possuem atividade
bactericida. As bactérias de maior interesse nesta área são as lácticas que
produzem uma série de bacteriocinas porém, uma das poucas com uso aprovado
em alimentos pelo FDA (Food and Drug Administration - USA) é a nisina que é
produzida por Lactobacillus lactis spp. lactis. Esta substância é ativa contra o
desenvolvimento de microrganismos Gram-positivos (sobretudo esporulados) mas é
ineficaz contra fungos e bactérias Gram-negativas (JAY, 2005).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
19
Outra maneira de interação de microrganismos visando a proteção do
alimento é promover a competição entre a flora bacteriana presente. Pode-se
adicionar ao produto algum microrganismo inócuo, mas que de alguma forma irá
competir com os microrganismos patogênicos ou deteriorantes reduzindo a sua
população ou até mesmo eliminando-os. Este mecanismo é muito utilizado para
evitar-se a contaminação de aves por Salmonella e Campylobacter (FRANCO;
LANDGRAF, 2008).
2.2.2 Fatores extrínsecos
Estes fatores estão relacionados com as interações entre o alimento e o
meio ambiente onde este se encontra.
2.2.2.1 Temperatura ambiente
A temperatura ambiente é o fator extrínseco que mais afeta a propagação
dos microrganismos. Assim como para a maioria dos fatores, para a temperatura os
microrganismos possuem um valor mínimo, máximo e ideal para o seu
desenvolvimento. Apesar disto, a faixa de desenvolvimento de alguns gêneros é
bastante ampla havendo casos em que ocorre o desenvolvimento a temperaturas
mínimas de –35 °C e máximas de 90 °C. Esta ampla faixa de desenvolvimento fez
com que os microrganismos fossem divididos em grupos de acordo com sua
temperatura ideal de desenvolvimento:
- Psicrófilos: apresentam temperatura de crescimento de 0 °C a 20 °C com
ótima entre 10 °C a 15 °C.
- Psicrotrófilos: desenvolvem-se em temperaturas de 0 °C a 7 °C.
- Mesófilos: apresentam temperatura máxima entre 40 °C e 50 °C e mínima de
5 °C e 25 °C com ótima entre 25 °C e 40 °C.
- Termófilos: desenvolvem-se a temperaturas máximas entre 60 °C e 90 °C e
mínimas de 35 °C e 45 °C com ótimas entre 45 °C e 65 °C (FORSYTHE,
2002; FRANCO; LANDGRAF, 2008).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
20
As temperaturas de refrigeração são as mais ideais para os microrganismos
psicrófilos e psicrotrófilos sendo que as bactérias do gênero Pseudomonas,
Alcaligenes, Flavobacterium e Micrococus são os principais responsáveis pela
deterioração de carnes, pescados, ovos e frangos entre outros alimentos.
Os fungos crescem em uma faixa de temperatura bem mais ampla que as
bactérias apresentando a capacidade de desenvolverem-se em ambientes de
refrigeração, porém as leveduras não adaptam-se bem a altas temperaturas
(FRANCO; LANDGRAF, 2008).
No momento da armazenagem, a qualidade do produto deve ser observada
pois apesar de microbiologicamente ser muito mais vantajoso as temperaturas de
refrigeração, certos produtos acabam tendo suas características organolépticas
deterioradas ou alteradas devido as baixas temperaturas (JAY, 2005).
2.2.2.2 Umidade relativa do ambiente
Este fator está relacionado com a aw do alimento. Alimentos com baixa aw e
armazenados em locais com alta umidade relativa tendem a absorver umidade e
vice-versa. Estas interações podem provocar alterações na capacidade de
desenvolvimento de microrganismos e ao mesmo tempo podendo alterar a qualidade
do produto (EVANGELISTA, 2008).
2.2.2.3 Composição gasosa do meio
Este fator irá determinar quais os tipos de microrganismos que irão
desenvolver-se no alimento. Microrganismos aeróbios irão desenvolver-se na
presença de oxigênio enquanto que na ausência do oxigênio os microrganismos
anaeróbios irão predominar (FRANCO; LANDGRAF, 2008).
Através de processos tecnológicos adequados é possível alterar-se a
composição gasosa do meio na qual o alimento encontra-se. O oxigênio pode ser
parcial ou totalmente substituído por outros gases (ou diferentes composições) como
nitrogênio, gás carbônico, monóxido de carbono, óxido nitroso e dióxido de enxofre
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
21
que possibilitam tempos de estocagem dos produtos maiores (EVANGELISTA, 2008;
FRANCO; LANDGRAF, 2008).
2.2.2.4 Conceito de obstáculos de barreiras
Através da determinação dos fatores extrínsecos e intrínsecos que atuam
sobre determinado alimento seria possível determinar-se facilmente quais tipos de
microrganismos estariam presentes e quais prevaleceriam além de determinar-se
prazos de validade muito mais seguros porém, deve-se considerar que estes fatores
não atuam de maneira isolada mas as diversas situações fazem com que atuem
sinergicamente ou antagonicamente (FRANCO; LANDGRAF, 2008).
A técnica das barreiras se refere a utilização conjunta de diversos fatores
para o controle dos microrganismos. Desta forma, processos de secagem,
acidificação, salga, conservantes químicos entre outros são aplicados em um
mesmo produto buscando obter um alimento mais seguro, estável e de maior vida de
prateleira (JAY, 2005).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
DOENÇAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS
As doenças transmitidas por alimentos (DTA) são relatadas na história
humana há milhares de anos porém, estas inicialmente sempre eram relacionadas a
intoxicações por produtos químicos ou venenos. Somente a partir do século XIX
tomou-se conhecimento e iniciaram-se estudos relacionados a doenças alimentares
causadas por microrganismos (BRASIL, 2005).
Embora os microrganismos estejam intimamente ligados as doenças
alimentares, vários outros fatores podem ser relacionados nestes tipos de doenças:
- Produtos químicos como metais pesados, pesticidas, herbicidas entre outros;
- Toxinas naturais de plantas e animais como alcalóides e histamina;
- Vírus como hepatite;
- Parasitas como amebas e helmintos, e
- Bactérias patogênicas e fungos toxigênicos.
Além destes fatores já citados (extrínsecos e intrínsecos) para o
desenvolvimento e predominância de um determinado microrganismo patogênico no
alimento, a contaminação deste não implica obrigatoriamente na ocorrência de uma
doença. Esta somente será deflagrada se o microrganismo patogênico ultrapassar
todos os mecanismos de defesa naturais que os indivíduos normais possuem
(FRANCO; LANDGRAF, 2008). Em geral, crianças, idosos e imunodeprimidos
apresentam maior suscetibilidade as DTA (BRASIL, 2005).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
23
Em geral, os sintomas mais comuns das DTA são a diarréia e vômitos
porém, sintomas como falta de apetite, náuseas e febre também podem acontecer.
Apesar disto, o estado físico da pessoa infectada e principalmente a patogenicidade
do microrganismo envolvido podem fazer com que os sintomas digestivos evoluam
para intoxicações extra-intestinais atingindo outros sistemas e órgãos como
meninges, rins, fígado, sistema nervoso central ou terminações nervosas periféricas.
Estes casos mais graves podem apresentar desidratação grave, diarréia
sanguinolenta, insuficiência renal aguda (síndrome hemolítica urêmica – SHU) e
insuficiência respiratória (no caso de botulismo) (BRASIL, 2005).
As DTA, devido aos diversos mecanismos de contaminação envolvidos,
podem ser divididas em:
- Intoxicação alimentar: a doença é causada pela ingestão do alimento já
contaminado por toxinas produzidas pelos microrganismos durante sua
proliferação. Estes contaminantes em sua grande maioria não apresentam
cheiro ou sabor e desencadeiam a doença mesmo após o microrganismo
fonte ter sido eliminado. Bactérias como Clostridium botulinum,
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e fungos produtores de micotoxinas
são exemplos de microrganismos que produzem toxinas.
- Infecção alimentar: alimentos contaminados com microrganismos patogênicos
vivos causam esta infecção. Nesta forma, após a ingestão, os microrganismos
proliferam-se e se aderem à mucosa do intestino. Bactérias como a
Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae
e Campylobacter jejuni destacam-se nesta forma de infecção (FRANCO;
LANDGRAF, 2008; BRASIL, 2005).
