aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con

Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial

aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B

Yeimy Johana Rodríguez Molina

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

2019

Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B.

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Aproximaciones al diseño de copolímeros anfifílicos con potencial

aplicación en la encapsulación y liberación de Anfotericina B

Yeimy Johana Rodríguez Molina

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias Química

Director:

León Darío Pérez Pérez, Ph.D.

Línea de Investigación:

Síntesis química

Grupo de Investigación:

Grupo de Investigación en Macromoléculas

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Departamento de Química

Bogotá, Colombia

2019


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Dedicatoria

A mi abuelo José del Carmen, desde el cielo tus ojos son mi guía.


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Agradecimientos

Agradezco especialmente a mi director de tesis, el profesor León D. Pérez, por su

dedicación, ideas y consejos que hicieron posible la finalización de este trabajo.

A la Universidad Nacional de Colombia y al grupo de investigación en macromoléculas por

el acompañamiento, las instalaciones y los recursos brindados durante este tiempo.

Sin dejar atrás a mis amigos y compañeros, su ayuda, apoyo y motivación en todo

momento ha sido fundamental para lograr estos resultados, en especial: Elsa, Gladys

Sofía, Lucimar, Andrea y Angie.

Finalizo agradeciendo a quienes para mí han sido motivo de trabajo, amor y constancia,

mi familia, mi mamá Graciela, mi papá Florián, mis hermanos Diana y Camilo y a mi novio

Andrés, por su compañía y conocimientos.


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Resumen

En este estudio, se describe la síntesis de copolímeros anfifílicos de PEG-b-PCL

bioconjugados con colesterol o retinol del tipo AB y ABA a través de polimerización por

apertura de anillo (ROP) y esterificación de Steglich. La copolimerización fue confirmada

empleando resonancia magnética nuclear protónica (RMN1H), espectroscopia infrarroja

(FTIR) y cromatografía de permeación en gel (GPC), las propiedades térmicas fueron

estudiadas por calorimetría diferencial de barrido (DSC).

Posteriormente, se realizó el estudio de las relaciones entre las propiedades coloidales de

las micelas y los copolímeros anfifílicos sintetizados. La micelización de los copolímeros y

su concentración micelar critica (CMC) se estudió empleando el método de fluorescencia

con pireno. De acuerdo con los resultados, se evidencia que los métodos de polimerización

y bioconjugación empleados dieron lugar a copolímeros con entidades terpénicas

enlazadas covalentemente a su estructura. Por su parte, las propiedades coloidales de las

micelas evidencian que el incremento del segmento hidrofóbico de los materiales genera

disminución en la CMC, conveniente para la estabilidad de las dispersiones micelares

empleadas en la liberación controlada de fármacos. Adicionalmente, se caracterizaron los

sistemas micelares empleando DLS, potencial Z y TEM, en su orden, se obtuvieron

partículas micelares de tamaños que comprenden el rango entre 22,0 y 136,8 nm; la

estabilización de los sistemas micelares establecida por el potencial Z es de tipo estérico,

teniendo en cuenta que la carga de las partículas fue cercana a cero; En tanto, la

morfología de las micelas mostrada en las imágenes TEM confirma la presencia de

partículas nanométricas con estructura tipo “core-shell”.

Finalmente, se evaluó la potencial aplicación de estos copolímeros bioconjugados en la

encapsulación de AmB, el estudio de su liberación controlada y el efecto sobre el estado

de agregación en cada sistema micelar cargado con AmB. Se evidenció que las unidades

de terpeno inciden favorablemente en la encapsulación de AmB, encontrándose mayores

contenidos de fármaco cuando se bioconjugan con retinol (10,21%). No obstante, la

conjugación con colesterol también incrementa la solubilización de AmB (5,88%) con

respecto a los copolímeros blanco (<3,16%). Los estudios de liberación demuestran

condiciones controladas y porcentajes de liberación menores en los copolímeros


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6

bioconjugados con terpenos, corroborando que el núcleo micelar genera un microambiente

con interacciones favorables que retardan la salida de AmB al medio de liberación.

Finalmente, los estudios de agregación realizados por espectrofotometría UV-Vis,

demostraron que la AmB cargada en las micelas se encuentra formando autoagregados.

Palabras clave: Micelas poliméricas; Policaprolactona; Polietilenglicol; Colesterol; Retinol;

Anfotericina B.


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7

Abstract

In this study, the synthesis of amphiphilic PEG-b-PCL copolymers type AB and ABA

bioconjugate with cholesterol or retinol through ring open polymerization (ROP) and

Steglich esterification are described. The copolymerization was confirmed using proton

nuclear magnetic resonance (¹H NMR) and infrared spectroscopy (FTIR) and gel

permeation chromatography (GPC), the thermal properties were studied using differential

scanning calorimetry (DSC). Then, the study of the relationship between the colloidal

properties of the micelles and the amphiphilic copolymers synthetized were carry out. The

copolymers micellization and its critical micelle concentration (CMC) were perform using

fluorescence method with pyrene. According to the results, it is evident that the

polymerization and bioconjugate methods used gave rise to copolymers with terpene

entities covalently linked to its structure. In the same way, the colloidal properties of the

micelles show that an increase in the hydrophobic segment of the material generates a

CMC decrease; this is convenient for the stability of the micellar dispersion used in drug-

controlled release.

The micellar systems were characterized employing Dynamic Light Scattering (DLS), Z

potential and transmission electron microscopy (TEM). In its order, micellar particles of

sizes that comprise the range between 22,0 and 136.8 nm were obtained; the stabilization

of the micellar systems stablished using Z potential exhibit a steric type, taking in account

that the particle charge was near to cero. While, the morphology shown in TEM images

confirm the presence of nanometric core-shell type particles.

The application of this bioconjugate copolymers in the AmB encapsulation, the study of

their controlled release and the aggregation state were evaluated for each micellar system

charged with AmB. It was evidenced that the terpene units favorably affect the

encapsulation of AmB, when the AmB was bioconjugate with retinol the obtained drug

content was 10,21%. However, the conjugation with cholesterol increase also the AmB

solubilization (5,88%) compared to blank copolymers (<3,16%). Release studies

demonstrate controlled conditions and lower release rates in bioconjugate copolymers with

terpenes, this confirms that the micellar core generates a microenvironment with favorable

interactions that delay the exit of AmB to the release medium. Finally, aggregation studies


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8

performed by UV-Vis spectrophotometry showed that the AMB loaded in the micelles is

arranged in self-aggregates form.

Key words: Polymeric micelles, Polycaprolactone, Polyethylene glycol, Retinol,

Cholesterol, Amphotericin B.


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Contenido

1. Introducción .......................................................................................................... 16

2. Marco teórico ......................................................................................................... 19

2.1. Copolímeros en bloque .................................................................................... 19

2.2. Síntesis de copolímeros en bloque anfifílicos ................................................... 20

2.3. Polimerización por apertura de anillo (ROP)..................................................... 20

2.3.1. Polimerización por apertura de anillo (ROP) de Coordinación-Inserción ... 21

2.4. Esterificación de Steglich ................................................................................. 22

2.5. Micelización de copolímeros en bloque: autoensamblaje en solución acuosa .. 23

2.6. Encapsulación de fármacos ............................................................................. 24

2.7. Liberación controlada de fármacos ................................................................... 24

2.8. Anfotericina B ................................................................................................... 25

2.8.1. Mecanismo de acción de la AmB .............................................................. 25

2.9. Antecedentes ................................................................................................... 26

3. Objetivo general .................................................................................................... 28

3.1. Objetivos específicos ....................................................................................... 28

4. Diseño metodológico ............................................................................................ 29

4.1. Síntesis de copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA bioconjugados con colesterol y

retinol 30

4.1.1. Protocolos de síntesis ............................................................................... 31

4.2. Caracterización de los copolímeros anfifílicos bioconjugados tipo AB y ABA ... 33

4.3. Estudio de las relaciones entre las propiedades coloidales de las micelas y los

copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA ......................................................................... 34

4.3.1. Determinación de la concentración micelar crítica (CMC) ......................... 34

4.3.2. Caracterización de los sistemas micelares ................................................ 35

4.4. Encapsulación de anfotericina B, liberación controlada y efecto sobre su

agregación .................................................................................................................. 35

4.4.1. Encapsulación de AmB ............................................................................. 35

4.4.2. Estudio de liberación controlada de AmB .................................................. 36

4.4.3. Estado de agregación de AmB .................................................................. 38

5. Resultados y discusión ........................................................................................ 39

5.1. Síntesis de los copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA bioconjugados con

colesterol y retinol ....................................................................................................... 39


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10

5.1.1. Espectroscopia infrarroja por Transformada de Fourier (FTIR) .................. 41

5.1.2. Resonancia magnética nuclear protónica (RMN1H) ................................... 43

5.1.3. Cromatografía de permeación en gel (GPC) .............................................. 45

5.1.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC) .................................................. 46

5.1.5. Espectrofotometría UV-Vis ......................................................................... 48

5.2. Estudio de las relaciones entre las propiedades coloidales de las micelas y los

copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA .......................................................................... 49

5.2.1. Determinación de la concentración micelar critica (CMC) .......................... 50

5.2.2. Caracterización de los sistemas micelares ................................................ 54

5.3. Encapsulación de AmB, liberación controlada y efecto sobre su agregación .... 57

5.3.1. Encapsulación de AmB .............................................................................. 57

5.3.2. Estudio de liberación controlada de AmB ................................................... 61

5.3.3. Estado de agregación de AmB .................................................................. 64

6. Conclusiones ......................................................................................................... 67

7. Anexos .................................................................................................................... 69

8. Referencias ............................................................................................................ 71


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11

Lista de figuras

Figura 1. Representación de las distintas morfologías de copolímeros en bloque ............ 19

Figura 2. Mecanismo de reacción propuesto para la ROP de coordinación-inserción ..... 21

Figura 3. Estructura química del catalizador octanoato de estaño (Sn(Oct)2) .................... 22

Figura 4. Mecanismo de reacción general para la esterificación Steglich .......................... 22

Figura 5. Representación del proceso de micelización por el autoensamblaje en medio

acuoso de copolímeros en bloque anfifílicos. ........................................................................... 23

Figura 6. Estructura química de la anfotericina B (AmB) ....................................................... 25

Figura 7. Esquema general del diseño metodológico de la investigación ........................... 29

Figura 8. Representación esquemática de la encapsulación de AmB ................................. 36

Figura 9. Representación esquemática de la liberación controlada de AmB ..................... 37

Figura 10. Representación esquemática de la ROP iniciada por COL (a) e iniciada por

mPEG (b) ........................................................................................................................................ 39

Figura 11. Representación esquemática de la carboxilación de los materiales para COL

(a) y para RET (b) ......................................................................................................................... 40

Figura 12. Representación esquemática de la esterificación de Steglich de los materiales

para COL (a) y para RET (b) ....................................................................................................... 41

Figura 13. Espectro FTIR del copolímero anfifílico tipo ABA COP-COL1 ........................... 42

Figura 14. Espectro FTIR del copolímero anfifílico tipo ABA COP-RET1 ........................... 42

