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Arbeiten mit Membranproteinen
Rupert Abele
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Überblick
• Solubilisierung• Reinigung• Liposomenpräparation• Rekonstitution
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Selbstorganisation von Detergenzien und Lipiden
Detergenz → Bildung von Mizellen (a)
Phospholipiden → Bildung von Lipiddoppelschichten (b) und Liposomen (c)
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Einteilung von Detergenzien
• Ionische Detergenzienhohe Solubilisationseffizienzstark denaturierend
• Nichtionische Detergenzienmilde Detergenzienkurze Kettenlängen (C7-C10) führen oft zurInaktivierung des Membranproteins
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Einteilung von Detergenzien
• Gallensäuresalzeionische Detergenzien mit starrem steroidem Rückgrat bildet nierenförmige Aggregatweniger inaktivierend als ionische Detergenzien
• Zwitterionische DetergenzienEigenschaften zwischen ionischen und nicht ionischen Detergenzien
CHAPSO
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Eigenschaften von Detergenzien
CMC (critical micellar concentration)verringert sich mit Länge der Alkylketteerhöht sich mit Anzahl der Doppelbindungen oder Verzweigungen erhöht sich mit der Konzentration von Gegenionen von ionischen Detergenzien
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Eigenschaften von Detergenzien
N (aggregation number)Anzahl der monomeren Detergenzmoleküle in einer Mizelleerhöht sich mit der Konzentration von Gegenionen von ionischen Detergenzien
CMT (critical micellar temperature)Temperatur, bei der monomeres, kristallines und mizellenhaltiges Detergenz im Gleichgewicht sindDetergenzlösungen werden klar
Cloud point (Trübungspunkt)Temperatur über der CMT, bei der nichtionische Detergenzien trübe werden Phasentrennung in Detergenz reiche und –verarmte Phase (eg. Triton X-114, 22 °C)
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Faustregel
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Eigenschaften von Detergenzien
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Phasen der Solubilisierung
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Phasen der Solubilisierung
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Kinetik der Solubilisierung
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Arten der Solubilisierung
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Kryo-Elektronenmikroskopie
Triton X-100 Decylmaltoside
5 mM; 0 h
5 mM; 144 h
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Vesikel-Mizellen Übergang
Rsat Rsat
TX-100
DM [DM] < Rsat
[DM] = Rsat4 days
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Arten der Solubilisierung
„Transbilayer Solubilisation“Schnell
„Micellar Solubulisation“Langsam
• schneller Flip-Flop• kooperative Bindung
• langsamer Flip-Flop, da große, sehr hydrophile Kopfgruppe
• Transfer von Phospholipiden und Detergenzienaus der äußeren Schicht in Mizellen
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Der Packungsparameter bestimmt den Solubilisierungsmechanismus
laVP×
=
V = hydrophobes Volumena = Querschnittsfläche des
hydrophilen Kopfsl = Länge der hydrophoben Kette
Detergenz
Phospholipid
Phosphatidylethanolamin
transbilayer solubilisation
micellar solubilisation
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Einflüsse auf den Solubilisierungsmechanismus
Änderung der Querschnittsfläche(Detergenz oder Lipid)
Octyl‐β‐D‐glucopyranosid
Octyl‐β‐D‐thioglucopyranosid
aOTG = 47,2 A2
aOG = 41,3 A2
POG > POTG
PDOPC > PDMPC
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Einflüsse auf den Solubilisierungsmechanismus
Änderung der Querschnittsfläche(Ionenstärke)
P300 mM NaCl > P100 mM NaCl
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Detergenz-Protein Interaktion
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Was ist solubilisiert?
