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Mendoza-Muoz, Nstor;Pin-Segundo, Elizabeth;Ganem-Quintanar,Adriana;Quintanar-Guerrero, David

PREPARACIN Y EVALUACIN IN VITRO DE NANOPARTCULAS POLIMRICASBIODEGRADABLES COMO AGENTE DE CONTRASTE PARA ULTRASONIDO

Tip Revista Especializada en Ciencias Qumico-Biolgicas, Vol. 10, Nm. 1, junio-sinmes, 2007, pp. 14-20

Universidad Nacional Autnoma de MxicoMxico

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Tip Revista Especializada en Ciencias Qumico-BiolgicasISSN (Versin impresa): 1405-888Xrevistatip@yahoo.comUniversidad Nacional Autnoma de MxicoMxico

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TIP Rev.Esp.Cienc.Qum.Biol.14 Vol. 10, No. 1

RRRRRESUMENESUMENESUMENESUMENESUMENLos agentes de contraste para ultrasonido hasta ahora disponibles en el mercado, no permiten la deteccineficiente de tumores en diversos rganos, la miniaturizacin de este tipo de sistemas a escala nanomtricapodra resolver este problema. La finalidad de este trabajo fue la adaptacin del mtodo de desplazamiento desolvente que permitiera la preparacin de nanopartculas huecas, a partir de la encapsulacin de un ncleosublimable (naftaleno), para despus caracterizarlas desde el punto de vista de tamao, densidad y morfologa,as como llevar a cabo su evaluacin in vitro mediante un sistema de ultrasonido comercial. Las nanopartculaspreparadas tuvieron un dimetro entre 50-400 nm logrando una eficiencia de entrampamiento del 66.55% denaftaleno. Mediante liofilizacin se retir un 98% de la cantidad de naftaleno encapsulada, sin embargo, deacuerdo con las micrografas obtenidas por microscopa electrnica de barrido y de transmisin no se evidencila presencia de huecos en la matriz polimrica adems la densidad fue similar para las preparaciones connaftaleno y nanoesferas formadas nicamente con polmero, por otro lado, los resultados de la evaluacin invitro sugieren un aumento en la ecogenicidad de las preparaciones que contienen nanopartculas, encomparacin con aquellas soluciones en donde no estn presentes.Palabras Clave: Agentes de contraste, desplazamiento de solvente, liofilizacin, nanopartculas, ultrasonido.

AAAAABSTRACTBSTRACTBSTRACTBSTRACTBSTRACTUltrasound contrast agents available in the market do not allow the efficient detection of tumors in diverseorgans. The miniaturization of this kind of systems on nanometric scale could solve this problem. The purposeof this work was to adapt the solvent displacement method in order to obtain the hollow nanoparticles fromthe encapsulation of a sublimate nucleus (naphthalene), characterizing them for their size, density andmorphology. An in vitro evaluation by means of a commercial ultrasound system was also performed.Nanoparticles with a diameter of 50-400 nm and an entrapment efficiency of 66.55% of naphthalene wereobtained. Lyophilization allow to take off 98% of the encapsulated amount of naphthalene, however, themicrographs obtained by scanning electronic microscopy and transmission, did not demonstrate the presenceof pores or hollows in the polymeric matrix. In addition, the density of the preparations with naphthalene wassimilar to the systems with nanospheres formed only by polymer. Nevertheless, in vitro results suggest an increasein echogenicity for those preparations containing nanoparticles, in comparison with those solutions withoutnanoparticles.Key Words: Contrast agents, solvent displacement, lyophilization, nanoparticles, ultrasound.