Figura 15. Espectro RMN1H del copolímero anfifílico tipo ABA COP-COL1 en CDCl3. .... 43

Figura 16. Espectro RMN1H del copolímero anfifílico tipo ABA COP-COL1 en CDCl3 ..... 44

Figura 17. Curvas GPC de los CBA con unidades de retinol (A) y con unidades de

colesterol (B) .................................................................................................................................. 46

Figura 18. Termogramas DSC de materiales poliméricos A. enfriamiento de 100 ° C

hasta -20 °C a 10 °C/min y B. calentamiento de -20 °C hasta 120 °C a 10 °C/min ........... 47

Figura 19. Espectro UV-Vis del retinol y los CBA bioconjugados con retinol ..................... 49

Figura 20. Espectro de excitación de pireno a diferentes del copolímero COP-COL1 ..... 51

Figura 21. Relación de intensidad de fluorescencia (I335/I332) vs el logaritmo de la

concentración de los copolímeros bioconjugados. .................................................................. 52

Figura 22. Efecto de la temperatura en el diámetro hidrodinámico de las micelas de los

CBA B1, COP-COL1 y COP-RET1 ............................................................................................ 55


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12

Figura 23. Estabilidad estérica en sistemas micelares .......................................................... 56

Figura 24. Imágenes TEM de las micelas de los copolímeros anfifilicos de mPEG-b-PCL-

Terpeno y Terpeno-PCL-b-PEG-b-PCL-Terpeno .................................................................... 57

Figura 25. Contenido de AmB (%) cargado en las micelas ................................................... 59

Figura 26. Perfiles de liberación para las micelas de copolímeros anfifílicos

bioconjugados cargados con AmB ............................................................................................. 62

Figura 27. Porcentaje de liberación de AmB máximo obtenido en cada sistema micelar 63

Figura 28. Espectros UV-Vis de absorción de AmB en DMSO y en PBS (DMSO 1% v/v)

......................................................................................................................................................... 64

Figura 29. Espectros UV-Vis de absorción los copolímeros anfifílicos bioconjugados con

terpenos .......................................................................................................................................... 65


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13

Lista de tablas

Tabla 1. Condiciones de reacción de los copolímeros anfifílicos bioconjugados con

terpenos vía ROP y esterificación de Steglich. ........................................................................ 31

Tabla 2. Características de los copolímeros mPEG-b-PCL-Terpeno y Terpeno-PCL-b-

PEG-b-PCL-Terpeno .................................................................................................................... 45

Tabla 3 Propiedades térmicas de los copolímeros mPEG-b-PCL-Terpeno y Terpeno-

PCL-b-PEG-b-PCL-Terpeno ........................................................................................................ 48

Tabla 4. Concentraciones micelares críticas (CMC) de los copolímeros bioconjugados

con terpenos................................................................................................................................... 53

Tabla 5. Propiedades de las micelas de copolímeros anfifílicos bioconjugados con

terpenos .......................................................................................................................................... 54

Tabla 6. Eficiencia de encapsulación y contenido del fármaco en los sistemas micelares

cargados con AmB ........................................................................................................................ 58

Tabla 7. Efecto de la carga de AmB en el diámetro hidrodinamico de las micelas ............ 60

Tabla 8. Estado de agregación de AmB basado en la relación de la intensidad de las

bandas I y IV (I/IV) del espectro UV-Vis. ................................................................................... 66


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14

Lista de símbolos y abreviaturas

Símbolo Término

PEG Polietilenglicol

mPEG Metoxipolietilenglicol

e-CL Épsilon-Caprolactona

PCL Policaprolactona

COL Colesterol

RET Retinol

COP Copolímero

CBA Copolímero en bloque anfifilico

MP Micelas poliméricas

AmB Anfotericina B

FDA Food and Drug Administration

ROP Polimerización por apertura de anillo

DCC N, N'-diciclohexilcarbodiimida

DMAP N-(dimetilamino)piridina

RMN1H Resonancia Magnética Nuclear Protónica

FTIR Espectroscopia Infrarroja por Transformada de Fourier

DSC Calorimetría diferencial de barrido

GPC Cromatografía de permeación en gel

CMC Concentración micelar crítica

DLS Dispersión dinámica de luz

Dh Diámetro hidrodinámico


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15

PDI Índice de polidispersidad

DNa Desoxicolato de sodio

DMSO Dimetil sulfóxido

PBS Buffer fosfato salino


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16

1. Introducción

El continuo desarrollo de materiales poliméricos desempeña un papel protagónico en el

campo de las ciencias biomédicas, esto se debe a la versatilidad con la que puede

controlarse su composición, peso y arquitectura molecular [1]. Por ejemplo, la

copolimerización en bloque permite unir segmentos hidrófobos e hidrófilos en la misma

molécula, esta característica les confiere la habilidad de autoensamblarse

espontáneamente en medios acuosos formando micelas poliméricas (MP) [2]. Las MP,

están compuestas por dos dominios separados, un núcleo interno capaz de solubilizar

fármacos hidrófobos como Anfotericina B (AmB) y una cubierta externa hidrófila encargada

de estabilizar coloidalmente las micelas y asegurar su biocompatibilidad [3].

Los copolímeros en bloque anfifílicos (CBA) empleados en liberación controlada de

fármacos deben ser biocompatibles y biodegradables, asimismo, tener la capacidad de

proteger el fármaco, reducir su toxicidad y conservar su actividad durante la circulación [4].

Por tal motivo, sistemas micelares obtenidos a partir de copolímeros de polietilenglicol

(PEG) y policaprolactona (PCL) han sido el eje de investigaciones en biomateriales, ya que

ambos son aprobados para uso clínico por la FDA. El PEG (segmento hidrófilo), incrementa

la solubilidad y biocompatibilidad, tiene baja inmunogenicidad y toxicidad y ayuda a

proteger las partículas del reconocimiento por el sistema reticuloendotelial (SRE) [5][6]. Por

su parte la PCL (segmento hidrófobo), es biocompatible, biodegradable, no es toxica y

presenta una alta capacidad de encapsulación de sustancias hidrófobas [3]. Por lo anterior,

estos materiales han sido ampliamente estudiados y aplicados en liberación controlada de

fármacos, usualmente, la conjugación PEG-PCL suele estar acompañada por la inserción

de otras moléculas bioactivas que aumenten la interacción fármaco-copolímero.

Los terpenos o terpenoides son compuestos orgánicos derivados de unidades de isopreno,

ellos representan una clase de compuestos naturales con diferentes estructuras químicas

y bioactividades, por su biocompatibilidad han generado gran interés en el desarrollo de

materiales biohíbridos [7]. Entre los compuestos que mayor interés han generado, se tiene

el colesterol (Col) el cual es biocompatible, ampliamente usado en la síntesis de

biomateriales y presenta interacciones que benefician la encapsulación de fármacos

insolubles en agua [8]. De manera análoga, el retinol (RET), además de su intervención

vital en el ciclo visual, se une a receptores específicos y regula varios procesos biológicos

como la proliferación y diferenciación celular [9]. Debido a la cadena lateral isoprenoide


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17

rica en electrones, el retinol es inestable en presencia de luz y oxígeno, sin embargo, se

ha demostrado que la conjugación con un polímero incrementa su estabilidad química y su

biodisponibilidad [2]. Asimismo, esta característica estructural le confiere interacciones

favorables con sustancias liposolubles, por lo que su participación es ventajosa en la

encapsulación de fármacos hidrófobos, sin alterar la biocompatibilidad de los copolímeros

que lo contienen. En el caso de AmB, se favorece interacciones intermoleculares tipo π-π,

debido a que ambos presentan segmentos poliénico.

La AmB es un agente antifúngico lipófilo que cuenta con un amplio espectro de acción, su

uso clínico se remonta a 1959 cuando fue aprobado por la FDA [10]. Es una molécula

compuesta por una cadena polihidroxilada enlazada a una cadena poliénica hidrofóbica.

Este antifúngico aislado naturalmente de cepas de Streptomices nodosus, es el fármaco

de elección en el tratamiento de infecciones fúngicas, su mecanismo de acción consiste

en la unión con el ergosterol de la membrana celular fúngica promoviendo la disfunción y

muerte celular [11]. Pese a su alta eficacia, se encuentra limitado por su toxicidad y baja

solubilidad en la mayoría de disolventes [12]. Actualmente, la administración de AmB para

el tratamiento de infecciones fúngicas se lleva a cabo vía parenteral empleando

Fungizone®, una dispersión coloidal de AmB con desoxicolato de sodio en la que

prevalece la toxicidad del fármaco. Por esta razón, los avances para disminuir la toxicidad

asociada a la AmB se han centrado en formulaciones liposomales, como lo son

AmBisome®, Amphocil® y Abelcet®, sin embargo, su elevado costo es un impedimento

para realizar un tratamiento en la mayoría de los pacientes [13]. El uso de micelas

poliméricas como vehículos para fármacos con limitada solubilidad en agua ha demostrado

mejorar la solubilización de estos principios activos, asegurar una liberación controlada y

aumentar la seguridad de administración a pacientes contraindicados [14]. Debido a esto,

en la presente contribución con el fin de abordar estos problemas, se sintetizaron

copolímeros anfifílicos del tipo ABA y AB con PCL-b-PEG-b-PCL y mPEG-b-PCL,

respectivamente, empleando diferentes longitudes del segmento hidrófobo, bioconjugados

con colesterol (COL) y retinol (RET) vía ROP y esterificación de Steglich, que luego se

emplearon para obtener micelas a partir de su autoensamble en medio acuoso. En este

trabajo, se presenta el protocolo de síntesis y la caracterización estructural de los

copolímeros por FTIR, RMN1H, DSC y GPC, así como también el proceso de micelización

y su caracterización empleando diferentes técnicas como fluorescencia, DLS, potencial

zeta y TEM. Finalmente, se estableció la capacidad de las micelas como una formulación


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18

antimicótica de AmB, evaluando el efecto de la composición del copolímero sobre el estado

de agregación, la eficiencia de encapsulación y su liberación controlada.


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19

2. Marco teórico

2.1. Copolímeros en bloque

Los polímeros son macromoléculas constituidas por la unión de unidades repetitivas o

monómeros. En función de la repetición o variedad de monómeros, los polímeros se

clasifican en homopolímeros (formados por un solo tipo de monómero), o copolímeros

(formados por al menos dos monómeros diferentes) [15]. La síntesis de copolímeros es

una estrategia interesante para generar estructuras con características beneficiosas que

no presenta cada homopolímero por separado [16]. Según el método de polimerización

empleado, es posible obtener diferentes tipos de arquitecturas en las cadenas

copoliméricas, estas pueden ser, de injerto, al azar, alternado, en estrella o en bloques. En

los copolímeros en bloque, cada monómero se encuentra separado por secciones distintas

dentro de la cadena principal, sin embargo, su distribución puede variarse obteniendo

estructuras dibloque (AB) o tribloque (ABA/BAB)[17] [18].

