“APUNTES DE ANALISIS DE MEDICAMENTOS”

INTRODUCCIÓN

Analizar: llevar a cabo una serie de procedimientos, técnicas o métodos para caracterizar algo.Método: serie de procedimientos lógico que nos puede llevar a un resultado. Procedimiento: serie de pasos secuenciales lógicos (comprobados) que nos deben de llevar a un resultado.Técnica: es la utilización de un procedimiento en el cual está inmiscuido un instrumento.Medicamento: de acuerdo a la OMS es una forma farmacéutica cuyas características deben ser prevenir, diagnosticar y aliviar una enfermedad tanto en seres humanos como en animales. Ejemplos: vacunas.Forma Farmacéutica: presentación comercial de un medicamento formado por un

excipiente y un principio activo.Excipiente: materia prima inerte, no tiene actividad farmacológica y no da una respuesta analítica.Principio Activo: tienen efecto farmacológico.Formas Farmacéuticas

Sólidos• Comprimidos• Tabletas• Cápsulas• Parches• Capletas (cápsulas planas)

1

ANALISIS DE MEDICAMENTOS

DefiniciónAnálisisMedicamento

ProcedimientosMétodosTécnicas

Control de

Calidad

FarmacopeasA.O.A.C.ASTM

Etiquetas{Acondicionamiento}

Materias Primas

AuditoriasAseguramiento {PNO’s}Fórmula Maestra

Forma FarmacéuticaSólidasSemisólidasLíquidas

ExcipientePrincipio Activo

Análisis Químico

GMP’s

BitácoraMétodos validadosInstrumentos calificadosPersonal capacitado

GLP’s

• Tabletas masticables• Efervescentes• Polvos efervescentes• Grageas• Polvos para reconstituir• Implantes

Semisólidos• Supositorios• Óvulos vaginales• Ungüentos• Cremas• Pomadas

Líquidas• Jarabes• Suspensiones• Emulsiones• Inyectables• Oftálmicos• Oticos• Nasales• Elixir

Los medicamentos pueden clasificarse en:

- Estériles y- No estériles

Asimismo las formas farmacéuticas se pueden clasificar de acuerdo a su vía de administración.Pruebas para sólidos

• Espesor • Tamaño• Altura• Diámetro• Delimitación (no grietas)• Forma

Son propiedades organolépticas para comprimidos.

Polvos• Gránulo del polvo• Olor• Color• Tamaño

Cápsulas• Tamaño• Color (gelatina blanda)

Prueba de friabilidad: (peso, dureza para comprimidos) tiene como objetivo que tan manipulables pueden ser al colocarlos en su estuche; asimismo que tanto polvo se desprende.Dureza: prueba de desintegración y dilución (manipulación).Peso: contiene la dosis requerida y es una medida de que tan bien estuvo hecha la tableta.Prueba de desintegración.Contenido de Principio Activo.

Prueba de dilución: establece el medicamento adecuado o no. Tiene que ver con la bioequivalencia y biodisponibilidad.

Semisólidos.

• Aspecto• Textura (cremas, ungüentos, pomadas)• Dureza (óvulos y supositorios)• Color• Olor• Apariencia

2

• Gravedad específica• Prueba de reblandecimiento• Densidad• Contenido de Principio Activo• Viscosidad y velocidad de sedimentación• Tamaño de partícula para emulsiones

La Prueba de Identidad es lo primero que se requiere. Líquidos

• Aspecto• Color• Gravedad específica (líquido de referencia, el valor es adimensional)• Densidad (masa/volumen)• Viscosidad• Cantidad de azúcar presente en jarabes• Elixir (cantidad de alcohol)• Prueba de esterilidad (en inyectables)• Prueba de pirogenicidad• Prueba de isotonicidad• pH• Contenido de Principio Activo• Prueba de Identidad previamente

Control de Calidad para Excipientes y Principio Activo

Se lleva a cabo mediante:- Proveedores certificados.- Reglamentación adecuada (Farmacopeas como compendios oficiales que contienen mejores criterios de calidad).- NF control de excipientes o reactivos analíticos.- Farmacopea (principios activos sólidos y su forma farmacéutica).- A.O.A.C. Organización Americana de Análisis Químicos.- ASTM American Society Test of Methods.- Aseguramiento o Auditoria de la Calidad (los proveedores satisfagan condiciones de certificado)

Procedimientos Estandarizados de Operación PNO’s verifican que todo se lleve a cabo adecuadamente desde la entrada de materia prima. Se realiza verificación cada cierto tiempo. Se tienen las Fórmulas Maestras para cada medicamento.CALIDAD: Tener o reunir los requisitos del cliente.

Etiquetas o Acondicionamiento del medicamentoMateria prima

• Etiquetado y control adecuado.• Incluir información (nombre, cantidad, contenedores recibidos, número de lote). Cada bolsa debe de llevar su

propia etiqueta, la fecha de caducidad y las recomendaciones de almacenaje.• Responsable del análisis con registro.• Medicamentos de Patente deben de llevar el nombre comercial y principio activo.• Medicamentos Magistrales deben de llevar el nombre del paciente, nombre del médico y lo que contiene.

Las etiquetas generalmente son de color blanco con margen de color rojo.Todas las pruebas se deben de realizar en medicamentos :

- Al inicio.- A granel.- Y como producto terminal.

ANÁLISIS QUÍMICOUso de metodología analítica.

Cualitativo (propiedades intensivas del sistema no depende de la cantidad)• Prueba de Identidad

Aluminio + EDTA . Formación de un complejo utilizando como indicador a negro de eriocromo.Na+ a la flama es de color anaranjado.K+ color rosado violeta.Fe+2 color verde.

Cuantitativo (se requiere de cantidad exactamente conocida)• Procedimiento.

3

• Técnica.• Método

Se selecciona el método, la técnica a seguir y que procedimiento. En el compendio de Farmacopea se regulan los límites de dosificación.La calidad de los reactivos está a cargo de la American Chemical Society.Validación de Métodos: se refiere a cualquier cambio de metodología que impacte sobre los resultados. En la Farmacopea se encuentran los métodos validados o requerimientos específicos.

Análisis adecuado• Muestra (debe ser homogénea, representativa, tamaño adecuado y aleatoria)• Método.• Instrumento• Analista capacitado.

Aleatorizar: que cada elemento de la muestra tenga la misma probabilidad de ser seleccionado para llevar a cabo el análisis.

METODO

Específico (sólo debe de cuantificar el analito de interés). Validado

• Preciso• Exacto• Reproducible• Repetible• Rápido y sencillo• Sensible• Límite de detección• Límite de cuantificación

Validación de un método analítico aplicado al análisis cuantitativo de medicamentosLa VALIDACIÓN de un método analítico puede definirse como un paso crítico cuyo propósito es asegurar su calidad o validez. El objetivo de la validación no es comparar un método con otro ya existente (método de referencia) sino conocer mejor sus características.La validación corresponde a un estudio científico de los criterios de confiabilidad de esta técnica. Estos corresponden a:

• La exactitud• La precisión o fidelidad• La sensibilidad• El límite de detección• La especificidad y selectividad• La linealidad• El rendimiento de extracción

La apreciación de las cualidades del método se define en relación a una molécula, un método y un equipo dado.Exactitud: representa la cualidad de concordancia entre un valor determinado y el valor real o convencionalmente verdadero. Estadísticamente, la exactitud se aprecia por la diferencia entre una media observada (Xi) y un valor teórico (X): (Xi – X).Precisión: la precisión o fidelidad de un método, representa la cualidad de concordancia en una zona definida de valores para determinar entre medidas repetidas, efectuadas en una misma muestra en condiciones constantes y determinadas.Sensibilidad: se define por la variación mínima que se debe imponer a la magnitud medida (por ejemplo, una concentración), para obtener una variación significativa del resultado de la medición (área en cromatografía).Límite de detección: se trata de la menor cantidad que puede detectarse por un método, con una probabilidad determinada de un blanco realizado en las mismas condiciones.Especificidad: caracteriza a un método que responde a un compuesto único y que no representa interferencia alguna.Selectividad: refleja la posibilidad de que mediante un método se determine simultáneamente o por separado las cantidades de dos entidades químicas distintas.Función analítica: relación entre el resultado analítico y la señal propia de la medida C = f(x).Función de calibración: relación inversa de la anterior entre la señal propia de la medida y el valor del patrón X = g(c).Repetibilidad: expresión cuantitativa de la precisión, cuando el mismo técnico aplica el método a la misma muestra, en el mismo laboratorio, con los mismos aparatos y los mismos reactivos, en el transcurso de la misma serie de análisis.Reproductibilidad: expresión de la precisión cuando el método se aplica a muestras distintas en condiciones diversas que deben de definirse.

VALIDACIÓN

4

PrecisoExactoReproducibleRepetibleLímite de detecciónLímite de cuantificaciónRobustezTolerancia

∑n

i

MuestraMétodoAnalista

Método para evaluar la materia prima ESTABILIDADDependiendo del tipo de técnica ESTABLECER LÍMITESDependiendo de que método PRECISION, EXACTITUDLineamientos del método INDICA % DE ERROR

TIPOS DE ERROR Sistemático (determinados)

Aleatorio (indeterminados) CrasoSISTEMATICO: se da independiente del aleatorio, ofrece valores abajo del valor real o verdadero, se da por el instrumento o material de laboratorio. El analista los puede eliminar al ser cuidadoso. Se pueden minimizar no eliminar.ALEATORIO: el equipo mismo los da, el analista no puede controlarlos. Se dan al azar inherente a los métodos. Pueden provocar valores que estén por arriba o por debajo de los valores promedio.

CRASO: errores graves que no tiene sentido llevar la metodología. Ejemplo:

A + B ↔ C + D Reactivos productos

- Directa : valorar C o D.- Indirecta: producir C o D y determinar cuanto queda de A o B (reactivos en exceso).

Para el reactivo en exceso se emplea el indicador fenolftaleina con pH de 8 a 10 (incoloro a rosa).

PRECISION: se vincula con los errores aleatorios. Coeficiente de variación o desviación estándar, hace referencia a que tan cercano se encuentran los valores por arriba o por abajo dentro de un valor medio. Ejemplo: valorar aspirina de 500 mg.

501.04 mg498.60 mg502.30 mg497.30 mg503.60 mg

2502.80 mg / 5 = 500.56 mg = X

σ = (Xi - X)2

√ n - 1

Concordancia entre ellos y el valor de la X.Grado de variabilidad de datos con respecto al valor promedio.

COEFICIENTE DE VARIACIÓN σ / X X 100 EXACTITUD: que tan cercano se encuentran los valores al valor verdadero o valor real (no conocido). Vinculada con errores sistemáticos.REPRODUCIBILIDAD DEL METODO: reproducción entre rachas, se manipula en diferentes períodos y en diferentes condiciones de laboratorio.REPETIBILIDAD DEL METODO: se determina la precisión dentro de rachas, dos personas trabajan en el mismo laboratorio, con el mismo material y con los mismos reactivos.LIMITE DE DETECCIÓN: cantidad de analito más pequeña que puede detectarse con un grado de confianza concreto. Está en función del instrumento utilizadoLIMITE DE CUANTIFICACION: cantidad que se puede cuantificar con precisión y exactitud.ROBUSTEZ: método capaz de aceptar cambios en los laboratorios, reactivos, analistas.TOLERANCIA

Distribución de Gauss n > 50 μ valor medio de población completa.

X estimación del valor.

5

μ ± 3 σ = 99 %μ ± 2 σ = 95 %μ ± 1 σ = 66 %La más elegible es la del 95 %.

En caso de diseños experimentales

• Variables independientes• Controlar las variables

Disminuir los errores sistemáticos. Si el número de determinaciones aumenta.Si n aumenta -------- X -------- μ

X = Σn Xi

i=1 n

LIMITES DE CONFIANZA

Establece que tanto el valor promedio de la muestra se va a encontrar dentro de la distribución de Gauss y se va a acercar al valor real.

Intervalo de confianza: valor promedio cerca del valor real.

Límites de confianza: valores hacia la izquierda o derecha.

μ – 1.96 σ < X < μ + 1.96 σ 95 % n n

Ejemplo. Se determinó el contenido de ion sodio en una muestra de orina utilizando electrodo selectivo de iones y se obtuvieron los siguientes valores:

102, 97, 99, 98, 101, 106 m¿Cuáles son los límites de confianza al 95 % y 99% para la concentración del ion sodio?

X = 100.5Grado de libertad = 5t= 2.57 a 95 %t= 4.03 a 99 %

= 3.27 100.5 +/- 2.57 (3.27/ 6 ) = 97.1 ------ 103.9 100.5 +/- 4.03 (3.27/ 6 ) = 95.1 ------ 105.87 hay más error

Ejemplo: se comprueba la escala de absorbancia de un espectrofotómetro a una longitud de onda concreta usando una desviación estándar. La lectura de la solución estándar da una absorbancia de 0.47. Se hicieron 10 mediciones de la absorbancia con el espectrofotómetro.