D.R. TIP Revista Especializada en Ciencias Qumico-Biolgicas, 10(1):14-20, 2007

PPPPPREPREPREPREPREPARACINARACINARACINARACINARACIN YYYYY EVEVEVEVEVALUACINALUACINALUACINALUACINALUACIN INININININ VITROVITROVITROVITROVITRO DEDEDEDEDE NANOPNANOPNANOPNANOPNANOPARARARARARTCULASTCULASTCULASTCULASTCULASPOLIMRICASPOLIMRICASPOLIMRICASPOLIMRICASPOLIMRICAS BIODEGRADABLESBIODEGRADABLESBIODEGRADABLESBIODEGRADABLESBIODEGRADABLES COMOCOMOCOMOCOMOCOMO AGENTEAGENTEAGENTEAGENTEAGENTE DEDEDEDEDE CONTRASTECONTRASTECONTRASTECONTRASTECONTRASTE

PPPPPARAARAARAARAARA ULULULULULTRASONIDOTRASONIDOTRASONIDOTRASONIDOTRASONIDO

Nstor Mendoza-Muoz, Elizabeth Pin-Segundo,Nstor Mendoza-Muoz, Elizabeth Pin-Segundo,Nstor Mendoza-Muoz, Elizabeth Pin-Segundo,Nstor Mendoza-Muoz, Elizabeth Pin-Segundo,Nstor Mendoza-Muoz, Elizabeth Pin-Segundo,Adriana Ganem-Quintanar y David Quintanar-GuerreroAdriana Ganem-Quintanar y David Quintanar-GuerreroAdriana Ganem-Quintanar y David Quintanar-GuerreroAdriana Ganem-Quintanar y David Quintanar-GuerreroAdriana Ganem-Quintanar y David Quintanar-Guerrero

Divisin de Estudios de Posgrado (Tecnologa Farmacutica), Facultad de Estudios SuperioresCuautitln, Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Av. 1 de Mayo s/n, Cuautitln Izcalli,

C.P. 54740, Estado de Mxico. E-mail: nestormm05@hotmail.com,elizabethps75@yahoo.com.mx,, ganemq@hotmail.com, quintana@servidor.unam.mx.

Nota: Artculo recibido el 20 de marzo de 2007 y aceptado el 14 demayo de 2007.

ARTCULO ORIGINAL

15Mendoza-Muoz, N. et al.: Preparacin y evaluacin de nanopartculas huecasjunio, 2007

na de las modalidades imagenolgicas con mayoraceptacin y uso en el mbito mdico es el ultrasonido(US), ya que presenta diversas ventajas sobre otrascomo los rayos X, la resonancia magntica nuclear yla tomografa computarizada. Algunas de estas ventajas

son: su bajo costo (tanto en equipo como en precio del estudio),no es invasivo, es en tiempo real y no usa radiacin ionizante1.

Sin embargo, la principal desventaja del diagnstico medianteUS es la dificultad de diferenciar entre el tejido anormal y elsaludable debido a las propiedades acsticas similares, por loque, las seales recibidas producen imgenes que tienen bajocontraste2. Esta situacin ha conducido al desarrollo de losagentes de contraste para US (ACUS) los cuales estn diseadoscon el objetivo de aumentar la diferencia de seales entre el tejidode inters y sus alrededores. Un ACUS es un sistema capaz dealterar la absorcin, reflexin o refraccin de las ondasultrasnicas3.

Los inicios de los ACUS se reportan en la publicacin de Gramiaky Shah4 (1968), quienes al inyectar verde de indocianuro en aortade conejo obtuvieron un mejor contraste debido a las burbujasde aire generadas por cavitacin. A partir de este hecho se hanpropuesto diversos sistemas partiendo del principio de que losgases tienen menor densidad y mayor compresibilidad, que ensu conjunto son capaces de aumentar la seal acstica reflejada.Actualmente los ACUS disponibles en el mercado se componende micropartculas de 3 a 10 m de dimetro llenas de aire uotros gases, estos sistemas reciben el nombre genrico demicroburbujas.

A pesar del avance que ha representado la introduccin de lasmicroburbujas para el diagnstico ultrasnico, an no es posiblela deteccin eficiente de tumores; esta limitacin est relacionadaen parte con el actual tamao de los ACUS comercialmentedisponibles. Se ha sugerido que la miniaturizacin de estossistemas podra mejorar la capacidad para detectar tumores enuna gran variedad de rganos, como hgado, rin, pncreas,etc.5 Por otra parte, el tener partculas relativamente grandesaumenta en mucho la posibilidad de presentar efectos adversostales como la tromblisis y lisis celular, entre otros6.