Mesmo quando o alimento já está pronto e fica disponível para o consumidor
final, este ainda fica suscetível a uma série de fatores que podem propiciar
contaminações indesejadas. Situações como temperaturas inadequadas de
cozimento, resfriamento e estocagem, higiene pessoal precária ou contaminações
cruzadas entre produtos crus e cozidos ou processados são os principais fatores que
podem contribuir para as contaminações (PELCZAR et al., 1997).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
24
3.1 Salmonella enteritidis
Este microrganismo pertence a família Enterobacteriaceae. A bactéria hoje
denominada pelo nome Salmonella em homenagem ao Dr. E. Salmon
(microbiologista americano) foi primeiramente chamada de Bacterium e,
posteriormente, Eberthela em honra a Heberth. Os primeiros relatos de
salmoneloses datam de 1.888 na Alemanha, por Gurtener que relatou a
contaminação de 59 pessoas com óbito de 1 jovem (EVANGELISTA, 2002).
As Salmonellas apresentam-se na forma de pequenos bastonetes curtos (1
a 2 µm), são Gram-negativas, anaeróbias facultativas e não formadoras de esporos.
Além disto, a Salmonella fermenta a glicose produzindo ácidos e gás sendo
incapazes de metabolizar a lactose e sacarose e a maioria das espécies é móvel (S.
galinarum e S. pullorum não são móveis). Pelo fato de não produzirem esporos, são
termosensíveis podendo ser destruídas a 60 °C por 15 a 20 minutos (FORSYTHE,
2002). Como características gerais, necessitam de pH próximo de 7,0 (valor ótimo)
para desenvolver-se (acima de 9,0 e abaixo de 4,0 são bactericidas) mas conforme o
tipo de ácido empregado estes valores podem mudar, não desenvolvem-se bem em
concentrações salinas superiores a 9%, nitrito possui efeito bactericida que pode ser
acentuado em pH ácido e apresentam temperatura ótima de crescimento de 35 °C a
37 °C (mínima em 5 °C e máxima de 47 °C) porém estudos indicam que estes
valores mínimos e máximos dependem do sorotipo da bactéria (FRANCO;
LANDGRAF, 2008).
Atualmente, as Salmonellas estão divididas em duas espécies: Salmonella
enterica e Salmonella bongori. São conhecidos mais de 2.000 sorovares que foram
divididas em subespécies (ou grupos) e classificadas nestas duas espécies (JAY,
2005).
A Salmonella é um microrganismo que é facilmente disseminado no meio
ambiente. Esta bactéria é encontrada preferencialmente no trato intestinal de
animais como pássaros em geral, galinhas, porcos, gatos, cachorros e no homem e
esporadicamente em insetos. A sua presença no trato intestinal possibilita a sua
excreção pelas fezes tornando sua disseminação muito fácil (através de insetos por
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
25
exemplo) no ambiente inclusive em águas poluídas. Assim ao ingerir-se alimentos
contaminados por estas águas poluídas, acaba formando-se um ciclo permanente
(JAY, 2005). Devido a isto e a sua facilidade de disseminação, Jay (2005) cita vários
estudos realizados onde foram detectadas contaminações de Salmonellas em
rações de animais, manipuladores de rações e criadores de frangos por diversos
sorotipos, vários tipos de alimentos como misturas de bolos e biscoitos, molhos de
salada, maionese e leite entre outros alimentos.
Apesar de serem divididas em grandes grupos, as doenças causadas pela
Salmonella podem ser divididas em 3 grupos: a febre tifóide causada pela S. typhy,
as febres entéricas causadas pela S. parathypy e as gastroenterites (salmoneloses)
causadas pelas demais salmonelas (FRANCO; LANDGRAF, 2008).
A febre tifóide ocorre somente no homem e é causada pela Salmonella typhy
e caracteriza-se pela transmissão por alimentos ou águas contaminadas com
material fecal humano. Essa doença apresenta sintomas graves como septicemia
(multiplicação do microrganismo no sangue), febre alta, diarréia e vômitos. Devido a
essas características infecciosas, os pacientes recuperados da febre tifóide podem
continuar excretando bacilos nas fezes por muitas semanas (meses ou anos até)
tornando-se portadores crônicos. Trabalhadores da indústria de alimentação e
profissionais da área de saúde que sejam portadores podem representar um grave
problema de saúde pública. As febres entéricas (Salmonella thypy) apresentam
características semelhantes porém, seus sintomas clínicos são mais brandos. Estas
febres são geralmente tratadas com cloranfenicol ou ampicilina (FRANCO;
LANDGRAF, 2008; PELCZAR et al., 1997).
As salmoneloses (gastroenterites) são caracterizadas por sintomas como
diarréia, febre, dores abdominais e vômitos. Em geral, 36 a 48 horas após a
ingestão do alimento contaminado (ou contato direto com o microrganismo) os
sintomas aparecem. Os sintomas desaparecem de 2 a 5 dias e geralmente estas
enterocolites não requerem tratamento com antibióticos (PELCZAR et al., 1997).
Devido as características próprias do microrganismo e, atualmente a
facilidade de trânsito de pessoas e de produtos industrializados ou não (apesar dos
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
26
controles sanitários), a Salmonella representa uma grande fonte de contaminações e
causadora de DTA. No Brasil, conforme dados da Secretaria de Vigilância em Saúde
(SVS/MS) (TABELA 3), de 1999 a 2009, de um total de 3.088 surtos comunicados e
que tiveram sua causa identificada, a Salmonella spp. foi a responsável por 1.313
surtos o que representa 42,5% do total (BRASIL, 2009).
Tabela 3 – Microrganismos mais freqüentes causadores de DTA. Agente Número de
etiológico surtos %
Salmonella spp. 1.313 42,5
Staphylococcus spp. 635 20,5
Bacillus cereus 219 7,0
Clostridium perfringens 154 4,9
Salmonella enteritidis 129 4,1
Shigella spp. 85 2,7
Outros 553 18,0
Fonte: Brasil, (2009).
Também conforme dados da Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS/MS),
entre as várias espécies de Salmonella, a S. enteritidis foi a que apresentou um
maior número de casos (GRÁFICO 1).
13 7 6 5 5 4 4 3 3 2 2 2 2 2 1 1 1 1
216
0
50
100
150
200
250
S. Ent
eritid
is
S. Inf
antis
S. Lon
don
S. Typ
himur
ium
S. Typ
hi
S. Cor
vallis
S. Sain
ttpau
l
S. Pan
ama
S. Pom
ona
S. Dub
lin
S. Heid
elber
g
S. Ana
tum
S. Der
by
S. Joh
anne
sbur
g
S. Bre
dene
y
S. New
port
S. San
Dieg
o
S. Sen
ftenb
erg
S. Jav
iana
Sorovar de Salmonella
Fre
qu
ênci
a
Gráfico 1 – Surtos de DTA por sorovar de Salmonella. Fonte: Brasil, (2009).
A S. enteritidis coloniza normalmente o canal ovopositor das galinhas que
causa a contaminação da gema durante a formação do ovo. Desta forma alimentos
envolvendo em sua composição ovos são os maiores responsáveis por este tipo de
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
27
contaminação (TABELA 4) (FRANCO; LANDGRAF, 2008). No Brasil, estes tipos de
alimentos são os mais relacionados com as DTA.
Tabela 4 - Alimentos causadores de DTA mais freqüentes. Número de
Alimentos surtos %
Ovos e produtos a base 928 22,8
Alimentos mistos 666 16,3
Carne vermelha e derivados 478 11,7
Sobremesas 438 10,7
Água 355 8,7
Leite e derivados 293 7,2
Outros 908 22,3
Fonte: Brasil, (2009).
Uma vez que a grande parte das salmoneloses são transmitidas por
alimentos contaminados, muitas vezes, medidas simples de controle ajudam a
prevenir:
- Preparo dos alimentos adequadamente: conservar os alimentos em locais
adequados (e sob refrigeração) que evita a proliferação dos microrganismos e
observar as temperaturas e o tempo de cozimento que elimina as possíveis
salmonelas presentes;
- Evitar o contato do alimento com roedores, insetos e outros animais que
possam ser fonte do microrganismo;
- Realizar exames periódicos em manipuladores de alimentos (principalmente)
buscando detectar portadores crônicos;
- Observar as boas práticas pessoais sanitárias e higiênicas tanto em
residências quanto em locais públicos (lanchonetes, bares, restaurantes)
(PELCZAR et al., 1997).