Alles im Überstand nach Zentrifugationfür 1 h bei 100,000 x g
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Praktische Aspekte der Solubilisierung
• Detergenz (Detergenz-screen)• Einfache Screening Prozedur (Western blot; Achtung spezielles Laufverhalten
etc.)• Lipidkonzentration• Detergenz –Lipid Verhältnis (so gering wie möglich)
[detergent] - cmc[lipid]ρ =
• Solublisieringsdauer (so kurz wie möglich)• Temperatur• Ionenstärke• Puffer, pH• Chemische Chaperone (Glycerin,Sucrose)• Stabilität und Funktionalität des Proteins
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Größenbestimmung von Membranproteinen
OmpF mit einem Detergenzring
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Größenbestimmung von Membranproteinen
Problem:• Stokes-Radius setzt sich aus Protein und Detergenz zusammen• Detergenzanteil ist von der Art des Detergenz und Protein abhängig
Methoden der Molekulargewichtbestimmung:
• Analytische Ultrazentrifugation• Statische Lichtstreuung• STEM (scanning transmission electron microscopy)• Kleinwinkel Neutronen- oder Röntgenstrahlenbeugung
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Der Umgang mit Lipiden
• Lagerung von organischen Lösungen von Phospholipiden in Glasflaschen überschichtet mit Argon bei -80°C
• Niemals Plastikpipetten benutzen, um organische Lösungsmittel zu pipettieren• Ungesättigte Phospholipide sind hygroskopisch (in getrockneten organischen
Lösungsmitteln lagern) • Phospholipide nicht länger in wässrigen Lösungen aufbewahren• Oxidation von Phospholipiden verhindern (benutze qualitativ hochwertige
Lipidextrakte, destilliertes und entgastes Wasser, vermeiden von Lichteinstrahlung und hohen Temperaturen, verwende Antioxidantien wie Vitamin C, DTT, EDTA)
• Arbeite über der Phasenübergangstemperatur
liquid crystaline crystaline
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Liposomen
water
water
Amphiphilpolarer Kopf
unpolaren Schwanz
MLV0.5 -2 µm
SUV
50 nm
LUV
100 - 500 nm
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Liposomen Herstellung
Amphiphile Lipide
Auflösen in Detergenzien
Kolloidale Lösung
Entfernung des Detergenz
Auflösen in organischer Phase
Trocknen des Lipidfilms
Hydratisieren (MLV)
Ultraschall
SUV LUV
SUV
LUV
Einfrieren/ Auftauen
LUV (homogene Größe)
Extrudieren
Zugabe von wässriger Phase
Ultraschallbehandlung
Entfernung des organischen Lsgmittels
Extrudieren
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Liposomen Herstellung von getrockneten Lipiden
• Auflösen der Lipide (5 – 20 mg/ml) in organischem Lösungsmittel (Chloroform oder Chloroform:Methanol 2:1)
• Trocknen der Lipide in einem Rotationsverdampfer (Multilammelare Schichten) • Hydratisierung in einem Puffer oberhalb der Phasenübergangstemperatur
zwischen Gel und flüssig-kristalliner Phase (MLVs entstehen)• Ultraschallbehandlung (SUVs entstehen)• Einfrieren und auftauen 3x (LUVs mit inhomogener Größe entstehen)• Extrudieren (ungerade Anzahl, mindestens 11x) durch einen 200 – 400 nm
Polycarbonatfilter (homogene LUVs werden gebildet)
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Hydratisierung
Flüssig-kristalline Phase
Kristalline Phase
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Extrudieren
• oberhalb der Phasenübergangstemperatur• immer ungerade Anzahl von Durchläufen
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Charakterisierung der Liposomen
• Phospholipidkonzentration (Barlett assay):Hydrolyse des Phosphats mittels Perchlorsäure; Bestimmung von anorganischem Pi in Komplex mit Ammoniummolybdat
• Bestimmung der Lipidzusammensetzung und Oxidation von Lipiden
• Dichtigkeit der Liposomen:Selbstquenchen von Fluorescein, enzymatische Assays, radioaktive Substanzen
• Bestimmung des eingeschlossenen Volumens
• Bestimmung der Anzahl der SchichtenDerivatisierng der äußeren Lipide; Elektronenmikroskopie
• Größenbestimmung der Liposomen:Elektronenmikroskopie, dynamische und statische Lichtstreuung
• Trennung verschiedener Liposomen:Zentrifugation, Gelfiltration, Field flow fractionation
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Field Flow Fractionation
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Proteininkooperation
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Proteininkooperation
Natriumcholate Triton X-100 Octylglucoside
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Entfernung von Detergenzien
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Kritische Punkte der Rekonstitution
• Proteinaktivität
• Proteinausbeute in jedem Schritt
• Phospholipidzusammensetzung
• Lipid-zu-Protein Verhältnis
• Detergenz für Destabilisierung von Liposomen muß kompatibel mit Proteinaktivitätsein
• Orientierung des Proteins in der Membran
• Dichtigkeit der Proteoliposomen
• Inkoorporationseffizienz
• Trennung von Liposomen von Proteoliposomen