Los copolímeros en bloque son estructuras macromoleculares que poseen segmentos

poliméricos de distinta composición química enlazados covalentemente [19]. Dentro de

esta gama de materiales existen dos estados diferentes, uno desordenado, en donde se

presenta miscibilidad de los segmentos y uno ordenado, que presenta segregación de los

segmentos. En la mayoría de aplicaciones el estado segregado es el más provechoso,

puesto que se establecen dominios entre cada bloque [20]. Dentro de este tipo de

estructuras, se encuentran los copolímeros en bloque anfifílicos que consisten en

segmentos hidrófilos e hidrófobos enlazados covalentemente [21].

Figura 1. Representación de las distintas morfologías de copolímeros en bloque


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20

2.2. Síntesis de copolímeros en bloque anfifílicos

Para predecir y controlar las propiedades de un sistema micelar es importante que los

copolímeros empleados se encuentren bien definidos. La naturaleza del polímero a

sintetizar determinará el método de polimerización más adecuado para usar; dentro de

estos métodos se destacan las polimerizaciones radicalarias vivientes, la polimerización

aniónica y polimerización por apertura de anillo (ROP) [22].

ROP, proporciona uno de los mejores enfoques para sintetizar macromoléculas

biodegradables a partir de compuestos tales como éteres cíclicos, acetales, amidas

(lactamas), esteres (lactonas) y siloxanos [23]. La síntesis de CBA a partir de este método,

garantiza la obtención de materiales con estructura y composición bien definidas.

Alternativamente, estas estructuras poliméricas sintetizadas vía ROP pueden emplearse

en combinación con métodos de síntesis convergentes que permiten la funcionalización de

los materiales con distintas clases de compuestos, por ejemplo, moléculas bioactivas que

mejores las características farmacológicas de los CBA [16] [24].

2.3. Polimerización por apertura de anillo (ROP)

La ROP ha mostrado ser un método eficiente para la síntesis de poliésteres alifáticos con

propiedades específicas y controlables. En este tipo de polimerización es necesario el uso

de un iniciador y de monómeros cíclicos con grupos funcionales que sean susceptibles al

ataque por parte del iniciador [25]. Esta reacción se ve favorecida por la pérdida de tensión

del anillo, aunque en el caso de monómeros cíclicos de seis miembros como la lactida, la

presencia de grupos éster con una conformación planar le confiere mayor tensión al anillo

y por lo tanto la polimerización se ve favorecida [26].

Una gran variedad de monómeros cíclicos se ha polimerizado exitosamente vía ROP,

incluyendo las lactonas [27]; esta versatilidad está dada por su habilidad de proporcionar

materiales con arquitecturas definidas, altos pesos moleculares y pocos subproductos de

reacción. Este tipo de polimerización es favorecida por factores termodinámicos y

cinéticos. Un factor significativo que establece si un monómero cíclico es susceptible de

polimerizarse por esta técnica, es el termodinámico, es decir, si la estructura lineal que

adquiere con la formación del polímero es más estable que el correspondiente monómero

[28].


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21

Dentro de los mecanismos más comunes para sintetizar macromoléculas por ROP, se

encuentran el catiónico, aniónico y de coordinación-inserción, siendo este último el que

presenta mejores resultados a la hora de obtener materiales con altos pesos moleculares

y estructuras bien definidas ya que presentan una menor incidencia de procesos de

terminación y transferencia de cadena intramolecular [22].

2.3.1. Polimerización por apertura de anillo (ROP) de

Coordinación-Inserción

La ROP de coordinación-inserción ha sido investigada recientemente, puesto que permite

la síntesis de poliésteres con arquitectura definida a través de una polimerización “viviente”.

Dentro de sus aplicaciones destacadas se encuentra el diseño de copolímeros en bloque

que se forman por la adición secuencial de un segundo monómero [29].

Este tipo de polimerización también denominada ROP pseudo aniónica, propone que la

propagación procede por la coordinación del monómero con la especie activa, seguida de

la inserción del monómero en el enlace metal-oxígeno por medio del reordenamiento de

electrones. En la figura 2 se muestra el mecanismo general a través del cual ocurre una

ROP de coordinación-inserción [22] [29].

Figura 2. Mecanismo de reacción propuesto para la ROP de coordinación-inserción

Durante la propagación, la cadena que está creciendo permanece unida al metal a través

de un enlace de coordinación que involucra al grupo alcóxido. La reacción termina por

hidrólisis del complejo terminal para formar de grupo hidroxilo terminal. Dentro de los

catalizadores más empleados se destaca el octanoato de estaño (Sn(Oct)2) (figura 3), el

uso amplio de este reactivo se debe a su disponibilidad comercial, alta actividad,

solubilidad en solventes orgánicos, fácil manejo y estar aceptado por la FDA como un

aditivo en alimentos [30].


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22

Figura 3. Estructura química del catalizador octanoato de estaño (Sn(Oct)2)

2.4. Esterificación de Steglich

La esterificación de Steglich es un método de síntesis en el cual un ácido carboxílico

terminal en la molécula reacciona con un activador como la N, N'-diciclohexilcarbodiimida

(DCC) en presencia de una base fuerte como N-(dimetilamino)piridina (DMAP) como

catalizador nucleofílico. En una etapa posterior, el intermedio o-acilúrea formado se hace

reaccionar con un compuesto que posea un grupo hidroxilo primario, bien sea una

molécula de bajo peso molecular o polimérica (figura 4) [31]. La reacción fue descrita por

primera vez en 1978 por Bernhard Neises y Wolfgang Steglich, siendo una adaptación de

un método más antiguo para la formación de amidas empleando DCC como activador [31].

Figura 4. Mecanismo de reacción general para la esterificación Steglich

Generalmente, esta reacción tiene lugar a temperatura ambiente empleando

diclorometano (DCM) como disolvente, por esta razón, es posible obtener esteres a partir

de moléculas sensibles térmicamente e impedidas estéricamente tal como es el caso del

terbutanol [31].


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23

2.5. Micelización de copolímeros en bloque: autoensamblaje

en solución acuosa

El autoensamblaje de CBA en medio acuoso se basa en interacciones hidrofóbicas entre

las cadenas poliméricas formadoras de núcleos lipófilos, el proceso se lleva a cabo por

una ganancia en entropía de las moléculas de solvente a medida que los componentes

hidrofóbicos se retiran de los medios acuosos [32]. El proceso de micelización ocurre

cuando se disuelve el copolímero en un solvente selectivo para uno de los bloques, una

vez superada la concentración micelar crítica (CMC) el copolímero adopta una estructura

tipo “core-shell” y alcanza tamaños entre 10 - 100 nm (figura 5) [33]. Como consecuencia

de esta característica estructural, este tipo de nanopartícula tiene aplicación en la

encapsulación, transporte y liberación de principios activos hidrofóbicos. De manera que

el dominio hidrofóbico se asocia formando el núcleo micelar, zona en la cual se pueden

alojar fármacos hidrofóbicos, mientras que, el dominio hidrofílico forma la corona de la

micela, la cual interacciona con el medio externo proporcionando estabilidad física a las

partículas [34].

Figura 5. Representación del proceso de micelización por el autoensamblaje en medio

acuoso de copolímeros en bloque anfifílicos.

Dentro de las características que determina la micelización de un CBA se encuentra el

valor de su concentración micelar crítica (CMC), dado que es una medida indirecta de la

favorabilidad de la formación de las micelas, que a su vez se relaciona con la estabilidad

coloidal y termodinámica de las estructuras micelares que genera. Cuando un CBA tiene

una concentración inferior a su CMC, se encuentra como unímeros disueltos, solo hasta

que su concentración igual a la CMC se inicia el proceso de micelización, el sistema se

mantiene en equilibrio, lo cual implica que los unímeros que componen la micelas puede

intercambiarse[19]. La determinación de la CMC puede realizarse empleando diferentes


______________________________________________________________________________

24

técnicas, dentro de las más destacadas se encuentran: fluorescencia con pireno [35],

también se ha reportado el uso de dispersión de luz [36], medidas de tensión superficial y

conductividad [37].

2.6. Encapsulación de fármacos

El proceso de encapsulación se basa en la inclusión de un principio activo en una matriz

polimérica, preferiblemente biocompatible y biodegradable. En este sentido, las micelas

poliméricas presentan un alto potencial dada su capacidad de encapsulación, transporte y

liberación de fármacos con baja solubilidad en agua. En el cuerpo humano, estos

materiales poseen la habilidad de incrementar el tiempo de vida medio de los fármacos en

la sangre, reduciendo las dosis efectivas, así como la ocurrencia de efectos secundarios

[38]. En el caso de sustancias hidrófobas, su encapsulación es favorecida por interacciones

hidrofóbicas con el núcleo micelar, siendo factores críticos en el proceso la compatibilidad

del fármaco/polímero, la longitud del bloque hidrofóbico, la concentración del polímero y

su cristalinidad, entre otros [39].

Han sido reportadas diversas metodologías para encapsular fármacos, dentro de las que

se destacan la evaporación de solvente, secado en spray y separación de fases [40]. Los

factores fisicoquímicos que intervienen en la encapsulación de principios son: la longitud

del segmento hidrófobo, la cristalinidad del segmento hidrófobo, la concentración del

copolímero y finalmente la afinidad entre el núcleo micelar y el fármaco [41].

2.7. Liberación controlada de fármacos

La liberación controlada de medicamentos a partir de micelas poliméricas ofrece mayores

ventajas en comparación con otros sistemas de entrega, esto debido a que presentan

mayor eficacia, toxicidad reducida y disminución de los efectos secundarios. Comúnmente,

la liberación de fármacos sucede en tres fases, inicialmente una salida rápida, seguida por

un periodo de liberación lenta y finalmente una liberación acelerada causada por erosión

[42]. La liberación del fármaco se produce por difusión de los poros y por degradación del

copolímero, por acción enzimática o bien por la combinación de los dos mecanismos [43].

Los factores fisicoquímicos que intervienen en la liberación de principios activos son: el

tamaño de las partículas, la porosidad y las longitudes de los segmentos poliméricos [44].


______________________________________________________________________________

25

2.8. Anfotericina B

La Anfotericina B (AmB) es un antifúngico poliénico de amplio espectro comúnmente

empleado para el tratamiento de infecciones fúngicas sistémicas [45]. Es producido

naturalmente por el actinomiceto Streptomyces nodosus, por su estructura química

presenta dos principales propiedades fisicoquímicas: posee comportamiento anfifílico

debido a las cadenas policarbonadas (hidrófobas) y polihidroxiladas (hidrófilas) y

comportamiento anfótero debido a la presencia de grupos carboxilo y amina ionizables

(figura 6) [46].

Figura 6. Estructura química de la anfotericina B (AmB)

Como consecuencia de su naturaleza anfifílica y la asimétrica distribución de los grupos

polares y apolares, la AmB es prácticamente insoluble en la mayoría de solventes acuosos

a pH fisiológico, poco soluble en metanol y etanol y soluble en dimetilsulfóxido (DMSO) y

dimetilformamida (DMF) [47].

Pese a su alta actividad, el uso clínico de AmB es limitado debido a su elevada toxicidad,

que se debe a que a concentraciones superiores a 1 mg/mL forma agregados que se

acomplejan con moléculas de colesterol presentes en las membranas de las células

mamíferas generando canales que ocasionan la salida del contenido citoplasmático y por

como consecuencia la muerte celular [48].

