articulos caldos microbianos (7)

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PRCTICAS DE TERMOBACTERIOLOGA

Queda prohibida su reproduccin total o parcial por

cualquier medio sin el consentimiento expreso del autor

ENRIQUE ALFONSO CABEZA HERRERAPh.D., D.E.A. Ciencia y Tecnologa de alimentos

Especialista en Proteccin de AlimentosMicrobilogo

FACULTAD DE CIENCIAS BSICASDEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGAPAMPLONA NORTE DE SANTANDER

COLOMBIA2011


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Guas Unificadas de Laboratorio de Termobacteriologa

Enrique Alfonso Cabeza Herrera, Ph.D

Cdigo FLA-23 v.00

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Universidad de Pamplona Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Microbiologa 2011

INTRODUCCION

La Termobacteriologa surge como una disciplina alternativa a la microbiologa de los alimentoscon el fin de entender los fundamentos que el uso del calor acaece sobre los microorganismos ylos propios alimentos, as mismo busca desarrollar y aplicar nuevas metodologas que permitanelaborar y asegurar la calidad y seguridad de los alimentos. La determinacin de la vida til deun alimento puede establecerse de diversas maneras, algunas de ellas resultan ser un tantoortodoxas por cuanto no aplican una metodologa cientfica y los resultados obtenidos son frutode la experiencia y la cotidianeidad, en otros casos la vida til suele establecerse sobre la basede datos tericos o sobre referencias bien sean a partir de fuentes bibliogrficas o por

observacin de los tiempos de vida til de productos similares que se encuentran en elmercado.A travs de este manual se explicaran las diferentes herramientas que pueden usarse de formaexperimental para obtener resultados confiables en cuanto a la determinacin de los diferentesbaremos de termodestruccin, as como al clculo de los tratamientos trmicos sin que afectenen gran medida los valores nutricionales y cualitativos de los alimentos. Se pretende que laspersonas que consulten esta obra adquieran los conocimientos fundamentales que les permitadesempearse de la mejor forma en esta rea del que hacer cientfico aplicado a laagroindustria.


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NORMAS DE SEGURIDAD

La bioseguridad comprende el conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la saluddel personal frente a riesgos por agentes, biolgicos, qumicos y/o fsicos en las reas detrabajo del laboratorio, as corro medidas de seguridad aplicables a los edificios e instalacionesdonde se realicen las actividades. Su objetivo es crear un ambiente de trabajo SEGURO YORDENADO que permita alcanzar la productividad ptima.

Reglas bsicas de seguridad:

Usar ropa adecuada (bata manga larga abotonada y limpia, zapatos cerrados y limpios, uso

de cofia y tapabocas). No permitir el acceso a las reas de trabajo sin la debida precaucin. Respetar las reas de

acceso restringido; no ingresar inmediatamente a cuartos de siembra previamenteesterilizados con radiacin ultravioleta.

Al iniciar y finalizar las prcticas, lavarse las manos con agua y jabn Flamee el asa antes y despus de usarla. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada prctica

es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes ms habituales paraeste propsito son la leja y el alcohol (etanol 96), o una solucin de hipoclorito a 15 - 20

ppm. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama. Se deben evitar los

desplazamientos innecesarios con el asa bacteriolgica cargada con algn microorganismopor el laboratorio, ya que pueden crear corrientes que originen contaminaciones, aerosoleso producir accidentes.

Durante las prcticas est prohibido comer, beber, fumar o mascar chicle. Cuando se manipulan microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz,

ojos, etc. No portar maquillaje o aplicarse cosmticos en el laboratorio. Emplear pipeteadores para la transferencia de volmenes y colocar algodn, est prohibidopipetear soluciones con la boca (reactivos, sueros y soluciones en general). Libros, carpetas, abrigos y cualquier otro material que no se utilice en la realizacin de la

prctica deben estar apartados del lugar de trabajo. Para deshacernos del material contaminado utilizaremos los recipientes adecuados. Estos

recipientes sern esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada por el fregadero oa la basura comn.

Bajo ningn concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio. El suministro de gas para los mecheros Bunsen requiere las precauciones propias de estas

instalaciones. Los escapes de gas son muy peligrosos, por lo que hay que cerrar todas lasllaves de paso de gas al finalizar la prctica, evitar la presencia de sustancias inflamables y


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revisar peridicamente las conducciones. En las prcticas en que se trabaje con luz ultravioleta debe tenerse en cuenta que la

exposicin a este tipo de radiacin es peligrosa, ya que tiene poder mutagnico. Por tanto,nunca se debe mirar directamente el foco emisor. Hay que protegerse los ojos y cualquierzona de la piel expuesta a la radiacin (gafas, guantes, mscaras, etc.).

En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.) secomunicar inmediatamente al instructor.

Trabaje solamente en su puesto. Marque cuidadosamente todos los cultivos y las preparaciones que de ellas se hacen.

Incube en el lugar asignado por el instructor. Al terminar cada sesin de trabajo, limpie la superficie de la mesa. Descarte el material que

no necesita ya sea usando los recipientes respectivos o entregndolos al instructor y/omonitor.

Nunca retire los cultivos de microorganismos del lugar de trabajo sin previa autorizacin delinstructor.

No se toque la cara con las manos ya que los dedos y las uas se contaminan fcilmente,llevando grmenes patgenos.

Los cultivos microbianos empleados para las prcticas solo se deben abrir durante elmomento de ser usados.

Trabaje con el cabello recogido, evite usar joyas (anillos, pulseras y cadenas largas por

fuera de la blusa). Esterilizar todo el material de desecho. Deben establecerse reglas para la eliminacin de

desechos slidos, incluyendo agujas hipodrmicas, que deben colocarse en envasessellados etiquetados como "material peligroso". Los medios de cultivo o muestras de sueroque se sospecha que contienen un agente Infeccioso, o virus de la hepatitis, debenautoclavarse antes de su eliminacin final.

Si se trabaja con material que no es desechable, tener las debidas precauciones. Etiquetar todos los frascos con fecha, nombre de la preparacin, concentracin y personal

que elabor. Cada tubo de cultivo, placa de medio y reactivo debe tener una etiqueta que

indique claramente el contenido y las fechas de preparacin y vencimiento. Los tubos,medios y reactivos "codificados por ser peligrosos" deben estar etiquetados de forma talque incluso personal ajeno al laboratorio pueda interpretar el signo.

Almacenar las sustancias voltiles en envases adecuados, ventilados y fros. Disponer de neutralizantes para usar en caso de accidente y extinguidores Deben utilizarse guantes adecuados cuando se manipulan instrumentos calientes, as

como protectores faciales u oculares cuando se manipulan o mezclan sustancias custicas. Todas las sustancias corrosivas o custicas deben designarse con una etiqueta de color

brillante y guardarse en gabinetes cerrados cerca del piso. Las soluciones corrosivas que

se vierten en las piletas deben enjuagarse con abundante agua, antes de la eliminacinreal y despus de ella.


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Todo el equipo elctrico debe estar apropiadamente conectado a tierra y debe tomarse lapreocupacin de no sobrecargar los circuitos. No manipular con las manos hmedas o sinconocer adecuadamente su funcionamiento.

En el laboratorio esta estrictamente prohibido el uso extensiones elctricas y artefactosdomsticos, como cafeteras o calentadores elctricos.

El personal de laboratorio debe informar al supervisor sobre cualquier choque elctrico conel uso del aparato. Nunca debe intentarse la reparacin mientras el dispositivo estaconectado con el circuito elctrico.

Los tanques de gases comprimidos deben asegurarse bien a la pared y el nombre de sucontenido debe estar claramente indicado en la etiqueta.

Recomendaciones antes y durante la prctica: Llegue siempre al laboratorio con un conocimiento completo de la prctica que va a

realizar. Llegue a tiempo para la prctica, evite interrupciones. Atienda las explicaciones del profesor y pregunte lo que no entienda. Marque todos sus cultivos y especmenes del estudio siguiendo las indicaciones del

instructor. Dicha marcacin debe contener por lo menos: Grupo de trabajo, Fecha, Nombre del microorganismo, Datos relativos al

experimento como temperatura, medio de cultivo, tiempo de incubacin y otros que

considere pertinente, Semestre y nombre de la asignatura Para estos rtulos usar marcador de vidrio, rtulos adhesivos o escriba en cinta de

enmascarar, que usted debe llevar al laboratorio. No olvide llevar siempre el kit de trabajo elemental: porta y cubreobjetos, lanilla o toalla,

jabn, marcador, cinta de enmascarar, cortapapel, asas de siembra reta, redonda, deDriglasky y todo lo dems que considere necesario.


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NIVEL DE RIESGO

Para el desarrollo en general de este curso se han definido en cada una de las prcticas el nivelde riesgo, sin embargo de forma genrica para las actividades escritas en este manual se hadefinido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, ya que se manejaran microorganismosconsiderados oportunistas y que en algn momento por malas prcticas de laboratorio puedenconllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto, todo estudiante, auxiliar y docenteque oriente e intervenga en el desarrollo de este curso deber usar los siguientesequipamientos:

Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,

Pantaln Largo

Nota 1: el docente ser el responsable de velar por el cumplimiento de los elementos descritosanteriormente.Nota 2: cada estudiante deber portar un kit de trabajo conteniendo mnimo los siguienteselementos:

Pipeteador, Tijeras, Cinta de enmascarar, Marcador para vidrio, Jabn lquido, en polvoo en barra antibacterial, Toalla absorbente, Porta y Cubre objetos, Guantesdesechables de ltex, Gasa, Algodn, Asas de platino redonda, recta y de Driglasky

(hockey), encendedor o fsforos.