Hasta la fecha, muy pocos trabajos han sido publicados acercadel desarrollo de ACUS a escala nanomtrica. Wheatley y cols.7(2004) lograron separar por centrifugacin poblaciones de tamaonanomtrico (450-690 nm) de una suspensin de microburbujasobtenidas mediante sonicacin de una solucin de Span 60 yTween 80 en presencia de octafluoropropano. Sin embargo, laprincipal desventaja de estas nanoburbujas es su pocaestabilidad in vitro. Adicionalmente, un trabajo reciente de estosmismos autores ampli la informacin acerca de este tipo desistemas, pero sin poder solucionar el problema de estabilidad8.Asimismo, Bloch y cols.9 (2005) han descrito la preparacin de

IIIIINTRODUCCINNTRODUCCINNTRODUCCINNTRODUCCINNTRODUCCIN

UUUUUACUS de 740 y 910 nm. La metodologa reportada por Bloch ycolaboradores consisti en una modificacin de la tcnicaempleada y patentada por POINT Biomedical Inc. (2005) para lapreparacin de microburbujas de nitrgeno envueltas en unadoble pared, la exterior de naturaleza protenica y la interiorcompuesta por un polmero biodegradable, este ACUS sedenomin biSphere y el trabajo resulta muy interesante debidoa la incursin de las nanopartculas polimricas como agentes decontraste.

Por otra parte, las tcnicas usadas para la elaboracin denanopartculas a partir de polmeros preformados pueden seruna alternativa para la elaboracin de ACUS de tamaonanomtrico, estas tcnicas son utilizadas principalmente parael desarrollo de sistemas acarreadores de frmacos. En esesentido, el mtodo de desplazamiento de solvente es uno de losms difundidos debido a que es fcil y simple de implementar.Esta tcnica fue descrita y patentada por Fessi y cols.10 (1998),en este proceso, polmero, frmaco y, opcionalmente, unestabilizante lipoflico son disueltos en un solvente semipolarmiscible con el agua, como acetona o etanol, esta solucin esvertida o inyectada dentro de una solucin acuosa que contieneun estabilizante bajo agitacin magntica. Las nanopartculasson formadas instantneamente por la rpida difusin delsolvente, el cual es eliminado mediante presin reducida. Elmecanismo de formacin de las nanopartculas por esta tcnicaha sido explicado por la turbulencia interfacial que se generadurante el desplazamiento del solvente. La violenta difusin delsolvente es debida a la mutua miscibilidad entre los solventes,entonces, glbulos de solvente probablemente de tamaonanomtrico, son formados en torno a la interfase. Estos glbulosson rpidamente estabilizados por el agente estabilizante, hastala difusin completa del solvente11.

El objetivo de este trabajo es proponer una metodologa paraelaborar nanopartculas huecas las cuales puedan serpotencialmente usadas como agente de contraste en ultrasonidomediante la encapsulacin de un ncleo voltil, as como llevara cabo la caracterizacin fisicoqumica de las nanopartculasobtenidas y su evaluacin in vitro en un sistema de ultrasonidocomercial.

MMMMMATERIALESATERIALESATERIALESATERIALESATERIALES YYYYY MTODOSMTODOSMTODOSMTODOSMTODOSMaterialesMaterialesMaterialesMaterialesMaterialesAlcohol polivinlico (PVAL) Mw 26 000 y 98% hidrolizadoobtenido de Glomarza (Mxico); copolmero de cido lctico-co-gliclico 50:50 (PLGA); resomer RG 502 H de BoehringerIngelheim (Alemania); naftaleno grado reactivo adquirido deMerk (Alemania); percoll (suspensin de slica coloidal)obtenido de Fluka (Suiza); marcadores de densidad (consistentesde microesferas de dextrn de densidad conocida) obtenidos dePharmacia Biotech AB (Suecia); los solventes acetona gradoanaltico de Fermont (Mxico) y agua desionizada obtenida porsmosis inversa del sistema RiOs Millipore (USA). Todos los

TIP Rev.Esp.Cienc.Qum.Biol.16 Vol. 10, No. 1

otros reactivos fueron de grado analtico y usados sin posteriorpurificacin.