2.8.1. Mecanismo de acción de la AmB La cadena policarbonada de la molécula de AmB actúa uniéndose preferencialmente al

ergosterol de la membrana celular fúngica, lo que promueve un canal transmembrana que

permite la fuga de sustancias celulares esenciales, como iones de potasio, nucleótidos y

aminoácidos. Las interacciones intermoleculares entre los enlaces de hidrogeno de los

grupos hidroxilo, carboxilo y amino estabilizan el canal transmembrana [49]. La pérdida de


______________________________________________________________________________

26

estas sustancias junto con el ingreso de protones al interior de la célula, causa acidificación

del interior fúngico, precipitación del citoplasma y finalmente la muerte del hongo [49] [10].

El ergosterol, es el esterol principal de la membrana celular de los hongos, empleándose

como el blanco de acción del fármaco, sin embargo, la AmB también tiene la capacidad de

unirse al colesterol de las membranas celulares en los mamíferos, esta cualidad es

responsable de su potencial toxico [49][50]. Las propiedades farmacéuticas desfavorables

en el uso de las formulaciones de AmB con desoxicolato de sodio (DNa) (Fungizone®)

están relacionadas con la dosis y la duración del tratamiento (desde 30 hasta 40 días) los

efectos secundarios se manifiestan como nefrotoxicidad y perfusión (fiebre, escalofrío,

náusea, vómito y dolor de cabeza) [51].

2.9. Antecedentes

Los copolímeros basados en PEG y PCL han sido ampliamente estudiados en aplicaciones

biomédicas por ser biocompatibles y biodegradables. Por consiguiente, han sido evaluados

como candidatos promisorios en la encapsulación y liberación de fármacos, estos sistemas

de entrega pueden ser polimerizados a través de diferentes rutas de polimerización, sin

embargo, ROP ha sido una herramienta destacada en estas aplicaciones. Zhang y

colaboradores, reportan la síntesis de copolímeros de injerto basados en PCL-g-PEG

combinando ROP con química click, posterior a la síntesis, los copolímeros se

ensamblaron espontáneamente dando lugar a sistemas micelares con alta capacidad de

carga de sustancias hidrofóbicas [28]. La esterificación de Steglich ha sido estudiada por

Erothu e investigadores, como una alternativa para enlazar polímeros utilizando

condiciones de reacción amigables con el medio ambiente, en su estudio, se muestran las

ventajas de ese enfoque de acoplamiento sobre otros métodos de síntesis, esto se basa,

en la ausencia de catalizadores metálicos sin afectar los rendimientos de reacción [18].

Zhao y colaboradores emplearon ROP aniónica para sintetizar PEG conjugado con

terpenos (mentol, retinol, colesterol y betulina). Estas biomoléculas fueron empleadas

como iniciadores en la polimerización del óxido de etileno, los materiales se sintetizaron

con buenos rendimientos de reacción y baja dispersidad, de esta manera, se considera

que la ruta sintetiza seleccionada puede ser utilizada para obtener otros materiales

biohíbridos con distintas funcionalidades [2]. En un estudio similar, Yildirim e

investigadores, prepararon nanopartículas de poli(D,L-Lactida) y retinol a través de un

enlace éster biodegradable vía ROP, las nanopartículas poliméricas obtenidas por el


______________________________________________________________________________

27

método de nanoprecipitación presentaron tamaños inferiores a 250 nm, estas

nanopartículas podrían ser empleadas en el ataque a adipocitos hepáticos, debido a que

su función es el almacenamiento de grasa, y, por tanto absorberían fácilmente el retinol

[52].

En una investigación previa, Diaz y Pérez, emplearon micelas poliméricas obtenidas a

partir de copolímeros tribloque anfifílicos, compuestos por policaprolactona y

poli(metacrilato de N,N-dimetilamino etilo) (PDMAEMA) con diferentes pesos moleculares

en la encapsulación anfotericina B. Los copolímeros PDMAEMA-b-PCL-b-PDMAEMA

presentaron concentraciones críticas micelares en el rango de 0.9 a 7.0 mg/L, dependiendo

del peso molecular de PCL. Las micelas obtenidas en medio acuoso a pH 6.0 presentaron

estructuras esféricas con tamaños inferiores a 100 nm. Las principales características de

estos sistemas fueron: menor estado de agregación del fármaco, liberación controlada a

lo largo de 170 h presentaron porcentajes de liberación acumulados cercanos al 80 %,

menor actividad hemolítica, pese a todos los aspectos positivos encontrados en esta

formulación, se encontró que los porcentajes de encapsulación de AmB bajos [38]. En una

investigación posterior realizada por Villamil, Parra y Pérez se evaluó el desempeño de

copolímeros de mPEG-b-PCL empleados como vehículos micelares para la entrega de

AmB a través de su conjugación con colesterol, los resultados publicados, revelan que la

molécula de colesterol incrementa la solubilización de AmB en el núcleo de las micelas,

asimismo, la liberación sostenida del medicamento se monitoreo durante 160 h [8].


______________________________________________________________________________

28

3. Objetivo general

Diseñar formulaciones micelares antimicóticas de Anfotericina B a partir de copolímeros

en bloque anfifílicos biodegradables conjugados con colesterol y retinol que reduzcan su

toxicidad y permitan su liberación controlada.

3.1. Objetivos específicos

• Proponer un protocolo para la síntesis de copolímeros anfifílicos compuestos por

policaprolactona y polietilenglicol bioconjugados con colesterol y retinol del tipo AB

y ABA.

• Establecer relaciones entre propiedades tales como concentración micelar crítica,

tamaño y estabilidad de los sistemas micelares con la composición y estructura de

los copolímeros en bloque anfifílicos usados como precursores.

• Evaluar la capacidad de los sistemas micelares obtenidos para solubilizar

anfotericina B, su liberación controlada y el efecto sobre su agregación.


______________________________________________________________________________

29

4. Diseño metodológico

El presente trabajo de investigación fue llevado a cabo en tres etapas. En la primera, se

sintetizaron copolímeros dibloque y tribloque de polietilenglicol y policaprolactona

bioconjugados con colesterol y retinol. Posteriormente, en la segunda se evaluó su

autoensamble en medio acuoso para formar micelas poliméricas y se estudió el efecto de

la estructura sobre las propiedades coloidales. Finalmente, en la tercera etapa se realizó

la solubilización de AmB en el núcleo micelar, se efectuaron ensayos de liberación

controlada y, por último, se evaluó el efecto de agregación en la formulación micelar

antimicótica.

Figura 7. Esquema general del diseño metodológico de la investigación

Materiales

La -caprolactona ( -CL) (98%) se adquirió comercialmente de Sigma-Aldrich y se secó

sobre hidruro de calcio (CaH2) durante 48 h. El tolueno se secó por destilación reactiva con

sodio empleando benzofenona como indicador de humedad, el solvente seco fue

almacenado sobre tamices moleculares de 3 Å. El metoxi polietilenglicol (mPEG) con peso

molecular de 5 kDa y polietilenglicol (PEG-diol) con peso molecular de 6 kDa se secaron

empleando destilación azeotrópica con tolueno seco. El etilhexanoato de estaño (II)


______________________________________________________________________________

30

(Sn(Oct)2) (95%) se secó sobre tamices moleculares durante 48 h. Los demás reactivos:

colesterol (≥ 99%), retinol (≥ 95%), diclorometano (DCM), anhidrido succínico (≥ 99%), N’N-

Diciclohexilcarbodiimida (DCC), 4-(Dimetilamino) piridina (DMAP) y trietilamina (TEA),

fueron suministrados por Sigma-Aldrich y usados sin purificación adicional.

4.1. Síntesis de copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA

bioconjugados con colesterol y retinol

Se sintetizaron copolímeros anfifílicos del tipo AB y ABA empleando la combinación de

métodos sintéticos como ROP y esterificación de Steglich. En la primera etapa, la -CL se

polimerizó vía ROP empleando como iniciadores mPEG para copolímeros tipo AB y PEG-

diol para copolímeros tipo ABA siendo A el segmento hidrofóbico y B el segmento

hidrofílico. Asimismo, en los bioconjugados con colesterol, la molécula terpénica fue quien

dio inicio a la ROP de -CL al ser térmicamente estable. Posteriormente, todos los

materiales obtenidos por ROP fueron carboxilados por un método tradicional utilizando

anhídrido succínico. Finalmente, la esterificación de Steglich fue realizada con el fin de

obtener los copolímeros bioconjugados con colesterol y retinol.

Los materiales de mPEG-b-PCL-OH y HO-PCL-b-PEG-b-PCL-OH con diferente longitud

de -caprolactona (1,5 kDa y 3,0 kDa) usados como precursores de la bioconjugación con

terpenos se emplearon como copolímeros blancos con la finalidad de determinar la

capacidad que presentan los terpenos en la encapsulación y liberación controlada de AmB.

En la tabla 1 se describen las condiciones experimentales llevadas a cabo.


______________________________________________________________________________

31

Tabla 1. Condiciones de reacción de los copolímeros anfifílicos bioconjugados con

terpenos vía ROP y esterificación de Steglich.

Muestra

Polimerización por apertura de

anillo (ROP) Esterificación de Steglich

Copolímero

obtenido Iniciador

Relación

molar

(mmol)a

Mn PCL

teórica

(kDa)

Alcohol

(OH)

Ácido carboxílico

(COOH)

Relación

molar

(mmol)b

COP-

RET1

PEG-diol 6

kDa (0,5:0,6:7,9) 1,5 RET

HOOC-PCL-b-

PEG-b-PCL-

COOH

(2:5:1:6) RET-PCL-b-PEG-b-

PCL-RET

COP-

RET2

mPEG 5

kDa (0,6:0,6:7,9) 1,5 RET

mPEG-b-PCL-

COOH (2:5:1:6) mPEG-b-PCL-RET

COP-

COL1 COL (2,6:1,3:36) 1,5

PEG-

diol 6

kDa

COL-b-PCL-

COOH (5:2:1:6)

COL-PCL-b-PEG-

b-PCL-COL

COP-

COL2 COL (2,6:1,3:72) 3,0

PEG-

diol 6

kDa

COL-b-PCL-

COOH (5:2:1:6)

COL-PCL-b-PEG-

b-PCL-COL

COP-

COL3 COL (2,6:1,3:36) 1,5

mPEG 5

kDa

COL-b-PCL-

COOH (2:5:1:6) mPEG-b-PCL-COL

COP-

COL4 COL (2,6:1,3:72) 3,0

mPEG 5

kDa

COL-b-PCL-

COOH (2:5:1:6) mPEG-b-PCL-COL

B1 PEG-diol 6

kDa (0,5:0,6:7,9) 1,5 - - -

HO-PCL-b-PEG-b-

PCL-OH

B2 mPEG 5

kDa (0,6:0,6:7,9) 1,5 - - - mPEG-b-PCL-OH

B3 PEG-diol 6

kDa (0,5:0,6:16) 3,0 - - -

HO-PCL-b-PEG-b-

PCL-OH

B4 mPEG 5

kDa (0,6:0,6:16) 3,0 - - - mPEG-b-PCL-OH

aRelaciones molares ROP: (Iniciador:Sn(Oct)2:-CL)

bRelaciones molares esterificación Steglich: (COOH:OH:DCC:DMAP)

4.1.1. Protocolos de síntesis

Polimerización por apertura de anillo (ROP):

Todas las polimerizaciones vía ROP se llevaron a cabo en condiciones anhidras,

empleando un balón de fondo redondo de dos bocas como reactor, la temperatura se


______________________________________________________________________________

32

mantuvo a 115 °C bajo atmosfera de argón, se usó tolueno seco como disolvente y

agitación magnética continua durante 24 h. Para la síntesis de segmentos de PCL, la -

CL se polimerizó vía ROP iniciada por mPEG, PEG-diol o colesterol, para obtener pesos

moleculares de PCL Mn de 1,5 kDa y 3,0 kDa. En un procedimiento característico para la

síntesis de copolímeros dibloque tipo AB de mPEG-b-PCL-OH, el iniciador mPEG (0,6

mmol) se disolvió en tolueno seco, seguido por la adición del catalizador Sn(Oct)2 (0,6

mmol) bajo atmosfera de argón. Después de diez minutos, se añadió -CL (7,9 mmol) para

obtener PCL de 1,5 kDa [29]. Terminada la reacción, los productos crudos se purificaron

por cromatografía en columna usando alúmina básica como fase estacionaria, seguido por

tres precipitaciones sucesivas con un exceso de hexano frio, finalmente, los materiales

fueron secados aplicando presión reducida a temperatura ambiente.