STD = 0.47 absorbancian = 10x = 0.461

0.003t = 2.26

Encuentre intervalo de confianza al 95 % y decida si existe un error sistemático.

0.461 +/- 2.26 (0.003/ 10) = 0.459 ------- 0.463 hay error sistemáticot = 3.25 a 99%

0.461 +/- 3.25 (0.003/ 10) = 0.458 ------- 0.464 hay error sistemático

Empleo de límites de confianza

- No necesito muestras demasiado grandes.- Eliminar resultados anómalos.

Grado de libertad: número de desviaciones independientes que se utilizan al calcular la desviación estándar. A medida de que el tamaño de la muestra se hace más pequeño s agranda la incertidumbre.

6

CURVAS DE CALIBRACION

Requiere de un estándar primario o estándar de referencia con las siguientes características:• Pureza conocida y alta.• Peso molecular de acuerdo a lo que se desea valorar.• Estable.• Poco higroscópico.• Barato.

Se pesa la mínima cantidad con precisión en balanza digital. La exactitud y precisión está dada por la estabilidad de la sustancia.Cada concentración se realiza por triplicado (15).Cada valoración requiere de cinco concentraciones.

• Respuesta proporcional entre señal analítica y respuesta analítica.• Proporción aritmética.• La ordenada al origen sea estadísticamente cero.

• Análisis de regresión r > 0.98 (coeficiente de correlación) b = 0 m = 1• Estimación sobre la línea que ya hizo la regresión.¿Cómo se hace?Verificar pureza del estándar.Coeficiente de absortividad 1% a un paso de haz de luz de 1 cm y la concentración de 1 % ese valor de absorbancia es el que daría.Deformación del espectro- Concentración.- pH- Medio de disolución (alcohol, cloroformo, agua).

Seleccionar longitud de onda de máxima absorción.- A concentraciones de 0.01 M y 0.1 M el es bajo.- A concentraciones bajas el es alto.

Las dos longitudes de onda a seleccionar se debe hacer conforme a pequeños cambios de longitud de onda para una absorbancia constante.Para el comportamiento de una meseta se parte de:

• Primera solución STOCK o solución madre, la cual es la de máxima concentración (una única pesada, una única concentración, volumen exacto y concentración conocida).• De la solución stock se realizan CINCO SOLUCIONES ESTANDAR, cada una por triplicado.• Se procede a aleatorizar (prepararlas para leerlas indistintamente y con el mismo procedimiento).

PRUEBAS DE SIGNIFICANCIA

Compara media experimental con media verdadera Comparar las x de dos muestras (x - x ). Comparar prueba t por parejas. Prueba de significancia de 1 y de 2 colas. Prueba F para la comparación de pruebas estándar. Análisis de valores anómalos (1 o 2 valores). Prueba Q de Dickson.

Hacer un análisis de varianza (2 varianzas) ANOVA. Análisis de varias medias.Para cualquier análisis establecer hipótesis nula.Hipótesis nula: aquella mediante la cual un método no se encuentra sujeto a errores sistemáticos; al realizar una prueba de significancia se comprueba la veracidad de una hipótesis. Se llama nula para indicar que no hay más diferencia entre lo observado y el valor conocido que la que puede atribuirse a la variación aleatoria.Establecer hipótesis nula verdadera o falsa.Hipótesis verdadera: calcular probabilidad de que la diferencia observada entre la media muestral x y el valor verdadero se debe solamente a un error aleatorio.Establecer nivel de significancia 0.05 ó 0.010.05: quiere decir que se pueden tomar como valores verdaderos 5 de cada 100 mediciones que se hagan, ó 1 de 20.

7

0.01: tomar como valor verdadero 1 de cada 100.INTERPRETACION DE LA PRUEBA

• Si se acepta la hipótesis nula no significa que se haya probado que sea verdadera, sólo que no se ha demostrado que sea falsa.

• Para decidir si la diferencia entre y el valor promedio entonces

y x x +/- (t n )

t = ( x - n /

El valor crítico (t) si el valor de t es mayor que el crítico entonces se rechaza la hipótesis nula.

Ejemplo: en un método para determinar mercurio por absorción atómica de vapor frío se obtienen los siguientes resultados para material de referencia: 38.9, 37.4, 37.1 %. Un valor de referencia conocido dio 38.9 % . ¿Hay alguna evidencia de error sistemático?

Grados de libertad = 2t = 0.05 ----- 4.3x = 37.8

0.9644

t = (37.8 – 38.9) 3/ 0.9644 = 1.9756

Ho = no hay evidencia de error sistemático.

No se rechaza la hipótesis nula, es decir no hay evidencia de error sistemático.

PRUEBA DE Q DE DIXON

PRUEBA DE VALORES ANOMALOS

Distribución normal.Uno o dos valores anómalos (errores de tipo humano).Más de 3 valores.Impacto sobre y C.V. , precisión y exactitud.

Determinar si un valor es anómalo o no.

Ejemplo: determinar la concentración de nitrito en mg/l 0.403, 0.41, 0.401, 0.380 ------- Q = 0.831

Q = [ valor sospechoso – valor más cercano ] / (valor más grande – valor más pequeño)

Q = [ 0.380 – 0.401 ] / (0.41 – 0.380) = 0.7 se acepta el valor

Ejemplo: 0.403, 0.41, 0.401, 0.380, 0.4, 0.413, 0.411 n = 7 ------ Q = 0.57

Q = [ 0.380 – 0.4 ] / (0.413 – 0.380) = 0.606 valor anómalo

Si Q teórico es mayor al resultado se acepta el valor .Si Q teórico es menor que el valor obtenido se rechaza el dato anómalo

Ejemplo: se quiere determinar 2.1, 2.0, 2.1, 2.3, 2.9, 2.3, 3.1, 2.2, 2.0, 2.3. n = 10 ------ Q = 0.464

Q = [ 2.9 – 3.1 ] / (3.1 – 2.0 ) = 0.18 no son anómalos y por lo tanto se consideran

Ejemplo: 10.4, 10.1, 10.05, 9.8, 10.5, 10.0

Cuando hay dos valores anómalos.

8

n = 6 ------ Q = 0.621

Q = [ 9.8 – 10.0 ] / (10.5 – 9.8) = 0.285

Q = [ 10.4 – 10.5 ] / (10.5 – 9.8) = 0.1428

Q = [10.5 – 10.4 ] / (10.5 – 9.8) = 0.1428

Q = [ 10.5 – 10.0 ] / (10.5 – 9.8) = 0.07 los valores en todos los casos se aceptan.

GRASAS

• Moléculas de ácidos grasos.• Acidos carboxílicos R-COOH (12,18, 22, 24 átomos de carbono constituyen a R)• Valor de pKa = 4.0 son ácidos débiles.• Poco solubles en agua y muy solubles en solventes orgánicos.• Configuración C-C-C, C=C, C=C cis/trans• POLIMORFOS misma fórmula condensada, mismo peso molecular, propiedades fisicoquímicas diferentes de solubilización.

• Densidad menor a la del agua por tener peso molecular elevado. Es una propiedad INTENSIVA del sistema porque no depende la cantidad. g/ ml = 1g / cm 4 °C referencia con agua.• Gravedad Específica

G.E. = muestra g/ml / líquido g/ml

La GRASA es un éster RCOOR proviene de la condensación de un alcohol y de un ácido carboxílico.

R’OH + RCOOH -------- RCOOR’ + H2O GRAVEDAD ESPECÍFICA O INDICE DE ACIDEZ

H H O

H-C-OH H-C-O-C-R1 MONOGLICERIDO H-C-OH + 3 RCOOH --------------------- H-C-O-C-R2 DIGLICERIDOH-C-OH H-C-O-C-R3 TRIGLICERIDO H H O

ESTER

PRUEBAS

• Identidad gravedad específica o

• Indice de acidez evalúa una medida de la hidrólisis de la sustancia.

I.A = (mg KOH/g) necesarios para neutralizar ácidos grasos libres.

I.A = ml NaOH 0.1 N / 10 g muestra

1. Pesar muestra en balanza analítica (peso exacto) y colocarlo en un matraz erlenmeyer de 250 ml.2. Adicionar mezcla alcohol-éter (1:1) previamente neutralizado a la fenoftaleina.3. Valorar con NaOH 1N solución valorada usando fenoftaleína como indicador, después de 30 minutos neutralizada en color rosa. Incoloro si y solo si hay ácidos grasos libres.

El índice de saponificación no se ve influenciado por la hidrólisis de la muestra.

Isap = mg KOH /g necesarios para saponificar ésteres y ácidos grasos libres en 1 g de muestra

El glicerol presenta de 1, 2, 3 ácidos grasos en su molécula.

La hidrólisis alcalina de ácidos grasos libres y ésteres para formar jabón:

9

1. Pesar exactamente la muestra en un matraz de bola de fondo plano.2. Adicionar KOH 0.5 N con pipeta volumétrica.3. Hacer un blanco (mismo volumen de KOH 0.5 N).Poner a reflujo a condiciones suaves.5. Valorar el exceso de KOH con HCl 0.5 N (solución valorada a la fenoftaleina). Si los matraces están incoloros ya no sirve la prueba..

Isap = (Vol blanco – Vol mtra) N valorante X 56.11 / peso mtra (g)

Isap = meq X 56.11 mg KOH / 1 meq KOH = mg KOH / g

RCOOH + R’OH -------- RCOOR’ + H2O

Los ácidos grasos saturados son aún más insolubles en agua.No existen los isómeros (cadena rígida).

• Los ácidos grasos insaturados presentan isómeros CIS y TRANS predominando el cis.• Dependiendo de la posición de la doble ligadura se van a encontrar los ISOMEROS DE OPOSICION.• Los polimorfos (diferentes formas cristalinas) son de importancia por la diferencia de sus propiedades como solubilidad, punto de fusión, difracción de rayos X, etc.

IDENTIFICACION DE ACIDOS CARBOXILICOS

• Porción hidrofílica.• Porción hidrofóbica.• Reacción de hidrogenación (cuantas dobles ligaduras se encuentran).• Cromatografía en placa fina teniendo un estándar.• Absorción cercano al infrarrojo.

SATURADOSNo de Carbonos Nombre P de fusión Fórmula

12 Ácido laúrico 44.2 °C CH3(CH2)10COOH16 Acido palmítico 63.1 °C CH3(CH2)14COOH24 Acido lignosérico 86.0 °C CH3(CH2)22COOH

A temperatura ambiente son sólidos y conforme aumenta el número de carbonos aumenta el punto de fusión.

INSATURADOSNo de Carbonos Nombre Punto de fusión

16 Acido palmitoleico -0.5 °C

18 Acido oleico, linoleico, linolenico -13.4 °C

20 Acido araquidónico -49.5 °C

ESTERES

• Grasas o aceites.• Las grasas se presentan en forma sólida y los aceites en forma líquida.

Evaluación:

- Indice de acidez es la descomposición del éster en alcohol y ácido. Medida de la hidrólisis de una sustancia.- Empleo de un desecante o ácidos fuertes y bases fuertes en solución (hidrólisis ácida o alcalina).- Evitar humedad del medio ambiente.

10

RCOOH + NaOH ---------- RCOONa + H2O0.1 N

(alcohol / éter solubilizar al éster neutralizado a la fenoftaleina)

I.A = (Vmta) VNaOH X 56.11 / mta (g) = mg KOH / g

Cantidad de mg de KOH para neutralizar los ácidos grasos libres de la muestra.Cantidad de ml de NaOH para neutralizar los ácidos grasos libres en 10 g de muestra.

1.6 g ----- 3.6 ml de NaOH 0.0984 NDeterminar mg de KOH /g y ml de NaOH / 10 g de muestra.

FACTOR DE CORRECCION FC = N EXP / N teorico X ml gastados

FC = 0.0984 N / 0.1 N = 0.984 N X 3.6 ml = 3.54 ml1.6 g --------- 3.54 ml10 g --------- x x = 22.14 ml

I.A = ml NaOH x meq NaOH / ml NaOH x 1 meq KOH / 1 meq NaOH x 56.11 meq KOH / 1 meq KOH _______________________________________________________________________ g de muestra

I.A = 56.11 meq KOH (3.6 ml) (0.0984) / 1.6 g = 12.42 mg KOH

INDICE DE SAPONIFICACION

Isap = mg de KOH / g

O O OR-C-O-R’ + KOH --------- R-C-OR’ -------- R-C-OH + R’OH OH O R-C-OK Jabón

• Alcalis de Na+ y K+ solubilizan la muestra.• Más un exceso conocido de KOH alcohólico 0.5 N• HCl 0.5 N solución valorada con fenoftaleina.• Realizar un blanco.