3.2 Escherichia coli
A Escherichia coli pertence a família Enterobacteriaceae. Este
microrganismo foi primeiramente denominado por Theodor von Escherich (em 1885)
sendo chamado inicialmente de Bacterium coli commune devido ter sido detectado
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
28
em todos os pacientes doentes (EVANGELISTA, 2002; JAY, 2005). A E. coli
juntamente com os gêneros Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella pertencem ao
grupo de microrganismos denominados de coliformes totais. Dentre estes, somente
a E. coli possui como hábitat principal o trato intestinal do homem e de animais e os
demais além de serem encontrados nas fezes podem ser encontrados em locais
como solo e vegetais onde podem resistir por tempos maiores do que bactérias
patogênicas de origem intestinal como a Salmonella e Shigella (FRANCO;
LANDGRAF, 2008).
Pelo fato do microrganismo E. coli ser de origem do trato intestinal tanto de
homens quanto de animais, a sua presença em contaminações alimentares indica
contaminação de origem fecal e desta forma indicando que o alimento foi
manipulado, produzido ou armazenado em condições higiênicas insatisfatórias e
além disto, sua presença pode indicar a possibilidade da ocorrência de infecções
alimentares pois este microrganismo é patogênico. A E. coli possui como
características principais: são bacilos Gram-negativos, não formadores de esporos e
capazes de fermentar a lactose produzindo ácidos e gás (em 24 horas a 44,5 °C a
45,5°C) (FRANCO; LANDGRAF, 2008; SILVA et al., 1997).
Assim como em um grande número de microrganismos, a presença de
coliformes ou E. coli no alimento pode não ser o problema principal, porém a
quantidade destes presentes sim. Sabe-se que métodos higiênicos de manipulação
e produção eliminam uma grande parte destes microrganismos e desta forma a sua
presença deixa de ter significado. A eliminação total destes nos alimentos (tanto de
frescos quanto processados) é muito difícil de forma que a sua quantificação em
muitos casos perde significado perante fato da presença destes. Desta forma Jay
(2008), cita como exemplos a presença destes nos produtos lácteos que indicam as
condições higiênico sanitárias das indústrias lácteas e dos produtores em geral e a
presença em vegetais (branqueados e congelados) que indicam problemas no
processo.
Devido suas características de virulência e aos efeitos destas, a E. coli está
dividida em cinco grupos (todos patogênicos):
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
29
- E. coli enteropatogênica (EPEC): microrganismo causador de diarréias
principalmente em recém nascidos e lactantes que são mais suscetíveis. Este
sorotipo é o causador dos casos mais graves de doenças.
- E. coli enteroinvasiva (EIEC): este sorotipo causa sintomas clínicos como
cólicas abdominais, diarréia, febre e mal estar. Ataca principalmente crianças
maiores e adultos.
- E. coli enterotoxigênica (ETEC): causa diarréias em crianças e adultos. Este
microrganismo está muito associado a “diarréia dos viajantes” estando ligada
principalmente a casos onde as condições de saneamento são precárias.
- E. coli entero-hemorrágica (EHEC): microrganismos desta cepa pertencem os
sorotipos O157:H7. Provocam colite hemorrágica que causa dores
abdominais fortes e diarréia aguda (seguida de diarréia sanguinolenta)
diferenciando-se dos demais sorotipos pela ausência de febre e grande
quantidade de sangue nas fezes. Em casos mais graves pode evoluir para a
síndrome urêmica hemolítica (HUS). As contaminações por este
microrganismo podem estar associadas a um grande número de alimentos
como carnes, leites e aves. Porém, pelo fato do gado ser seu habitat normal,
os alimentos de origem animal estão mais relacionados com estas
contaminações.
- E. coli enteroagregativa (EAggEC): difere dos demais microrganismos pelo
fato das diarréias persistentes com duração superior a 14 dias infectando
principalmente crianças (FRANCO; LADGRAF, 2008).
No Brasil, casos de intoxicações pela E. coli representam um fator de
preocupação para as autoridades de saúde (GRÁFICO 2) uma vez que a síndrome
hemolítica urêmica (E. coli O157:H7) é considerada uma DTA emergente devido ao
grande número de casos e surtos que tem-se verificado nos últimos anos (BRASIL,
2005).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
30
1313
635303 227 219 167 154 129 86 85 41 16 15 15 13 11 9 9
2872
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Igno
rado
Salmon
ella
spp.
Staph
yloco
ccus
spp.
Hepat
ite A
Bacillu
s cer
eus
Rotav
irus
Clostri
dium
per
fring
ens
Salmon
ella
Enter
itidis
Colifo
rmes
feca
is
Shigell
a sp
p.
Clostri
dium
bot
ulinu
m
Outro
s par
asita
s
Salmon
ella
Typhi
Crypt
ospo
ridium
Novov
irus
Microrganismo causador DTA
Nú
mer
o d
e su
rto
s
Gráfico 2 – Surtos de DTA por microrganismo causador Fonte: Adaptado Brasil, (2009).
De um modo geral, a sensibilidade da E. coli a temperatura é bastante
grande de modo que tomando-se cuidados com o cozimento dos alimentos evitaria-
se muitas possibilidades de contaminações. Jay (2005) cita também que entre 16
fatores de contaminação, 5 foram verificados com maior freqüência: refrigeração
inadequada (25,5% dos casos), alimentos preparados com muita antecedência,
manipuladores infectados com hábitos de higiene insuficientes, cozimento ou
processamento inadequado e alimentos cozidos com temperaturas que favorecem o
crescimento bacteriano.
3.3 Avaliação da atividade antimicrobiana
Os microrganismos contaminantes apresentam diferentes padrões de
sensibilidade frente as substâncias antimicrobianas devido principalmente aos
complexos mecanismos de ação destas substâncias sobre os microrganismos
(BLACK, 2002).
Para a determinação da ação antimicrobiana de determinada substância
frente a algum microrganismo, geralmente são utilizados os métodos de diluição ou
da difusão em disco. O método da diluição é também denominado de concentração
inibitória mínima (CIM), ambos são eficientes e rotineiramente utilizados (BLACK,
2002).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
31
Através do teste CIM pode-se determinar a menor quantidade da substância
antimicrobiana necessária para inibir o desenvolvimento do microrganismo
(MADIGAN et al., 2004). O teste consiste na aplicação de um meio contendo uma
quantidade constante do microrganismo teste em uma série de tubos (ou placas de
microdiluição) que contenham concentrações decrescentes da substância
antimicrobiana. Após período de incubação, os tubos são verificados (o crescimento
microbiano é caracterizado pela turvação do meio) e a concentração menor do
agente microbiano no qual não houve o crescimento bacteriano é denominada de
CIM (BLACK, 2002).
Apesar da larga utilização, o teste da CIM pode apresentar variações para
uma mesma determinada substância uma vez que o teste pode ser influenciado pelo
tipo de microrganismo, a composição do meio de cultura e tempo e condições de
incubação (pH, temperatura e aeração). Porém, através da utilização de condições
padronizadas, pode-se obter resultados e comparar diferentes substâncias
antimicrobianas verificando-se e determinando-se a eficiência contra determinado
microrganismo ou até mesmo avaliar a atividade antimicrobiana desta substância
frente a diversos microrganismos (MADIGAN et al., 2004).
A versatilidade de teste CIM (método de diluição) possibilita a realização de
uma segunda etapa através da qual pode-se diferenciar substâncias bactericidas
(que matam microrganismos) de substâncias bacteriostáticas (que inibem o
crescimento). Isto pode ser verificado através dos tubos onde não verificou-se o
crescimento bacteriano mas que ainda podem conter microrganismos que foram
somente inibidos os quais destes são retiradas amostras que são inoculadas em
meios de cultura que não contenham a substância antimicrobiana. A verificação do
resultado faz-se observando a concentração mais baixa da substância bactericida
que não possibilite a crescimento microbiano na segunda inoculação. Este resultado
constitui a concentração bactericida mínima (CBM) (BLACK, 2002).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
A INDÚSTRIA DE PRODUTOS CÁRNEOS
A indústria de produtos cárneos é um dos setores industriais mais antigos da
história do homem com referências sendo citadas no livro XVIII da Odisséia (900
a.C.) onde falasse de tripas de cabras recheadas com sangue e gordura. A partir
daí, outros povos e civilizações adotaram e aperfeiçoaram estes processos de
manipulação e preparo o que possibilitou a popularização e diversificação destes
tipos de produtos cárneos entre a população (ORDÓÑEZ, 2005).
