Atividade Anti-Complemento na Saliva de Flebotomíneos e outros Insetos Hematófagos

Estudada e utilizada para fins medicamentosos:• sanguessugas e sangrias;• restabelecimento da microcirculação.

Inseto morde

Proteínas da saliva do

inseto desencadeiam

defesa imunológica localizada

Células de defesa liberam

histamina

Inflamação:pele

vermelha e coceira

A Saliva de Insetos Hematófagos

Sanguessugas: conseguem parasitar o hospedeiro por horas sem que haja coagulação do sangue

• hirudina - liga-se à trombina

Carrapatos: conseguem driblar o sistema imune. • proteínas na saliva que se ligam à histamina

Flebotomíneos: alimentam-se o suficiente por pouco tempo.

• ao morder o hospedeiro, o inseto secreta substâncias vaso dilatadoras. O hospedeiro ficará ciente do parasita em poucos segundos.

Particularidades da Saliva de Alguns Animais Hematófagos:

PARASITA TIPO DE DROGA PODERIA SER USADA PARA...

Sanguessuga Diminui a viscosidade Prevenção da coagulação do sangue do sangue após cirurgias.

Carrapato Anti-inflamatórios Tratamento de conjuntivite, asma.

Flebotomíneos Vacinas Prevenção da leishmaniose.

Sistema do Complemento

• um dos principais efetores da imunidade humoral,

• importante mecanismo efetor da imunidade inata,

• são proteínas plasmáticas e de superfícies celulares que se interagem entre si e com algumas células de modo altamente regulado,

• as duas principais vias de ativação são a Via Clássica e Via Alternativa.

A Via Clássica

• É ativada por certos isotipos de anticorpos ligados a antígenos.

• É iniciada pela ligação da proteína C1 do complemento nos domínios CH2 das moléculas de IgG ou dos domínios CH3 das moléculas de IgM ligadas a antígenos.

A Via Alternativa

• É ativada nas superfícies das células dos microrganismos.

• Resulta na proteólise de C3 e na inserção de seu produto de degradação C3b às superfícies microbianas, sem o papel de anticorpo.

A “Via Comum”

Funções do Complemento

• opsonização e fagocitose,

• estimulação das respostas inflamatórias,

• citólise mediada pelo complemento.

Objetivo

• estudo da cascada do complemento pela ativação da via clássica, mantendo a via alternativa inativada.

Metodologia

1) Opsonização de eritrócitos de ovelha:

Opsonização com anticorpos anti-eritrócitos de ovelha

Ensaio da Ação Salivária nas Vias Clássica e/ou Comum da Cascata do Complemento

2) Hemólise e leitura:

a) 50l de soro humano foi diluído em GBH²+ b) adição de 25l de solução de saliva;c) eritrócitos sensibilizados;d) centrifugação (1700 g por 30s); e) transferência de 200l do sobrenadante para uma

placa de ELISA; f) medição das hemólises: • Total• Espontânea• Na presença do complemento sem saliva

Resultados:

•Lu. longipalpis - curva de inibição da via clássica do complemento é sigmoidal.

•Lu. migonei - gráfico de inibição da via clássica do complemento apresenta padrão retilíneo.

• Triatomíneos

Discussão:

• Diferença poderia estar relacionada com a ação de moléculas inibitórias da saliva destes insetos.

• Preparação dos eritrócitos de coelho:-eritrócito lavado 3x em GHB – EDTA-armazenado a 4°C por uma semana -dia do experimento: lava-se os eritrócitos 3x Mg – EGTA

• Ensaio:-soro humano (50 ml) diluído em Mg – EGTA 90% hemólise-25 ml de saliva(procedimento idêntico ao descrito no ensaio da via clássica)

• Procura por hemolisina na saliva de flebotomínio-protocolo da via clássica: soro humano foi substituído por solução salina -usado 20 lobos de glândula salivar em cada teste-Lu. longipalpis e Lu. migonei