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ACTIVIDAD 1. ESCALDADO DE VEGETALES: TUBRCULOS, FRUTAS,

HORTALIZAS

1.1.OBJETIVOS

Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de: Observar el efecto de un tratamiento trmico suave, ideado para inactivar enzimas,

sobre la flora banal pero deteriorante, presente en los tejidos vegetales tanto de frutascomo de hortalizas.

Comparar y analizar el efecto de diferentes tratamientos trmicos, manejando variablesde tiempo y temperatura, sobre el mismo vegetal, para llegar a una conclusin acercadel tratamiento ms indicado para dicho vegetal.

1.2.MARCO TERICO

Cuando se cortan ciertas frutas o verduras y la superficie entra en contacto con el aire, enunos minutos adoptan un color oscuro. Es lo que se conoce como pardeamiento enzimtico,una alteracin que se manifiesta con la formacin de colores oscuros y la prdida de sabor,e incluso, de contenido nutricional. Por este motivo, se convierte en un problema paraproductos como frutas y hortalizas, as como para la industria del vino, ya que produce

alteraciones en el color que reducen su valor comercial o lo hacen inaceptable para elconsumidor.

Los colores caractersticos del pardeamiento son muy variados, desde marrones, hastarojizos, dorados o negros, en funcin del alimento y de las condiciones del proceso deproduccin. Adems de la alteracin del color, los productos secundarios que se formanpueden reaccionar con las protenas, que insolubilizan, lo que contribuye a una prdidanutricional de vitamina C, entre otras.

1.2.1. Pardeamiento enzimtico: es una reaccin de oxidacin que produce un determinadogrupo de enzimas y que afecta a casi todos los seres vivos. En los alimentos, estefenmeno se da al cortar algunas frutas como las manzanas, duraznos, banano, pera uotros vegetales como los esprragos o la papa. Al cabo de pocos minutos, la superficiecortada se vuelve ms oscura. Esto se debe a la accin de enzimas denominadaspolifenoloxidasas que, en condiciones de humedad, producen una oxidacin de loscompuestos que dan color a los alimentos. En las frutas, oxidan ciertos fenoles e introducentomos de oxgeno en su composicin. Esto provoca que los fenoles se conviertan enquinonas, que causan los pigmentos marrones, rojos y negros que se aprecian.

1.2.2. Pardeamiento no enzimtico: es el resultado de reacciones originadas por loscompuestos que contienen azcares reductores y los compuestos proteicos. stas


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conducen a la formacin de polmeros oscuros, en algunos casos deseables, como losdestinados a los aromas de los crnicos sintticos o del caf tostado. Sin embargo, en lamayora de los casos, estas reacciones conllevan alteraciones organolpticas y prdidas delvalor nutritivo. Las rutas para lograr el efecto del pardeamiento son varias, aunque la msconocida es la accin del calor. La qumica de todas ellas est relacionada con la Reaccinde Maillard, que es el resultado de la unin de los azcares con las protenas. Estacombinacin provoca cambios irreversibles en las propiedades, tanto qumicas comofisiolgicas, de las protenas.

La acumulacin de pigmentos de un color marrn indica que la reaccin se ha producido enalimentos que contienen hidratos de carbono y protenas. Uno de los usos ms extendidos

de este tipo de reaccin se encuentra en la industria lctea, en la que se emplea comoindicador de un excesivo procesado trmico. Cuando la reaccin de Maillard avanza, puedeseguir diferentes rutas que variarn en funcin de las condiciones ambientales, del pH y dela temperatura. Una de las posibilidades es que aparezca la caramelizacin, llamadatambin pirolisis, una reaccin de oscurecimiento que tiene lugar cuando los azcares secalientan por encima de su punto de fusin. Su utilizacin ms importante se da en laproduccin de caramelos comerciales. Esta reaccin se ve favorecida por condicionesalcalinas o cidas y puede ser conveniente o perjudicial para la calidad de un productoalimentario. Prevenir que se desarrolle pasa por aplicar en el proceso una elevadatemperatura, adems de almacenar los alimentos a bajas temperaturas.

1.2.3. El escaldado: es en resumidas cuentas, una breve coccin en agua o vapor de agua,que se suele aplicar como un tratamiento previo a cualquier procedimiento industrial detransformacin y/o conservacin de vegetales.Este proceso tiene como finalidad bsica la inactivacin trmica de las enzimas autolticasnaturales del vegetal, para que no intervengan en el deterioro del mismo y as evitarcomplicaciones en etapas posteriores en una lnea de produccin. Sin embargo, ademscontribuye con una serie de efectos benficos para el producto, tales como: Eliminacin del oxgeno y otros gases de los espacios intercelulares del tejido, para

reducir las reacciones de oxidacin (corrosin de envases, alteraciones sensoriales,etc.) y la presin interna de los botes en la esterilizacin.

Ayuda a fijar el color natural del vegetal. Completar el lavado del producto, reduciendo de la misma manera la contaminacin

qumica, as como tambin reduce la carga microbiana banal. Esto ltimo comoconsecuencia del tiempo y la temperatura empleados.

Ablandar el tejido vegetal de modo que pueda soportar sin fracturas ni daos,posteriores manipulaciones (por ejemplo habichuelas y esprragos) y reducir suvolumen aparente (por ejemplo espinacas, lechugas y otras hojas) para hacer posible

su acondicionamiento y embalaje. En los casos de frutas que van a ser congeladas o deshidratadas y as sern


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comercializadas; este proceso aumenta la permeabilidad de las paredes celulares loque incrementa la velocidad de deshidratacin y facilita la posterior rehidratacin.

Limpiar los sabores acres (como en la col) y eliminar algunos pigmentos indeseables.

1.2.3.1.Coadyuvantes del escaldado: El efecto del calor puede ser acentuado por medio desustancias qumicas, para mejorar su efecto sobre el vegetal. El tratamiento trmicodebe ser lo suficientemente elevado para inactivar enzimas y lo suficientemente suavecomo para no alterar el tejido vegetal. En algunos casos stas sustancias protegen alvegetal. Las siguientes son algunos ejemplos de estas sustancias denominadascoadyuvantes del escaldado: Sal: eleva la presin osmtica del medio sensibilizando las bacterias.

cido ascrbico: fuerte antioxidante que regulas las reacciones oxidativas dedeterioro.

cido ctrico: acidulante fuerte, reduce el pH lo que sensibiliza a las enzimas y depaso a los microorganismos.

Sal soluble de calcio: endurece el tejido de algunos vegetales (trozos de manzana,tomate, etc.) por su reaccin con las pectinas.

Carbonato de sodio: protege a la clorofila, pero afecta la tiamina y la vitamina C. Fosfatos: reducen la oxidacin de los carotenos. Sulfitos: evita el pardeamiento enzimtico durante la deshidratacin.

1.2.4. Enzimas alterantes de los alimentos: como hemos mencionado, el principal papel delescaldado es la inactivacin de enzimas que alteran el producto, sin interesar su origen.Estas enzimas alterantes puede ser tanto endocelulares como exocelulares y puedenprovenir del tejido vegetal o enzimas microbianas, las cuales pueden actuar a pesar de quelos microorganismos se hallen destruidos. Las enzimas dainas se pueden clasificar en tresgrupos, as:

OXIDATIVAS: Son poco especficas y alteran, generalmente, al mismo tiempo elcolor, aroma y otros caracteres del producto. Son las ms termorresistentes.

Ejemplos: Catalasa: H2O2 H2O + 1/2O2 Peroxidasa: H2O + 2AH 2H2O + 2A

Deshidrogenacin directa

HIDROLTICAS: Originan la formacin especfica de olores o sabores indeseables.Como ejemplos encontramos:

Lipasas: que generan cidos grasos libres. Proteasas: pptidos amargos, malos olores. Amilasas: sabores azucarados. Pectinohidrolasas: modifican la textura del producto.


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Enzimas metablicas naturales: producen etanol a partir de los azcares.

ALTERADORAS DEL COLOR: Especficamente contribuyen con modificar el colorde los productos.

Polifenoloxidasas: pardeamiento enzimtico. Clorofilasas: degradan la clorofila. Lipoxidasas: oxidan los beta carotenos.

1.2.5. Control del escaldado: Se efecta teniendo en cuenta el grupo de enzimas mstermorresistentes. Se realiza bsicamente para evitar inconvenientes como:

Ablandamiento excesivo. Sabores a cocido y olores extraos. Prdidas de nutrientes, por su difusin en el agua. Transformacin de la clorofila en feofitina. Prdida del aroma tpico.

Este control se hace mediante la verificacin de la subsistencia de enzimas tales como lacatalasa y la peroxidasa que son las ms termorresistentes. La ms termorresistente deestas enzimas es la peroxidasa, pero esta es la menos daina. Por lo general, estosprocesos aseguran la inactivacin total de la catalasa; pero solo la inactivacin parcial de la

peroxidasa, ya que para inactivar sta ltima el tratamiento sera tan drstico para el vegetalque acarreara sobre coccin y algunos daos fsicos. Como la mayora de las enzimas, laperoxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las que precisan mayortemperatura y ms tiempo para su inactivacin. Posee, adems, la propiedad peculiar de laregeneracin enzimtica. Este fenmeno consiste en que al inactivarla por medio del calorrecupera parcialmente su actividad despus de un cierto tiempo (Schmidt y Pennacchiotti,2001b). Esto ha sido explicado, aduciendo que la fraccin proteica de la enzima sufre unadesnaturalizacin slo parcial, con prdida de su estructura terciaria, si el calor se aplica untiempo muy corto, producindose luego una reversin de la protena a su estado normal por

recombinacin de sus grupos hidrgenos o sulfhidrlicos.