A carne, como alimento, naturalmente é um produto muito perecível devido a
suas características químicas e principalmente devido a sua elevada atividade de
água. O homem, para ter produtos menos perecíveis e de melhores qualidades
sensoriais, desenvolveu e aprimorou novos processos e matérias primas que
possibilitaram a obtenção de produtos de qualidade muito superior. Processos de
corte, embutimento, misturas de sal, condimentos e ervas aromáticas possibilitaram
a produção de embutidos de sabor e odor muito agradáveis (ORDÓÑEZ, 2005).
Juntamente com estas melhorias e processos, a adição de substâncias
conservantes (naturais ou sintéticas) visando uma produção segura e
conseqüentemente garantindo (ou aumentando) a vida de prateleira do alimento
tem-se tornado cada vez mais necessária e utilizada (FORSYTHE, 2002).
Estas substâncias denominadas conservantes possuem propriedades
antimicrobianas atuando principalmente inibindo o crescimento e desenvolvimento
de microrganismos patogênicos ou não. Alguns processos físicos utilizados no
controle microbiológico dos alimentos como refrigeração, congelamento,
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
33
pasteurização e esterilização entre outros, apresentam algumas limitações
(alterando características organolépticas do alimento) sendo este um dos principais
fatores que torna necessária e extremamente útil a utilização dos conservantes
químicos além do que na maioria das situações a utilização de processos físicos
conjuntamente com os conservantes possibilita a obtenção de resultados melhores
(ARAÚJO, 2008).
A quantidade de substâncias permitidas e utilizadas como conservantes não
é muito grande dentre as quais pode-se destacar:
- Ácidos lipofílicos e derivados: ácido benzóico, ácido sórbico e ácido
propiônico e seus respectivos sais de sódio, potássio e cálcio;
- Nitratos e nitritos;
- Dióxido de enxofre e derivados;
- Nisina, e
- Natamicina.
Nesta classificação como conservantes não incluem-se os sais comuns,
vinagres e açúcares e condimentos ou seus óleos essenciais. Devido a diversidade
de alimentos e possibilidades de utilização, para o uso destas substâncias deve-se
observar fatores como:
- Concentração: deve ser compatível possibilitando a inativação dos
microrganismos;
- Temperatura de estocagem: geralmente, a toxicidade da substância aumenta
proporcionalmente a temperatura. Porém, se a temperatura de estocagem
estiver próxima da ideal para o desenvolvimento de microrganismos isto pode
reduzir a ação do conservante;
- Tipo e número de microrganismos presentes: os diferentes microrganismos
atuam de maneira diferenciada no substrato além de estarem presentes em
quantidade diferentes o que pode prejudicar a ação dos conservantes
(FRANCO; LANDGRAF, 2008).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
34
4.1 Condimentos e especiarias
Estes compostos, quando utilizados na composição do alimento, por
possibilitarem aos alimentos melhora nas características organolépticas podem ser
considerados de ação coadjuvante (EVANGELISTA, 2008).
O interesse por estas substâncias de origem natural tem aumentado
consideravelmente nos últimos anos principalmente devido ao interesse dos
consumidores por consumir produtos cada vez mais livres (ou com quantidades
reduzidas) de substâncias conservantes. Porém, sabe-se que juntamente com isto, o
consumidor exige produtos de alta qualidade e somente com a utilização destas
substâncias naturais isto se tornaria inviável o que talvez realça o maior benefício
destas substâncias: a possibilidade de atuarem conjuntamente potencializando
outros agentes microbianos. Além disto, deve-se destacar as propriedades
organolépticas (sabores e odores) que as especiarias podem transmitir
conjuntamente ao alimento (SOUZA et al., 2003).
Conforme destaca Riedel (2005), os condimentos em sua grande maioria
são utilizados com a finalidade única de melhorar o gosto dos alimentos sendo que
as qualidades bactericidas desta não podem ser provadas na prática uma vez que
as quantidades de condimentos utilizados em relação ao produto são muito
pequenas. Outro fator destacado está relacionado com a possibilidade de
contaminações microbiológicas ocorrerem a partir dos condimentos uma vez que
estes estão diretamente em contato (quando no estado “in natura”) com fontes de
contaminação em potencial (ar, água, solo). Apesar de atualmente uma grande
gama de condimentos serem industrializados, estes não estão estéreis e apesar de
contarem com substâncias bactericidas, o fato de na maioria das vezes os
condimentos estarem na forma de pós secos, acaba dificultando sua atuação
bactericida sobre os microrganismos que poderiam estar presentes.
Segundo Jay (2005), os efeitos antimicrobianos destas substâncias, além da
dificuldade de serem determinados, mudam consideravelmente conforme a
composição do produto (alimento) aplicado e principalmente conforme as
concentrações dos agentes antimicrobianos que compõe estas substâncias. Apesar
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
35
disto, a atividade antimicrobiana de um grande número destes compostos é
comprovadamente eficaz e um grande número de pesquisas e trabalhos a respeito
já foram realizados.
A utilização destes condimentos como agentes antimicrobianos é geralmente
feita a partir da utilização dos seus respectivos óleos essenciais (principalmente) ou
extratos. Os óleos essenciais apresentam uma composição química complexa
formada por hidrocarbonetos (terpenos e sesquiterpenos), álcoois e compostos
carbonílicos. Os extratos compreendem material resinoso constituído de lipídios,
ceras, pigmentos e uma série de outras substâncias características do condimento
(ARAÚJO, 2008).
A utilização dos óleos essenciais e extratos também possibilita a
manutenção das principais características dos condimentos. A uso de condimentos
na forma de pós potencializa principalmente a perda de aromas além do que como
qualquer produto possui uma validade relativamente pequena. A utilização destes
condimentes na forma de óleos essenciais e extratos permite que estas
características sejam preservadas mais facilmente (ARAÚJO, 2008).
Devido principalmente a fatores intrínsecos e a diversidade de
microrganismos contaminantes, os condimentos naturais apresentam menor
eficiência bactericida quando aplicados nos alimentos do que quando aplicados em
testes (meios de cultura). As bactérias do tipo Gram-negativas (as bactérias lácticas
são as mais resistentes) apresentam maior resistência que as Gram-positivas e os
fungos apresentam maior sensibilidade que as Gram-negativas (JAY, 2005).
As substâncias antimicrobianas atuam na maioria das vezes sobre uma
estrutura ou função microbiana que as difere das demais. Estas diferenças são as
responsáveis pelo efeito bactericida pelo qual o microrganismo é eliminado
completamente ou pelo efeito bacteriostático no qual o crescimento do
microrganismo é inibido. As formas e mecanismos de atuação das substâncias
antimicrobianas são por vezes pouco conhecidos e explicados devido a
complexidade das situações porém, alguns modos de ação são conhecidos:
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
36
- Inibição da síntese da parede celular: a parede celular externa rígida
(peptidioglicano) é uma das características das bactérias Gram-positivas e de
fungos. As substâncias antimicrobianas (anel β-lactâmico) impedem a síntese
da parede celular promovendo a lise da célula;
- Destruição da função da membrana celular: microrganismos possuem em sua
membrana externa substâncias denominadas fosfolipídios (característica de
bactérias Gram-negativas) que são atacadas pelas substâncias
antimicrobianas possibilitando a destruição do microrganismo;
- Inibição da síntese de proteínas: as substâncias atuam seletivamente sobre a
síntese protéica dos ribossomos;
- Inibição da síntese de ácidos nucléicos: os antimicrobianos agem
seletivamente sobre enzimas presentes nas células bacterianas;
- Ação como antimetabólitos: estas substâncias atuam impedindo a utilização
de metabólitos que são essenciais para o desenvolvimento e sobrevivência do
microrganismo devido possuírem estruturas muito parecidas com os
metabólitos. São muito utilizados no combate a infecções virais (BLACK,
2002).
4.2 Louro – uma erva condimentar
Na antiguidade, os povos mediterrâneos sempre demonstraram um forte
sentimento em relação a sua terra, sua história antiga e a seus costumes culinários.
Isto fez com que uma grande quantidade de folhas, flores e frutos de ervas e árvores
passassem a ornamentar e a temperar uma grande variedade de pratos culinários.