MMMMMTODOSTODOSTODOSTODOSTODOSPreparacin y caracterizacin de las nanopartculasPreparacin y caracterizacin de las nanopartculasPreparacin y caracterizacin de las nanopartculasPreparacin y caracterizacin de las nanopartculasPreparacin y caracterizacin de las nanopartculasLas nanopartculas se prepararon por el mtodo dedesplazamiento de solvente, para ello se disolvieron 300 mg dePLGA y la cantidad de naftaleno requerida para la preparacin(37.5 75 mg, 12.5 y 25% respectivamente) en 25 mL de acetona,posteriormente esta solucin se inyect lentamente en 50 mL deuna solucin acuosa de PVAL al 5%, bajo agitacin magnticamoderada. Despus de 5 minutos de agitacin, se retir elsolvente y la dispersin se concentr hasta aproximadamente 25mL bajo presin reducida, por medio de un rotavapor. Lasnanopartculas fueron separadas mediante ultracentrifugacin(Ultracentrfuga Optima LE-80K, Beckman, USA) a 30 000 rpmpor 30 minutos utilizando un rotor 50.2 Ti. El sobrenandante fuedesechado y la pastilla formada resuspendida en agua desionizadamediante agitacin magntica durante toda la noche, esteprocedimiento de lavado se llev a cabo tres veces.

La eficiencia de entrampamiento (EE) fue calculada de acuerdocon la siguiente ecuacin12:

(1)

Donde CN corresponde a la cantidad cargada de naftaleno la cualse calcul de la siguiente manera12:

(2)

El porcentaje inicial de naftaleno corresponde a la cantidadterica de naftaleno cargado y fue calculado a partir del peso denaftaleno usado en la preparacin dividido entre el peso delpolmero usado en la preparacin y el peso del naftaleno. Pararetirar el naftaleno encapsulado se procedi a liofilizar lasnanopartculas obtenidas, para ello la suspensin denanopartculas fue congelada a 15C y secada durante 72 horasa una presin < 100 Bar en un liofilizador Labconco FreeZone(USA). El dimetro de las nanopartculas se determin mediantela tcnica de dispersin de luz lser (Coulter N4 Plus, Coulter,USA). La longitud de onda de la luz lser (He/Ne, 10 mW) fue de678 nm. Las mediciones fueron hechas a un ngulo de 90 durante180 s, a una temperatura de 25C. Las dispersiones fuerondiluidas con agua desionizada para asegurar que el nmero departculas contadas por segundo estuviera dentro del rango desensibilidad del instrumento. Las medidas fueron hechas portriplicado para todos los lotes preparados. Se observ lamorfologa de las nanopartculas recubiertas con una pelcula deoro de 20 nm con un microscopio electrnico de barrido JEOLJMS-25SII (Japn) a 12.5 kV, mientras que la estructura fueobservada con un microscopio electrnico de transmisin JEOL

JEM-2010 (Japn) a 200 kV. La determinacin de la densidad fuellevada a cabo mediante la separacin de las nanopartculas enun gradiente de slica coloidal formado in situ durante laultracentrifugacin en un rotor modelo 90Ti (Beckman, USA) a5C y 10, 000 rpm durante 3 horas. En el tubo de centrfuga fueroncolocados 7.5 mL de Percoll al 45 % v/v en NaCl 0.15 M juntocon 200 L de la dispersin de las nanopartculas. En un tubo porseparado, fueron colocados marcadores de densidadconstituidos por micropartculas de diferentes densidades,adicionados bajo las mismas condiciones que las muestras yusados para la calibracin externa de las bandas formadas. Ladistancia entre la parte superior del menisco y la banda (altura)fue determinada mediante un Vernier (Digitex , USA). La densidadde las nanopartculas fue situada grficamente mediante lainterpolacin de su altura en una curva obtenida a partir de lasalturas de los marcadores de diferente densidad.