1.3.MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS

3 Bolsas de cierre fcil (tipo Ziploc) 400 ml de Agar estndar para recuento en placa SPC 20 Cajas de petri estriles 3 baos serolgicos ajustados a 75C, 80C y 85C. 14 pipetas de 1 ml estriles.

4 pipetas de 0,1 ml estriles. 3 termmetros de 0 C 100 C.


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6 tubos de ensayo grandes y estriles. 1 mortero con pistilo. 1 espectrofotmetro (opcional si se desea cuantificar la actividad peroxidasa). Celdas plsticas o de cuarzo para espectrofotometra (opcional si se desea

cuantificar la actividad peroxidasa).

1.4.REACTIVOS

5 Tubos con 9 mL de agua peptona 0,1% estril. 1 vaso de precipitado con 200 ml de solucin acuosa de sal al 1,5% estril. 1 vaso de precipitado con 200 ml de solucin de cido ctrico al 0,8% estril. 1 vaso de precipitado con 200 ml de solucin de cido ascrbico al 0,5% estril. 1 ml de solucin de Guayacol al 1% en solucin de alcohol al 50%. 10 ml de solucin de perxido de hidrgeno al 3%. 4 fiolas con 225 ml de agua peptona 0,1% estril.

1.5.PROCEDIMIENTO

Pesar aproximadamente 450 g de un vegetal debidamente troceado en cubos de 1cm3.

Dividir en tres grupos de 125 g cada uno, con otros 25 g hacer recuento de aerobiosmesfilos de la dilucin 10-1, 10-2 y 10-3.

Preparar en tres vasos de precipitado, una solucin acuosa de sal al 1,5%, cidoctrico al 0,8% y cido ascrbico al 0,5%.

Calentar cada solucin hasta conseguir en cada vaso de precipitado las siguientestemperaturas: 75, 80 y 85C, respectivamente.

Adicionar en cada vaso de precipitado los correspondientes 125 g de vegetal alalcanzar la temperatura propuesta. Dejar el vegetal, segn la temperatura, lossiguientes tiempos*: 10 min (75C), 6 min (80C), 3 min (85C).

Realizar a cada vaso de precipitado un recuento de aerobios mesfilos de la dilucin10-1, 10-2 y 10-3.

Escurrir y empacar 75 g en frasco o en bolsa transparente estril. Almacenar a temperatura de refrigeracin (4C) durante 2 o 3 semanas. Observar

cada 48 horas los cambios ocurridos en color, olor, textura, apariencia, etc. Determinar la actividad de las enzimas peroxidasa (mtodo cualitativo descrito por

Avallone et al., 2001) y catalasa (ver anexo 4) como control del escaldado, segnlos mtodos descritos en el anexo 4.

1.6.NIVEL DE RIESGO


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Nivel 2: Riesgo Medio (Bata de Laboratorio, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato CerradoBajo, Pantaln Largo).

1.7.BIBLIOGRAFA

Arias, B.P., Gonzlez, M.C., Llanes, L.Y. (2003). Actividad peroxidasa, polifenoloxidasa,fenilalanina amonio liasa y Glucanasa en somaclones y mutantes de arroz. Rev.Proteccin Veg., vol. 18, No. 3: 183 188.

Avallone, C.M., Cravzov, A.L., Montenegro, S.B., Pellizzari, E.E. (2001). Estudio de laactividad peroxidasa, pectinesterasa y polifeniloxidasa en extracto enzimtico de sanda(Citrullus vulgaris Schard). Resmen T-074. Ciencia y Tcnica, comunicaciones cientficasy tecnolgicas 2001. Universidad Nacional del Nordeste, Argentina. Disponible en:http://www.unne.ed.ar/Web/cyt/cyt/2001/cyt.htm, vnculo Tecnolgicas.

Braverman, J.B.S. (1963). Introduction to the biochemistry of foods. Elsevier.

Pennacchiotti, M. (1998). Captulo 2: Las Enzimas, apartado 3, aplicaciones de lasenzimas. En: Las Protenas: generalidades y su importancia en nutricin y en la industriade alimentos. Edicin Digital, Universidad de Chile. Disponible en internet:http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/penacchiottii01/. Fecha de acceso: 1 de marzo de 2008.

Schmidt, H., Pennacchiotti, I. (2001a). Captulo 3: Determinacin de Catalasa enVegetales. En: Las enzimas en los alimentos, su importancia en la qumica y la tecnologade los alimentos. Edicin digital. Biblioteca digital, Universidad de Chile. Disponible eninternet:http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/. Fecha de acceso: 1 de marzo de 2008

Schmidt, H., Pennacchiotti, I. (2001b). Captulo 2: Determinacin de Actividad Peroxisaday de su Regeneracin. En: Las enzimas en los alimentos, su importancia en la qumica y latecnologa de los alimentos. Edicin digital. Biblioteca digital, Universidad de Chile.Disponible en internet:http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02/. Fecha de acceso: 1 de marzo de 2008.


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ACTIVIDAD 2. DETERMINACIN DEL PUNTO FRO EN PRODUCTOS FLUIDOS

Y SEMIFLUIDOS

2.1.OBJETIVOS

Los objetivos que se buscan con esta prctica son: Disear modelos para el estudio de la penetracin de calor en productos lquidos,

semislidos y slidos. Disear protocolos para el estudio y determinacin de puntos fros en cualquier

producto. Comprender como estn constituidos los termopares y como se usan para la

determinacin de puntos fros y estudios de penetracin de calor.

2.2.MARCO TERICO

La temperatura es de lejos la variable ms frecuentemente medida en la ingeniera de procesos.En la produccin de alimentos, el registro y control de la temperatura es un factor importantepara asegurar la calidad y seguridad del producto final. Aunque existen muchas aplicacionespara la medicin de la temperatura en el procesado de alimentos, las condiciones de procesoque va a encontrar no son particularmente hostiles. De este modo, las temperaturas se

encuentran en el intervalo desde 50C en el almacenamiento en fro a + 150C en lasaplicaciones de esterilizacin en continuo. Solamente en la generacin de vapor se encontrarntemperaturas ms altas (Berrie, P.G., 2001).

2.2.1. Medicin de la temperatura: En el momento en que se comenz a estudiar lapenetracin de calor en alimentos, el nico instrumento de medida de temperatura queexista era el termmetro, aunque este daba unos resultados no muy precisos debido a queel bulbo del termmetro es ligeramente largo (aproximadamente 1 cm) y por tanto, lamedicin de la temperatura se hace a lo largo de dicho bulbo. Con la necesidad de tener

resultados verdaderamente satisfactorios se tuvo la urgencia de crear unos instrumentosque dieran resultados ms precisos, generndose una amplia gama de instrumentos comolos termopares, detectores de resistencia de temperatura (RTDs), restatos, etc. Engeneral, los dispositivos de medicin de la temperatura los podemos clasificar en dosgrupos a saber: dispositivos de fuerza de temperatura (FTDs) y dispositivos elctricos detemperatura (ETDs).

2.2.1.1.Dispositivos de fuerza de temperatura: Los dispositivos FTDs se pueden dividir en FTDsbimetlicos y sistemas FTD llenados trmicamente, destacndose la cinta o termmetrobimetlico y los termmetros lquidos, respectivamente. Estos dispositivos hacen uso del

hecho de que la longitud o el volumen de una masa determinada de materia cambia amedida que aumenta la temperatura. El cambio de longitud o volumen con la


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temperatura depende del material y viene caracterizado por el denominado coeficientede expansin. Los termmetros BIMETALICOS se definen como un material compuestoque consta de tiras de dos o ms metales unidos entre s, por ejemplo remachados ounidos en espiral. Cuando la temperatura aumenta, cada metal se expande en unacantidad diferente provocando que la cinta entera se curve debido a los diferentesndices de expansin de sus componentes. La cantidad de curvatura es una indicacinde la temperatura. Este principio se emplea para la fabricacin de termmetros ytermostatos, los cuales se forman con un resorte espiralado que en el centro est unidoa una aguja. Al calentarse, el espiral se deforma provocando la deflexin de la aguja.El bimetal termoesttico se cuando se mantiene fijo un extremo de la franja recta, y elotro sufre una deflexin proporcional al cambio de temperatura y el cuadrado de la

longitud, y en sentido inverso al espesor, a lo largo de la porcin lineal de la curvacaracterstica de deflexin.

Figura 2.1. Dispositivos de fuerza de temperatura. a: Cinta bimetlica; b: Sistematrmico llenado (Termmetro).

2.2.1.2.Dispositivos elctricos de temperatura: en esta categora se incluye los denominadosTermopares. El termopar es un dispositivo para la medicin de temperatura, basado enefectos termoelctricos (Medrano, 2002). Es un circuito formado por un conjunto de dosalambres de diferentes metales conductores o aleaciones de metales (Constantan: aleacincobre y niquel; Cromel: niquel y cromo; Nicrosil: niquel, cromo y silicio; Alumel: nquel yaluminio; Misil: niquel y silicio) unidos en sus extremos y conectados a un voltmetro

(potencimetro), el cual registra el diferencial del potencial elctrico que se genera cuandoeste conjunto de alambres son sometidos a calentamiento. Como explica Medrano (2002) la

a b


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fuerza electromotriz generada por el termopar est en funcin de la diferencia entre la uninfra y caliente, pero ms especficamente, esta es generada como resultado de losgradientes de temperatura los cuales existen a lo largo de la longitud de los conductores.