Nesta grande variedade de ervas condimentares que passaram a ser cultivadas, o
louro (Laurus nobilis – que significa louro nobre), foi uma das espécies que
facilmente difundiu-se e popularizou-se em todo o mundo. Para estes povos antigos,
o loureiro seria proveniente do amor que Apolo sentia pela ninfa Dafne que fugindo
deste teria recorrido a Zeus que acaba transformando-a na árvore de louro. Apolo
fez do loureiro sua árvore (para não perder o amor de Dafne) e passou a usar coroas
de folhas de louro em sua cabeça para celebrar este amor. Desta forma nasceu o
costume, que mais tarde foi muito difundido pelos romanos de coroar imperadores
com coroas de louro que representariam o triunfo, a vitória destes (PELT, 2003).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
37
Segundo informativo da Embrapa (2007), o louro (Laurus nobilis L.) é uma
planta da família Lauraceae que pode atingir 15 metros de altura, de casca lisa e
escura, que apresenta folhas persistentes, pecioladas, alternadas, elípticas ou
lanceoladas de coloração verde brilhante (na parte superior) e verde pálida (na parte
inferior) e com flores pedunculares de coloração amarelada. Suas flores masculinas
e femininas desenvolvem-se em plantas separadas e o fruto (baga) amadurecido
apresenta coloração negra.
Conforme Fochesato et al., (2006), a planta de louro pode ser utilizada em
projetos paisagísticos além de representar uma fonte de renda, pois também é fonte
de madeira e suas folhas são utilizadas como aromatizantes na culinária. Conforme
pesquisas de Cardoso et al., (2010), as folhas de louro podem ser utilizadas como
tempero em carnes vermelhas, brancas e peixes, feijão e ervilhas, cremes de leite,
ovos e pudins além de possuírem usos terapêuticos atuando contra o cansaço
muscular e contusões, auxilia no tratamento de hemorróidas, reumatismo e dores de
cólicas menstruais. Suas folhas quando preparadas em infusão ajudam na digestão
e estimulam o apetite.
Como várias outras espécies de árvores e ervas aromáticas, as folhas de
louro possuem em sua composição os óleos essenciais. Os óleos essenciais são
substâncias voláteis, formadas por complexos compostos que caracterizam-se pelo
forte odor (compostos aromáticos e metabólitos secundários) apresentando-se com
coloração límpida (raramente são coloridos), apresentam solubilidade em lipídios e
solventes orgânicos e com densidade mais baixa que a água (em geral). Como
estão presentes em toda a planta, os óleos essenciais podem ser extraídos de todas
as partes da planta: folhas, flores, frutos, caule, raízes ou casca. Estes óleos
também são importantes para a planta pois são agentes antimicrobianos, antivirais,
antifúngicos e inseticidas naturais que atuam de maneira a proteger a planta. Seu
forte e característico odor também atrai alguns tipos de insetos que atuam
dispersando o pólen e sementes e espanta alguns tipos de herbívoros que iriam
alimentar-se de suas folhas (BAKALLI et al., 2008). Conforme estudos de Corato et
al., (2010) e Polovka et al., (2010), a composição química do óleo essencial do louro
apresentou os compostos: 1,8 cineol, eugenol, acetil e metil eugenol, α e β-pineno,
felandreno, linalol, geraniol e terpeniol. Porém, vários autores (BAKALLI et al., 2010;
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
38
OUSSALAH et al., 2006 e LIRA et al., 2009) citam que a extração e composição dos
óleos essenciais (de todas espécies vegetais) pode variar em função do clima,
composição do solo, órgão da planta do qual foi extraído (flor, folha..), ciclo
vegetativo da planta e idade da mesma.
Devido a suas propriedades antimicrobianas, o óleo essencial de louro já
teve vários relatos de casos de sua atuação bactericida em alimentos: Oussalah et
al., (2006) obteve baixa atividade antimicrobiana frente a Pseudomonas putida,
Tajkarimi et al., (2010) relata que o louro tem propriedades bacteriostáticas inibindo
a deterioração e a patogenicidade de microrganismos e que o óleo essencial foi
testado contra Listeria monocytogenes e Salmonella enteritidis em queijos moles
obtendo bons resultados, Corato et al., (2010) obteve atividade antifúngica muito boa
do óleo quando aplicado em kivis e pêssegos, Muñoz et al., (2009) observou
significativa redução na velocidade e taxa de crescimento da Listeria monocytogenes
quando exposta os extratos aplicado no suco de brócolis. Já Morais et al., (2009) e
Hinneburg et al., (2006) relatam bons resultados obtidos a partir de extratos para
fins antioxidantes.
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 Material vegetal
As amostras das quais foram realizados os testes CIM são duas: uma
amostra íntegra e outra desidratada. A amostra íntegra constitui amostra de folhas
de louro “in natura” as quais foram coletadas em Encantado/RS em agosto de 2010.
A amostra desidratada refere-se a de um preparado comercial de folhas de louro
desidratadas e moídas (data de validade maio/2012) adquirido no comércio local.
5.2 Extração do extrato etanólico
Após a coleta das folhas, o material vegetal foi lavado em água corrente
para retirada de sujidades, de folhas danificadas e galhos maiores. Após levou-se
todo o material para estufa de secagem a aproximadamente 40 °C por 24 horas.
Após as folhas estarem secas, estas foram trituradas em liquidificador
industrial. O material triturado foi passado em uma peneira (de granulometria média)
a fim de reter galhos e o material mais grosso recolhendo-se o restante do material.
A partir deste material, foram pesadas duas alíquotas de 100 g que foram
transferidas para frasco âmbar no qual adicionou-se 1000 mL de álcool etílico 90%.
Estes frascos foram mantidos por 7 dias em ambiente escuro e em repouso. A partir
desta etapa, os procedimentos foram realizados também com a amostra seca.
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
40
Passado o tempo, as amostras foram filtradas à vácuo (separadamente)
onde recolheu-se o filtrado em frascos receptores (extrato etanólico). O solvente
destes extratos foram removidos em evaporador rotatório, sob pressão reduzida e
em banho quente (40 °C). Os extratos obtidos foram recolhidos em frascos
adequados, identificados e armazenados sob refrigeração.
5.3 Avaliação da atividade antimicrobiana
A análise da atividade antimicrobiana dos extratos etanólicos da Laurus
nobilis L. foi feito através do método de microdiluição (CIM). Foram utilizadas as
cepas ATCC (Amercican Type Culture Collection) dos microrganismos:
- Salmonella enteritidis (ATCC 13076)
- Echerichia coli (ATCC 25922)
Como solução antibiótica padrão foi utilizado cloranfenicol 0,2 mg/mL-1 e
como solvente para os extratos foi utilizado o dimetilsulfóxido (DMSO).
5.3.1 Procedimentos
Os procedimentos realizados para o preparo dos reagentes e soluções
utilizados foram os seguintes:
- Meio ágar nutriente: foram pesados 2,53 g do meio, dissolvidos em 110 mL de
água destilada e levado para autoclavar (121°C por 20 minutos). Após, a
solução foi transferida para as placas de Petry, aguardado sua solidificação,
identificadas e armazenadas em refrigeração.
- Solução padrão de turvação 0,5 McFarland: foram misturados 0,05 mL de
solução de cloreto bário 0,048 M e 9,95 mL de ácido sulfúrico 0,18 M.
- Solução salina 0,8%: foram pesados 0,8 g de cloreto de sódio P.A.,
transferidos para balão volumétrico de 100 mL, dissolvido e avolumado com
água destilada.
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
41
- Meio caseína de soja: foram pesados 9,00 g do meio, dissolvidos em 300 mL
de água destilada e levado para autoclavar (121 °C por 20 minutos). Após, a
solução foi transferida para tubos de ensaio e armazenadas sob refrigeração.
- Solução de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) 0,5%: foram pesados 0,5 g de
cloreto de trifeniltetrazólio, transferidos para balão volumétrico de 100 mL e
avolumado com água destilada. Após, foi transferido para frasco âmbar,
identificado e armazenado sob refrigeração.
- Solução cloranfenicol 0,2 mg/mL-1: foi transferido uma alíquota de 500 µL de
colírio oftalmológico 4 mg/mL para balão volumétrico de 10 mL sendo após
avolumado com água destilada estéril. O balão foi identificado e armazenado
sob refrigeração.
- Meio ágar Mueller-Hinton: pesaram-se 1,52 g do meio que foram dissolvidos
em 400 mL de água destilada e levado para autoclavar (121 °C por 20
minutos). Após, a solução foi transferida para as placas de Petry, aguardado
sua solidificação, identificadas e armazenadas em refrigeração.