EvaluacinEvaluacinEvaluacinEvaluacinEvaluacin in vitro in vitro in vitro in vitro in vitroSe construy un dispositivo formado por un tubo deultracentrfuga (16 x 76 mm) de policarbonato, el cual se perforcon la finalidad de formar dos ventanas centradas y opuestas de10 x 50 mm. Posteriormente, el tubo se forr con ltex (obtenidode un guante quirrgico) y fue sellado con un tapn de baquelita.El tapn de baquelita se perfor de tal forma que se introdujo unamanguera de 2 mm de dimetro la cual se conect a una jeringade 20 mL (Figura 1). En dicho dispositivo se inyectaron 15 mL dela dispersin de nanopartculas en una concentracin deaproximadamente 5x108 partculas/mL determinada por medio delNanosizer N4 Plus (Coulter, USA). Despus, el dispositivo fuesometido al ultrasonido por el lado de la ventana utilizando comoamplificador una bolsa de acoplamiento (bolsa con agua)colocada debajo del dispositivo, el estudio se realiz con unequipo de US comercial en modo B marca Mitsubishi, equipadocon un transductor convexo, trabajando a una frecuencia centralde 3.5 MHz, la imagen obtenida fue impresa directamente delequipo, digitalizada y convertida en escala de grises a 8 bitsutilizando un scanner Hewelt Packard Modelo 5100C a unaresolucin de 600 dpi. Dicha imagen fue analizada mediante elsoftware Image v.1.35p (National Institutes of Health, USA),para ello se defini la regin de inters (RDI) correspondiendoen lo posible a la ventana del dispositivo y se obtuvo el valorpromedio de la escala de grises (VPEG), as como el histogramacorrespondiente.

RRRRRESULTADOSESULTADOSESULTADOSESULTADOSESULTADOS YYYYY DISCUSINDISCUSINDISCUSINDISCUSINDISCUSINPreparacin de las nanopartculasPreparacin de las nanopartculasPreparacin de las nanopartculasPreparacin de las nanopartculasPreparacin de las nanopartculasEl mtodo de desplazamiento de solvente permiti prepararnanopartculas de PLGA de tamao submicrnico con un dimetropromedio 150 nm y una estrecha distribucin monodispersa(50- 400 nm), no se encontr diferencia significativa en eldimetro promedio entre la preparacin al 12.5 % y la de 25 % denaftaleno. La eficiencia de encapsulamiento fue de 66.55%. Bajolas condiciones de la liofilizacin se logr sublimar un 98% de lacantidad total encapsulada, quedando un 2% de naftaleno

CN(%) = x 100Peso de naftaleno en las nanopartculas

Peso recuperado de nanopartculas

EE(%) = x 100CN(%)

Porcentaje inicial de naftaleno

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residual, estos datos muestran que los materiales voltiles osublimables como el naftaleno, cuyo punto de sublimacin bajocondiciones estndares de presin y temperatura es < 80C 13,son compuestos que pueden ser fcilmente retirados. Estemtodo ha sido ampliamente utilizado en la elaboracin demicropartculas huecas14-16. Las imgenes obtenidas medianteMEB (Figura 2) no evidencian la presencia de poros o huecos enla matriz polimrica de PLGA, sin embargo, podemos observarque el tamao de las nanopartculas corresponde al determinadopor dispersin de luz lser. Por otro lado, las micrografasobtenidas por MET (Figura 3) tampoco muestran la presencia deestructuras que pudieran sugerir huecos o poros en lasnanopartculas, stas pueden observarse como partculasesfricas con una matriz compacta similares a las nanoesferasformadas nicamente por PLGA (sin incluir naftaleno en supreparacin). De acuerdo con lo anterior, a pesar de que se llevaa cabo la encapsulacin y sublimacin del naftaleno que seencuentra situado en la matriz polimrica no se evidencianhuecos, la hiptesis que planteamos es que el naftaleno puedeencontrarse disperso en forma molecular. Se ha reportado que lassubstancias encapsuladas en nanoesferas (como es nuestrocaso) se encuentran dispersas en forma molecular17,18. Losresultados de densidad (Figura 4) confirman el hecho que elpolmero se est reacomodando porque no presenta cambios dedensidad por retencin de aire, ya que se encontraron densidadessimilares para las nanoesferas y las preparaciones denanopartculas a las cuales se les incorpor el naftaleno. Esimportante sealar que los resultados esperados eran que laspreparaciones con naftaleno tuvieran una densidad muchomenor en comparacin con las nanoesferas de PLGA debido ala presencia de aire producto de los huecos formados.