El termopar (Figura 2.2) fue inventado por el fsico y mdico alemn Thomas JohannSeebeck entre los aos 18211822. l descubri que una corriente elctrica flua a travsde un circuito cerrado formado por dos metales distintos cuando cada una de sus unionesson calentadas a distintas temperaturas, este se constituye como el fundamento de lostermopares y a este evento se le denomina el efecto o tensin de Seebeck o FuerzaElectromotrz (FEM) (Figura 2.3, a y b).

Figura 2.2. Representacin de un termopar

La magnitud y direccin de la corriente son funcin de la diferencia de temperatura de lasuniones y de las propiedades trmicas de los metales usados en el circuito. A estefenmeno se le conoce como efecto Seebeck.

Figura 2.3. Diseo bsico del circuito de Seebeck.

Si abrimos este circuito, obtenemos una diferencia de potencial pequea (milivolts), la cuales directamente proporcional a la temperatura de la unin y a la composicin de los dos

metales (Figura 2.4)

a

b


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Figura 2.4. Representacin del circuito abierto de un termopar.

Funcionamiento de un Termopar (Medicin): La diferencia de potencial (ddp) no puede

ser medida directamente con un voltmetro debido a que la unin del termopar con el

voltmetro crea un nuevo circuito termoelctrico.

Figura 2.5. Representacin de un Termopar J aislado isotrmicamente en sus uniones U2 y U3.

Si el termistor o Pt100 determinan la temperatura de referencia de U2 y U3, se puede determinarentonces la tensin elctrica de referencia de esas uniones (Vref), por lo tanto V1 ser ladiferencia de V menos la Vref. A este procedimiento se le conoce como de Compensacin por

software, esto es debido a que el clculo de la tensin de referencia y a su vez el clculo de ladiferencia de tensiones es realizado por un microprocesador alojado en el instrumento demedicin. ste es sin duda el procedimiento de medicin de termopares ms comn en laindustria. En la tabla 2.1 puede verse los tipos de termopares ms comunes empleados en laindustria.


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Tabla 2.1. Tipos de termopares (Denominacin, composicin, rango de temperatura y color basepara identificacin).

* El color del polo negativo del termopar es Rojo.

Otra forma de clasificacin de termopares de acuerdo al revestimiento de los mismos nospermite diferenciar dos clases: aquellos cuyos vstagos van protegidos por fundas metlicas ylos que poseen fundas o cubiertas de materiales no conductores como la cermica o el polmerode baquelita.

2.2.2. Medicin de la penetracin del calor dentro de los alimentos enlatados: Aunquepueden usarse termmetros para seguir ciertas caractersticas en el calentamiento delos alimentos, el mtodo ms satisfactorio involucra el uso de termopares. Cuando eltermopar es introducido en el recipiente y este se calienta en un autoclave o en otrodispositivo de calentamiento, se genera un diferencial de energa la cual es medida porun potencimetro y transformada en una grfica mediante la cual puede seguirse loscambios de temperatura dentro de la lata con respecto al tiempo, all podremos apreciarel punto ms difcil de esterilizacin de un alimento al cual llamaremos Punto Fro.Este punto vara en los alimentos segn la forma de calentamiento que estos reciban,siendo estas formas de calentamiento por conveccin y por conduccin. Como hemoscomentado anteriormente, existen diversos tipos de termopares comerciales para seguirla velocidad de penetracin del calor en botes de alimentos. Uno de los ms corrientes

es el que descubri ECKLUND en 1949 (Termocupla tipo T: cobre-constantan), demuelle a presin cuyo vstago se fija a la pared del cuerpo del bote. Una vez fijo e,


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vstago, la lata puede cerrarse fcilmente en todos los tipos de mquinas cerradoras.Son pocos los partidarios de usar termopares cuyos vstagos van protegidos por fundasmetlicas, por lo que prefieren los que poseen fundas o cubiertas de material noconductor, lo que evita el riesgo de conduccin del calor desde el centro del bote a lolargo de la cubierta del termopar. En el calentamiento por conduccin de los botespueden originarse errores al transmitirse el calor por los alambres del propio termopar.Para evitarlo ECKLUDED ha elaborado una tabla de factores de correccin que debenaplicarse a los valores J, sealando adems que los errores se originan en su mayorproporcin en las fases iniciales de calentamiento y enfriamiento, para trabajar conprecisin se necesitan termopares construidos con alambres finos, aplicando cuando seaconveniente factores de correccin de temperatura.

La posicin en que debe situarse el par caliente depende de las propiedades fsicas delalimento y para comprenderlo es necesario conocer a su travs. Como se ha explicadoen la prctica anterior, en los alimentos slidos el calor se transmite por conduccin y elproceso es relativamente lento, mientras que en los lquidos el calor se transmiteprincipalmente por conveccin y la elevacin trmica es ms rpida, puesto que existeun movimiento continuo del material, de tal modo que las diferencias trmicas dentro delbote son mnimas en cualquier instante del proceso. En contenidos slidos los alambrestermopares, usualmente requieren soportes no especiales, pero en contenidos lquidos,

es necesario soportar los alambres sobre una fibra de vidrio o pasando ellos a travs desellos sobre los lados opuestos a la lata. Los alambres deben ser dejados algo flojospara permitir la expansin de la lata y abultamiento de las terminaciones durante elcalentamiento. Estos mtodos por ajustamiento de termopares dentro de las lataspermiten que las medidas sean hechas desde cualquier tamao y forma, con un mnimode equipo y costo.

2.2.3. Medicin del punto fro en los alimentos enlatados: No todos los puntos de unrecipiente que est siendo calentado se encuentra a la misma temperatura. La zona decalentamiento ms lenta es llamada el punto fro de un recipiente y es esta zona la ms

difcil de esterilizar, debido al retraso en el calentamiento. En los productos calentadosprincipalmente por conveccin el punto fro est sobre el eje vertical cerca del fondo delrecipiente. Los productos calentados por conduccin tienen el punto de calentamientoms lento aproximndose al centro del recipiente sobre el eje principal. Para determinardonde se encuentra el punto fro de un alimento puede seguirse la siguientemetodologa:

Una abertura de 1,8 pulgadas (4,57 cm) de dimetro es perforada en la paredcilndrica de la lata opuesta al punto propuesto de medida. Un tubo de cobre de 3,4

pulgadas (8,64 cm) de longitud y 1,4 pulgadas (3,56 cm) de dimetro es soldado a lapared de la lata circundante a la abertura, los alambres termopares son pasados a travs


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del tubo y la abertura hacia el interior de la lata. Los alambres son entonces selladosdentro del tubo de cobre con una resina basada en epoxi que coloca la temperatura en elespacio cuando un endurecedor es agregado. Cuando alambres finos son usados, un sello hermtico al vacio puede serobtenido sin el tubo de cobre simplemente con perforar la lata y colocando el alambredentro de esta abertura con la resina. Las latas ajustadas con termopares por el segundomtodo pueden ser pasadas a travs de muchos tipos de equipos exhaustivos ycerrados si los alambres son enrollados alrededor de la lata y mantenidos en esaposicin con cinta adhesiva. Las latas sometidas a experimentos pueden ser entoncesincluidas en una extensa produccin de latas para reproducir condiciones comercialestan cuidadosamente como sea posible.

Las cajas de empaquetadoras son soldadas a la lata comenzando a pulgada(1,27 cm) del fondo de la primera lata, de pulgadas (1,91 cm) del fondo de la segundalata, 1 pulgada (2,54 cm) del fondo de la tercera lata, 1 de pulgadas (3,18 cm) delfondo de la cuarta lata, y as sucesivamente cada de pulgada (0,635 cm) superior a ladel termopar de la lata anterior. El producto se prepara y se mantiene un llenado uniforme en todos losrecipientes, dejando un espacio de cabeza mnimo del 6% y mximo un 10% de lacapacidad de la lata (medido en trminos de volumen). Las latas se sellan, y lostermopares quedan fijados en cada recipiente, quedando disponibles con termopares

localizados cada de pulgada del fondo de las latas comenzando con la primera a pulgada del fondo de la misma (Figura 2.6). Las latas son colocadas luego en una retorta (Autoclave), la cual es llevada a latemperatura deseada, con la debida precaucin para eliminar el aire. Las temperaturasson registradas cada minuto manualmente o de forma automtica si se dispone de algnsoftware adecuado (por ejemplo irMOTIOM premium) o si se usa un potencimetro -voltmetro registrador, los valores tiempo-temperatura sern graficados en papelsemilogartmico, lo que da una lnea recta con desviaciones menores para la relacinentre el tiempo y la temperatura. Finalmente, una vez localizado el punto frio del alimento, todos los estudios

subsecuentes de penetracin de calor, valores de esterilizacin o pasteurizacin, etc., seharn ubicando siempre los empalmes de los termopares en la distancia calculada comodicho punto.

2.3.MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS

Para esta prctica no se utilizaran termopares sino 6 termmetros de 10 100C. 6 frascos de vidrio resistentes al calor con sus respectivas tapas. 1 bao serolgico ajustado a una temperatura de 70C, 80C o la indicada por el

profesor. Papel milimetrado.


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Figura 2.6. Forma de insercin de los termopares para estudios de penetracin de calor.

2.4.REACTIVOSNo requiere

2.5.PROCEDIMIENTO

Se toman las tapas y se perforan justo en el centro de las mismas. Se adiciona un volumen conocido de agua o el producto que indique el profesor en los

recipientes, dependiendo de la capacidad de los mismos. Se debe procurar dejar unespacio de cabeza que no sea menor al 6% del volumen del recipiente, ni mayor al 10%.En todos los botes deber adicionarse la misma cantidad.