Inicialmente, foram pesados 0,100 g (e 1,00 g quando os procedimentos
foram repetidos com concentrações maiores) de cada uma das amostras dos
extratos etanólicos em béquer, dissolvidos em uma pequena quantidade de
dimetilsulfóxido sendo após transferidos para balão volumétrico de 10 mL e
avolumado com o mesmo solvente. Os balões foram identificados e armazenados
sob refrigeração.
A partir das cepas de bactérias originais, estas foram inoculadas em placas
de Petry contendo o meio de cultura ágar nutriente, identificadas e incubadas em
estufa bacteriológica a 36±2 °C por 24 horas. A partir do desenvolvimento destas
culturas, com o auxílio de swab inoculou-se as mesmas em tubos de ensaio
contendo a solução salina 0,8% (agitando-se vigorosamente). Após, foi comparado
visualmente a turvação desta solução frente à solução 0,5 McFarland onde foi
observado a turvação das mesmas. Após isto com o auxílio de pipetador automático
(e de ponteiras adequadas) foram transferidos 200 µL das soluções contendo os
microrganismos para tubos de ensaio contendo meio caseína de soja. Os tubos
foram agitados vigorosamente, identificados e separados. Após isto foi transferido 1
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
42
mL destas soluções para novos tubos de ensaio com o caldo caseína de soja os
quais juntou-se também 100 µL das soluções dos extratos etanólicos
(previamente dissolvidos em dimetilsulfóxido) sendo após os tubos agitados e
identificados apropriadamente. As amostras foram separadas.
Com o pipetador automático, foram transferidas alíquotas de 100 µL
do meio caseína de soja (meio de cultura) para cada um dos poços da placa
estéril (96 poços divididos em 12 colunas de 8 poços cada) com exceção dos
poços de controle necessários.
A partir disto, com as amostras dos extratos etanólicos nos tubos de
ensaio, foram transferidas alíquotas de 100 µL para os primeiros poços das
placas, em triplicata. Depois disto, com auxílio de um pipetador automático
foram feitas diluições seriadas destas amostras (nos 100 µL do meio de
cultura já previamente inoculado) nos demais poços que resultaram nas
concentrações de: 500 µg/mL, 250 µg/mL, 125 µg/mL, 62,5 µg/mL, 31,2
µg/mL e 15,6 µg/mL. Na segunda etapa quando os procedimentos foram
repetidos, as concentrações obtidas foram as seguintes: 5000 µg/mL, 1250
µg/mL, 625 µg/mL, 312,5 µg/mL e 156,2 µg/mL.
Nestas mesmas placas, também foram realizados os controles para o
solvente dimetilsulfóxido (meio de cultura inoculado e solvente sem amostra), para o
inoculo (meio cultura inoculado sem amostra), para o meio de cultura (sem inoculo e
sem amostra) e também para o padrão antibiótico cloranfenicol que após as
diluições seriadas ficaram com as concentrações: 25 µg/mL, 12,5 µg/mL, 6,25
µg/mL, 3,12 µg/mL, 1,56 µg/mL e 7,81 µg/mL.
Finalizadas as diluições, as placas devidamente identificadas foram
incubadas em estufa a 36±2 °C por 24 horas. Após este período, as placas foram
observadas visualmente (o crescimento bacteriano é confirmado pela turvação do
meio) e devido ao fato dos extratos etanólicos apresentarem uma coloração
escurecida (mesmo após as diluições), foram aplicadas sobre as mesmas vários
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
43
borrifos da solução de cloreto de trifeniltetrazólio 0,5% que possibilita uma melhor
confirmação do crescimento bacteriano pelo desenvolvimento de coloração
avermelhada nos poços.
Após a verificação dos resultados com a aplicação da solução de cloreto de
trifeniltetrazólio 0,5%, para a confirmação do crescimento bacteriano, foram retiradas
pequenas alíquotas (com auxílio de alça de platina) de cada uma das séries de
diluições e inoculadas novamente em placas de Petry (meio de cultura Mueller-
Hinton) e após sendo incubadas em estufa 36±2 °C por 24 horas. Após o período de
incubação, as placas foram observadas visualmente sendo após os resultados
verificados anotados.
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Conforme já descrito, os extratos etanólicos de folhas de louro utilizados nos
testes foram duas sendo identificadas como: amostra íntegra que representa o
extrato proveniente de folhas “in natura” (colhidas recentemente) e amostra
desidratada que identifica o extrato produzido a partir de um preparado comercial (de
folhas secas desidratadas e moídas) adquirido no comércio local.
Após realizadas as extrações do material, os extratos etanólicos
apresentaram coloração verde escura e odor característico do louro (FIGURAS 1 e
2).
Figura 1 – Extrato etanólico amostra íntegra Fonte: autor
Figura 2 – Extrato etanólico amostra desidratada Fonte: autor
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
45
Apesar de muitas pesquisas relatando atividade antimicrobiana do óleo
essencial de folhas de louro (OUSSALAH et al., (2006), TAJKARIMI et al., (2010),
CORATO et al., (2010), MUÑOZ et al., (2009) entre outros), os estudos relacionando
extratos aquosos ou etanólico são poucos: Bara e Vanetti (2006) não observaram
atividade bactericida do extrato etanólico frente às bactérias E.coli, S. typhymurium,
S. aureus, L. monocytogenes e Yersinia enterocolitica, Shan et al., (2007) observou
atividade do extrato aquoso frente às bactérias B. cereus, L. monocytogenes e S.
aureus não obtendo resultados frente a E. coli e S. anatum e Sagdiç et al., (2003)
não observou atividade bactericida do extrato aquoso (hidrossol) frente às bactérias
Bacillus amyloliquefaciens, B. brevis, B. cereus , B. subtilis var. niger, Enterobacter
aerogenes, Escherichia coli, E. coli O157:H7, Klebsiella pneumoniae, Proteus
vulgaris , Salmonella enteritidis, S. gallinarum, S. typhimurium, Staphylococcus
aureus, S. aureus e Yersinia enterocolitica. Já Mariutti et al., (2008), Morais et al.,
(2009), Hinneburg et al., (2006) observaram bons resultados do extrato como
substância antioxidante.
Desta forma para verificar-se CIM do extrato etanólico de folhas de louro, os
testes foram realizados em 2 etapas: a primeira nas concentrações de 500 µg/mL,
250 µg/mL, 125 µg/mL, 62,5 µg/mL, 31,2 µg/mL e 15,6 µL/mL e na segunda
etapa nas concentrações de 5000 µg/mL, 1250 µg/mL, 625 µg/mL, 312,5
µg/mL e 156,2 µg/mL. Os resultados verificados podem ser observados nas
tabelas abaixo (TABELAS 5 e 6) frente aos microrganismos E. coli e S. enteritidis.
Tabela 5 – Resultados de concentração inibitória mínima (CIM) do microrganismo Escherichia coli.
Amostra Amostra
Concentração íntegra seca
substrato (µg/mL) Coluna poços poços Resultado
5000 A 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 NA*
2500 B 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 NA*
1250 C 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 NA*
625 D 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 NA*
312,5 E 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 NA*
156,2 F 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 NA*
*NA: não ativo Fonte: autor
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
46
Tabela 6 – Resultados de concentração inibitória mínima (CIM) do microrganismo Samonella enteritidis.
Amostra Amostra
Concentração íntegra seca
substrato (µg/mL) Coluna poços poços Resultado
5000 A 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 NA*
2500 B 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 NA*
1250 C 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 NA*
625 D 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 NA*
312,5 E 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 NA*
156,2 F 1 - 2 - 3 4 - 5 - 6 NA*
*NA: não ativo Fonte: autor
Conforme relata Rios et al., (2005), testes para determinação de atividade
antimicrobiana a partir de substâncias naturais devem ser evitados com quantidades
superiores a 1 mg/ml para extratos e 0,1 mg/ml para os compostos isoladamente e
também segundo este, a atividade antimicrobiana quando comprovada é
interessante para concentrações abaixo de 100 µg/ml para extratos e 10 µg/ml
para os compostos isolados. Os testes realizados nas concentrações
determinadas ficaram de acordo com o sugerido por este autor
compreendendo concentrações acima e abaixo do especificado.