ISAP = (V BLANCO – V MTA) V HCl X 56.11 / (g) muestra

Isap = (26 ml – 15.7 ml) (0.51 N) 56.11 / 1.532 g = 192.39 mg KOH / g

13.0875 meq --------- 25 ml (0.5235 N) KOH8.007 meq --------- 15.7 ml (0.51 N) HCl

13.0875 meq - 8.007 meq = 5.0805 meq gastados para saponificar.

Isap = 5.0805 meq X 56.11 / 1.532 g = 186.07 mg KOH /g

Valoración de tipo residual exceso por retroceso. El blanco también corrige las condiciones de reacción, error de pipeta, valorante añadido.

25 ml KOH x 0.5235 meq KOH / ml KOH = 13 .08 meq KOH

Ejemplo:

Ejemplo: 1.532 g de muestra reflujo con 25 ml de KOH 0.5235 N. Se utilizaron 15.7 ml de HCl 0.51 N para la titulación. Se corrió un blanco de KOH gastándose al final 26 ml del mismo ácido. Calcule el índice de saponificación de la muestra.

11

15.7 ml HCl x 0.5 meq HCl / ml HCl = 8.007 meq HCl

P.M. = 722 g / mol

Isap teórico 722 -------- 3 (56.11) 1 g -------- x x = 0.2331

ADULTERANTES

Como los terpenos (colesterol y lanosterol).

Ejemplo: mezcla que contenga 33.4% Isap = 80 y 66.6 % Isap = 118

0.334 (80) + (0.666) (118) = 105.308¿Qué cantidad se coloca de cada una de ellas?

Isap = 93

x (80) + y (118) = 93 ............... Ec. 1x + y = 1 ............................... Ec. 2

x = 1- y1- y (80) + 118 y = 9380 – 80 y + 118 y = 9338 y = 93 – 80 y = 93 – 80 / 38 = 0.34210.3421 (118) + 0.6579 (80) = 92.9998 % X % = 65.79 ------ ISAP = 80Y % = 34.21 ------ ISAP = 118

IESTER = mg KOH / g

IESTER = ISAP - IACIDEZ mg necesarios de KOH para esterificar 1 g de muestra.

IESTER = ISAP cuando IACIDEZ = 0

IYODO = g Yodo / 100 g de muestra

• Pesar la muestra en función del índice de yodo esperado.

• Adicionar cloroformo o CCl4, CHCl3 para ayudar a que solubilice la muestra.• Agregar reactivo de Hannus (solución Yodo-Bromo) o reactivo de Wijs (solución Yodo-Cloro) con ácido acético que favorece la ionización; son anhidras y se agregan en exceso para la presencia mayor de dobles ligaduras. Se lleva a cabo una reacción de adición característica por dobles enlaces o una halogenación.• Reposar 30 minutos protegido de la luz. Adicionar en exceso KI (TS).• Realizar un blanco.

• Valorar el exceso de reactivo con Na2S2O3 0.1 N (SV).• Usar como indicador el almidón que es un indicador interno.

• ICl ó IBr el I+2 se oxida con la luz, es muy estable, buen agente halogenante, pero el ICl ó IBr son muy reactivos y disminuyen el tiempo de análisis.

ICl ------------- I+ + Cl –

R-CH = CH2 + I + --------- R-CH-CH2 + Cl- Cl H I+ ----------------- R-C-C-H

I

ICl + KI --------- KCl + I2

I2 + 2 Na2S2O3 --------- 2 NaI + Na2S4O6 Por cada doble ligadura se adicionará dos veces el peso del Yodo.

Materias primas no saponificables, no llevan a cabo hidrólisis .

Procedimiento:

12

P.M. Yodo 126.9

IYODO TEORICO 282.5 --------- 2 (126.9) 100 g --------- x x = 89.84 g / 100 g mta

IYODO EXPERIMENTAL

IYODO = (VBCO – VMTA) N 0.1 N

IYODO = (VBCO 0.1 N – V MTA 0.1 N) 1.26 g / g de muestra

Blanco 44.6 0.1035 N Na2S2O3 -------- 46.16Muestra 28.34 ml de Na2S2O3 ----------- 29.33

FC = 0.1035 N / 0.1 N = 1.035

IYODO = (46.16 – 29.32) 1.269 / 0.259 = 82.45 g I / 100 g mtra.

El adulterante con doble ligadura aumenta el IYODO.

El IA en el ISAP no influye.Otros índices son el IPEROXIDO y el IACETILO.

INDICE DE HIDROXILO

IOH = mg / KOH mg de KOH equivalentes al contenido de hidroxilos presentes en 1 g de muestra.

1. Pesar la muestra y disolverla en tolueno.2. Correr un blanco.

3. Añadir un volumen conocido exactamente de reactivo de acetilación. Como reactivo limitante o reactivo en exceso son la piridina (Py), anhídrido acético y piridina más cloruro de acetilo.4. Se coloca muestra y blanco en reflujo suave aproximadamente por una hora.5. Adicionar una cantidad conocida de agua y se coloca en reflujo nuevamente durante 2 minutos más.6. Adicionar 20 ml de alcohol butílico previamente neutralizado a la fenoftaleina. Alcohol ácido incoloro neutralizar (KOH 0.5 N) solución valorada7. Valorar el exceso de ácido formado con KOH 0.5 N solución valorada utilizando nuevamente fenoftaleina.

RCOOH + R’OH --------- RCOOR’ + H2O

Los alcoholes de cadena larga también pueden cuantificarse.

CH3C-Cl + --------- [ ] + Cl-

agente Nu: acil piridinio

+ H+ + [ ] ROH

OCH3C-OR + + HCl

Éster de no interfiere en la reacción, formación de HCl “in situ”cadena corta

Ejemplo: P.M. Acido oleico 282.5 tiene una doble ligadura.

Ejemplo: muestra de ácido oleico con método de Wijs se pesaron 0.59 g de muestra.

ml corregidos

13

O1. CH3C-Cl + H2O ----------- CH3COOH + HCl cloruro de ácido acético acetilo

CH3COOH + KOH ------------ CH3COOK + H2O

2. anhídro acético O CH3 –C-O + H2O ------------ 2 CH3COOH CH3-C O

Los agentes acetilantes mejores son el anhídrido acético y el cloruro de acetilo debido a que tienen cadena corta y no hay impedimento estérico por ataque del hidroxilo que el mismo ácido acético.

El índice de hidroxilo es para los grupos:- Fenoles sin sustituyentes.- Alcoholes aromáticos.- Aminas.

IOH’ aparente = (VBCO – V MTA) N KOH 0.5 N X 56.11 / g de muestra = mg KOH / g mta

IOH real = IOH’ + IACIDEZ = mg KOH / g de mta

Ejemplo: se pesaron 9.6533 g del aceite para determinar el IOH en la valoracón se gastaron 9.6 ml y en el blanco 21 ml de KOH 0.5326 N.

IOH’ = (21- 9.6) 0.5326 X 56.11 / 9.6533 = 35.29 mg KOH / g mta

Ejemplo: Etanol CH3CH2OH P.M. 46 g/ mol OH P.M 17 g/ mol

Determinar mg de KOH equivalentes OH/g de muestra.

IOH = 46 g/mol ------- 17 g/mol 1 g ------- x x = 0.3696 g OH

Metanol P.M. 32 g/molGlicerol P.M. 92 g/mol

(3) 1 OH/ 46 g/mol [0.0217 eq OH]x [1 eq KOH /1 eq OH]x [56.11 g KOH/ 1 eq KOH] x [1000 mg / 1g KOH] = 1217.587 mg KOH / g mta.

1 eq OH ---------- 17.0 x ---------- 0.3695 x = 0.0217

Peq = PM / No. de partículas intercambiadas

1/ Peq = glicerol (3) 1 OH/ 46 g/mol

92 g/mol ---------- (17 g/mol ) 3 1 g ---------- x x = 0.5543 g

1 eq OH --------- 17.0 x --------- 0.5543 g x = 0.0326 eq OH

0.0326 eq OH [1 eq KOH /1 eq OH] x [56.11 g KOH/1 eq KOH]x [1000 mg/ 1 g KOH] = 1829.6739 mg

Se debe controlar la materia de acuerdo a sus índices obtenidos.Dan identidad a los ésteres de la materia prima. También la gravedad específica porque da propiedad al sistema.La cromatografía también proporciona identidad.

14

El enranciamiento se debe a :

• Peróxidos.• Radicales libres.

Debido a grupos de aldehídos y cetonas por oxidación. La luz puede ser un catalizador, por eso se debe de proteger.

ANALISIS DE AGUA

Determinación de contenido de sustancias orgánicas e inorgánicas del agua, control microbiológico es el ANALISIS DE AGUA.El agua como impureza es la DETERMINACION CUANTITATIVA DE AGUA.

Diferentes formas de agua:

• Agua no enlazada- Higroscópica- Ocluida

• Agua enlazada- Hidratación- Constitución

HIGROSCOPICA: Se encuentra en la superficie del sólido y puede ser eliminada por el calor.OCLUIDA: Agua que se queda dentro de los cristales cuando se forma el sólido, se considera una impureza.HIDRATACION: Forma parte de la molécula (hidratos) unida al compuesto mediante enlaces covalentes.CONSTITUCION: Agua que se encuentra presente en la muestra aunque se considera deshidratada (bicarbonato de sodio).

2 NaHCO3 ----------- NaCO3 + H2O + CO2

Métodos para la determinación de agua:

• DIRECTOS

- Volumétricos (Reactivo de Karl Fischer) determina p.p.m., valora agua enlazada y no enlazada, se emplea en la industris farmacéutica y alimenticia; es preciso, exacto, sensible y es el método primario por excelencia.

- Azeótropos parte del vehículo de una muestra.- Destilación

• INDIRECTOS

- Secado térmico se lleva a cabo a presión normal y a presión reducida, valora agua higroscópica y de hidratación.

- Desecación se lleva a cabo a presión normal y a presión reducida.

REACTIVO DE KARL FISCHER

• Es un reactivo líquido con yodo, dióxido de azufre, metanol y una base (piridina).• Presenta un color ámbar (caoba) rojizo-amarillento.• El yodo le proporciona características oxidantes; ya que el par yodo/yoduro se oxidan y puede realizarse una determinación amperométrica.• En el metanol son solubles los componentes.• Se emplea dimetilformamida y triclorotrifluroetano para los compuestos polares y no polares al ayudar a la solubilidad de la muestra.

• I2 y SO2 presentan reacciones secundarias que hacen que se degrade, se debe por lo tanto controlar la luz y la temperatura.

DETERMINACION

CH3OH + I2 + SO2 + H2O -------- 2 HI + H2SO4 + BASE

15

1 BASE H+ I- + BASE H+ CH3SO4-

Complejos de transferencia de carga

INCONVENIENTES

- Muestra con agua.

- Muestra reaccionando con I2 y SO2

- El peso molecular del agua es bajo por lo que los errores son grandes.

TITULO DEL REACTIVO es la capacidad para determinar H2O por ml de reactivo

Título (mg H2O / ml RKF) presenta dos métodos:

• Cantidades conocidas de agua ultrapura, ósmosis inversa, agua tridestilada.• Utilizando sales hidratadas (tartrato de sodio dihidratado).

Existen tres métodos para determinar valoración final:

• Visual• Fotométrica (500- 550 nm)• Electrométrica (amperométrica y voltamétrica)

PROCEDIMIENTO

1. La bureta debe de esta seca protegida de la humedad, se controla la temperatura porque varía la densidad del metanol.2. Cuando hay agua se torna incoloro.3. Cuando no hay agua está de color caoba.

4. El CH3OH anhidro es el medio de disolución.5. Se coloca una cantidad conocida de agua, se determina el volumen gastado del RKF y se calcula el título del reactivo.6. Se decolora nuevamente agregando un exceso del reactivo para obtener el color original.

EL tartrato de sodio tiene 15.61 % de H2O, puede contener agua ocluida; también se puede agregar carga pesada en lugar del agua conocida y realizar lo mismo con el reactivo de Karl Fischer.

COULOMBIMETRIA

Mide la cantidad de corriente que se usa para oxidar in situ yoduros en yodo que reacciona con el agua presente. Un exceso de yodo en el ánodo indica el fin de la valoración.

Desventajas:

• Reacciones secundarias o colaterales con algunos grupos que pueden reaccionar con los componentes del reactivo como aldehídos y cetonas con metanol formando acetales y cetales más agua.

• Los ésteres reaccionan con el agua formando metanol y ácidos carboxílicos.• Acidos carboxílicos con metanol forman ésteres y agua.• Otros grupos son aminas, mercaptanos, silanoles, perácidos, peróxidos, nitritos, sales de estaño, sales férricas, sulfitos y tiosulfatos.

Sales de cobre, selenito, telurito, sales de zinc, hidracina y derivados.

Solventes:• Metanol 100%, cloroformo 70% (muestras con aceites), decaol, hexanol, dodecanol al 50 % ayudan a la solubilidad para esencias,

pomadas y cremas. Formamida de 30 – 50 % en mermeladas, pastas, productos con almidón y azúcar.