Se tapan los botes, se introducen los termmetros a distintas profundidadescomenzando por ubicar el bulbo a 1,25 cm del fondo del primer bote. El segundotermmetro se ubica a 1,9 cm del fondo, el tercero a 2,5 cm, el cuarto termmetro a 3,13

cm, el quinto a 3,75 cm y el sexto termmetro a 4,38 cm del fondo. En la medida que sedisponga de ms termmetros y botes, se ubicaran cada de altura a lainmediatamente anterior.

Se introducen todos los botes en el bao serolgico y se toman los datos de temperaturaen intervalos de 1 minuto hasta alcanzar la temperatura de proceso establecida.

Construir la grfica Temperatura vs tiempo para cada bote en papel milimetrado ydeterminar la curva de ms lento calentamiento.

En este punto se ubicara el punto frio del producto.

2.6.NIVEL DE RIESGO


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Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2. Portanto, todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la mismadeber usar los siguientes equipamientos: Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,

Pantaln Largo.

2.7.BIBLIOGRAFA

Medrano, S. 2002. Termopares. En: La Gua MetAs, Ao 02, No 7. Julio, 2002. Board, R.G. 1988. Introduccin a la microbiologa moderna de los alimentos. Editorial

Acribia S.A., Zaragoza, Espaa.

Heldman, S. 1998. Introduccin a la ingeniera de los alimentos. Editorial Acribia S.A.,Zaragoza, Espaa.

Ress, G.A., Bettison, J. 1994. Procesado trmico y envasado de los alimentos. EditorialAcribia S.A., Zaragoza, Espaa.

Berrie, P.G. 2001. Captulo 4: Medicin de la presin y temperatura en el control deprocesos alimentarios. En: Tecnologas trmicas para el procesado de los alimentos.Philip Richardson Editor. Editorial Acribia S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 55 79. ISBN:84-200-1042-1.

http://www.termocamara.com/software.htm

http://www.thermoteknix.com/brochures/visir/VisIR_Spanish.pdf http://www.simca.com.mx/calif.htm


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ACTIVIDAD 3. ESTUDIO DE LA PENETRACIN DEL CALOR EN PRODUCTOS

FLUIDOS

3.1.OBJETIVO

Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de: Construir grficas de penetracin de calor para diversos productos e interpretar su

comportamiento. Comparar las velocidades de penetracin de calor en los diferentes productos

alimenticios. Determinar el grado de destruccin bacteriana durante el estudio y comparar la carga

microbiana en diferentes momentos de la curva de penetracin de calor

3.2.MARCO TERICO

Existen diferentes modos de transmisin del calor. Pero tericamente se habla del caso idealen el que la temperatura del tratamiento trmico alcance instantneamente a todos lospuntos del producto, mantenindose por un lapso de tiempo y luego descender otro tanto.Sin embargo, lo ms frecuente es que la temperatura de tratamiento no se logreinstantneamente y no resulte homognea en toda la masa del producto. Por otro lado el

mismo medio de calentamiento (como agua o vapor de agua en el autoclave) necesita uncierto tiempo para conseguir la temperatura deseada. Como se sabe el mtodo clsico (deNicolas Appert) presupone:

Introduccin del producto convenientemente preparado en un recipiente. Cierre hermticamente del envase. Tratamiento trmico del recipiente con su contenido. Enfriamiento.

Evidentemente, lo que interesa para establecer un clculo de esterilizacin adecuado, esconocer la evolucin de la temperatura en la parte del producto, que dentro del proceso total,es decir, comprendiendo tambin la fase de enfriamiento; tuviese la menor velocidad depenetracin de calor, se habla a ste propsito del punto fro que dependiendo de laforma como se transmita el calor puede ubicarse en el centro geomtrico de la masa delproducto o bien sobre el eje central aproximndose a de la parte inferior del envase.

La medida de las variaciones de la temperatura en diferentes puntos del producto y msespecialmente en el punto fro, en funcin del tiempo y de otros factores se realiza por mediode pares termoelctricos especiales, fijos en el recipiente y unidos a un potencimetroregistrador, que detecta los cambios trmicos en el punto fro del producto (Figura 3.1).


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Figura 3.1. Mecanismos bsicos de la transmisin de calor en alimentos. a). Conduccinpara alimentos slidos. b). Conveccin para alimentos lquidos.

En la figura 3.2 puede verse diversos ejemplos de las curvas tpicas de penetracin de calordependiendo de la naturaleza de la matriz alimentaria, destacndo tres ejemplos:

a. Producto muy mvil de viscosidad bastante baja, agitado enrgicamente (porejemplo, un zumo de frutas calentado en capas finas y en circulacin rpida en un

intercambiador de calor). la transmisin del calor ocurre por conveccin y latemperatura de tratamiento se consigue casi instantneamente, es decir, en untiempo despreciable.

b. Producto mvil poro no agitado (por ejemplo, frutas en almbar ligero o una cremade verduras). La trasferencia de calor tiene lugar especialmente por conveccin; enste caso las corrientes de conveccin se deben a diferencias en la temperatura y,como consecuencia de esto, de densidad entre las capas del producto prximas alas paredes del recipiente y de las proporciones que estn ms alejadas.

c. El producto est constituido por una masa slida compacta (ej.: pat de hgado) opor un lquido de muy alta viscosidad (ej.: solucin de almidn o soluciones pcticaspor encima de determinadas concentraciones), aqu la propagacin del calor sehace por conduccin, es decir, por transmisin gradual de vibraciones trmicas demolcula a molcula en la masa del producto, desde las paredes del recipientehasta el punto fro.

a b

Termopares

Punto fro


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Figura 3. 2.Curvas tpicas de penetracin de calor. a. Transmisin de calor por conveccincon agitacin; b. Transmisin de calor por conveccin sin agitacin; c. Transmisin de calorpor conduccin.

Los clculos de esterilizacin deben tener en cuenta las fases de calentamiento y deenfriamiento, ya que su contribucin a la esterilizacin es apreciable. Durante el ciclo:calentamiento mantenimiento enfriamiento, el punto fro adopta una sucesin detemperaturas de las cuales cada una posee un determinado valor letal, el efecto esterilizadordel conjunto del ciclo es la suma de los efectos esterilizantes de cada temperatura sucesiva.

3.3.MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS (por grupo de trabajo)

400 ml de un producto fluido (sin leche). El instructor asignara a cada grupo un productodiferente, p.ej. Bebida de malta, jugo de fruta en agua, sopas, bebida gaseada, etc.

1 Fiola estril de 500 ml de capacidad. 1 Termmetro de 10 250 C. 1 Bao serolgico. Mnimo 10 pipetas estriles de 1 mL de capacidad. 12 Cajas de petri estriles.

3.4.REACTIVOS

7 tubos con 9 ml de agua peptonada 0,1%.

a

b c

10 20 30

100

110

120

40

Tiempo (min)

Tempera

tura(C)

Temperatura delmedio calefactor


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240 ml de agar estndar para recuento en placa (SPC). Cultivo madre de E. coli oS. aureus en fase logartmica (mantenido en caldo BHI).

3.5.PROCEDIMIENTO

Tomar aproximadamente 300 ml de producto en una fiola estril de 500 ml decapacidad. Realizar recuento de aerobios msofilos de las diluciones 10-2 y 10-3.. Si suproducto se trata de una muestra comercial realizar recuento de las diluciones 10-1 y 10-2.

Tomar la temperatura inicial e iniciar el calentamiento. Verificar la temperatura del producto en el punto frio, a intervalos de 2 minutos, segn

sea la velocidad de transmisin de calor (puede ser ms amplio o ms reducido), hastallegar a una temperatura constante que se repita 3 o 4 veces.

En este punto se toma de la muestra 1 ml para realizar otro recuento de aerobiosmesfilos a partir de las diluciones 10-1 y 10-2.

Se siguen con el enfriamiento rpido en agitacin y ayudados con un chorro de aguafran, hasta llevar el producto a una temperatura aproximada de 35C, siempre haciendoseguimiento de la temperatura cada 2 minutos (o segn el intervalo establecido paracada producto).

En este punto se hace un ltimo recuento de aerobios mesfilos de las diluciones 10-1 y

10-2

. Construir la grfica de penetracin de calor para el producto, y comparar las cargas encada uno de los tres puntos.

Determine la velocidad de penetracin de calor para cada producto y discuta el porquede los resultados.

3.6.NIVEL DE RIESGO

Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, yaque se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento por

malas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto,todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberusar los siguientes equipamientos: Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,

Pantaln Largo.

3.7.BIBLIOGRAFA

Board, R.G. (1998). Introduccin a la microbiologa moderna de los alimentos. Editorial

Acribia S.A., Zaragoza, Espaa.


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Heldman, S. (1998). Introduccin a la ingeniera de los alimentos. Editorial Acribia S.A.,Zaragoza, Espaa.

Ress, G.A., Bettison, J. (1994). Procesado trmico y envasado de los alimentos. EditorialAcribia S.A., Zaragoza, Espaa.

Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en losalimentos, la temperatura. En: Microbiologa alimentaria, volumen 1. Aspectosmicrobiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza,Espaa. Pps. 7 50.

ICMSF. (2000). Temperatura, Captulo 1. En: Ecologa microbiana de los alimentos 1.Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos.Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pps. 1 38.


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ACTIVIDAD 4. DETERMINACIN DEL VALOR D PARA CULTIVOS

ASPORGENOS

4.1. OBJETIVO

Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de: Comprender el efecto de la temperatura en funcin del tiempo sobre la supervivencia

microbiana. Construir grficas TDT (tiempo de destruccin trmica), para diversos microorganismos,

las cuales describen el comportamiento de los mismos frente a una temperatura

determinada. Calcular los respectivos valores D para cada microorganismo, segn la grfica TDT

construida para ellos.