Conforme resultados observados, o extrato etanólico não apresentou
atividade antimicrobiana em nenhuma das concentrações frente às 2 bactérias
testadas. Pode-se observar isto também pela coloração avermelhada adquirida após
a aplicação do TTC (FIGURAS 3 e 4) que é indicativo de turvação e conseqüente
crescimento microbiano.
Observando-se as figuras abaixo (FIGURAS 3 e 4), pode-se observar que os
poços correspondentes aos controles tiveram os resultados esperados.
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
47
Figura 3 – Placas de CIM da primeira etapa após aplicação TTC Fonte: autor.
placa S. enteritidis -
primeira etapa após
aplicação do TTC
placa E. coli -
primeira etapa após
aplicação TTC
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
48
Figura 4 – Placas de CIM da segunda etapa após aplicação TTC Fonte: autor.
Pode-se observar que os poços 7, 8 e 9 (colunas A, B, C, D, E e F)
correspondentes ao controle com solução de cloranfenicol não apresentou turvação
inicial nem coloração avermelhada após a aplicação da solução de cloreto de
trifeniltetrazólio. Este resultado confirmou que a solução antibiótica nas
concentrações testadas teve atividade bactericida frente às 2 bactérias testadas.
Já os poços 10, 11 e 12 (colunas A, B, C, D, E e F) são referentes ao
controle do solvente dimetilsulfóxido o qual pode-se observar apresentou turvação
inicial e coloração avermelhada (em diferentes tonalidades) em todas as
concentrações testadas após a aplicação da solução de cloreto de trifeniltetrazólio.
Isto confirma que o solvente não possui capacidade para inibir o desenvolvimento
placa S. enteritidis
segunda etapa após
aplicação TTC
placa E. coli -
segunda etapa após
aplicação TTC
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
49
dos microrganismos não sendo este o responsável por eventuais resultados
negativos quanto a atividade bactericida dos extratos.
A coluna G (das 4 placas) corresponde ao controle do inoculo no qual
observa-se coloração avermelhada em todos os poços. Este resultado comprova
que os microrganismos foram capazes de desenvolver-se no meio de cultura
utilizado sendo que este não influenciou nos resultados negativos dos demais
extratos.
A coluna H da placa da primeira etapa do microrganismo S. enteritidis (que
deveria corresponder a um controle) apresentou turvação inicial e coloração
avermelhada devido a erro analítico no qual foi inoculado o microrganismo
indevidamente e desta forma esta coluna não é considerada como controle nesta
placa.
As colunas H das demais placas correspondem ao controle do meio de
cultura o qual não apresentou turvação ou coloração avermelhada o que comprova
que o meio utilizado não apresentava contaminações. Observa-se na placa E. coli
segunda etapa os poços 1, 2 e 12 coloração avermelhada que provavelmente
decorrem de alguma contaminação durante o preparo das placas.
Os resultados das atividades antimicrobianas obtidos nos testes estão de
acordo com os resultados obtidos por Shan et al., (2007) que também não observou
atividade antimicrobiana do extrato frente a E. coli e Salmonella anatum. Conforme
suas pesquisas, que também testou outras bactérias Gram-positivas, estas
apresentaram em sua grande maioria maior sensibilidade bactericida quando
comparadas com as bactérias Gram-negativas e isto foi observado na medida em
que a E. coli e Salmonella anatum não apresentaram atividade antimicrobiana. Em
seu trabalho também, a E. coli apresentou uma resistência maior em relação a S.
anatum. Sagdiç et al., (2003), além de não ter observado eficiência bactericida do
extrato de louro frente a estas bactérias Gram-negativas, ressalta que os efeitos
antimicrobianos também podem variar conforme os tipos de condimentos testados e
das condições ambientais em que estes condimentos naturais desenvolveram-se.
Da mesma forma Bakkali et al., (2010), Oussalah et al., (2006) e Lira et al., (2009) e
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
50
Marino et al., (2001) observam que as composições dos óleos essenciais (não
somente do louro mas também de outras espécies vegetais) podem variar devido a
fatores como o clima do local, estação da colheita, composição do solo, idade e ciclo
vegetativo da planta além da parte da planta da qual este óleo é extraído.
Nos testes realizados, quando comparados os resultados finais das placas
contendo os microrganismos, é possível observar pela intensidade da coloração
avermelhada que a Escherichia coli está mais intensa pressupondo um crescimento
microbiano maior e conseqüentemente uma resistência maior ao extrato etanólico e
que a placa com a Salmonella enteritidis apresenta uma coloração menos intensa
indicando um crescimento microbiano menor e conseqüente menor resistência ao
extrato etanólico de folhas de louro.
Os resultados negativos obtidos do extrato etanólico de folhas de louro
frente as bactérias Gram-negativas testadas podem ser devido as características
estruturais destas bactérias que acabam dificultando ou impedindo a ação das
substâncias antimicrobianas. Sabe-se que as bactérias Gram-negativas (E coli e
Salmonella enteritidis) possuem uma membrana externa rica em fosfolipídios que
acaba representando uma barreira a mais para a ação antibiótica de determinadas
substâncias. Geralmente, as substâncias antimicrobianas atuam destruindo a parede
celular e membrana citoplasmática das bactérias que acaba resultando na
coagulação e destruição do citoplasma. Estes mecanismos de atuação são relatados
por Shan et al., (2007), Tajkarimi et al., (2010), Souza et al., (2003) e Tassou et al.,
(2000).
Os resultados para as confirmações de crescimento microbiano em todas as
concentrações e a conseqüente ineficiência destes extratos pode ser confirmada
mais uma vez pelos resultados observados quando da inoculação destas culturas no
ágar Mueller-Hinton. Foram observados crescimento bacteriano em todas as
concentrações dos extratos bem como frente aos microrganismos. Abaixo (FIGURA
5), pode-se verificar, como exemplo, uma destas placas na qual foram inoculadas
soluções dos poços 2 (amostra íntegra – com crescimento) e 5 (amostra desidratada
– com crescimento), poço 7 (cloranfenicol – sem crescimento) e poço 11
(dimetilsulfóxido – com crescimento).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
51
Figura 5 – Placa de confirmação de crescimento. Fonte: autor.
Apesar dos resultados negativos obtidos, é preciso salientar que estas
substâncias naturais em muitos casos podem potencializar ou atuar sinergicamente
com outros conservantes (sintéticos ou não) tornando a necessidade destes menor.
Hsieh et al., (2001) pesquisou o efeito antimicrobiano combinado de três extratos
vegetais frente a variações de pH obtendo resultados inibitórios melhores com
valores de pH ácidos (diminuindo com aumento do pH), com adição de íons
metálicos observando pequena diminuição da ação e com a adição de outros
aditivos alimentares no qual obteve atividade antimicrobiana levemente maior (com
exceção do ácido cítrico). Bedin et al., (1999) relata que conforme pesquisas, os
óleos essenciais de condimentos possuem pouca importância antimicrobiana devido
as dosagens destes serem muito pequenas e nestes casos a importância destes
estaria ligada com a capacidade de potencializar outros agentes antimicrobianos.
Nos resultados obtidos dos testes de CIM e nas confirmações após, não é
possível determinar se existem diferenças de ação, atuação ou resultados finais que
possam distinguir as 2 amostras. Desta forma pode-se dizer que não existem
diferenças entre a amostra íntegra (folhas colhidas recentemente) e a amostra
desidratada (amostra comercial de folhas desidratadas e moídas).
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
52
Pelos resultados obtidos, pode-se concluir que tanto a amostra íntegra
quanto a amostra desidratada não possuem atividade antimicrobiana nas diferentes
concentrações testadas frente às bactérias Escherichia coli e Salmonella enteritidis.
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
CONCLUSÃO
Os extratos obtidos das duas amostras não apresentaram diferenças
perceptíveis apresentando os dois uma coloração verde escura intensa e odor forte
característico de louro.
Através dos dados obtidos da atividade antimicrobiana do extrato etanólico
de folhas de louro (Laurus nobilis L.), verificou-se que não existe ação bactericida ou
bacteriostática sobre os microrganismos Escherichia coli e Salmonella enteritidis nas
concentrações testadas. Isto sugere que o louro pode ser utilizado como
condimento apenas para realçar sabores e odores no alimento.
Conforme os resultados obtidos, também não observou-se diferenças de
atuação entre a amostra íntregra (recém colhida) e a amostra desidratada (folhas
desidratadas e moídas). Desta forma, pode-se dizer que o processo secagem não
prejudica ou altera as características do condimento.