Carboxilación de copolímeros terminados en PCL-OH:

Los materiales poliméricos con grupos terminales hidroxilo fueron modificados para

obtener ácidos carboxílicos empleando esterificación con anhidrido succínico, tomando

como referencia el método reportado por Yoon y colaboradores [53]. Brevemente, el

mPEG-b-PCL-OH (5 mmol) y el anhidrido succínico (6 mmol) se colocaron en un balón

fondo plano y se disolvieron en cloroformo, posteriormente, se añadió DMAP (6 mmol) y

TEA (6 mmol), la reacción transcurrió con agitación continua durante 24 h, bajo atmosfera

de argón a temperatura ambiente. Finalmente, la mezcla de reacción fue filtrada, el

producto final se obtuvo precipitado dos veces sucesivas con un exceso de éter etílico y

secando al vacío durante 4 h.

Esterificación de Steglich:

Los materiales carboxilados (2 - 5 mmol; ver tabla 1) y el DCC (1 mmol) fueron disueltos

en DCM y agitados magnéticamente a 500 rpm durante 30 min, a continuación, se añadió

el DMAP (6 mmol) y la correspondiente sustancia hidroxilada (retinol o PEG) (2 - 5 mmol;

ver tabla 1). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente y en oscuridad durante

6 h (retinol) y 24 h (PEG) [54]. El producto se filtró para remover el subproducto de

diciclohexilurea. Los copolímeros se disolvieron en DCM y se precipitaron con un exceso

de éter etílico, el solvente residual fue removido bajo presión reducida para obtener los

copolímeros bioconjugados con retinol y se almacenaron a 6°C en oscuridad, los

copolímeros bioconjugados con colesterol se almacenaron a temperatura ambiente.


______________________________________________________________________________

33

4.2. Caracterización de los copolímeros anfifílicos

bioconjugados tipo AB y ABA

La caracterización de los copolímeros anfifílicos obtenidos se llevó a cabo a través de

diferentes técnicas descritas a continuación:

• Espectroscopia infrarroja por Transformada de Fourier: Los análisis de FTIR,

se realizaron en un equipo Shimadzu IR Prestige 21 FTIR, utilizando 2 mg de cada

copolímero y se disolvieron en CHCl3, para la medición se empleó una ventana de

NaCl sobre la cual se depositó la película de copolímero.

• Resonancia Magnética Nuclear de protón: las mediciones de RMN1H se llevaron

a cabo a temperatura ambiente para los biocopolímeros de COL y a temperatura

≤6 ºC para los biocopolímeros de RET, en un espectrofotómetro Bruker 400

Ultrashield operado a 400 MHz. Aproximadamente 20 mg de los copolímeros se

disolvieron en CDCl3, los desplazamientos químicos () fueron expresados en

partes por millón (ppm) con respecto a la señal del disolvente.

• Cromatografía de permeación en gel: los análisis de GPC se realizaron en un

equipo Merck Hitachi D-6000, con un detector de índice de refracción LaChrom L-

7490 y una bomba L-6000A. Se utilizó THF grado HPLC como eluyente a un flujo

de 0,8 mL/min empleando una columna 00H-0444-K0. Para obtener la curva de

calibración relativa se usaron estándares de poliestireno.

• Calorimetría Diferencial de Barrido: Las propiedades térmicas de los materiales

poliméricos se analizaron empleando un calorímetro diferencial de barrido (DSC)

Mettler Toledo DSC 1 STAR System, el método empleado se configuró de la

siguiente manera: primero, se borró su historial térmico calentando desde 30 °C

hasta 100 °C a 10 °C/min; después, se realizó una isoterma durante 5 min; seguido,

las muestras fueron enfriadas hasta -20 °C a 10 °C/min; esta temperatura se

mantiene durante 5 min; finalmente, se calienta desde – 20 °C hasta 120 °C a 10

°C/min.


______________________________________________________________________________

34

• Espectrofotometría UV-Vis: la presencia de unidades de retinol en los CBA (COP-

RET1 y COP-RET2) fue adicionalmente evaluada empleando un espectrofotómetro

Evolution 300 UV/VIS. El retinol y los COP-RET se disolvieron en diclorometano a

una concentración de 0,2 mg/mL (COP-RET) y 0,02 mg/mL (retinol).

Posteriormente se registraron espectros UV-Vis de barrido desde 250 nm hasta

400 nm.

4.3. Estudio de las relaciones entre las propiedades coloidales

de las micelas y los copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA

En esta etapa, se prepararon sistemas micelares en medio acuoso a partir del

autoensamblaje de los copolímeros anfifílicos, empleando el método de nanoprecipitación

[3], de acuerdo con el cual, 20 mg del copolímero se disolvieron en 2,5 mL de acetona; la

solución resultante fue goteada lentamente bajo agitación constante sobre 5 mL de agua;

el cosolvente se removió por evaporación a presión reducida y bajo agitación constante

durante 24 h. Asimismo, se estudiaron las propiedades coloidales de las micelas a través

de diferentes técnicas analíticas:

4.3.1. Determinación de la concentración micelar crítica (CMC)

La concentración micelar critica de los copolímeros anfifílicos se determinó mediante

espectrofotometría de fluorescencia utilizando pireno como molécula hidrófoba de prueba

[35] [55]. Para el cual sus características optoelectrónicas dependerán de la polaridad del

medio en que se encuentre. Dicha polaridad se modificará crecientemente con la

concentración de copolímero que se disponga en el medio; cuanta más concentración del

copolímero, el pireno se instalará en mayor medida en los núcleos hidrófobos de las

micelas lo que generara mayor emisión de fluorescencia. los espectros de excitación

fueron tomados en un fluorómetro PTI-710. Brevemente, se prepararon soluciones

micelares con varias concentraciones de cada copolímero (0,01; 0,1; 0,5, 1,0; 5,0; 10,0;

30,0; 50,0; 70,0; 100,0 y 1000,0 mg/L) y una concentración fija de pireno de 0.02 μM, todas

las disoluciones fueron preparadas con agua desionizada. Se midieron espectros de

excitación para el pireno desde 300 nm hasta 360 nm y se monitorearon a 390 nm. La


______________________________________________________________________________

35

CMC se determinó mediante la relación de intensidades a dos longitudes de onda (I335/I332)

frente a la concentración expresada como logaritmo.

4.3.2. Caracterización de los sistemas micelares

La caracterización de las micelas se llevó a cabo empleando:

• Dispersión dinámica de luz (DLS): los diámetros hidrodinámicos (Dh) de las

partículas se midieron tanto para las micelas sin AmB como a las micelas cargadas

con el fármaco, las muestras fueron diluidas hasta una concentración de 0,5

mg/mL, los análisis fueron realizados a dos temperaturas (25 y 37 ºC) en un equipo

DLS, Litesizer 500, Anton Paar.

• Potencial zeta: esta técnica brindará información sobre la carda superficial de las

micelas poliméricas y por ende su estabilidad, para ello, se empleará el método de

movilidad electroforética. Las medidas de potencial zeta fueron realizadas en

solución acuosa de las micelas sin carga de fármaco a una concentración de 0,5

mg/mL, empleando un equipo DLS, Litesizer 500, Anton Paar

• Microscopia electrónica de transmisión (TEM): la morfología de las dispersiones

micelares se observó con un microscopio electrónico de transmisión Jeol 1400

Plus. Las muestras se prepararon diluyéndose hasta una concentración de 0,1

mg/mL y posteriormente se dejaron caer 5 μL de la solución micelar sobre el grid

(rejilla de cobre recubierta con una película de formvar) las cuales se dejaron

secar durante 48 h.

4.4. Encapsulación de anfotericina B, liberación controlada y

efecto sobre su agregación

4.4.1. Encapsulación de AmB

Las micelas cargadas con AmB se prepararon de acuerdo con el método de evaporación

de solvente [56]. Inicialmente, se prepararon dispersiones micelares pesando 20 mg de


______________________________________________________________________________

36

cada copolímero disuelto en 25 mL de agua desionizada (concentración del copolímero

0.8 mg/mL). Paralelamente, se disolvieron 5 mg de AmB en 5 mL de metanol, esta solución

fue adicionada gota a gota a las dispersiones micelares. La mezcla resultante se dejó bajo

agitación constante durante 48 h. Por último, la AmB no incorporada en el núcleo micelar

se removió por centrifugación a 13000 rpm durante 15 min. La concentración de AmB

solubilizada en el núcleo de las micelas fue cuantificada por espectrofotometría UV-Vis a

una longitud de onda de 406 nm.

Figura 8. Representación esquemática de la encapsulación de AmB

4.4.2. Estudio de liberación controlada de AmB

La cinética de liberación controlada de las formulaciones antimicóticas de AmB fue

estudiada in vitro empleando el método de diálisis [56]. El estudio se realizó empleando 10

mL de un medio de liberación constituido por deoxicolato de sodio al 0,5% y dimetil

sulfóxido (DNa:DMSO 2:1) que proporciono “sink conditions”. La diálisis de AmB se realizó

utilizando membranas de diálisis MWCO de 10 kDa, las cuales fueron activadas por

agitación en agua desionizada (conductividad <0.1 μS/cm) durante 5 min. En un microtubo

con tapa rosca de 5 mL se dispuso 3 mL de las dispersiones micelares cargadas con AmB,

en la parte inferior del tubo se ubicó la membrana y se selló permitiendo el contacto con el

medio de liberación. Las muestras se mantuvieron bajo agitación constante (200 rpm) con

control de temperatura a 37 ºC. Durante diferentes tiempos (1, 2, 3, 4, 5, 6, 24, 48, 72 y 96

h) se tomó una alícuota de 1mL para analizar la concentración de AmB liberada por UV-


______________________________________________________________________________

37

Vis a una longitud de onda de 406 nm, el volumen del medio de liberación se mantuvo

constante reconstituyendo con la misma alícuota tomada para la lectura.