Evaluacin in vitroPrimeramente, con respecto al dispositivo podemos afirmar que

ste cumpli con el objetivo planteado al permitir que las ondasultrasnicas atravesaran la ventana creada y se lograra observarel lquido inyectado en su interior. En general, en las imgenes(Figura 5) se ve el dispositivo bien definido debido a que lasondas ultrasnicas rebotan principalmente en la regin rgida deltubo. Entre las dos paredes que delimitan al tubo se observa unaregin de menor brillo la cual est constituida por el lquidoinyectado, en esta seccin es donde fue delimitada la RDI. Lazona de alto brillo por debajo del dispositivo est dada por labolsa de acoplamiento que es un sistema constituido por unabolsa de plstico la cual en su interior tiene agua, sta sirve paraamplificar estructuras que tienen bajo contraste o que son muypequeas.

El anlisis de las imgenes digitalizadas se bas en obtener elvalor promedio de escala de grises (VPEG) de la RDI. El VPEG esdeterminado asignndole a la imagen (la cual deber estar enformato de escala de grises) valores desde 0 hasta 255, en donde

Figura 1. Esquema del dispositivo elaborado para laFigura 1. Esquema del dispositivo elaborado para laFigura 1. Esquema del dispositivo elaborado para laFigura 1. Esquema del dispositivo elaborado para laFigura 1. Esquema del dispositivo elaborado para ladeterminacin de la ecogenicidad determinacin de la ecogenicidad determinacin de la ecogenicidad determinacin de la ecogenicidad determinacin de la ecogenicidad in vitroin vitroin vitroin vitroin vitro de las nanopartculas de las nanopartculas de las nanopartculas de las nanopartculas de las nanopartculas(unidades en mm).(unidades en mm).(unidades en mm).(unidades en mm).(unidades en mm).

Figura 2. Micrografas obtenidas por MEB para las nanopartculasFigura 2. Micrografas obtenidas por MEB para las nanopartculasFigura 2. Micrografas obtenidas por MEB para las nanopartculasFigura 2. Micrografas obtenidas por MEB para las nanopartculasFigura 2. Micrografas obtenidas por MEB para las nanopartculasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a) Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a) Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a) Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a) Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a) Nanoesferasde PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% denaftaleno. 15000 x Barra= 1mnaftaleno. 15000 x Barra= 1mnaftaleno. 15000 x Barra= 1mnaftaleno. 15000 x Barra= 1mnaftaleno. 15000 x Barra= 1m

a)

b)

TIP Rev.Esp.Cienc.Qum.Biol.18 Vol. 10, No. 1

0 corresponde al negro puro y 255 al blanco puro; de esta manerael VPEG es el tono promedio de los pixeles analizados. Esimportante mencionar que el software utilizado, Image v.1.35p(National Institute of Health, USA), es un programa desarrolladopara el anlisis de imgenes mdicas utilizado en tcnicas comoson: el US, la resonancia magntica nuclear, la tomografacomputarizada, entre otras. El VPEG es equivalente a un ndiceque proporciona un estimado de la cantidad de color blanco onegro presente en la imagen. Por lo tanto, en este caso si elsistema es capaz de aumentar el contraste, ste se ver traducidoen un aumento en el brillo y, por ende, en una mayor cantidad detonos blancos, por lo que el VPEG deber desplazarse a laderecha en comparacin con un sistema de menor contraste. Estetipo de anlisis ya ha sido utilizado en la determinacin de laecogenicidad de algunos ACUS como SonoVue y algunosotros trabajos de investigacin19,20. La Figura 6 muestra loshistogramas de frecuencia de la escala de grises para cada unode los sistemas evaluados y en la Tabla I se reporta el VPEG. Demanera general las tendencias de los sistemas analizados son entodos los casos distribuciones sesgadas hacia la izquierda.Adems una caracterstica importante es que contienennanopartculas que presentan una distribucin bimodal en dondeuna de estas modas corresponde al valor para el blanco puro. Porotra parte se observa que el VPEG del sistema blanco presentael menor valor numrico, sin embargo, este valor puede