Apesar dos resultados negativos encontrados neste experimento, deve-se
salientar que várias outras pesquisas obtiveram bons resultados quando o extrato ou
óleo essencial foi testado frente a outras bactérias e desta forma não deve-se
desprezar totalmente a ação bactericida que este condimento pode exercer ou
deixar de exaltar a sua importância.
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
REFERÊNCIAS
ARAÚJO, J. M. A. Química de alimentos: teoria e prática. 4ª ed. Viçosa: Ed. UFV, 2008. BAKKALI, F.; AVERBECK, S.; AVERBECK, D. ; IDAOMAR, M. Biological effects of essential oils – A review. Food and Chemical Toxicology. 46: 446–475, 2008. BARA, M. T. F; VANETTI, M. C. D. Estudo da atividade antimicrobiana de plantas medicinais, aromáticas e corantes naturais. Revista Brasileira de Farmacognosia. n° 1, vol 7-8, São Paulo, 1998. BEDIN, C.; GUTKOSKI, S. B.; WIEST, J. M. Atividade antimicrobiana das especiarias. Revista Higiene Alimentar, n° 65, vol 65, p. 26-29, 1999. BLACK, J. G. Microbiologia fundamentos e perspectivas. 4ª ed. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan S. A., 2002. CARDOSO, M. G.; CASTRO, D. P.; AGUIAR, P. M.; SILVA, V. F.; SALGADO, A. P. S. P.; MUNIZ, F. R.; GAVILANES, M. L.; PINTO, J. E. B. P. Plantas aromáticas e condimentares. Boletim técnico UFLA. Disponível em: <http://www.editora.ufla.br/site/_adm/upload/boletim/bol_62.pdf> Acesso em: 07 set. 2010 CORATO, U.; MACCIONI, O.; TRUPO, M.; SANZO, G. Use of essential oil of Laurus nobilis obtained by means of supercritical carbon dioxide technique against post harvest spoilage fungi. Crop Protection. 29: 142–147, 2010. BRASIL. Embrapa. Série plantas medicinais, condimentares e aromáticas. Disponível em: < http://www.cpap.embrapa.br/publicacoes/download.php?arq_pdf=FOL113>. Acesso em: 07 set. 2010. EVANGELISTA, J. Tecnologia de alimentos. São Paulo: Editora Atheneu, 2008. EVANGELISTA, J. Alimentos: um estudo abrangente. São Paulo: Editora Atheneu, 2002.
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
55
FOCHESATO, M. L.; MARTINS, F. T.; SOUZA, P. V.D.; SCHWARZ, S. F.; BARROS, I. B. I. Propagação de louro (Laurus nobilis L.) por estacas semilenhosas com diferentes quantidades de folhas e tratadas com ácido indolbutírico. Rev. Bras. Pl. Med. n° 3, vol. 8, Botucatu, 2006. FORSYTHE, S. J. Microbiologia da segurança alimentar. Porto Alegre: Artmed, 2002. FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos alimentos. São Paulo: Editora Atheneu, 2008. HINNEBURG, I.; DORMAN, H.J.; HILTUNEN, R. Antioxidant activities of extracts from selected culinary herbs and spices. Food Chemistry. 97, 122-129, 2006. HSIEH, P-C.; LEUNMAU, J.; HUANG, S-H. Antimicrobial effect various combinations of plant extracts. Food Microbiology. 18: 35-43, 2001. JAY, J. M. Microbiologia de alimentos. 6. ed. Porto Alegre : Artmed, 2005. LIRA, P. D. L.; RETTA, D.; TKACIK, E.; RINGUELET, J.; COUSSIO, J. D.; van BAREN, C.; BANDONI, A. L.. Essential oil and by-products of distillation of bay leaves (Laurus nobilis L.) from Argentina. Industrial Crops and Products. 30: 259– 264, 2009. MARINO, M.; BERSANI, C.; COMI, G. Impedance measurements to study the antimicrobial activity of essential oils from Lamiaceae and Compositae. International Journal of Food Microbiology. 67: 187-195, 2001. MARIUTTI, L. R. B.; BARRETO, G. P. M.; BRAGAGNOLO, N.; MERCADANTE, A. Z. Atividade captadora de radical livre do extrato etanólico das ervas e especiarias comercializadas no Brasil. Revista Brasileira de Biologia e Tecnologia. n° 6, vol. 51. Curitiba, nov/dez, 2008. MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Microbiologia de brock. São Paulo: Prentice Hall, 2004. MORAIS, S. M.; CAVALCANTI, E. S. B.; COSTA, S. M. O.; AGUIAR, L. A. Ação de antioxidantes de chás e condimentos de grande consumo no Brasil. Revista Brasileira de Farmacognosia. vol 19. João Pessoa, jan/mar, 2009. MUÑOZ, M.; GUEVARA, L.; PALOP, A.; TABERA, J.; FERNÁNDEZ, P. S. Determination of the effect of plant essential oils obtained by supercritical fluid extraction on the growth and viability of Listeria monocytogenes in broth and food systems using flow cytometry. Food Science and Technology. 42: 220 –227, 2009. BRASIL. Ministério da Saúde – Secretaria da Vigilância em Saúde. Análise epidemiológica dos surtos de doenças transmitidas por alimento no Brasil, 1999 – 2009. Disponível em: <
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
56
http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/analise_ep_surtos_dta_brasil_2009.pdf>. Acesso em: 07 de set. 2010. BRASIL. Ministério da Saúde – Secretaria da Vigilância em Saúde. Vigilância epidemiológica das doenças transmitidas por alimentos no Brasil, 1999 – 2004. Disponível em : <http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/bol_epi_6_2005_corrigido.pdf>. Acesso em: 07 set. 2010. ORDÓÑEZ , J. A. Tecnologia de alimentos. Porto Alegre: Artmed, 2005. OUSSALAH, M.; CAILLET, S.; SAUCIER, L.; LACROIX, M. Antimicrobial effects of selected plant essential oils on the growth of a Pseudomonas putida strain isolated from meat. Meat Science.73: 236– 244, 2006. PELCZAR Jr., M. J; CHAN, E. C. S.; KRIEG, N. R. Microbiologia: conceitos e aplicações - volumes 1 e 2. 2. ed. São Paulo: Pearson Makron Books, 1997. PELT, J. M. Especiarias e ervas aromáticas: história, botânica e culinária. Rio de Janeiro: Jorge Zahar, 2003. POLOVKA, M.; SUHAJ, M. Detection of caraway and bay leaves irradiation based on their extracts antioxidant properties evaluation. Food Chemistry. 119: 391– 401, 2010. RIEDEL, G. Controle sanitário dos alimentos. 3ª ed. São Paulo: Editora Atheneu, 2005. RÍOS, J. L.; RECIO, M. C. Medicinal plants and antimicrobial activity. Journal of Ethnopharmacology. 100: 80-84, 2005. SAGDIÇ, O.; ÖZCAN, M. Antibacterial activity of Turkish spice hydrosols. Food Control. 14: 141-143, 2003. SHAN, B.; CAI, Y.-Z.; BROOKS, J.; CORKE, H. The in vitro antibacterial activity of dietary spice and mecicinal herb extracts. International Journal of Food Microbiology. 117: 112-119, 2007. SILVA, N.; JUNQUIERA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A. Manual de métodos de análise microbiológica de alimentos. São Paulo: Livraria Varela, 1997. SOUZA, E. L.; LIMA, E. O.; NARAIN, N. Especiarias: uma alternativa para o controle da qualidade sanitária e de vida útil de alimentos, frente às novas perspectivas da indústria alimentícia. Revista Higiene Alimentar, n° 113, vol 17, p. 38-42, 2003. STROHL, W. A.; ROUSE, H. ; FISHER, B. D. Microbiologia ilustrada. Porto Alegre: Artmed, 2004.
BD
U –
Bib
liote
ca D
igita
l da
UN
IVAT
ES
(htt
p://w
ww
.uni
vate
s.br/
bdu)
57
TAJKARIMI, M. M., IBRAHIM, S. A.; CLIVER, D. O. Antimicrobial herb and spice compounds in food. Food Control. 21: 1199–1218, 2010. TASSOU, C.; KOUTSOUMANIS, K.; NYCHAS, G.-J.E. Inhibition of Salmonella enteritidis and Staphylococcus aureus in nutrient broth by mint essential oil. Food Research International . 33: 273-280, 2000.