Figura 9. Representación esquemática de la liberación controlada de AmB

Cuantificación de AmB encapsulada y liberada por espectrofotometría UV-

Vis

La cuantificación de AmB encapsulada en las micelas y liberada fueron realizadas

empleando un espectrofotómetro UV-Vis. Para ello, se realizó una curva de calibración de

AmB a diferentes concentraciones (0.1; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 4.0 y 5.0 mgAmB/L). Se realizó

un barrido desde 300 nm hasta 450 nm, obteniéndose una longitud de onda de máxima

absorción a 406 nm, la cual se seleccionó para los análisis posteriores.

Para conocer el contenido del fármaco en cada una de las formulaciones se empleó la

siguiente ecuación:

𝐶𝑜𝑛𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑒 𝐴𝑚𝐵 = 𝑚𝑔 𝐴𝑚𝐵 𝑒𝑛 𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑖𝑐𝑒𝑙𝑎𝑠

𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑝𝑜𝑙𝑖𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑢𝑠𝑎𝑑𝑜 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 × 100 (1)

Asimismo, se calculó la eficiencia de la encapsulación empleando la siguiente

ecuación:

𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑐𝑎𝑝𝑠𝑢𝑙𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 = 𝑚𝑔 𝐴𝑚𝐵 𝑒𝑛 𝑙𝑎𝑠 𝑚𝑖𝑐𝑒𝑙𝑎𝑠

𝑚𝑔 𝐴𝑚𝐵 𝑢𝑠𝑎𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑝𝑟𝑒𝑝𝑎𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛× 100 (2)


______________________________________________________________________________

38

Por su parte, la AmB liberada se cuantifico utilizando la curva de calibración descrita

anteriormente, se tomaron alícuotas de la solución de liberación (DNa:DMSO 2:1) a

diferentes tiempos. Los resultados se expresaron en mg/L y en porcentaje de liberación.

4.4.3. Estado de agregación de AmB

Para determinar el estado de agregación en las formulaciones antimicóticas de AmB, se

prepararon soluciones de AmB a una concentración de 10 mg AmB/L en dimetil sulfóxido

(DMSO) y en buffer de fosfato salino (PBS) pH 7.4 unidades (la solución de PBS contenía

1%v/v de DMSO). De la misma manera, se obtuvieron soluciones de las formulaciones

micelares a la misma concentración. Posteriormente se registraron espectros UV-Vis de

barrido de todas las muestras desde 300 nm hasta 450 nm utilizando un espectrofotómetro

Evolution 300 UV/VIS. Para conocer el estado de agregación se analizó la relación de

absorbancia del primer (I) y cuarto pico (IV) en el espectro UV-Vis se tomó como parámetro

semicuantitativo [56].


______________________________________________________________________________

39

5. Resultados y discusión

5.1. Síntesis de los copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA

bioconjugados con colesterol y retinol

La polimerización de los materiales, mPEG-b-PCL-COL, COL-PCL-b-PEG-b-PCL-COL,

mPEG-b-PCL-RET y RET-PCL-b-PEG-b-PCL-RET, con diferente longitud de segmento

hidrofóbico, se llevó a cabo mediante el empleo de tres métodos sintéticos, en su orden,

polimerización por apertura de anillo (ROP), carboxilación empleando anhidrido succínico

y finalmente esterificación de Steglich. Inicialmente, se sintetizó una serie de copolímeros

dibloque y tribloque de mPEG-b-PCL, PCL-b-PEG-b-PCL y COL-PCL. Para ello, se

polimerizó -CL por medio de ROP para obtener PCL con pesos moleculares de 1,5 kDa y

3,0 kDa, en esta etapa de síntesis se empleó mPEG, PEG o COL como iniciadores de la

polimerización y Sn(Oct)2 como catalizador (Figura 10).

Figura 10. Representación esquemática de la ROP iniciada por COL (a) e iniciada por

mPEG (b)

Posteriormente, se carboxilarón los materiales obtenidos por ROP empleando anhidrido

succínico como se muestra a continuación (Figura 11):


______________________________________________________________________________

40

Figura 11. Representación esquemática de la carboxilación de los materiales para COL

(a) y para RET (b)

Finalmente, a través de esterificación de Steglich se bioconjugarón los copolímeros con

mPEG o PEG-diol en el caso de copolímeros de COL y de la manera análoga la

esterificación de los bioconjugados con RET empleo el terpeno como molécula hidroxilada

(Figura 12). El primer paso de la reacción implica la activación del ácido carboxílico por

medio del acoplamiento con DCC, lo que conduce a la formación de un éster intermedio,

en esta etapa el alcohol puede realizar un ataque nucleofílico al carbonilo activado

terminando en la formación del éster, sin embargo, una variación de la reacción incluye el

uso de DMAP para minimizar la formación del subproducto de acilo improductivo en la

reacción (reorganización del intermediario O-acilo a una N-acilurea donde ya no sería

posible el ataque nucleofílico del alcohol). Las reacciones en las que se emplea un exceso

de DMAP, consisten en la formación de un intermedio acilpiridinio el cual reacciona con el

alcohol formando el compuesto esterificado y regenerando el DMAP [57].


______________________________________________________________________________

41

Figura 12. Representación esquemática de la esterificación de Steglich de los materiales

para COL (a) y para RET (b)

Bajo este protocolo de síntesis se obtuvieron copolímeros del tipo AB (mPEG-b-PCL-

Terpeno) y tipo ABA (Terpeno-PCL-b-PEG-b-PCL-Terpeno) con diferentes grados de

polimerización (Xn), controlando los parámetros de síntesis como, por ejemplo: la longitud

del segmento de PCL de 1,5 kDa y 3,0 kDa, tiempos de reacción, temperaturas de reacción

y relaciones molares de los reactivos, entre otros. Los copolímeros obtenidos se analizaron

por espectroscopia FTIR y RMN1H para caracterizar la estructura química de cada material;

DSC para identificar sus propiedades térmicas, GPC para conocer la distribución de pesos

moleculares y finalmente se realizó espectrofotometría UV-Vis a los CBA bioconjugados

con retinol. Los resultados obtenidos se muestran a continuación:

5.1.1. Espectroscopia infrarroja por Transformada de Fourier

(FTIR)

En las figuras 13 y 14, se muestran los espectros vibracionales obtenidos por FTIR de los

copolímeros COP-COL1 y COP-RET1. Estos espectros confirman la presencia de los

principales grupos funcionales en los copolímeros resultantes y sus precursores.

Inicialmente el PEG, presenta la banda correspondiente al estiramiento del grupo éter C–

O–C a 1100 cm−1, asimismo, se identifican las vibraciones debidas al estiramiento del

grupo metileno -CH2 en 2865 cm-1. En los espectros de PEG-b-PCL, aparece la banda de

absorción acentuada característica del estiramiento del grupo éster (C=O) a 1725 cm-1,

correspondiente a la señal intensa del grupo carbonilo. Por su parte, los biohíbridos

conjugados con retinol presentan las bandas entre 1610 y 1555 cm-1 debidas a los

estiramientos de C=C presentes en las insaturaciones de la cadena isoprenoide, además,

se observa el estiramiento C-H de los grupos metilo que aparece a 2927 cm-1. En tanto,


______________________________________________________________________________

42

los biohíbridos que contienen colesterol, no mostraron señales características, debido a

que solo poseen un solo grupo alqueno, el cual se caracteriza por una banda débil y por

ende dada su abundancia relativa en el copolímero no es observada.

Figura 13. Espectro FTIR del copolímero anfifílico tipo ABA COP-COL1

Figura 14. Espectro FTIR del copolímero anfifílico tipo ABA COP-RET1


______________________________________________________________________________

43

5.1.2. Resonancia magnética nuclear protónica (RMN1H)

Con el fin de facilitar la determinación estructural de los materiales poliméricos, la

composición y el peso molecular (Mn), se empleó espectroscopia RMN1H. Los espectros

representativos de los copolímeros purificados de COP-COL1 y COP-RET1 se presentan

en las figuras 15 y 16, respectivamente, en los cuales se pueden observar las señales

debidas a las secuencias de los monómeros y terpenos; ambos espectros presentan las

señales características de los grupos metileno (-CH2-) de la PCL ( ~ 2,32; 1,65; 1,40 y

4,08 ppm) y también la señal debida a los grupos -CH2CH2O- del PEG ( ~ 3,65 ppm),

igualmente, la señal de los grupos -CH3-O ( ~ 3,35 ppm) para el caso del mPEG. Además

de la copolimerización base de PEG-b-PCL, los espectros RMN1H obtenidos por

bioconjugación con terpenos revelaron la inserción de la molécula terpénica en la

estructura del polímero. En consecuencia, el espectro RMN1H de COP-RET1 fue obtenido

del copolímero almacenado bajo refrigeración (≤6 °C), la bioconjugación con retinol se

distingue por las señales asignadas a los dobles enlaces conjugados ( ~ desde 5,47 a

6,75 ppm). Por su parte, el espectro de COP-COL1, revela la señal correspondiente a los

protones del grupo -CH3 a ~ 0,70 ppm.

Figura 15. Espectro RMN1H del copolímero anfifílico tipo ABA COP-COL1 en CDCl3.


______________________________________________________________________________

44

En consecuencia, el espectro RMN1H de COP-RET1 fue obtenido del copolímero

almacenado bajo refrigeración (≤6 °C), la bioconjugación con retinol se distingue por las

señales asignadas a los dobles enlaces conjugados ( ~ desde 5,47 a 6,75 ppm). Por su

parte, el espectro de COP-COL1, revela la señal correspondiente a los protones del grupo

-CH3 a ~ 0,70 ppm.

Figura 16. Espectro RMN1H del copolímero anfifílico tipo ABA COP-COL1 en CDCl3

A partir de los espectros RMN1H, se determinó la composición, la longitud de PCL y el peso

molecular (Mn) de los copolímeros a través de la integración de las señales. Por

consiguiente, se tomó como referencia la intensidad de las señales de los picos

característicos de PEG ( ~ 3,65 ppm) y PCL ( ~ 2,3 ppm). El peso molecular promedio

en número (Mn) de los copolímeros y el grado de polimerización (Xn) de la -CL se calculó

teniendo en cuenta la ecuación 3 y 4:

𝑀n = MnPEG + (PMCL × XnCL) + PMSucc + PMT (3)

𝑋𝑛𝐶𝐿 = 𝑀𝑛 𝑃𝐶𝐿

𝑃𝑀 𝐶𝐿 (4)

Donde, MnPEG es el peso molecular promedio en número del PEG o mPEG, XnCL es el

grado de polimerización de la -CL, PMSucc es el peso molecular del anhidrido succínico,

PMT es el peso molecular del terpeno correspondiente, MnPCL es el peso molecular


______________________________________________________________________________

45

promedio en número obtenido después de la polimerización y PMCL es el peso molecular

del monómero -CL.