4.2. MARCO TERICO

La mayor parte de las bacterias patgenas tienen una tolerancia limitada a las variacionesextremas en su medio ambiente fsico y escasa capacidad para sobrevivir fuera del organismovivo. Otras, en cambio, producen esporas que son muy resistentes a las condiciones fsicas

deletreas del medio ambiente y que dotan al microorganismo de un valor incrementado desupervivencia.

En el vocabulario comn se emplea la palabra esterilizacin como un absoluto que implica lainactivacin total de todas las formas de vida microbiana en trminos de la capacidad delmicroorganismo para reproducirse. El sufijo cida se agrega cuando se hace alusin a una accinletal, en tanto que stasis se aade cuando simplemente se trata de inhibir el desarrollo o lamultiplicacin del microorganismo.

4.2.1. ndice de letalidad de los microorganismos: la informacin referida a la cintica de ladestruccin de una poblacin bacteriana es esencial para comprender las bases de laesterilizacin por agentes letales. Para los microorganismos el nico criterio vlido de muerte esla prdida irreversible de la capacidad de reproducirse. Esto en general est determinado portcnicas de siembra en placas que cuantifican, por medio de recuento de colonias, el nmero desobrevivientes.

Cuando se expone una poblacin bacteriana a un agente letal con el tiempo tiene lugar unareduccin progresiva en el nmero de microorganismos sobrevivientes. La cintica de ladestruccin de una poblacin microbiana suele ser exponencial: el nmero de sobrevivientes

disminuye en funcin del tiempo. Si el logaritmo del nmero de sobrevivientes se representacomo una funcin del tiempo de exposicin se obtiene una lnea recta (figura 4.1) cuya pendiente


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negativa define la velocidad de destruccin. Sin embargo, el ndice germicida solo nos dice quefraccin de la poblacin inicial sobrevive a un periodo determinado de exposicin al agenteantimicrobiano. Para determinar el nmero real de sobrevivientes es necesario conocer eltamao inicial de la poblacin. Esta relacin se expresa de forma matemtica por la frmula:

1

Donde,N0 = nmero inicial de microorganismosNf= nmero final de supervivientes despus del tiempo t.

Tericamente se ha descrito que la destruccin de una poblacin bacteriana sigue un ordenmatemtico progresivo, que obedece a un descenso exponencial (o logartmico, si se desealinealizar). Esto es comn para todas las bacterias, pero cada una de ellas difiere en suvelocidad de destruccin, la cual se halla reflejada en la pendiente de la grfica. Esta velocidadser la que determine el grado de resistencia del microorganismo a las altas temperaturas, por lotanto sta ser diferente para cada especie bacteriana; constituyndose en una importanteherramienta para la medida de la termorresistencia bacteriana.

Como puede observarse en la figura 4.1, la pendiente negativa de la curva obtenida refleja latasa de destruccin a esa temperatura en especial; pero dicha tasa es independiente del nmeroinicial de bacterias y se ve influenciada por un sinnmero de factores.

Figura 4.1. Grfica de la velocidad de muerte bacteriana o TDT (Thermal Destruction Time).

El calor es el mtodo de esterilizacin ms confiable y el de empleo ms difundido a nivel

mundial; siempre que sea posible debe ser el mtodo de eleccin. Como ocurre con otros tiposde desinfeccin, la esterilizacin de una poblacin bacteriana por calor es un proceso gradual y

Log

No

de

sobrev

ivientes

0

1

10 20 30 40

2

Tiempo (min)


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la cintica de la accin germicida es exponencial. La inactivacin de primer orden por calorsignifica que una fraccin constante de los microorganismos sufre un cambio qumico inactivantepor cada unidad de tiempo y que cada una de esas alteraciones es suficiente para inactivar unmicroorganismo.

El tiempo necesario para la esterilizacin es inversamente proporcional a la temperatura deexposicin. Esta relacin se puede expresar por el trmino de tiempo de muerte trmica o valorD de inactivacin trmica (McDonald y Sun, 1999; Joklik y col., 1997; Brennan et al., 1990), quese refiere al tiempo mnimo necesario para destruir una suspensin de microorganismos a unatemperatura predeterminada en un medio ambiente especificado (el concepto del valor D sedefine como el tiempo mnimo necesario a una temperatura constante para reducir el 90% de la

poblacin (Harrigan, 1998), lo cual equivale a reducir la poblacin en una unidad logartmica.Este valor D, como veremos ms adelante es equivalente al valor del inverso de la pendiente dela curva TDT). Debido a los elevados coeficientes de temperatura implicados en la esterilizacinpor calor, un cambio mnimo en la temperatura altera de manera significativa el tiempo de muertetrmica. De acuerdo con la ley de accin de masas, el tiempo de esterilizacin se relaciona deforma directa con el nmero de microorganismos en la suspensin.

4.2.2. Mecanismo de la lesin trmica: la inactivacin de las bacterias por calor no puede serdefinida en trminos bioqumicos simples. Aunque el efecto letal del calor hmedo por encima de

una temperatura determinada en general se atribuye a la desnaturalizacin y coagulacin de lasprotenas, el patrn del dao trmico es bastante complejo y la coagulacin sin duda enmascaraotros cambios ms sutiles inducidos en la clula antes de que se evidencie la coagulacin.

La produccin de rupturas en una hebra de DNA puede ser el primer episodio letal. La prdidade viabilidad de las clulas expuestas a una temperatura suave se puede correlacionar con laintroduccin de estas rupturas. El dao al DNA parece ser de naturaleza enzimtica y es unaconsecuencia de la inactivacin de las nucleasas. La capacidad de la clula para reparar estedao y para recuperar la viabilidad depende del estado fisiolgico del microorganismo y de suconformacin gentica. El calor tambin ocasiona una prdida de la integridad funcional de la

membrana y la filtracin de pequeas molculas y de material absorbente a 260 nm. Estematerial es de origen ribosmico y aparentemente proviene de la degradacin de los ribosomaspor ribonucleasas activadas por el tratamiento trmico. Parece existir una correlacin entre ladegradacin del RNA ribosmico y la prdida de viabilidad de las clulas expuestas atemperaturas elevadas.

El mecanismo por el cual los microorganismos resultan destruidos por el calor seco es diferenteal del calor hmedo. Los efectos letales del calor seco, o la desecacin en general,habitualmente se atribuyen a la desnaturalizacin proteica, al dao por oxidacin y a los efectos

txicos de elevadas concentraciones de electrolitos. En ausencia de agua el nmero de grupospolares sobre las cadenas peptdicas disminuye y se requiere ms energa para abrir las


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molculas; de ah el aumento aparente de la estabilidad del microorganismo.

En la tabla 4.1 se ilustran los tiempos mnimos necesarios para lograr una adecuadaesterilizacin a distintas temperaturas y formas de calor, tanto hmedo como seco.

Tabla 4.1. Tiempos mnimos requeridos para la esterilizacin por calor hmedo y calor seco adiferentes temperaturas.

Temperatura

(C)

Calor hmedo Calor seco

Tiempo (min) Presin (lb) Tiempo (min)

121 15 15 -

126 10 20 -

134 3 30 -

140 - - 180

150 - - 150

160 - - 120

170 - - 60

Fuente: Joklik y col., 1997.

Cuando se habla de termorresistencia, el arma principal con que se cuenta para inferir que tansusceptible es un microorganismo a un tratamiento trmico, es la grfica TDT o curva del tiempode destruccin trmica; en la cual se verifica la poblacin de bacterias en funcin del tiempo deduracin de un proceso trmico, que se hace necesario se realice a una temperatura constante.

La pendiente de la curva obtenida refleja la tasa de destruccin a esa temperatura en especial;pero dicha tasa es independiente del nmero inicial de bacterias y se ve influenciada por unsinnmero de factores. A partir de sta grfica surge un concepto que servir de parmetro paramedir la termorresistencia de microorganismos, y es el tiempo de reduccin decimal o valor D,definido como el tiempo necesario para destruir el 90% de la poblacin total de bacterias(Rahman et al., 2004); lo cual equivale a reducir la poblacin en una unidad logartmica. Estevalor D, como veremos ms adelante es equivalente al valor del inverso de la pendiente de lacurva TDT.

Debido a que cada ensayo para evaluar o determinar un valor D, se hace a una temperaturaconstante; sta temperatura debe indicarse como un subndice, as por ejemplo, valor D215F = 5minutos, lo que quiere decir que el valor corresponde a 215F. Para hallar este valor, trabajamoscon la ecuacin de la recta, especficamente con su pendiente, porque en estos trminos D,

equivale al inverso de la pendiente de la grfica obtenida, as:


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mD

1= ;

Dm

1=

Ntese el signo negativo como una compensacin ya que la pendiente en todos los casos sernegativa, y por tanto el tiempo de reduccin positivo.

La grfica TDT clsica, que se obtiene al realizar un estudio de termorresistencia a unmicroorganismo cualquiera, es la siguiente (Figura 4.2):

Figura 4.2. Grfica TDT.