Ensaio da ação de saliva na via alternativa e/ou comum na cascata do complemento

Resultados

• Teste da inibição da via alternativa do sistema do complemento:

+ Lu. longipalpis

- Lu. migonei

• Ausência de hemolisina, nas duas espécies, que poderia interferir no ensaio (a maior concentração usada foi incapaz de provocar hemólise)

Discussão

• A saliva de Lu. longipalpis tem aproximadamente a mesma potência de inibir tanto a via clássica quanto a alternativa do sistema do complemento, desde que a taxa entre as quantidades (requerida para promover 100% de inibição). de soro e saliva nos ensaios seja a mesma

• A saliva de alguns insetos interfere no sistema do complemento

poderia explicar a transmissão de Leishmania por insetos

Caracterização da natureza química do fator inibitório da Via Clássica

1. Ensaio da inativação por aquecimento:

incubação da saliva de Lu. longipalpis em banho maria (~100ºC) por 10, 30 e 60 min. Após isso, foram realizados ensaios de hemólise pela Via Clássica.

2. Ensaio de digestão pela proteinase K: uma amostra de saliva foi incubada com proteinase K. Após a incubação e diluição com soro fetal bovino foi realizado ensaio de hemólise pela Via Clássica.

3. Avaliação do peso molecular do fator inibitório da Via Clássica: ultrafiltragem de saliva em membranas cujo “limite de corte” era de 30.000, 10.000, e 5.000Da. Após isso foi realizado ensaio de hemólise pela Via Clássica com as três amostras de saliva ultracentrifugada.

Resultados:

• a saliva incubada com proteinase K perde sua atividade inibitória trata-se de uma proteína.

• trata-se de uma proteína de peso molecular entre 10 – 30kDa.

• fator inibitório do complemento bastante termoestável, pois resiste por mais de 1 hora a 100ºC sem perder sua função provavelmente apresenta alto número de pontes dissulfeto entre resíduos de cisteína.

Ensaio:

•Tripsina de porco•Tampão HEPES / HCl•Saliva•Substrato (BApNA)•Medição por densidade óptica

Resultados:

Quantidade de saliva correspondente a 100 glândulas não inibe a atividade da tripsina

Ensaio da Inibição da Tripsina por Saliva de Lu. longipalpis

Ensaio:

• Imunização dos hamsters com Lu longipalpis• Coleta de sangue dos hamsters• Inativação do soro dos animais• Ensaio de hemólise• Mistura da saliva com anticorpos• Adição do complemento

Ação do Soro Anti-saliva de Lu. longipalpis no Efeito Inibitório da Saliva do Inseto na Via Clássica do Complemento

Resultados:

O soro anti-saliva não inativou significativamente a atividade inibitória da saliva de Lu. longipalpis na via clássica do complemento.

Discussão:

• Anticorpos da saliva de Lu longipalpis foram incapazes de inativar totalmente a atividade do inibidor do complemento.

• Baixa eficiência pode estar relacionada a propriedades imunossupressoras da saliva do flebotomíneo.

A proteína inibitória da via clássica e

alternativa poderia fazer parte da

composição de uma vacina dirigida

contra algum componente

imunomodulatório da saliva de Lu.

longipalpis e outros flebotomínios.

Referências Bibliográficas:

• CAVALCANTE, R. R., PEREIRA, M. H., GONTIJO, N. F. Anti-complement activity in the saliva of phlebotomine sand flies and outher haematophagous insects. Parasitology (2003) 127, 87 – 93.

• CLAYTON, J. Wanted: bloodsuckers. NewScientist – 13 de julho de 2002, 42 – 45.

• ABBAS, A . K., LICHTMAN, A . H., POBER, J. S. Imunologia Celular e Molecular, Quarta Edição, Editora Revinter, 2003.

Ana Cristina Munhoz;

Marcela Oliveira Faria;

Patrícia Rosa de Araújo;

Paula Fernandes dos Santos;

Raquel Coelho Loures Fontes.

Ciências Biológicas – UFMG.