Los resultados de las características de los copolímeros bioconjugados calculadas por

RMN1H se presentan en la tabla 2.

Tabla 2. Características de los copolímeros mPEG-b-PCL-Terpeno y Terpeno-PCL-b-

PEG-b-PCL-Terpeno

Muestra Composición promedio Xn

-CL

Mn

(kDa)a Mw/Mn

b Conversión (%)

COP-RET1 RET-(PCL)9-(PEG)97-

(PCL)9-RET 9,3 8,8 1,29 71

COP-RET2 (mPEG)80-b-(PCL)11-RET 11,2 6,6 1,24 86

COP-COL1 COL-(PCL)9-(PEG)97-

(PCL)9-COL 9,2 9,0 1,34 72

COP-COL2 COL-(PCL)18-(PEG)97-

(PCL)18-COL 17,9 11,1 1,37 71

COP-COL3 (mPEG)80-(PCL)10-COL 9,8 6,6 1,57 76

COP-COL4 (mPEG)80-(PCL)19-COL 18,7 7,6 1,58 73

B1 HO-(PCL)9-(PEG)97-

(PCL)9-OH 9,2 9,0 1,13 72

B2 (mPEG)80-(PCL)10-OH 9,8 6,6 1,20 76

B3 HO-(PCL)18-(PEG)97-

(PCL)18-OH 17,9 11,1 1,10 71

B4 (mPEG)80-(PCL)19-OH 18,7 7,6 1,14 73

a Calculado por RMN1H b Determinado por GPC

5.1.3. Cromatografía de permeación en gel (GPC)

Con el fin de conocer la distribución de peso molecular y el índice de dispersión (Mw/Mn)

de los copolímeros obtenidos se realizaron mediciones empleando GPC. Los índices de

dispersión se observan en la tabla 2, los valores de Mw/Mn obtenidos en los CBA son bajos,

encontrándose valores desde 1,10 en los copolímeros blanco hasta 1,58 en los CBA con

entidades terpénicas enlazadas; los índices de dispersión revelaron valores cercanos a la

unidad, con lo que se afirma el control durante la polimerización, característica distintiva

de la síntesis mediante ROP [58].


______________________________________________________________________________

46

Las curvas GPC obtenidas se muestran en la figura 17, observándose una distribución

unimodal. Adicionalmente, en los CBA bioconjugados ocurre un corrimiento de la señal a

menores tiempos de retención con respecto a los materiales precursores, lo cual es indicio

del proceso de copolimerización.

Figura 17. Curvas GPC de los CBA con unidades de retinol (A) y con unidades de colesterol (B)

5.1.4. Calorimetría diferencial de barrido (DSC)

Mediante la caracterización por calorimetría diferencial de barrido (DSC), se estableció el

efecto de las propiedades térmicas y morfológicas en la bioconjugación de los copolímeros

PEG-b-PCL con terpenos. En primer lugar, se borró la historia térmica calentando desde

30 °C hasta 100 °C, en seguida, se realizó un enfriamiento hasta -20 °C con una velocidad

de 10 °C/min con la finalidad de estudiar el comportamiento cristalino (figura 18A). Por su

parte, el calentamiento desde –20 °C hasta 120 °C indico la fusión de los materiales (Figura

18B). En las curvas DSC obtenidas, se observa que la caracterización térmica del PEG-

diol de 6 kDa mostro un pico de cristalización a 36,7 °C y un pico de fusión a 64,0 °C, el

alto grado de cristalinidad, obedece al plegado de los grupos éter presentes en la


______________________________________________________________________________

47

estructura que le confiere flexibilidad [59]. En la unión covalente con PCL, se observa un

comportamiento unimodal dado que los picos de cristalización se encuentran

superpuestos, esto sugiere, que la corta longitud de la cadena PCL comparada con las

unidades de PEG no generan un cambio térmico en la cristalinidad del PEG-b-PCL, como

si el dominio PCL no coexistiera [8].

Figura 18. Termogramas DSC de materiales poliméricos A. enfriamiento de 100 ° C

hasta -20 °C a 10 °C/min y B. calentamiento de -20 °C hasta 120 °C a 10 °C/min

En relación con los polímeros bioconjugados que presentan moléculas de terpeno en su

estructura, se muestra que la cristalinidad de los copolímeros disminuyó. En este sentido,

para el copolímero COP-RET1, se muestra una menor cristalización a una temperatura de

a 15,0 °C. En contraste, el COP-COL1 también redujo la cristalización del material a una

temperatura de 23,7 °C, además, la bioconjugación con COL evidencia la separación de

dominios, donde el PEG y PCL forman cristales independientes, de manera que, la

inserción de la moléculas de terpeno en la estructura al ser moléculas con mayor rigidez

reducen la movilidad de los segmentos [33]. La tabla 3 resume las propiedades térmicas

obtenidas en los materiales poliméricos.


______________________________________________________________________________

48

Tabla 3 Propiedades térmicas de los copolímeros mPEG-b-PCL-Terpeno y Terpeno-PCL-

b-PEG-b-PCL-Terpeno

Muestra Composición promedio Temperatura

fusión (°C)

Temperatura

cristalización

(°C)

Entalpia de

cristalización

(J/g)

COP-RET1 RET-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-RET 46,7 15,0 48,2

COP-RET2 (mPEG)80-b-(PCL)11-RET 36,7 7,7 15,2

COP-COL1 COL-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-COL 51,0 23,7 96,0

COP-COL2 COL-(PCL)18-(PEG)97-(PCL)18-COL 54,0 33,7 98,3

COP-COL3 (mPEG)80-(PCL)10-COL 49,7 29,3 90,8

COP-COL4 (mPEG)80-(PCL)19-COL 45,3 29,3 92,5

B1 HO-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-OH 45,3 29,3 71,1

B2 (mPEG)80-(PCL)10-OH 54,0 29,3 110,7

B3 HO-(PCL)18-(PEG)97-(PCL)18-OH 49,7 29,3 92,9

B4 (mPEG)80-(PCL)19-OH 54,0 29,3 97,4

5.1.5. Espectrofotometría UV-Vis

El especto UV-Vis del retinol y el CBA bioconjugado con retinol (COP-RET1 y COP-RET2)

en diclorometano se muestra en la figura 19. La absorbancia máxima del retinol es

observada a máx = 331 nm (amarillo), por su parte los COP-RET mostraron una señal con

menor absorbancia a una longitud de absorción máxima de 325 nm. Este pequeño

desplazamiento hacia el azul puede estar relacionado con la agregación o isomerización

del retinol en el copolímero, sin embargo, estos resultados aportan certeza sobre la

presencia del terpeno en la estructura del copolímero.


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49

Figura 19. Espectro UV-Vis del retinol y los CBA bioconjugados con retinol

5.2. Estudio de las relaciones entre las propiedades coloidales

de las micelas y los copolímeros anfifílicos tipo AB y ABA

Sistemas coloidales de micelas fueron preparados por el autoensamblaje en medio acuoso

de los copolímeros bioconjugados, para ello, se empleó el método de nanoprecipitación

goteando solución de acetona-copolímero sobre agua. Este método es conveniente dado

que favorece la formación de MP con una distribución de tamaño estrecha, es sencillo y

rápido [60].

En el caso de las dispersiones micelares en medio acuosas, uno de los bloques debe ser

hidrófilo, proporcionando la afinidad de las micelas en medio acuoso. En este estudio, se

seleccionó PEG como dominio hidrófilo por su biocompatiblidad, biodegradabilidad y

aprobación de la FDA en aplicaciones biomédicas [61]. Estudios previos, han demostrado

que la longitud de los segmentos de PEG está relacionada con el comportamiento

fisiológico in vivo. De tal modo que longitudes cortas de PEG han presentado una mayor

captación celular, por el contrario, cuando se presentan longitudes de PEG largas, la

interacción con proteínas disminuye [62]. Por este motivo, se han seleccionado PEG y

mPEG con pesos moleculares de 6 kDa y 5 kDa, respectivamente, para proporcionar

segmentos hidrofílicos largos que permitan ser empleados eficientemente como sistemas

de liberación controlada de fármacos hidrófobos, aumentando así los tiempos de

circulación en el cuerpo, con baja captación celular y liberación a nivel plasmático.


______________________________________________________________________________

50

5.2.1. Determinación de la concentración micelar critica (CMC)

La concentración micelar critica (CMC), además de constituir una evidencia importante del

autoensamblaje de los copolímeros en el medio acuoso, es un parámetro que proporciona

información sobre la estabilidad de las micelas [63]. Los valores de CMC altos, son poco

deseables debido a que las micelas formadas pueden disociarse después de ser

administradas en el cuerpo. Sin embargo, se ha demostrado que las micelas de

copolímeros en bloque exhiben bajas CMC, ello implica que el equilibrio entre unÍmeros y

agregados micelares se alcanza a concentraciones inferiores, usualmente cercanas a 1

µg/mL, dependiendo de las características químicas de los segmentos que lo componen y

su longitud, así como la arquitectura del copolímero [64].

En este trabajo, la formación de micelas poliméricas se monitoreo empleando fluorescencia

con pireno como molécula de prueba. Este hidrocarburo aromático policíclico ha sido

ampliamente utilizado para sensar la polaridad en sistemas micelares, la naturaleza

hidrofóbica de esta molécula conduce a su preferencia para ubicarse en el interior de las

micelas, dando como resultado, una fluorescencia intensa bajo un entorno hidrófobo,

mientras que en un entorno hidrófilo su intensidad es débil [33].

Con el fin de llevar a cabo la medida, se tomó el espectro de excitación de pireno

monitoreado a una longitud de onda de 390 nm para soluciones micelares del copolímero

en concentraciones cercanas al valor de CMC esperado, tal como se muestra en la Figura

20. De estos espectros, se observa un corrimiento hacia el rojo del máximo de excitación

desde 332 nm hasta 335 nm a medida que la concentración de copolímero aumenta. La

relación de intensidad entre las dos bandas (I335/I332) se emplea como la medida relativa de

la polaridad, exhibiendo valores mayores en entornos menos polares.


______________________________________________________________________________

51

Figura 20. Espectro de excitación de pireno a diferentes del copolímero COP-COL1

El valor de CMC para los copolímeros se estimó a partir de un gráfico semilogarítmico de

I335/I332 versus concentración del copolímero, el cual exhibe una forma sigmoidal (ver Figura

19). Se observa que, a bajas concentraciones del copolímero, la I335/I332 permanece

constante, sin embargo, a partir de un valor crítico, esta relación aumenta

significativamente. Este valor de concentración corresponde, según el método de

fluorescencia, a la CMC del copolímero, en este punto se presenta un equilibrio de partición

del pireno entre la fase acuosa y los núcleos de las micelas formadas. Los valores de CMC

en mg/L se obtuvieron por intersección de líneas rectas dibujadas en las regiones planas

del gráfico, tal como se muestra en la Figura 21.


______________________________________________________________________________

52

Figura 21. Relación de intensidad de fluorescencia (I335/I332) vs el logaritmo de la

concentración de los copolímeros bioconjugados.