De la figura 4.2 se infiere que:y

m

=

xab

yaybm

=

Donde m es la pendiente de la grfica TDT, la cual equivale a la razn existente entre undiferencial de valores en el eje y y el mismo diferencial en el eje x, los cuales estndelimitados por los puntos (xa;ya) y (xb;yb). Esta pendiente se puede, tambin, expresar de lasiguiente forma:

tatb

abm

=

loglog(4.1)

Ahora, como tenemos que la pendiente (que siempre ser negativa, en estos casos) es igual alinverso del valor D, podemos reemplazar as:

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30 35

Tiempo (min)

Log#m.o

log a

ta

log b

tb

xy

(xa; ya)(xb; yb)

Y = mx + b y = -x/D + b

b (punto de corte con el eje y)


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Dm

1= (4.2)

Entonces,tatb

ab

D

=

loglog1(4.3)

Despejando D, obtenemos:

ab

tatbD

loglog

)(*)1(

= (4.4)

Donde (tb ta), es considerado como el tiempo en que la poblacin inicial que tena unaconcentracin de log a, se redujo a una poblacin final con una carga de log b; sta diferenciade tiempo, es decir, el tiempo en que disminuir el nmero de microorganismos desde unapoblacin conocida hasta una poblacin final estipulada y debido a que siempre ser unadiferencia as est como un producto se conoce como t. Este t, se puede hallar si se conoceel valor D del microorganismo en estudio, as (debemos recordar que t es negativo en laecuacin del valor D, ya que se trata de un diferencial: tb ta):

)log(log ab

tD

= (4.5)

O lo que es lo mismo:)log(log* baDt = (4.6)

Ntese que en la anterior ecuacin el diferencial de la poblacin se ha invertido, de tal forma queel diferencial de tiempo es positivo. Si la diferencia de poblaciones log a log b es igual a uno,entonces el valorD ser igual a la duracin del tratamiento trmico t, as:

1

tD

= ; es decri: tD = (4.7)

En una grfica TDT, la recta tericamente, se puede prolongar por debajo del eje x, hasta la

zona de los negativos en el eje y, as por ejemplo, luego de a minutos de proceso la curva seubicar en el punto -2. Si lo anterior llega a suceder, debe interpretarse estadsticamente entrminos de probabilidad; es decir:

Antilog de 2: log 1 2 = 0,01

Esto no indica que una centsima parte de una bacteria o endospora por gramo o mililitro hasobrevivido en la muestra, como sera de suponer matemticamente; lo que esta cifra quieredecir, es que a esa temperatura y durante ese tiempo, existe la posibilidad de que en 100 g de

producto, sobreviva una bacteria o endospora. De tal manera que cuando la grfica llega en eleje yhasta 3, una bacteria sobrevivir en 1000 g del producto.


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Por lo anterior es evidente que la poblacin no puede nunca quedar reducida a cero, de lo quese infiere que si se somete cierto nmero de recipientes conteniendo una poblacin conocida, aun determinado tratamiento trmico, siempre existir la probabilidad de supervivencia de almenos un microorganismo en alguna lata. Estos hechos son muy tiles en la elaboracin de losclculos del diseo de un tratamiento trmico, para un producto en especial que va a sersometido a una appertizacin.

Si bien el tiempo de reduccin decimal (valor D) resulta til como parmetro para evaluar latermorresistencia microbiana, presenta una serie de limitaciones, y entre ellas la ms importantees que restringe ver la supervivencia de los microorganismos frente a una sola temperatura, que

es la que permanece constante durante el ensayo. Esta limitante conduce a la formulacin de unnuevo parmetro de termorresistencia denominado valor z, el cual permite realizar unseguimiento ms global del comportamiento microbiano durante diferentes temperaturas. As, sise conocen por lo menos dos valores de termorresistencia es posible determinar este nuevovalor como veremos en la siguiente actividad.

4.2.3. Determinacin del valor D para cultivos asporgenos por el mtodo de los tubosmltiples o de Bigelow: Este mtodo desarrollado por Bigelow en 1923 es denominado el

mtodo de los tubos TDT consiste en la determinacin del nmero de supervivientes para cadaintervalo de tiempo de exposicin a la temperatura de proceso, obteniendo as un recuento finalpara cada tiempo, y posteriormente graficando dichos recuentos en trminos de log10 versustiempo. Se calcula la pendiente y el inverso de la misma corresponde al valor D del cultivo. Diluir un caldo de cultivo de 24 horas (por ejemplo de Escherichia coli), para obtener un

recuento total alrededor de 3x108 clulas por ml. (Esto puede ser determinado por conteomicroscpico, o por nefelometra o por la opacidad de tubos (McFarland) si estos han sidocalibrados usando conteos microscpicos.

Colocar 10 ml de esta dilucin en 90 ml de diluyente estril (por ejemplo agua peptonada al0,1%) contenido en un recipiente de vidrio. Agitar bien para mezclar y romper los posiblesagregados. Distribuir cantidades de 5 ml en 5 tubos de ensayo estriles de 150 x 16 mm(preferiblemente con tapa de rosca o de polipropileno).

Colocar simultneamente los tubos preparados anteriormente en un bao de agua a 58Ccon un tubo control de temperatura conteniendo un termmetro y 5 ml de diluyente. Cuandola temperatura del contenido del tubo control alcance 1C por debajo de la temperatura delbao, remueva uno de los tubos (t0) e inmediatamente iniciar el conteo de tiempo desde estemomento.

Rpidamente enfriar el tubo removido en agua refrigerada. Preparar seis diluciones decimalesy realizar un recuento total en placa con todas estas diluciones.

Retirar otro tubo y repetir el paso 4 despus de cada una de los siguientes tiempos: 2 minutos, 5 minutos, 7 minutos y 10 minutos.


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Incubar las placas a 35C 2C durante 24 48 horas y determinar el nmero desupervivientes despus de varios periodos de calentamiento. Dibujar un grfico del log10(nmero de supervivientes) contra el tiempo. A partir de este determine el D58C (en minutos)como el inverso de la pendiente de la mejor lnea de ajuste (Coeficientes de regresin R2 y decorrelacin R) (Ver ejemplo en tabla 4.2. y figura 4.3a y 4.3b.).

Ejemplo determinacin del valor D por el mtodo de los tubos TDT:

Tabla 4.2. Ejemplo del recuento de supervivientes a 58C durante 10 minutos.

Tiempo

(minutos)

Recuento supervivientes

UFC/ml Log10 UFC/ml

0 10000000 7,00

2 6900000 6,84

5 540000 5,73

7 23000 4,36

10 1000 3

Figura 4.3a. Grfica TDT para la determinacin del valor D del ejemplo de la tabla 4.2.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

0 2 4 6 8 10 12

Log10ufc/ml

Tiempo (min)

m = -0,4191R2 = 0,9481R = 0,9737


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Figura 4.3b. Grfica TDT para la determinacin del valor D del ejemplo de la tabla 4.2.

Tal y como puede verse en la figura 4.3a el coeficiente de correlacin para todos los datos desupervivientes vs tiempo es de 0,9737 mientras que para los datos de la figura 4.3b (tiempos2 hasta 10 min) dicho valor fue 0,9988. De acuerdo con lo anterior, el valor D seestablecer como el recproco de la pendiente para la figura 4.3b; correspondiendo este valorD58C a 1,94 minutos.

4.2.4. Determinacin del valor D por el mtodo de presencia ausencia o de Halvorson yZiegler: Tambin existe otra metodologa para calcular el valor D en aquellos casos donde, seemplee un mtodo semi-cuantitativo (Nmero ms Probable). Para dicho procedimiento seempleara una serie de tubos expuestos a diferentes temperaturas y tiempos, paraposteriormente incubarlos y determinar ausencia o presencia de crecimiento. Esta tcnica fuedescrita por Halvorson y Ziegler en 1933, la cual es ampliamente utilizada enTermobacteriologa. Cuando una gran cantidad de unidades de un lote que contienen N0 demicroorganismos vivos se somete a un tratamiento letal, la letalidad del tratamiento es medidapor comparacin del N0 y el nivel de organismos supervivientes Ns. De acuerdo con Halvorson yZiegler (1933) el nmero promedio esperado de microorganismos por unidad experimental[sometidos a tratamientos letales o no] puede ser calculado solo si una fraccin de las unidadesexperimentales [tubos, latas, tarros, frascos, etc.] es estril, es decir, no contiene organismosvivos. La relacin de Halvorson y Ziegler [Hz] para determinar el nmero de supervivientes es lasiguiente (ecuacin 4.8a y 4.8b):

2,303 (4.8a)

Donde P0 = relacin entre el nmero total de muestras sometidas a calentamiento (n) y elnmero total de muestras sin crecimiento (r).Reemplazando n y ren P0, tenemos la siguiente expresin:

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

0 2 4 6 8 10 12

Log10

ufc/ml

Tiempo (min)

m = -0,5155R2 = 0,9976R = 0,9988


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2,303 (4.8b)

Donde:n = nmero total de muestras sometidas a calentamientor = nmero de muestras sin crecimientoHz = nmero promedio esperado de microorganismos/unidad de muestra, cuando la fraccin demuestras estriles [es decir, los que no presentaron crecimiento] es igual a Po.

Para este tipo de ensayo es necesario conocer la poblacin inicial antes de iniciado el tiempo desostenimiento del calentamiento.

Despus de obtener el Hz para cada tiempo se calcula el valor D para la temperatura en cuestincon la ecuacin 4.9 (la cual es una modificacin de la ecuacin 4.4).

(4.9)La ecuacin 4.9 tiene una aplicacin muy amplia en Termobacteriologa, donde usualmentemuchas unidades simples [tubos, tubos capilares, viales, frascos, latas, etc.] se someten de unaa un tratamiento trmico y la supervivencia se mide por la frecuencia de alteracin de lasunidades almacenadas y sin abrir despus de un tiempo y temperatura adecuada. Esta tcnicaes muy valiosa porque permite evaluar la probabilidad de supervivencia a un tratamiento dado en

el mismo sustrato donde se aplica la condicin letal. Es decir que refleja lo que ocurre en laprctica.