Ejemplo: se disolvieron 0.5404 g de agua en 50 ml de metanol, se tomaron 5 ml de esta solución y se añadieron a un matraz erlenmeyer que contenía 20 ml más de metanol. En la valoración se consumieron 10 ml del reactivo de Karl Fischer, se corrió un blanco de 20 ml del mismo metanol los cuales requirieron 0.6 ml del reactivo antes mencionado. Calcular el título del reactivo.

20 ml ---------- 0.6 ml25 ml ---------- x x = 0.75 ml de RKF

Vol. Corregido de mta = 10 – 0.75 ml = 9.25 ml RKF

16

0.5404 mg H2O / 50 ml metanol x 5 ml metanol con agua = 0.05404 g H2O

Título = 54.04 mg H2O / 9.25 ml RKF = 5.84 mg H2O / ml RKF

b) Granulado por vía húmeda 5 % agua

500 mg granulado -------- matraz erlenmeyer que contenía 25 ml de metanol se valoraron con RKF gastándose 3.8 ml del reactivo.

¿Qué porcentaje de agua tiene el granulado?

5.84 mg H2O ----------- 1ml RKF x ----------- 3.05 ml RKF x = 17.81 mg H2O

500 mg ---------- 100 %17.81 mg -------- x x = 3.56 % de H2O

c) Granulado hay 5% y tomamos 1 g de mta. ¿Cuántos ml del RKF utilizaría para valorar el H2O?

5 g ----------- 100 g x ----------- 1g x = 0.05 g

5.84 mg H2O ----------- 1 ml RKF 50 mg ----------- x x = 8.56 ml

d) ¿Está dentro de especificaciones?

Si porque el límite es de 5% y el granulado presenta 3.56 %.

SECADO TERMICOSe emplea en muestras sólidas que no se descompongan con el calor, no volátiles ni aceites esenciales.Los agentes desecantes que se utilizan son pentóxido de fósforo, sulfato de sodio, ácido sulfúrico, sílica gel.

• Controlar pesafiltro a 110 °C toda la noche, tarar a peso constante.• Calentar por dos horas, enfriar en el desecador a temperatura ambiente .• Pesar en balanza. • Llevar a peso constante, la diferencia entre ellos debe ser menor a 0.5 mg.• Determinar peso final de muestra seca.• Determina la cantidad de agua en porcentaje.

Ejemplo: muestra 1.0 g muestra seca 0.9550 g

1- 0.9550 = 0-045 g

1 g -------- 100 %0.045 g ------ x x = 4.5 % de agua

• Sustancias a las que se les quiere determinar agua y que se descomponen a 100 o 105 °C.• Considerar condiciones del desecante (si contiene agua y la muestra está seca, se combina la humedad y el crisol gana agua).• Las características del desecante son:

- Muy estables.- Reversibles.- Inertes.

PERDIDA POR SECADO

• Igual al procedimiento de secado térmico.• Salida de agua más otros componentes volátiles.

TERMOBALANZAS

• Pesafiltro a peso constante.

17

• Se tiene la balanza con rayos infrarrojos y se determina watts para calentar la muestra.• Se colocan 10g de muestra• Se pueden determinar cantidades de agua y otros componentes que son volátiles a la temperatura de infrarrojo.

AZEOTROPOS

• Utilidad en mas del 50% de agua presente en la muestra• Util para cosmetología y emulsiones.• Azeótropo: mezcla de dos o más componentes que ebullen a temperatura constante como si se tratara de un solo

componente.• El azeótropo que se ocupa es el formado de tolueno y agua que ebulle a 86°C.

FUNDAMENTO: formación del azeótropo.

VENTAJAS: Ebulle a menor temperatura que el agua, formación del azeótropo inmiscible en agua que permite su separación.

Otros métodos:

• Cromatografía de gases• Resonancia magnética nuclear• U.V• Infrarrojo

PROPIEDADES INTENSIVAS Y EXTENSIVAS

Las propiedades que dependen de la cantidad de materia que se está midiendo son propiedades extensivas; ejemplos son la masa, la longitud y el volumen.Las propiedades que no dependen de la cantidad de materia que se está midiendo son propiedades intensivas. Son importantes por que dependen de la naturaleza del material; ejemplos son la densidad y la temperatura.EQUILIBRIO QUIMICO

VALORACIONES ACIDO-BASE

aA + bB -------- cC + dD

Keq = [ C]c [ D ]d / [ A]a [B ]b

El equilibrio químico está regido por la actividad y la estequiometría de la sustancia. Se considera la ley de acción de masas.

Base fuerte ------ ácido conjugado débilAcido débil ------ base conjugada fuerte

CAPACIDAD DE ACIDEZ O BASICIDAD

Va a depender de:- H2O comportamiento ANFOTERO (ácido y/o base)

2H2O ------- H3O + + OH- ion capacidad ácida y básica del agua respectivamente.hidronio

- pKw = 14 es la constante de autoprotólisis- Ks = constante de solvólisis (autodestrucción de algún solvente que no sea agua).

CH3COOH ------------ CH3COO - + H +

CH3OH ----------------- CH3O- + H +

Ion metóxido

HNO3 + HCl ------------ Cl- + NO3- + 2 H3O+

El agua tiene la capacidad de disociarse con ácidos fuertes; ya que se producen iones hidronio los cuales dan el valor de pH.Cuando se utilizan otros solventes el valor de pH depende de los protones.

CONSTANTE DIELECTRICA DEL MEDIO DE DISOLUCION

I = q . q2 / d

18

Distancia crítica: es la distancia mínima necesaria para que existan los pares iónicos. H2O = 79

Ki CH3COOH ---------- CH3COO- H+ -------- CH3COO- + H+

2 CH3COOH ---------- CH3COO- CH3COOH2

ION LIATO ION LIONIO PAR IONICO

El ion lionio procedente de agua es el ion hidronio.

2 CH3OH ------------- CH3O- + CH3OH2+

ION METOXIDO

La reacción Acido- Base depende de:

• Fuerza de las sustancias.• Grupos funcionales que contenga la molécula• Capacidad del medio de disolución de interactuar con el agua (capacidad anfotérica).•

TEORIA DE BROWSTER Y LOWRY

ACIDO es el donador de protones.BASE es el aceptor de electrones.

Hay un cambio del medio de disolución debido a:

• Estabilidad.• Fuerza ácido - base.

2 HCl + 4 H2O ----------- OH+ + 3 H3O+ + 2 Cl-

BASE

3 NaOH + H2O ---------- H3O + OH- + 2 Na+

ACIDO

HCl + NaOH ------------- NaCl + H2O

H3O+ + OH-

CLASIFICACION DE SOLVENTES DE ACUERDO A CARACTERISTICAS ACIDO – BASE

• SOLVENTES PROTOGENICOS (ácidos que forman protón).

• ANFOTEROS (agua, OH-, donadores o aceptores).

• PROTOFILICOS (aceptores de protones, bases como piridina, etilendiamina, dimetilformamida).

• APROTICOS O INERTES (benceno, hexano, compuestos orgánicos). Ayudan a la solubilidad de la muestra.

CLASIFICACION DE SOLUTOS DE ACUERDO A SU CAPACIDAD DE FORMAR O NO IONES

• IONOFONOS (HCl ).

• IONOGENOS (NaCl).

CH3COOH + RNH2 --------------- RNH3+ + CH3COO+

ACIDO BASE ACIDO Y BASE MAS FUERTES DEBIL DEBIL

Se permite la solubilidad de la amina en ácido acético porque favorece las propiedades básicas de la amina el ácido acético.

19

Se valora el acetato CH3COO- por ser el ácido acético el que se encuentre en exceso.

CH3COO- + H+ ClO4 -------------- CH3COOH + RNH3ClO4

ACIDO PERCLORICO

NaOH + HCl ------------------------ NaCl + H2O (H2O)

RNH2 + HClO4 ---------------------- RNH3COO4 + CH3COOH (CH3COOH)

EFECTOS QUE REALIZA EL AGUA

- Efecto nivelador: hace que las sustancias que se encuentren dentro de ella (ácidos y bases fuertes) se disocien completamente.

- Efecto diferenciador: establece una diferencia al valorar a distintas especies.

VALORES DE

- Para > a 50 se encuentran iones libres.

- De 30 < < 50 pares ionicos/ iones libres.

- Para pares ionicos.

SELECCIÓN DE INDICADORES

- Para ácidos y bases fuertes es la fenoftaleína con pH de vire de 8- 10.- Deben de tener una fuerza menor al analito que se desea cuantificar.- Se coloca gran cantidad para un exceso.- Los colores de vire no deben ser parecidos.

- Se prefiere valoración potenciométrica en lugar de colorida cuando no existe indicador para la base de la valoración. En Ka menores a 10-4 por ser ácidos débiles.

• Acido fuerte- base débil, la sal formada es fuerte.• Base fuerte – ácido débil, la sal formada es fuerte.

• Base débil – ácido débil, la sal formada es débil. El pH lo impone los valores de pKa no la sal.

pH = ½ pKa1 + ½ pKa2

Diferencias con la valoración ácido – base:

- Se encuentran iones libres en lugar de pares iónicos.- Limitadas por la del medio de disolución.

MOLECULAS BASICAS

Ejercicio: Metronidazol P.M. 171.2 El grupo Imidazol es básico y se valora con un ácido.

Acidos en medio no acuoso:

- p-toluensulfónico.

- HClO4 / ácido acético anhidro o glacial 0.1 N y 0.5 N (soluciones valoradas, volumétricas o tituladas).

Indicadores más comunes:

- p-naftol-benceína en ácido acético glacial.- Cristal violeta.- Verde de malaquita.

20

Estándares primarios:

- Biftalato de potasio.- Piridina.

La piridina solo se protona en presencia de un ácido

Medios de disolución más usados:

- Acido acético.- Anhídrido acético.- Mezcla de ambos.

MOLECULAS ACIDAS

Valorantes ácidos:

- Metóxido de sodio.- Metóxido de litio.

En soluciones anhidras, se preparan en alcohol y benceno.

Estándar primario:

- Acido benzoico.

Indicadores más comunes.

- Fenoftaleína.- Timolftaleína.

Solventes:

- Dimetilformamida.- Piridina.

Ejercicio: se disolvieron 150 mg aproximadamente pesados en 30 ml de ácido acético glacial, se calentó suavemente la disolución y se adicionaron 3 gotas de verde de malaquita (SI). Se tituló con HClO4 0.1 N, se gastaron 8.8 ml y se corrió un blanco el cual gastó 0.05 ml.¿Cuál es la pureza de la muestra?

21

CH3COO- + HCLO4 CH3COOH + CLO4-

Corrección de volumen (volumen gastado menos el blanco) = 8.8 ml – 0.05 ml= 8.75 ml de HClO4

8.75 ml HClO4 x [0.1 meq de HClO4 / 1 ml HClO4 0.1 N] = 0.875 meq HClO4

Peso equivalente = 171 .2 g/mol

171.2 mg ------------- 1 meq x ------------- 0.875 meq x = 149.8 mg

149.8 mg /150 mg x 100 = 99.86 %

Ejercicio: se disuelven 250 mg de diazepam, CH3COOH anhidrido acético, 0.3 ml azul de metileno.HClO4 0.0999 N, el blanco gastó 0.02 ml y la muestra 8.8 ml.P.M. = 284.7 g/mol

a)8.8 ml – 0.02 ml = 8.78 ml

8.78 ml HClO4 x [0.0999 meq HClO4 / 1 ML HClO4 0.0999 N] = 0.8771 meq HClO4

284.7 mg ---------- 1 meq x ---------- 0.8771 meq x = 249.7166 mg

249.7166 mg /250 mg x 100 = 99.8867 %

b) Marbete 10 mg de diazepam /tableta. Se pesan 40 tabletas y e pso promedio es de 132.1 mg por tableta. Tomar la cantidad equivalente de 150 mg de diazepam 0.1084 N, se gastaron 4.52 ml de HClO4 y el blanco de 0.07 ml. ¿Cuánto diazepam hay por tableta?Especificación de la USP [98.5 – 100.5 %]

132.1 mg --------- 10 mg x --------- 150 mg x = 1981.5 mg ó 1.9815 g

Fc = 0.1084 N / 0.1 N x 4.45 ml = 4.8238 ml

1 ml 0.1 N --------- 28.47 mg4.8238 ml --------- x x = 137.33 mg

137.33 mg diazepam ------------ 1981.5 mg polvo de tableta x ------------ 132.1 mg tableta x = 9.155 mg diazepam

9.155 mg diazepam / 10 mg x 100 = 91.55 % por debajo de especificación

Otra forma de calcular el inciso a es considerando que cada ml de solución 0.1 N es equivalente a 28.47 mg.