Figura 3. Micrografas obtenidas por MET para las nanopartculasFigura 3. Micrografas obtenidas por MET para las nanopartculasFigura 3. Micrografas obtenidas por MET para las nanopartculasFigura 3. Micrografas obtenidas por MET para las nanopartculasFigura 3. Micrografas obtenidas por MET para las nanopartculasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a) Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a) Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a) Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a) Nanoesferasformadas por PLGA posteriores a la liofilizacin. a) Nanoesferasde PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% dede PLGA; b) nanopartculas de PLGA formadas con 12.5% denaftaleno. 20000 x.naftaleno. 20000 x.naftaleno. 20000 x.naftaleno. 20000 x.naftaleno. 20000 x.

Figura 4. Bandas de las nanoesferas (NE), nanopartculas (NP)Figura 4. Bandas de las nanoesferas (NE), nanopartculas (NP)Figura 4. Bandas de las nanoesferas (NE), nanopartculas (NP)Figura 4. Bandas de las nanoesferas (NE), nanopartculas (NP)Figura 4. Bandas de las nanoesferas (NE), nanopartculas (NP)formadas con 12.5% y 25% de naftaleno y estndares externosformadas con 12.5% y 25% de naftaleno y estndares externosformadas con 12.5% y 25% de naftaleno y estndares externosformadas con 12.5% y 25% de naftaleno y estndares externosformadas con 12.5% y 25% de naftaleno y estndares externosgeneradas con Percollgeneradas con Percollgeneradas con Percollgeneradas con Percollgeneradas con Percoll mediante centrifugacin. mediante centrifugacin. mediante centrifugacin. mediante centrifugacin. mediante centrifugacin.

Figura 5. Ultrasonogramas digitalizados de los diferentesFigura 5. Ultrasonogramas digitalizados de los diferentesFigura 5. Ultrasonogramas digitalizados de los diferentesFigura 5. Ultrasonogramas digitalizados de los diferentesFigura 5. Ultrasonogramas digitalizados de los diferentessistemas probados. a) Blanco (agua desionizada), b) nanoesferas;sistemas probados. a) Blanco (agua desionizada), b) nanoesferas;sistemas probados. a) Blanco (agua desionizada), b) nanoesferas;sistemas probados. a) Blanco (agua desionizada), b) nanoesferas;sistemas probados. a) Blanco (agua desionizada), b) nanoesferas;c) nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.c) nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.c) nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.c) nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.c) nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.

a) b)

c)

a)

b)

NE NP 12.5% NP 25%Densidad(g/cm3)1.0181.035

1.052

1.065

1.075

1.1191.138

1.087

1.102

1.0781.082

1.076

19Mendoza-Muoz, N. et al.: Preparacin y evaluacin de nanopartculas huecasjunio, 2007

Figura 6. Histograma de distribucin del valor asignado en la escala de grises para la RDI de cada uno de los ultrasonogramasFigura 6. Histograma de distribucin del valor asignado en la escala de grises para la RDI de cada uno de los ultrasonogramasFigura 6. Histograma de distribucin del valor asignado en la escala de grises para la RDI de cada uno de los ultrasonogramasFigura 6. Histograma de distribucin del valor asignado en la escala de grises para la RDI de cada uno de los ultrasonogramasFigura 6. Histograma de distribucin del valor asignado en la escala de grises para la RDI de cada uno de los ultrasonogramasanalizados. a) Sistema blanco, b) nanoesferas; c) nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.analizados. a) Sistema blanco, b) nanoesferas; c) nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.analizados. a) Sistema blanco, b) nanoesferas; c) nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.analizados. a) Sistema blanco, b) nanoesferas; c) nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.analizados. a) Sistema blanco, b) nanoesferas; c) nanopartculas elaboradas con 25% de naftaleno.

considerarse alto teniendo en cuenta que se trata nicamente deagua, esto nos indica la presencia de artefactos, siendo elprincipal el asociado con la impresin de las imgenes de US, lascuales presentaron una serie de lneas blancas causadas por laimpresora, sin embargo, esto fue constante para todas lasimpresiones. Considerando lo anterior se observa que laspreparaciones formadas nicamente del polmero, es decir, lasnanoesferas, presentan un ligero grado de ecogenicidad que esindicado por el aumento del VPEG en comparacin con el sistemablanco. Esto puede considerarse normal, ya que las nanoesferastambin pueden comportarse como dispersores acsticos. Deigual manera se observa una ecogenicidad superior a la de lasnanoesferas para el caso de las nanopartculas elaboradas con