El mtodo: Diluir un caldo de cultivo de 24 horas (por ejemplo de Escherichia coli), para obtener un

recuento total alrededor de 3x108 clulas por ml. (Esto puede ser determinado por conteomicroscpico, o por nefelometra o por la opacidad de tubos (McFarland) si estos han sidocalibrados usando conteos microscpicos.

Colocar 10 ml de esta dilucin en 5 sets de 5 tubos de ensayo estriles de 150 x 16 mm

(preferiblemente con tapa de rosca o de polipropileno) cada uno. Adicionalmente colocar 10ml de la dilucin de trabajo en otro tubo de ensayo estril y marcarlo como N0.

Colocar simultneamente los tubos preparados anteriormente en un bao de agua a 58Ccon un tubo control de temperatura conteniendo un termmetro y 10 ml de diluyente. Cuandola temperatura del contenido del tubo control alcance 1C por debajo de la temperatura delbao, remueva uno de los sets de 5 tubos (t0) e inmediatamente iniciar el conteo de tiempodesde este momento. Al mismo tiempo retire el tubo marcado como N0 y enfriar todos lostubos removidos en agua refrigerada. A partir del tubo N0 preparar seis diluciones decimales yrealizar un recuento total en placa con todas estas diluciones, de esta forma determinamos la

poblacin al inicio del calentamiento.


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Retirar otro set de 5 tubos despus de cada una de los siguientes tiempos: 2 minutos, 5minutos, 7 minutos y 10 minutos.

Incubar tanto las placas como los 5 sets de 5 tubos a 35C 2C durante 24 48 horas. Con los recuentos obtenidos en las placas calcular la poblacin inicial (t0). Determinar para cada set de tubos en cuntos de ellos se presenta crecimiento (turbidez) y

en cuntos de ellos no hay crecimiento. A partir de la ecuacin 4.8 determine la relacin Hz para cada tiempo, y con estos datos

cuantifique el valor D58C (en minutos) a travs de la ecuacin 4.9.

Con los datos ilustrados en la tabla 4.3., vamos a calcular el valor D con este segundo mtodo.

Tabla 4.3. Ejemplo para el clculo del valor D por el mtodo de Halvorson y Ziegler.

Temperatura (C) Tiempo de calentamiento (min)Nmero de tubos

Calentadas Crecimiento Ausencia

58

0 5 5 0

2,5 5 4 1

5 5 3 2

7,5 5 2 3

10 5 1 4

Para el clculo del valor D vamos a partir con el supuesto de que la poblacin inicial (tubo N0) es1*107 ufc/ml (7,00 log10 ufc/ml).

Para el tiempo 0 minutos se obtuvo 5 tubos con crecimiento (P0 = 5/5).Para el tiempo 2,5 minutos se obtuvo 4 de 5 tubos con crecimiento (P0 = 5/1).Para el tiempo 5 minutos se observa que 3 de 5 tubos presentaron crecimiento (P0 = 5/2).Para el tiempo 7,5 minutos se observa que 2 de 5 tubos presentaron crecimiento (P0 = 5/3).Para el tiempo 10 minutos se observa que 1 de 5 tubos presentaron crecimiento (P0 = 5/4).

, 2,303 51Hz (2,5min) = 1,61

2,303 52Hz (5min) = 0,917

, 2,303 5

3

Hz (7,5min) = 0,511


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2,303

5

4

Hz (10min) = 0,223

En segundo lugar, procedemos a calcular el log10 para cada Hz:Log10Hz (2,5min) = 0,207Log10Hz (5min) = -0,038Log10Hz (7,5min) = -0,292Log10Hz (10min) = -0,652

Para calcular el valor D usaremos la ecuacin 4.9 para el primer intervalo de tiempo.

2,5 min 0 min 10000000 1,61

2,5min70,207

0,368

Repetimos la operacin anterior con cada intervalo de tiempo faltante:

5 0 70,038 0,71

7,5 0

70,292 1,03

10 0

70,652 1,31

4.3. MATERIALES, EQUIPOS E INSUMOS

30 tubos con 9 ml de caldo BHI (opcional agua peptonada estril 0.1%). 2 fiolas con 99 ml de caldo BHI 1120 ml de agar BHI fundido y mantenido a una temperatura de 55C. Cepas de bacterias mantenidas a 35C en caldo BHI (en fase exponencial). 56 cajas de petri estriles. 40 pipetas estriles de 1 ml. 2 pipetas de 5 ml estril. 2 Baos serolgicos ajustados a diferentes temperaturas.


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4.4. REACTIVOS

Patrn de McFarland No 0,5. Cepas de bacterias mantenidas a 35C en caldo BHI (en fase exponencial).

4.5. PROCEDIMIENTO

A partir de la cepa mantenida en caldo BHI se prepara una solucin patrn 0,5 de McFarland(equivalente a una poblacin terica de 1,5x108 bact/ml).

A partir del patrn se toma una alicuota de 11 ml que se suspende y homogeniza en 99 ml

de solucin diluyente para disminuir 10 veces la concentracin y preparar una suspensinde una poblacin terica aproximada de 1,5x107 bact/ml.

Se pasa 1 ml exacto de la suspensin, previamente homogenizada, a cada uno de los 6tubos con 9 ml de agua peptona estril. De sta manera reducimos 10 veces la anteriorpoblacin, es decir que supuestamente cada tubo tendr una concentracin de 1,5x106bact/ml. Cada tubo se rotula con 9, 18, 27, 36, 45 y 54 minutos.

Se toma el tubo rotulado para 9 minutos, y se le realiza un recuento inicial para verificar laconcentracin de las suspensiones. El recuento se hace de la dilucin 103, por duplicado enagar BHI.

En un bao serolgico, mantenido a una temperatura constante, indicada por el profesorpara cada microorganismo, se introducen los 6 tubos, manteniendo la temperatura

constante. Transcurridos los primeros 9 minutos, se toma el respectivo tubo, con la debidaasepsia, y se le realiza el correspondiente recuento de la siguiente manera: se lleva hasta ladilucin 10-1, tomndose 1 y 0,1 ml para inocular en las placas de Petri estriles, cubriendocon agar BHI fundido.

El procedimiento anterior se repite para cada tubo cuando se cumpla el tiempo respectivo deexposicin a la temperatura indicada.

Se incuban las placas durante 24 48 horas a 37C, segn el microorganismo a ensayar. Sehace la lectura correspondiente y se construye la grfica para especificar el valor D del

mismo.

4.6. NIVEL DE RIESGO

Para el desarrollo de la presente prctica se ha definido un Nivel de Riesgo Medio o Nivel 2, yaque se manejaran microorganismos considerados oportunistas y que en algn momento pormalas prcticas de laboratorio pueden conllevar algn peligro para los manipuladores. Por tanto,todo estudiante, auxiliar y docente que oriente e intervenga en el desarrollo de la misma deberusar los siguientes equipamientos:

Bata de Laboratorio manga larga, Guantes, Cofia, Tapabocas, Zapato Cerrado Bajo,Pantaln Largo.


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4.7. BIBLIOGRAFA

Brennan, J.G., Butters, J.R., Cowell, N.D. (1990). Heat processing 2. In: Food EngineeringOperations, Elsevier, UK, pp 297-302.

Mescle, J.F., Zucca, J. (1994). El comportamiento de los microorganismos en losalimentos, la temperatura. En: Microbiologa alimentaria, volumen 1. Aspectosmicrobiolgicos de la seguridad y calidad alimentaria. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza,Espaa. Pps. 7-50.

ICMSF. (2000). Temperatura, Captulo 1. En: Ecologa microbiana de los alimentos 1.Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos. Editorial

Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. Pgs. 1-38. Rahman, S.M., Guizani, N., Al-Ruzeiki, M.H. (2004). D- and Z-values of microflora in tuna

mince during moist- and dry-heating. Lebensm.-Wiss, u.-Technol., 37: 93-98. Harrigan, W.F. (1998). Chapter 12, Section 12.4: Effect of heat on microorganisms: the

determination of decimal reduction times (D values) and z values. In: Laboratory Methodsin Food Microbiology. 3rd Edition. Academic Press, San Diego, California, USA. Pgs. 123-127.

Halvorson, H.O., Ziegler, N.R. (1933). Applications of statistics to problems in bacteriology.I. A means of determining bacterial populations by the dilution method. Journal of

Bacteriology, 25: 101-121.


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ACTIVIDAD 5. DETERMINACIN DEL VALOR z PARA CULTIVOS

ASPORGENOS POR EL MTODO DE LA FRACCIN NEGATIVA DE BROWN(Ausencia Presencia)

5.1.OBJETIVO

Al finalizar la prctica el estudiante estar en capacidad de: Determinar el respectivo valor z del microorganismo asignado y compararlo con las

referencias bibliogrficas.

Manejar y emplear el valor z como otra herramienta de medida de la termorresistenciabacteriana, que complementa al valor D. Examinar diferentes estrategias existentes para hallar el valor z para un microorganismo

y explorar los clculos para su determinacin

5.2.MARCO TERICO

Con el devenir de la termobacteriologa se ha hecho necesario el empleo de ms y diferentesherramientas para el manejo y cuantificacin de la termorresistencia de un microorganismo. Desta manera, y como hemos comentado en la actividad anterior, se observa que el tiempo dereduccin decimal (valor D) como parmetro para evaluar la termorresistencia bacteriana,presenta

articulos caldos microbianos (7)

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