Fc = 0.0999 N / 0.1 N x 8.78 ml = 8.77 ml

1 ml ------------ 28.47 mg

22

8.77 ml ---------- x x = 249.7166 mg

No se puede determinar pureza en forma farmacéutica, se calcula el contenido de principio activo.- El ensayo de pureza se hace por triplicado.- El ensayo de contenido es con 20 muestras y al menos se hace por triplicado.

a. (CH3COO)2 Hg + 2 BH+ X- ---------- 2 CH3COO- BH+ + HgX2

2CH3COO- BH+ + 2 HClO4 --------- 2 CH3COOH + 2 BH+ ClO4

Método de Piffer y Woolisch determinación de bases que provienen de ácidos halogenados (ácidos fuertes). HCl

b. B + HB+ ---------------- BH+ + HCl exceso

a. Exceso de acetato mercúrico nivela la base. Los bromohidratos y clorhidratos pueden actuar como bases. Es una valoración directa.

b. El HCl en exceso se libra y la base también. Es una valoración indirecta.Ejemplo: fosfato de sodio dibásico Na2HPO4.

Na2HPO4 + HCl exceso -------- H3PO4 + HCl exceso + NaOH --------- Na2HPO4

ácido fosfórico

VALORACION EN MEDIOS NO ACUOSOS

Ejercicio: Trimetroprim, 300 mg de muestra en base húmeda se adicionaron a un matraz cónico que contenía 60 ml de ácido acético glacial y 3 gotas de verde de malaquita. Se tituló con solución 0.1045 de HClO4 en ácido acético utilizando para ello 10.8 ml del valorante. Se corrió un blanco y se utilizaron 0.07 ml de HClO4 / CH3COOH. Se determinó además que contenía un porcentaje de humedad de 0.35 % por el método de Karl Fischer.¿Cuál es la pureza de la muestra en base anhidra?

Corrección de volumen = 10.8 ml – 0.07 ml = 10.73 ml

% de humedad 350 mg H2O ---------- 100 g de muestra 350 mg H2O ------------ 100 000 mg de muestra x1 ------------ 300 mg de muestra x1 = 1.05 mg H2O

300 mg – 1.05 mg = 298.95 mg de muestra en base anhidra

Fc = 0.1045 N / 0.1 N = 1.045 N (10.73 ml) = 11.213 ml de HClO4 0.1 N

1 ml 0.1 N HClO4 ------------- 290.32 mg trimetroprim

1 ml 0.1 N HClO4 ----------- 290.32 mg 11.213 ml ----------- x x = 325.54 mg

325.54 mg / 298.95 mg x 100 = 108.89 %

Se valoró más de lo que había, donde el error se adjudica a:

- El analista.- Normalidad del valorante.- Detección del método (coloración del indicador).- Trabajar con base húmeda cuando ya estaba en base seca.

23

Ejercicio: se determinó el peso promedio de las tabletas que contenían sulfametoxazol y trimetroprim y fue de 565.6 mg. Se tomó una cantidad equivalente de muestra que contenía 300 mg de trimetroprim. Se valoraron con HClO4 / CH3COOH 0.1080 N y se gastaron 10.4 ml y un blanco gastó 0.1 ml.¿Qué cantidad se tomó del polvo equivalente o de muestra?¿Qué cantidad de trimetroprim hay en la tableta?Si según el marbete el contenido de trimetroprim por tableta es de 300 mg, decir cuál es el % de variación en el contenido?

565.6 mg ----------- 300 mg x ----------- 300 mg x = 565.6 mg

10.4 ml – 0.1 ml = 10.3 ml

Fc = 0.1080 N / 0.1 N = 1.08 N (10.3 ml) = 11.124 ml

1 ml ----------- 29.032 mg11.124 ml ------- x x = 322.9519 mg

Otra manera es 10.3 ml x 0.1080 meq /ml = 1.1124 meq

1.1124 meq x 290.32 mg / 1 meq = 322.9519 mg

10.3 ml x 0.1080 meq /ml = x1 = 0.1 meq /ml

x1 = 10.3 x 0.1080 / 0.1 meq = Fc

322.95 mg /300 mg x 100 = 107.65 % el porcentaje de error en el contenido es de 7.65 %

300 mg ----------- 10022.95 mg -------- x x = 7.65 %

Si el intervalo es de 95 –105 % esta fuera de la especificación.

Ejercicio: Fenitoína sódica pKa = 8.3Se pesaron 200 mg de fenitoína sódica, se disolvieron en 25 ml de ácido acético glacial y se adicionaron 3 gotas de p-naftolbenceína. Se tituló con HClO4 0.1 N y se gastaron 7.3 ml. ¿Qué pureza tiene en porcentaje?

P.M. = 274.3 g/mol

(7.3 ml x 0.1) = 0.73 meq x 274.3 / 1 meq = 200.239 mg

200.239 mg / 200 mg x 100 = 100.1195 %

(ml muestra – ml blanco) x N x PM x 100 / peso muestra

Ejercicio: 30 tabletas con peso promedio de 180 mg se reducieron a un polvo fino y se tomó el peso de una tableta, se colocó en un matraz erlenmeyer y se adicionaron 40 ml de ácido acético. Se agregó indicador p-naftolbenceína y se tituló con HClO4 0.0994 N. La muestra gastó 3.7 ml y para el blanco 0.02 ml.¿Cuál es el porcentaje de fenitoína en la tableta?

Volumen corregido = 3.7 ml – 0.02 ml = 3.68 ml

Fc = 0.0984 N / 0.1 N = 0.984 (3.68 ml) = 3.6211 ml

1 ml 0.1 N ------------ 27.43 mg3.6211 ml ------------ x x = 99.327 mg /tableta de fenitoína

99.327 mg / 180 mg x 100 = 55.18 %

Ejercicio: se mezclaron 100 ml de H2SO4 0.08 M con 50 ml de NaOH 0.04 M.

24

¿Cuál es el pH de la solución?

H2SO4 + 2 NaOH --------------- Na2SO4 + 2 H2O98 2(40)

784 mg 80 mg

100 ml [0.08 mmol/ml] = 8 mmol x 98 mg / 1 mmol = 784 mg50 ml [0.04 mmol/ml] = 2 mmol x 40 mg / 1 mmol = 80 mg

(784 mg – 98 mg) = 686 mg exceso

pH = - log [H30+]

686 mg [1 mmol/ 98 mg H2SO4] = 7 mmol / 150 ml = 0.047 M

pH = -log (0.047 M) = 1.33

Considerando normalidad

8 meq – 2 meq = 6 meq

6 meq x (98 mg H2SO4 / 2 meq) = 294 mg H2SO4

294 mg H2SO4 x (1 mmol / 98 mg H2SO4) = 3 mmoles / 150 ml= 0.02 M

8 meq x (98 mg H2SO4 / 2 meq) = 392 mg H2SO4

392 mg H2SO4 x (1 mmol / 98 mg H2SO4) = 3 mmol / 150 ml = 0.02 MpH = -log [0.02] = 1.698

METODOS BIOLOGICOS

Se clasifican en:

• METODOS MICROBIOLOGICOS determina que hace el microorganismo y cómo se puede evaluar.

• METODOS MACROBIOLOGICOS usan medicamento en cuanto a toxicidad.

- VALORACION DE ANTIBIOTICOS (control microiológic)- CUENTAS MICROBIOLOGICAS (control microbiológico)- PRUEBA DE ESTERILIDAD (control microbiológico)

Se requiere de un estándar microbiológico para la inhibición; se expone el cultivo en diferentes condiciones para ver si hay un microorganismo patógeno; se controla el proceso de esterilización para buscar la presencia de microorganismos (bacterias, virus, levaduras).En el caso de Microbiología:

- Controlar medio de cultivo. Se realiza prueba de promoción de crecimiento en los nutrientes (selectivos y no selectivos) y en el pH.

- En el microorganismo (se requiere de un estándar perfectamente reconocible cepario ATCC).

VALORACION DE ANTIBIOTICOS

Se controla el pH y la viscosidad del medio. Los métodos por los que se puede realizar son.

- Por difusión: se utiliza cuando el antibiótico es puro o difunde bien en un medio de cultivo sólido.

- Turbidimétrico: se realiza en medio de cultivo líquido.

DIFUSION

Es el mismo principio de los antibiogramas. Los factores que lo afectan son:

- Gradiente de concentración. - Temperatura.- Viscosidad.- Presión.

25

- pH.- Tamaño de la molécula.- Potencial.- Grosor del agar.

La potencia del antibiótico es en UI o mcg/ mg muestra. El reservorio es un disco de fibra de vidrio estéril que lleva cilindros huecos con un volumen constante llamados PENICILINDROS.Se realiza la incubación y se mide el diámetro del halo de inhibición que vaa depnder de la potencia del antibiótico para inhibir el crecimiento del microorganismo.

De acuerdo a la Regulación del Código Federal CFR marca que el ensayo sea “Ensayo en placa pequeña” por interpolación mediante una curva estándar que contenga al menos 5 puntos por triplicado, el microorganismo estandarizado y el antibiótico estándar. Se realiza la regresión lineal para conocer la interpolación de la concentración y no se permiten las extrapolaciones.

MODELO

ln Co’ inicial = ln C mínima + y2 / 4 Dto

ln Co’

m = 1 / 4 Dto

ln C mínima

Y2

Donde:

D = coeficiente de difusión del antibiótico (mm/hr)to = tiempo crítico, tiempo mínimo de inhibición.

La concentración de inhibición mínima en mcg/ml debe ser igual a la concentración de referencia del estándar 3.A partir de la concentración mínima y potencia del estándar se prepara la concentración.A cada una de las placas se les coloca tres penicilindros con la concentración de referencia CR y tres penicilindros con la concentración del estándar respectiva.

PREPARACION DEL MICROORGANISMO

- Cepa pura es liofilizada y se reconstituye con caldo lactosado, el sembrado es en tubo inclinado mediante estría, se incuba 24 horas antes de usarse.

- Suspensión del microorganismo se realiza en agua, solución buffer o solución isotónica, se agita el tubo y se lee en la celda espectrofotométrica a 530 nm de transmitancia .

Por cada 100 ml de cultivo ------------ es 1 ml de suspensión del microorganismo

- CAPA BASE es la primera capa que se coloca en la caja de Petri con 20 ml de agar aproximadamente, esta capa no contiene al microorganismo.

- CAPA SIEMBRA es la segunda capa y es la que contiene al microorganismo, se colocan aproximadamente 4 ml.

X Ref = X ref / n es la media de las medias de referencia.

26

Fc = X ref – X ref (cada uno) = +/- el diámetro corregido es igual a la suma algebraica del valor promedio del halo de inhibición y el factor de corrección.ln Co muestra -------- e C muestra --------- C muestra en UI / ml ó mcg / ml, después se hacen las diluciones correspondientes para conocer lo que hay por cápsula.

Ejercicio:

C1 CR C2 CR C4 CR C5 CR CMTA CR

[mcg/ml] 0.178 0.534 0.356 0.534 0.801 0.534 1.335 0.534 0.534

o (mm) 127.8 142.8 133.5 140.1 149.2 142.1 184.5 141 139.3 141.1

X 14.2 15.87 14.83 15.57 16.58 15.79 17.17 15.67 15.48 15.68

Fc -0.154 0.146 -0.074 0.046 0.036

Xc 14.046 14.976 16.506 17.216 15.516

XREF = 15.87 + 15.57 + 15.79 + 15.67 + 15.68 / 5 = 15.716

Fc = 15.716 – 15.87 = -0.154 15.716 – 15.57 = 0.146 15.716 – 15.79 = - 0.074 15.716 – 15.67 = 0.046 15.716 - 15 68 = 0.036

Xc (mm) [mcg / ml] ln Co 14.046 0.178 -1.7259 14.976 0.356 -1.0328 15.716 ------ Xref 0.534 -0.6274 16.506 0.801 -0.2219 17.216 1.335 0.2889

r2 = 0.9951 y = mx + bb = -10.33 y = 0.6162 (15.516) + (-10.33) = -0.77m = 0.6162 e-0.77= 0.462 mcg / ml

0.462 mcg / ml X [vol. mta ml / alícuota ml ] X [vol. ml / alicuota ml] X [vol. ml /peso mta] = mcg de principio activo / mg de peso mta ó mcg de principio activo / ml de muestra

METODO EN TUBO POR TURBIDIMETRIA

- Se requiere de medio de cultivo líquido inoculado con el microorganismo.- La curva de calibración es al menos con 5 puntos por triplicado.- Se toma 1 ml de cada concentración y se coloca por triplicado (al menos 15 tubos empleados).- Se incuban de 2 a 3 hrs.- Se colocan los tubos en baño de congelación para detener el crecimiento.- Adicionar 2 ml de formaldehído a cada tubo.- Leer la turbidez en transmitancia.- Elaborar curva de calibración (transmitancia VS concentración).- Interpolar para conocer la concentración y posteriormente calcular con diluciones.