Tabla I. VPEG para cada uno de los sistemas analizadosTabla I. VPEG para cada uno de los sistemas analizadosTabla I. VPEG para cada uno de los sistemas analizadosTabla I. VPEG para cada uno de los sistemas analizadosTabla I. VPEG para cada uno de los sistemas analizadosmostrando tambin el rea de la RDI.mostrando tambin el rea de la RDI.mostrando tambin el rea de la RDI.mostrando tambin el rea de la RDI.mostrando tambin el rea de la RDI.

Sistema

BlancoNanoesferasNanopartculas formadascon 25% de naftaleno

rea de RDI (pixeles2)

111496112047116960

VPEG

81.36496.998123.686

25% de naftaleno, siendo sta la que presenta el mayor valornumrico de VPEG. Si bien es cierto que los resultados de VPEGreflejan que las nanopartculas preparadas con naftalenopresentan una mayor ecogenicidad en comparacin con lasnanoesferas, estos datos debern de tomarse con cierta reservay es que de acuerdo con la ecuacin para la frecuencia deresonancia (f)21:

(3)

La frecuencia de resonancia es inversamente proporcional aldimetro (d) y en ese sentido, considerando que las NPsobtenidas son de 150 nm, la frecuencia de resonancia calculadacorresponde a 40 MHz, la cual es una frecuencia fuera del rangomdico. Considerando que el utilizado en este trabajo fue de 5MHz, nos indica que la frecuencia a la cual el sistema fuesometido no fue lo suficiente para que entrara en resonancia.Existen reportes que los ACUS de tamao submicrnico siguenestas ecuaciones22,23, sin embargo, otros autores consideran quela relacin entre la repuesta ultrasnica generada y el tamao departcula submicrnico de este tipo de ACUS no est del todocomprendida, inclusive Wheatley y cols.24 (2006) han encontradoque los valores experimentales de frecuencia de resonancia

a) b)

c)

f =6500

d

Inte

nsid

ad

Inte

nsid

ad

Inte

nsid

ad

12000

0

10000

8000

6000

4000

2000

7000

0

6000

5000

4000

3000

2000

1000

7000

0

6000

5000

4000

3000

2000

1000

1 256 1 256

256

TIP Rev.Esp.Cienc.Qum.Biol.20 Vol. 10, No. 1

corresponden a la mitad de los valores tericos calculados.

Como puede observarse, el uso de los ACUS de tamaosubmicrnico an est en desarrollo y falta la comprensin de losfenmenos que permitan entender la relacin entre la respuestagenerada y el tamao de partcula, adems de los parmetrosasociados a la composicin de los ACUS.

CCCCCONCLUSIONESONCLUSIONESONCLUSIONESONCLUSIONESONCLUSIONESSe lograron preparar nanopartculas con una buena eficiencia deencapsulamiento de naftaleno, el cual pudo ser retiradoeficientemente mediante liofilizacin, sin embargo, no seevidencian poros o huecos en la matriz polimrica, debido quizsa que el naftaleno se encuentra disperso molecularmente en lamatriz. Las preparaciones con nanopartculas presentaron unamayor ecogenicidad en comparacin con el agua, adems,consideramos que la evaluacin en un rango mayor de frecuenciaspodra evidenciar an mejor la diferencia en la respuesta generadapor las nanopartculas en comparacin a medios acuosos sindispersores.

AAAAAGRADECIMIENTOSGRADECIMIENTOSGRADECIMIENTOSGRADECIMIENTOSGRADECIMIENTOSAgradecemos al Tec. Rodolfo Robles y al IQ Ivn Puente por suasesoramiento en la Microscopa Electrnica de Barrido yTransmisin, respectivamente. Al Tec. J. Ignacio Garca por elapoyo en la bsqueda bibliogrfica.

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