“Todo el cultivo antes de usarse debe tener promoción de crecimiento”. Para la prueba se realizan 3 tubos como blanco, debe de considerarse la misma temperatura y tiempo; asimismo se necesita el mismo tubo, del mismo vidrio, color, etc.

27

Los tres tubos proporcionan:

- Estabilidad.- Crecimiento.- Blanco.

Para las mezclas de antibióticos se deja un antibiótico activo y otros se inactivan con enzimas o mediante dilución, filtración o extracción como métodos químicos.

METODOS MICROBIOLOGICOS

- Control microbiológico.- Esterilidad.- Cuentas microbiológicas.

CUENTAS MICROBIOLOGICAS

• Reglamentación y asepsia para productos biológicos y alimentos.• Calidad microbiológica.• Util para productos no estériles como jarabes, geles, pomadas, etc.• Se determina la presencia de microorganismos.• Para las materias primas se requiere conocer en que son solubles, naturaleza química (densidad y viscosidad).

METODOS

- NMP (número más probable).- Cuenta en placa.Los dos van a depender de la naturaleza química .

CUENTA EN PLACA

Se requiere de un medio de cultivo altamente nutritivo, el medio requiere anteriormente promoción de crecimiento. Se hace una dilución 1/ 100 ml de agua, solución salina fisiológica o agua peptonada previamente estériles.

Se utilizan al menos tres cajas para cada muestra con 20 ml cada una, antes de que el medio solidifique se coloca 1 ml de la muestra, se agita y la muestra queda inmersa “MÉTODO DE INMERSION”.

Se toma una caja como blanco, las demás se incuban a 34 °C por 72 horas al menos. Se dejan 3 cajas como blanco a temperatura ambiente de 20 – 25 °C durante 5 días.

Si el blanco se contamina la prueba no sirve y se tiene que volver a repetir. Se cuentan las unidades formadoras de colonias (UFC) en un cuenta colonias que tiene 10 cm3, se saca el promedio de 10 y se multiplica por 64 cuadritos. Otras pruebas se hacen en campana con 1000 ml3 de aire.

Las bacterias no permisibles para la cuenta microbiológica son: Enterobacterias, E.coli, Pseudomona aeruginosa, Salmonella, Candida albicans y Staphylococcus aureus.Los microorganismos se aislan y se siembran en agar soya tripticaseína, se colocan en cajas con medios selectivos; por ejemplo: E. coli en verde brillante o McConkey, Staphylococcus aureus en sales manitol, etc. Posteriormente se hacen las pruebas bioquímicas.

El análisis se hace en materia prima, producto subterminado y producto terminado.

CUENTA EN TUBO

• Util para muestras que no dan turbidez.• Se realiza mediante el método de NMP para estimar la cantidad de microrganismo.• Se toma 1 ml o 1 g de muestra.• Hacer dilución 1/ 10 con 9 mililitros de medio de agar soya tripticaseína estériles y 1ml de buffer, solución salina fisiológica o agua

peptonada; posteriormente hacer una dilución 1/ 100 y por último una dilución 1/ 1000. Para cada dilución se toman 4 tubos y se considera 1 tubo como blanco.

• Se toman los 12 tubos y se incuban a 37 °C de 24 – 48 horas.• Se observa en cual hay crecimiento, turbidez o cambio de color.• Si el blanco se contamina no sirve la prueba y se tiene que volver a repetir.

TABLAS DE NMP

28

1 / 10 1 / 100 1 / 1000 NMP 3 3 3 3

3 3 3 3

3 2 1 0

3 3 3 3

2 2 2 2

3 2 1 0

3 3 3 3

1 1 1 1

3 2 1 0

3 3 3 3

0 0 0 0

3 2 1 0

PRUEBA DE ESTERILIDAD

Se realiza en productos óticos, oftálmicos e inyectables que se aplican por vía intramuscular e intravenosa.Los dos métodos son:

• Prueba directa• Prueba indirecta

PRUEBA DIRECTA

Se consideran el medio fluido de tioglicolato para microorganismos anaerobios y el medio fluido de soya tripticaseína para microorganismos aerobios. Los medios selectivos con indicador redox o pH.La prueba también se aplica para gasas y material quirúrgico previamente estéril.

PRUEBA INDIRECTA

Se utilizan los mismos medios de cultivo, se considera para la muestra:

- Número de unidades de lote.- Volumen de las unidades.- Proceso de esterilización.

¿Cómo se hace la prueba?

Se emplean esterites y membrana de 0.42 o 0.45 micras; se lava la membrana 3 veces con agua peptonada, buffer o solución salina fisiológica.Es necesario saber si l muestra es oleosa u acuosa. La prueba se repite por triplicado para ver si hay crecimiento de bacterias y hongos; el blanco se observa y se siembra la membrana de la siguiente manera:

- 3 mitades de membrana en medio tioglicolato a 37 °C.- 3 mitades de membrana en medio soya tripticaseína a temperatura ambiente.

Se esperan 7 días para 37 °C y 14 días para 25 °C con su respectivo blanco.

La membrana debe de pasar prueba de integridad de membrana con 0.22 micras de porosidad, se genera incertidumbre porque la prueba se realiza en una membrana diferente a la que se va a utilizar.

A los medios se les realiza la prueba de promoción de crecimiento en base a:- Prueba de control positivo.- Prueba de control negativo.- Muestra.

La prueba de inhibición de bacteriostáticos o bactericidas no se realiza.

PRUEBA DE PIROGENOS

Los dos métodos mediante los cuales se realiza son:

29

• In vivo.• In vitro.

In vivo

Se emplean conejos; ya que la dosis umbral de pirógenos para producir reacción febril es la misma para conejos que para humanos. Una de las ventajas es que puede detectar cualquier tipo de pirógenos.

PIROGENOS: cualquier producto del metabolismo microbiano que al ser administrada por vía intramuscular e intravenosa produce reacción febril tanto en conejos como en el hombre.

La señal analítica es la fiebre en el conejo, el pirógeno en sangre hace que se libere histamina la cual desencadena la reacción.La respuesta es la reacción febril con temperatura > 0.6 °C.La ruptura de la pared de los Gram (-) está formada por el lipopolisacárido que da lugar a la reacción febril, el (LPS) es la endotoxina. Los conejos detectan cualquier sustancia, incluyendo partículas como metales, vidrio, pelusas o la química.La elección de los conejos se debe a:

- Ser una raza sensible.- No produzcan tolerancia.- Mantenerse en condiciones de salud adecuadas.

De acuerdo a la USP los conejos deben de cumplir las siguientes especificaciones:

- Albinos de Nueva Zelanda.- 1.5 kg o más.- Cualquier sexo.- Buena alimentación.- Temperatura de 20 °C.- Antes de la prueba se retira el alimento, el agua no.

Cuando se realiza la prueba por primera vez se seleccionan 5 conejos, se les toma la temperatura basal al menos 90 minutos antes de la prueba en intervalos de 30 minutos con termopares que contienen sensor de temperatura para el recto con +/- 0.1 °C.Se registran las temperaturas para saber si es constante, no debe haber un incremento de 0.6 °C; el medicamento se administra por la vena marginal de la oreja del conejo de acuerdo a la USP son 10 ml/ Kg de peso respecto al agua. El tiempo de administración debe ser menor a 10 minutos. La duración de la prueba es de 5 horas y el material a utilizar es apirogénico.

En caso de que los animales sean nuevos los pirógenos pueden casar tolerancia; de acuerdo a la USP se deben de mantener a las mismas condiciones y se realiza una prueba en blanco que consiste en someterlos una noche anterior sin alimento, se registra la temperatura durante 3 horas y lo que no se realiza es la inyección.

Para inyectables, estériles y apirogénicos si no se aproxima 5 unidades de endotoxinas por peso no hay reacción febril. Después de tener la temperatura se realiza la interpretación de la prueba de la siguiente manera:

- Cuando hay un incremento de 0.6 °C la prueba es pirogénia.- Cuando no hay un incremento de la temperatura la prueba es apirogénica.

In vitro

De acuerdo a la USP es una prueba para endotoxinas, contaminación de gérmenes Gram (-). Es un método relativamente nuevo pero su desventaja es que solo detecta endotoxinas. En un principio se realizó para el agua pero ya se aplica también para materia prima, medicamentos e instrumental.

La prueba se realiza mediante el LAL (lisado de amebocitos de Limulus poliphemus), se extrae el amebocito y el lisado contiene el péptido y una enzima que se llama procoagulasa.

LAL (coagulógeno) + [ endotoxinas] + [ Ca+2] ----------- procoagulasa -------- GEL

Se controla la temperatura a 37 °C y pH de 7 por 1 hora. El lisado se realiza en tubos apirógenos a los cuales se les adiciona la muestra, se colocan en baño de agua, se sacan y la GEL debe de formarse intacta.

- Si se forma GEL la prueba es positiva.- Si no hay formación de GEL la prueba es negativa.

30

Se realiza una curva de calibración para encontrar la mínima cantidad de formación de GEL y es por triplicado. Se hace un control negativo con agua apirogénica y un control positivo con la concentración mínima que forma la endotoxina.

PRUEBAS MISCELANEAS

Se emplean para:

- Verificar la vía de administración.- Forma farmacéutica.TOXICIDAD AGUDA

Es exclusiva para antibióticos y se realiza en ratones que no sean utilizados anteriormente, recién nacidos con 17 g de peso; se utilizan al menos 15 ratones. La observación se hace después de 24 y 48 horas. Si un ratón se muere antes de 48 horas se repite la prueba con 15 ratones nuevos pero ahora con un peso de 19 g de peso. La solución se administra por la cola de los ratones.

IRRITABILIDAD

• EN OJO

Se realiza para productos oftálmicos como pomada de terramicina, gotas y productos que por accidente caen en los ojos como tintes, shampoo, acondicionadores, spray para el cabello, maquillaje, etc. Se utilizan 5 conejos y la cantidad demuestra que se coloca si es sólido son 100 mg, si es líquido 0.1 ml o 100 L; se aplica en el saco conjuntival en un ojo, el otro ojo sirve de blanco.

Después de la aplicación se vigila a los conejos durante 10 días. Se observa daño leve como irritación hasta un daño en la pupila o córnea. Se clasifican desde 0 hasta 3 dependiendo del grado e irritabilidad.

• EN PIEL

Para productos utilizados en piel dañada por cortaduras o quemaduras. La prueba se realiza en ratas o conejos. Se lacera la piel y se aplica el medicamento, se coloca un parche y se observa si hay una irritación o lesión más grave.

• SENSIILIDAD EN PIEL

Se realiza para protectores solares, desodorantes, piel, talco, jabón y aceite de bebés. La prueba se determina en conejos y ratas sin estrato córneo de la piel, se les coloca el parche y se observa durante tres veces al día. La respuesta es desde enrojecimiento a hinchazón o prurito.

• PRUEBA DE IRRITABILIDAD EN VENAS

Se realiza para todos los intravenosos en perros a los cuales se les extrae muestra de la yugular. La muestra se les administra en la pata. Como resultado se observa si la formulación no causo lisis y que le sucedió a la vena con el producto como hinchazón, eritema, inflamación, enrojecimiento, etc.

• SUPOSITORIOS Y OVULOS

Se realiza en conejos y ratas a los cuales se les aplica el producto en el recto y se sutura, después se sacrifica al animal y se observa si hay inflamación, enrojecimiento, acumulación de líquidos o necrosis.

• GLANDULAS MAMARIAS

La prueba se realiza en ratas lactando a las que se les aplica el fármaco en las glándulas considerando unas como control. Se les retira a las crías un día antes de la prueba; se aplica de la muestra 0.1 g ó 1 g con diferentes dosis requiriéndose para cada dosis 10 animales.Se observa a las 24, 48 y 72 horas. Se sacrifican y se observa si la glándula presenta hinchazón, necrosis e irritación.

CROMATOGRAFIA

Es una técnica de separación, identificación y cuantificación en la cual se requiere de una sustancia de referencia (patrón interno o externo).

El sistema cromatográfico está formado por 3 partes:

- Fase estacionaria.- Fase móvil.- Muestra.

De acuerdo al fenómeno que se realiza cuando se lleva a cabo l separación se clasifica en:

31

- Fenómeno de adsorción (superficie).

- Partición (equilibrio entre dos líquidos).

- Por intercambio iónico (carga del analito).

- Por exclusión molecular (tamaño).

De acuerdo a la técnica se clasifica en:

- Cromatografía en capa fina (CCF).- Cromatografía en columna.- Cromatografía en papel.- Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC o CLAR).- Cromatografía de gases.

Forma de elución en la que se separan:

- Isocrática se presenta una única fase móvil.

- Por gradiente se cambian las proporciones de la mezcla.

Respecto a la fase estacionaria y fase móvil:

- Sólido / líquido fase estacionaria y fase móvil respectivamente.- Líquido / líquido.DEFINICION

Por diferencia de afinidad con respecto a la fase estacionaria y la fase móvil; actualmente es una técnica mediante la cual existe una separación de afinidad del analito de la fase estacionaria y fase móvil.

La afinidad de separación depende de:

- Solubilidad.- Polaridad.- Tamaño.- Carga.

¿Qué propiedades se deben de analizar?

FASE ESTACIONARIA

• Tamaño de partícula para cromatografía de capa fina y columna.• Tamaño del poro.• Geometría esférica por ser simétrica y tener mayor área superficial expuesta.• Empaque debe ser homogéneo.

CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

Se emplean sílica gel, alúmina, tierra silicia y poliamidas.Fase normal: la fase estacionaria es polar. La fase móvil es no polar.Fase reversa: la fase estacionaria es no polar. La fase móvil es polar.

Cambio de fases: se modifica por la adición de carbonos con cadenas hidrocarbonadas saturadas y no saturadas. C18, C12, C8, C6, C4.

En la fase reversa los que permanecen más tiempo son los no polares; ya que los polares son los que salen primero por no tener afinidad.Para el revelado se utiliza un indicador de luz UV o de fluorescencia.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR

La fase estacionaria es una matriz o red donde pasan las moléculas dependiendo del tamaño del poro, los más empleados son:

- CEFADEX matriz de dextrano.- CEFACRIL matriz de poliacrilamida.- BIOGEL matriz de agarosa.

32

FASE MOVIL

• Constante dieléctrica (interacciones con muestra, ionización).• Partición de solutos en la fase móvil.• Pureza elevada.

• Libres de cualquier partícula y gases disueltos para las cromatografías de columna.

METODOS PARA LA ELIMINACION DE GASES

- Sonicación: se lleva a la fase móvil al ultrasonido.- Burbujeando helio en la fase móvil.- Colocando barra magnética en fase móvil y agitando lentamente.

Se debe de cumplir las siguientes indicaciones:

- Estabilidad química.- No interaccione con la fase estacionaria (líquido/ líquido).- El analito o la muestra debe de estar soluble en la fase móvil. Debe de cumplirse que la muestra permanezca mucho más tiempo en

la fase móvil que en la fase estacionaria.- Polaridad y solubilidad depende de la muestra y tipo de cromatografía.

CAPACIDAD ELUITROPICA: referida a la constante dieléctrica, consiste en la capacidad de eludir.

MUESTRA

• Alta pureza.

• Solubilidad para la elección de la fase móvil y fase estacionaria.

• Detección de la muestra (que propiedades se le pueden medir, cómo se puede revelar; propiedades espectrofotométricas, de fluorescencia).

ESTANDARES

• Muy puro.• Poco higroscópico.

• Estable (que no reaccione con otros componentes).

Se requieren de estándares internos y externos.

TEORIA DE LOS PLATOS Y TEORIA CINETICA

- Explican el proceso cromatográfico.- Explica como se da la separación.

Se denomina COLEO al pico cromatográfico no simétrico que se desvía a la derecha e izquierda y se debe a la alta concentración de la muestra.El tiempo de retención es igual par la misma velocidad de flujo, muestra y fase móvil.El ancho de la banda (w) depende de la teoría cinética de la cromatografía con la ecuación de Van Deemter.

Durante el proceso se llega a un equilibrio que depende del coeficiente de partición influenciado por la temperatura, pH, fuerza iónica, constante dieléctrica del solvente y otras. Se lleva a cabo de forma contable surgiendo la teoría del plato teórico.

PLATO TEORICO (N): es el espacio en el cual se lleva a cabo el equilibrio, determina la eficiencia del sistema (a mayor N mayor eficiencia).

ALTURA EQUIVALENTE DEL PLATO TEORICO (H = AEPT): se refiere al grosor o altura de la interfase (a menor altura mayor eficiencia).

AMBOS DETERMINAN EFICIENCIA DE LA EXTRACCION.En una extracción hay la interacción entre la fase acuosa y la fase orgánica (entre mayor interacción hay mayor separación). El proceso es discontinuo y contable.

TEORIA CINETICA

33

¿Por qué hay ensanchamiento de la banda cromatográfica?De acuerdo a la ecuación de Van Deemter, la cromatografía es un proceso continuo.

• Difusión en remolino. Se disminuye con tamaño homogéneo e partícula, geometría y fase estacionaria. Se mantiene constante por una baja concentración, lo que permite una interacción mejor que conlleva a una separación más rápida y mejor.

• Difusión longitudinal.• Transferencia de masa.

H = A + B / U + Cu

Donde:

A = constanteB = difusión longitudinal.C = transferencia de masaU = velocidad de flujo de fase móvil.

DIFUSION LONGITUDINAL (B)

B = 2 DM

= factor de obstrucción de 0.5 a 0.9DM = coeficiente de difusión del soluto

Cuando asciende la separación difunden en primer plano las partículas que estén hasta el frente y son las que forman el pico de avance. Depende del contacto de la fase móvil por el soluto y de la afinidad del soluto por la fase móvil y estacionaria, características del soluto y la velocidad de la fase móvil.

Se debe de:

- Controlar la velocidad de flujo.- Mantener el entre 0.5 y 0.9

El es el impedimento que pone la fase estacionaria para que pase el soluto, le opone cierta resistencia que depende del empaque y tamaño de la partícula.A mayor velocidad de flujo menor efecto de difusión longitudinal. Son inversamente proporcionales.

TRANSFERENCIA DE MASA (C)

Se habla de pseudoequilibrios porque es poco el tiempo que permanece la fase móvil con la muestra en la fase estacionaria.A mayor velocidad de flujo mayor altura.

Velocidad de flujo óptimo:

- Menor altura.- Mejor efecto de masa.- Menor efecto longitudinal.

N = 16 (tR / w)2 platos teóricos

H = L / N altura

Donde:

tR = tiempo de retención, tiempo de soluto en columna.w = ancho de banda.L = longitud de fase estacionaria.

Resolución: dos picos perfectamente delimitados y separados. RS > 1.5Cuando la resolución es igual a 1 se dice que hay separación pero no hay resolución.El fenómeno de adsorción se da porque tanta muestra se coloca para la separación; se forma una estela o bolero cuando hay mucha muestra.El fenómeno de partición se da cuando la fase móvil y estacionaria son líquidas; si depende de la concentración se comporta de diferente manera por lo que tiene que ser independiente.La cromatografía es lineal cuando no depende la partición de la concentración y cuando hay bajas concentraciones.

ISOTERMAS: arriba de la cromatografía lineal son cóncavas y convexas y saturan el sistema.

34

Rs = 2 (tR B – tR A) / wA + wB

Eficiencia del sistema cromatográfico se debe a:

• H (es la mejor)• N

• RS

CROMATOGRAFIA PLANA

- En papel se da el fenómeno de partición.- En capa fina el fenómeno de adsorción en la fase normal y fase reversa por cambio de polaridad en la fase estacionaria.

La cromatografía en capa fina puede ser:

• Ascendente.• Descendente.La fase móvil migra por gravedad la fase estacionaria migra por capilaridad.

• Monodimensional (en un solo plano).

• Bidimensional (en dos planos donde hay una mejor separación).

En el fenómeno de adsorción lo importante es la polaridad de la fase normal; ya que lo menos polar es lo primero que sale, lo más polar tiene mayor afinidad por la fase móvil.La activación consiste en meter a la placa a cierta temperatura para la salida del solvente con agua. En la desactivación es con etanol o metanol.La fase móvil se selecciona por la fuerza eluitrópica, la polaridad de la muestra y la fase móvil.

Factor de retardo

Rf = distancia que recorre la muestra / distancia que recorre fase móvilEl factor de retardo debe ser menor a 1. Cuando es igual a cero no hay migración y cuando es igual a uno se dice que la muestra migró con el frente de solvente.

CUANTIFICACION

- La muestra es cuantitativa.

- Se realiza por densitometría (se realiza un scanner de todas las muestras leyéndose en nanolitros, se procede a la curva de calibración de estándares a diferentes concentraciones para determinar cuanto hay y que hay). Es un método empleado en la HPTLC (cromatografía en capa fina de alta resolución).

REVELADO

Los tipos de reveladores que se utilizan son:

- Químicos (yodo, sulfato sérico en ácido sulfúrico, ninhidrina, permanganato de potasio).

- Físicos (UV, indicadores de fluorescencia).

CROMATOGRAFIA DE PARTICION

Para la cromatografía en columna, la más usada es la reversa.

K = CS / Cm

Donde:

K = constante de partición.CS = concentración de soluto en fase estacionaria.Cm = concentración de soluto en fase móvil.

- Se considera del analito la solubilidad.- Se puede aumentar la temperatura para interacción de fase móvil y fase estacionaria y la transferencia de masa.

- Cromatografía de tipo isocrático y gradiente.

FACTOR DE SELECTIVIDAD

35

= t R B / tR A

Donde:

factor de selectividad, debe ser menor a 1; ya que indica si es factible la separación.FACTOR DE CAPACIDAD (K)

Indica que tan factible es que se lleve a cabo la separación. Hay diferentes maneras para calcularlo.

K (Vol. de fase estacionaria) / (Vol. de fase móvil)

tR – t0 / t0 (t0 es tiempo muerto e indica el tiempo que permanece un compuesto no retenido en la columna).

QE / QM QE = cantidad de analito en la fase estacionaria. QM = cantidad de analito en la fase móvil.

En la fase estacionaria se colocan C18, C12, C8, C6, C4 que depende de la solubilidad de la muestra.Se determina:

- H- N- Rs- Area bajo la curva mediante el método de los trapecios y formando un triángulo isósceles.

CROMATOGRAFIA DE IONIZACIONMediante la ionización se controla el pH de la muestra.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

Se usan resinas de intercambio iónico fuertemente ácidas y no fuertemente ácidas (grupos tipo ácido carboxílico); resinas fuertemente básicas contienen derivados de sales cuaternarias de amonio y grupos amino de fuerza moderada.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR

Interviene el tamaño o peso molecular de las moléculas, la separación se debe al radio de Stokes. Se usa una matriz que es un gel; por ejemplo los biogeles que son poliacrilamidas, superdex agarosa con dextrano, geles de celulosa, etc; que consisten en partículas huecas cuya superficie es una red o malla de tamaño controlado.

Se da un entrecruzamiento de malla donde las partículas grandes salen por fuera y las pequeñas por el hueco. Primero salen las de mayor tamaño y las más pequeñas son las últimas. Ocurre un hinchado de la gel o de la malla porque las partículas esféricas huecas van a la superficie.

Ejercicio: Se ha encontrado que la sustancia A y B tienen un tiempo de resolución de retención de 16.4 y 17.63 minutos en una columna de longitud de 30 cm. Un compuesto no retenido de 1.3 minutos. Los anchos de pico fueron de 1.11 y 1.21 mm.

Calcular:- Número medio de platos teóricos en columna.- Altura promedio del plato teórico.- Resolución de los 2 picos.- ¿Cuál sería la longitud de la columna necesaria para una resolución de 1.5?

17.63 – 1.3 = 16.3316.4 – 1.3 = 15.1

N = 16 (15.1 / 1.11)2 = 2960.93N = 16 (16.33 / 1.21)2 = 2914.22N = 2960.93 + 2914.22 = 5875.15 / 2 = 2937.57

H = 30 / 2937.57 = 0.0102 cmRs = 2 (17.63 – 16.4) / 1.11 + 1.21 = 1.060

N1 / N2 = (Rs1)2 / (Rs2)2 = (1.06)2 / (1.5)2

2937.57 / N2 = (1.06)2 / (1.5)2 N2 = 2937.57 (1.5)2 / (1.06)2 = 5882.46

36

H = L / N L = HN L = 0.0102 x 5882.46 = 60.04 cm

Tiempo necesario para la elución de la sustancia B en el lugar más grandetR1 / tR2 = (Rs1)2 / (Rs2)2

16.33 / tR2 = (1.06)2 / (1.5)2 tR2 = 16.33 (1.5)2 / (1.06)2 = 32.70 minutos

CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC o CLAR)

SOLVENTE ------------- BOMBA ------ PROGRAMADOR DE SOLVENTE --------- COLUMNA TRAMPA DE BOMBA INYECTOR BURBUJA

COLUMNA ----------- DETECTOR --------- INTEGRADOR ----------- PC

El flujo debe de ser de 0.1 a 10 ml por minuto. El tipo de bombas que se utilizan son neumáticas y/o mecánicas las cuales mantienen el flujo continuo.Para la elución isocrática se requiere de una sola bomba, mientras que para la elución por gradiente se requieren de dos bombas.

COLUMNAS Y FASE ESTACIONARIA

- Ninguna obstrucción de partículas.- Variación de características de retención del compuesto.- No golpear la columna, se fractura la fase estacionaria.

FLUORESCENCIA

Los métodos analíticos quimioluminicentes son:

• Fosforescencia.

• Fluorescencia abarca espectro de absorción y espectro de emisión.

La molécula en estado basal absorbe energía y pasa al estado de excitación con diferentes niveles.

ABSORCION = de estado basal a singulete excitado (S*).EMISION = de singulete excitado a estado basal.La fluorescencia es de singulete excitado a estado normal.

La absorción presenta longitudes de onda pequeñas. Se emplea la ecuación:

E = h C /

Donde: E = energía h = constante de Planck

FOSFORESCENCIA

El singulete normal de moléculas se excitan pero no llega a singulete excitado sino a triplete excitado (T*). La fosforescencia es de triplete excitado a singulete normal.El T* es un nivel más bajo que el S*. De S* a T* es un paso no permitido; se permite únicamente si se lleva a cabo por un fenómeno diferente a la emisión de luz; por ejemplo: calor.

La fluorescencia es de 10-4 y 10-8 segundos y no se ve a simple vista ya que se absorbe suficiente energía. La fosforescencia no depende de la fuente de energía, se observa a simple vista y puede durar hasta varios días.

RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA

= cantidad de fotones emitidos / cantidad de fotones absorbidos

Tiende a 1 pero nunca va a ser igual. A > < energía; en emisión hay menor e nergía que en absorción.

FENOMENO DE FLUORESCENCIA

F = IF = Io 2.3 E l C ------ K -----

37

Donde:

Io = intensidad de luz para que absorba.E = coeficiente de absortividad.IF = intensidad de fluorescencia.l = longitud de paso de luz.

IF = K Cy = mx + b

Es lineal a bajas concentraciones (10-4 M). El fenómeno depende de Io para que suban a un estado de excitación y emitan. A bajas concentraciones hay pocas moléculas, la luz impacta sobre todas por lo que se excitan y florecen. Se detectan cantidades pequeñas porque no todas fluorecen. Es selectivo y más sensible que UV, al depender de la luz sensibilizan más.Impacta el medio de disolución y pH mientras que la temperatura ayuda a la fluorescencia.Es útil para muestras con grupos heterocíclicos, moléculas planas y moléculas con dobles ligaduras.

El espectrofluorómetro al incidir la luz tiene un filtro donde detecta únicamente la luz emitida a un ángulo de 90 ° con lo cual lee la luz transmitida en otra posicón.Para la detección fluorométrica se requiere estandarizar con sulfato de quinina 0.2 M en ácido sulfúrico o rodamina.

Se valora la calidad del espectrofotómetro con:

- Dicromato de potasio.- Permanganato con alta pureza.- Osmio.- Benceno.

Ejercicios: Cromatografía de líquidos en fase inversa para el propanolol con un P.M. 259.35. Utilizando protiptilina como estándar interno y un detector de fluorescencia.Fase estacionaria C18.Fase móvil: metanol / H2O / ácido fosfóricoVelocidad de flujo 1 ml / min.Detector de fluorescencia de excitación o absorción 293 nm. de emisión 375 nm

Preparación de la muestra: después de una serie de extracciones con una mezcla de hexano y alcohol isoamílico a 1 ml de plasma añadido de 20 L de estándar interno de una cncetración de 1 mg / ml, el extracto obtenido se evaporó a sequedad y se reconstituyó con 20 L de metanol, de éstos 10 L se inyectaron en el cromatograma.

Preparación del estándar: a 1 ml de plasma limpio (sin fármaco) se le agregaron 20 L del estándar de concentración de 1 mg / ml más 9.25 g / ml de un estándar de propanolol. Se trata de la misma forma que la muestra. Calcular la concentración de propanolol en la muestra de suero. Resolver por alturas.

Cromatograma de solución muestra: propanolol 1.5 cm A 11 cm.Cromatograma de solución estándar: popanolol 9.5 cm B 11 cm.

9.25 g ----------- 1 ml ------ 10 L x ---------- 20 L x = 4.625 g propanolol

g propanolol -------- 9.5 cm x -------- 1.5 cm x = 0.7303 g propanolol

x = (0.7303 g) x 2 = 1.46 g propanolol

1.46 g / ml x (1000 ml / L) x ( 1 mg / 1000 g) x (1 g / 1000 mg) = 1.46 X 10 -3 g / L plasma

¿Por qué hay diferencia entre la longitud de onda de absorción y de emisión?Porque las moléculas al excitarse, no todas regresan por el mismo lugar por lo cual hay pérdida de energía; ya que a mayor longitud de onda menor energía.

38

Ejercicio: Griseofulvina P.M. 352.77Se cuantificó metabolito en orina (desmetilgriseofulvina) P.M. 338.77 g / mol por cromatografía de líquidos.

Tratamiento de la muestra: 3 ml de orina durante las 2 primeras horas subsecuentes a la administración VT 200 ml se extrajeron con 10 ml de butanol benceno, el extracto se evaporó a sequedad y el residuo se reconstituyó con 0.4 ml de una solución metanólica de estándar interno (4-m-hidroxifenil-1-isopropil-7-metil-2H-quinazolinona) de una concentración de 0.25 mg / ml. Se tomaron 5 L y se inyectaron al cromatografo.

Solución estándar se preparó una solución metanólica conteniendo 0.25 mg / ml del estándar interno y 0.5 mg / ml del estándar de desmetilgriseofulvina. Se inyectaron 5 L al comatograma.Fase estacionaria: sílicaFase móvil: heptano en bomba A metanol en bomba B

a) Calcular la concentración de desmetilgriseofulvina por ml de orina.b) Calcular cantidad total del metabolito en 200 ml de orina.c) ¿En qué consiste el sistema cromatográfico de gradiente?Resolver por altura de picos.

Primer cromatograma: A 12.2 cm. Segundo cromatograma: A 13.8 cm. B 13.8 cm B 15 cm. C 4.2 cm.

A estándar interno.B metabolito (desmetilgriseofulvina).C griseofulvina.

a)0.5 mg / ml x (1000 g / 1 mg) x (1 ml / 1000 L) = 0.5 g / L 0.5 g / L x 5 L = 2.5 g

g ------------ 13.8 cm x ------------ 15 cm x = 2.72 g

2.72 g / 3 ml = 0.906 g / ml

b)0.906 g ------------ 1 ml x ----------- 200 ml x = 181.33 g / 200 ml orina

c)Aquel en el cual la fase móvil cambia de composición y de proporción; desde 100 % de A y 0 % de B hasta 0 % de A y 100 % de B. Se necesitan 2 bombas necesariamente.

Ejercicio:

tR W 1 = 3 1 = 0.5 2 = 5 2 = 0.5 3 = 8 3 = 0.7 4 = 10.5 4 = 0.8 5 =14 5 = 1.1 6 = 18 6 = 1.4

Calcular N para 3, 4 y 5.

N = 16 (8 / 0.7)2 = 2089.79N = 16 (10.5 / 0.8)2 = 2756.25N = 16 (14 / 1.1)2= 2591.73

Calcular la resolución entre 3, 4 y 4, 5.

Rs = 2 (10.5 – 8 ) / 0.8 + 0.7 = 3.33Rs = 2 (14 – 10.5) / 1.1 + 0.8 = 3.88Ambas presentan una resolución excelente por ser arriba de 1.5

39

Segundo estándar 4 y 5 50 g / ml ---------- 30 L 4= área bajo la curva 13.2 --------- 1.5 g5= área bajo la curva 12.8 --------- 1.5 g

X = 4 = 11.8Y = 5 = 12.1

¿Qué cantidad hay del compuesto X y qué cantidad hay de Y?

(50 g / ml) x ( 1 ml / 1000 L) x 30 L = 1.5 g del compuesto 4.

1.5 g ----------- 13.2 x ----------- 11.8 x = 1.340 g

1.5 g ----------- 12.8 x ----------- 12.1 x = 1.42 g

Ejercicio: se valoró clorhidrato de tiamina (que fluoresce) P.M. 337.27 g / mol. Contenido en tabletas disolviendo el equivalente del peso medio en 200 ml de HCl 0.2 N.Se filtró la solución y se tomó 1 ml, se llevó a un aforo de 50, se tomó 1 ml y se aforó a 25 ml. Se preparó el estándar de clorhidrato de tiamina a 0.23 g / ml. En 2 tubos marcados como estándar y problema se colocaron 5 ml, 3 ml de agente oxidante (ferricianuro de potasio) y después se le adicionaron 20 ml de alcohol isobutílico. Se agita la muestra y se mide fluorescencia en capa orgánica en celdilla de 1 cm.

Lecturas STD 0.980 UF Blanco STD 0.005 UF Problema 0.93 UF Blanco Problema 0.035 UF

STD 0.980 – 0.005 = 0.975Problema 0.93 – 0.035 = 0.895

0.975 --------- 0.23 g / ml0.895 --------- x x = 0.2111 g / ml

0.2111 g / ml x (5 ml) = 1.0556 g

1.0556 g ----------- 5 ml x ---------- 25 ml x = 5.278 g

5.278 g ----------- 1 ml x ----------- 50 ml x = 263.9 g

263.9 g ----------- 1 ml x ----------- 200 ml x = 52780 g / tableta ó 52.75 mg / tableta

Ejercicio: se desea saber que cantidad de pesticida hay en una fruta. Cromatografía en placa y fluorescencia. Pesar 0.5 g de fruta, lavar para disolver pesticida, el solvente del lavado se lleva a sequedad, el soluto que queda se redisuelve en 1 ml de solvente. Del ml se toman 100 L se colocan en placa cromatográfica, se corre la muestra y lo que hay en la mancha se redisuelve en 100 ml de etanol. Se lleva al fluorómetro con 47.5 UF y un blanco lee 3 UF. Un estándar de 5 g de pesticida bajo las mismas condiciones da una lectura de 87 UF.Calcule cantidad de pesticida por p.p.m.

5 g / 1 ml x ( 1 ml / 1000 L) x (100 L) = 0.5 g

0.5 g ---------- 87 x --------- 44.5 x = 0.255 g

0.255 g x 10 = 2.55 g

2.55 g --------- 0.5 g x -------- 1 g x = 5.1 g / g ó 5.1 p.p.m.

Ejercicio: determinar selenio en una muestra e leche. Se toma leche en polvo 755.4 mg leche se diluyen 10 ml (Sol. A). Se le adiciona a la solución 2, 3-diaminonaftaleno para formar complejo fluorescente; da 27.8 UF.

40

1 ml de solución estándar de selenio cuya concentración es de 0.5 g / ml se diluyeron en 10 ml (Sol. B). Se le adicionó 2, 3-diaminonaftaleno y se formó el complejo fluorescente. Da una lectura de 66.4 UF.Calcule contenido de selenio por cada 100 g de leche.

0.5 g --------- 66.4 x --------- 27.8 x = 0.2093 g

0.2093 g --------- 0.7554 g leche x --------- 100 g x = 27.71 g / 100 g lecheEjercicio: la concentración de quinina se determinó en una muestra de orina, se coloca muestra de 2 ml en tubo de centrifuga se ajusta pH entre 9 y 10, se extrajo muestra con 10 ml de cloroformo.Al extracto cloroformico se le adicionaron 2 ml de ácido sulfúrico 0.1 N. Se separó capa ácida leída en espectrofluorómetro dando lectura de 0.35 UF.Se corrió curva estándar de quinina en:

g / ml UF X Y

0.5 0.2 r2 = 0.97030.1 0.4 b = 0.16670.2 0.8 m = 2.9462

0.4 1.60.8 2.4

¿Cuál es la concentración de quinina en la orina?

0.35 UF ----------- 0.062 g / ml(0.062 g / ml) x 2 ml = 0.124 g

0.124 g ---------- 2 ml de orina x ---------- 1 ml x = 0.062 g

REFRACTOMETRIA

Es una medición en forma de luz. Su base es en el fenómeno de refracción donde se mide el ángulo que se forma debido a la refracción de la luz al hacer incidir un rayo de luz y pasar de un medio a otro medio.

El índice de refracción sirve para:

- Pureza.- Identidad.

ISOTROPICAS: un único ángulo.ANISOTROPICAS: más de un ángulo.Es una propiedad intensiva del sistema. El índice de refracción experimental está influenciado por la temperatura, pH; es útil para aceites esenciales, joyería y perfumes.

POLARIMETRIA

Saber si la sustancia tiene molécula dextro o levo rotatoria, se discrimina a los enantiómeros. Se fundamenta en rayo de luz polarizado que incide en muestra.La luz se comporta como onda o como partícula, generando en un plano campo eléctrico y en plano perpendicular un campo magnético.

Se alinea a la luz en un plano únicamente. Se polariza a la luz en un solo plano con los polarizadores existentes como los prismas y polarizador donde se busca un ángulo para poder medir.

Las mezclas racémicas están formadas en un 50 % por moléculas dextro y en otro 50 % por moléculas levo; estas mezclas no desvían la luz.

41