En este estudio, se obtuvieron CMC de los copolímeros bioconjugados con terpenos y de

los copolímeros blanco, los valores encontrados comprenden el rango entre 0,7 mg/L y 7,4

mg/L, donde se observa una fuerte dependencia de la unidad terpénica en cada caso (tabla

4). Los copolímeros tipo ABA que contienen PEG-diol conjugado con colesterol, presentan

CMC más bajas (inferiores a 1 mg/L), mientras que el PEG-diol conjugado con retinol

presenta una CMC de 5,47 mg/L, al comparar estos resultados con los copolímeros tipo

AB que contienen mPEG se observa que la CMC incrementa en todos los casos. Este

resultado esta atribuido a que la CMC es sensible a la longitud hidrofílica de las micelas,

esto sugiere que el aumento del segmento hidrófilo proporciona valores de CMC bajos,

que está de acuerdo con lo reportado por otros autores [63].


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53

Tabla 4. Concentraciones micelares críticas (CMC) de los copolímeros bioconjugados con

terpenos

Muestra Composición promedio CMC (mg/L)

COP-RET1 RET-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-RET 5,5

COP-RET2 (mPEG)80-b-(PCL)11-RET 7,4

COP-COL1 COL-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-COL 0,8

COP-COL2 COL-(PCL)18-(PEG)97-(PCL)18-COL 0,7

COP-COL3 (mPEG)80-(PCL)10-COL 3,7

COP-COL4 (mPEG)80-(PCL)19-COL 3,0

B1 HO-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-OH 2,7

B2 (mPEG)80-(PCL)10-OH 4,5

B3 HO-(PCL)18-(PEG)97-(PCL)18-OH 3,0

B4 (mPEG)80-(PCL)19-OH 4,1

Por su parte, en los copolímeros con unidades de RET la hidrofobicidad del medio ocasiona

que la CMC se incremente, aunque la longitud del segmento de PCL obtenida en los

materiales de estudio, parece no tener un efecto significativo en esta propiedad, la

conjugación con los terpenos evidencia cambios significativos, los copolímeros de retinol,

presentan valores de CMC superiores a los conjugados con colesterol, lo cual es

consecuencia de su comportamiento liotrópico.

Conviene destacar, que los valores de CMC obtenidos por los copolímeros en la presente

investigación concuerdan con otros autores, quienes han señalado que un aumento en la

hidrofobicidad del medio proporciona CMC bajas [65], [66]. Una mayor estabilidad

termodinámica de las micelas, corresponde a valores de CMC bajos, investigaciones

similares han reportado valores de CMC mayores a los obtenidos en el presente estudio,

tal como copolímeros tribloque PCL-PEG-PCL para los cuales se reporta valores de CMC

de 30 mg/L, esto sugiere, que los materiales bioconjugados desarrollados en la presente

investigación son más estables termodinámicamente y por ende son promisorios como

vehículos de fármacos hidrófobos [9].

En cuanto a copolímeros en bloque empleados como formulaciones de AmB, el fármaco

ha sido incorporado en micelas poliméricas autoensambladas a partir policarbonato y

polietilenglicol funcionalizado con ácido fenilborónico (PEG-PBC), una mezcla de

polcarbonato y polietilenglicol funcionalizado con urea (PEG-PUC/PEG-PBC (relación


______________________________________________________________________________

54

molar 1:1) y copolímeros dibloque de PEG-PUC, los resultados de CMC encontrados

fueron bajos (8,0; 4,3 y 3,8, respectivamente), indicando que las micelas formadas por

estos materiales tienen asociada una potencial estabilidad termodinámica [36]. En

contraste, los materiales de mPEG-b-PCL-Terpeno y Terpeno-PCL-b-PEG-b-PCL-

Terpeno, obtenidos en esta investigación presentan CMC inferiores a 8,0 mg/L, por lo que

son sistemas altamente estables.

5.2.2. Caracterización de los sistemas micelares

Se prepararon dispersiones micelares con una concentración de copolímero de 4 mg/mL

en medio acuoso. Estos sistemas fueron caracterizados empleando diferentes técnicas,

estas incluyen: dispersión dinámica de luz (DLS) para conocer el diámetro hidrodinámico

(Dh) y la distribución de tamaños de las partículas micelares. Además, fueron realizadas

medidas de potencial zeta para determinar la estabilidad de las partículas y microscopia

electrónica de transmisión (TEM), para confirmar la morfología tipo “core-shell”.

Las medidas de DLS fueron determinadas a dos temperaturas diferentes, 25 y 37 ºC, con

el fin de evaluar el comportamiento de Dh a temperatura de almacenamiento y temperatura

corporal, respectivamente. Los resultados de DLS y potencial Z se muestran en la tabla 5.

Tabla 5. Propiedades de las micelas de copolímeros anfifílicos bioconjugados con

terpenos

Muestra Diámetro hidrodinámico (Dh) (nm)

25 °C PDI 37 °C PDI

COP-RET1 57,5 0,57 80,5 0,50

COP-RET2 53,4 0,54 77,6 0,47

COP-COL1 127,7 0,60 136,8 0,59

COP-COL2 122,7 0,65 126,3 0,58

COP-COL3 123,9 0,62 136,7 0,70

COP-COL4 126,8 0,60 141,6 0,62

B1 31,1 0,34 35,5 0,33

B2 22,0 0,36 32,4 0,35

B3 24,1 0,32 27,4 0,32

B4 39,3 0,35 40,1 0,34


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55

Figura 22. Efecto de la temperatura en el diámetro hidrodinámico de las micelas de los

CBA B1, COP-COL1 y COP-RET1

En la tabla 5 y la figura 22 se muestran los resultados de los diámetros hidrodinámicos

(Dh) obtenidos de las micelas en función de la temperatura (25 y 37 °C) observándose una

distribución de Dh unimodal en todos los sistemas micelares evaluados. Los Dh de las

micelas varían de acuerdo con la composición del copolímero, para los copolímeros blanco

basados en PCL y PEG o mPEG se presentan tamaños en el rango de 22,0 hasta 40,1

nm. Por su parte, los copolímeros con entidades terpénicas enlazadas incrementan el Dh

a valores entre 53,4 y 80,5 nm para el caso de RET, mientras que para los bioconjugados

con COL los valores oscilaron entre 122,7 y 244,1 nm, teniendo en cuenta las dos

temperaturas experimentadas.

El efecto de la temperatura también mostro un incremento en los Dh promedio de las

micelas, este fenómeno se encuentra directamente relacionado con la composición en la

sección hidrofílica de los copolímeros, los segmentos de PEG o mPEG disminuyen su

carácter hidrofílico a medida que aumenta la temperatura, generando mayor agregación

de las partículas.

Con respecto al tipo de copolímero, se observa que los tamaños más grandes son

obtenidos en los copolímeros tipo AB, es decir, aquellos que contienen mPEG como

segmento hidrofílico de la cadena polimérica. Esto indica, que el mecanismo por el cual se

forman las micelas nucleación - crecimiento en los CBA que contienen PEG-diol ocurre a

una menor CMC y confiere mayor hidrofobicidad al núcleo micelar ocasionando una

disminución en la agregación de las cadenas poliméricas y por ende menor Dh.


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56

Las micelas poliméricas con unidades de terpeno estudiadas por otros autores como

portadores de fármacos han sido reportadas por Huang y colaboradores, en su

investigación emplean copolímeros de (poliamino esteres-g-colesterol)-b-polietilenglicol-b-

(poliaminoesteres-g-colesterol) para formar micelas capaces de encapsular y liberar

doxorrubicina (DOX), los tamaños de partícula obtenidos para estas nanopartículas

estuvieron en el rango de 205,4 nm hasta 247,8 nm [67].

Adicionalmente, se realizaron medidas de potencial zeta de las dispersiones micelares

sin AmB para determinar la estabilidad del sistema, los resultados son mostrados en

la tabla 4. Estos valores indican que las micelas de mPEG-b-PCL-Terpeno y Terpeno-

PCL-b-PEG-b-PCL-Terpeno presentan una carga próxima a cero, lo que involucra que la

estabilidad de las micelas no es de tipo electrostático, siendo posiblemente un efecto

estérico, tal como se muestra en la figura 23 [68].

Figura 23. Estabilidad estérica en sistemas micelares

En cuanto a la morfología de las micelas, se emplearon análisis de microscopia electrónica

de transmisión (TEM). Las imágenes TEM permiten observar la formación de la estructura

micelar de los copolímeros en bloque anfifílicos. En la figura 24 se observa la forma esférica

habitual. Además, las imágenes permiten observar un núcleo oscuro rodeado por una

corteza con menor densidad, esta característica es propia de micelas con estructura tipo

“core-shell”. La distribución de tamaños observada en estas imágenes muestras la

presencia de agregados y de partículas micelares individuales.


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57

Figura 24. Imágenes TEM de las micelas de los copolímeros anfifílicos de mPEG-b-PCL-

Terpeno y Terpeno-PCL-b-PEG-b-PCL-Terpeno

5.3. Encapsulación de AmB, liberación controlada y efecto

sobre su agregación

5.3.1. Encapsulación de AmB

Las micelas de copolímeros en bloque se presentan como un sistema de administración

de AmB con características favorables para solubilizar el fármaco. Para llevar a cabo este

tipo de formulaciones, se requiere que la AmB sea afín con el núcleo de la micela. Los

terpenos seleccionados en esta investigación, COL y RET, presentan interacciones con el

fármaco de carácter hidrofóbico e interacciones tipo π-π, respectivamente [39].


______________________________________________________________________________

58

La encapsulación de AmB en las micelas derivadas de copolímeros anfifílicos

bioconjugados estudiados en este trabajo se llevó a cabo por partición del fármaco en

micelas preformadas. La concentración de AmB solubilizada en las micelas se cuantifico a

una longitud de onda de 406 nm y se determinó mediante una curva de calibración. La

tabla 6 resume los valores obtenidos de la eficiencia de encapsulación y la capacidad de

carga determinada bajo estas condiciones, cada determinación fue realizada por triplicado.

Tabla 6. Eficiencia de encapsulación y contenido del fármaco en los sistemas micelares

cargados con AmB

Muestra Composición promedio Eficiencia de

encapsulación (%)

Contenido del

fármaco (%)

COP-RET1 RET-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-RET 39,52 ± 0,79 10,21 ± 0,21

COP-RET2 (mPEG)80-b-(PCL)11-RET 29,78 ± 1,23 6,73 ± 0,28

COP-COL1 COL-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-COL 22,44 ± 0,72 5,72 ± 0,26

COP-COL2 COL-(PCL)18-(PEG)97-(PCL)18-COL 24,97 ± 0,52 5,88 ± 0,12

COP-COL3 (mPEG)80-(PCL)10-COL 16,90 ± 0,55 3,84 ± 0,12

COP-COL4 (mPEG)80-(PCL)19-COL 20,97 ± 0,15 4,81 ± 0,03

B1 HO-(PCL)9-(PEG)97-(PCL)9-OH 11,77 ± 0,71 2,74 ± 0,17

B2 (mPEG)80-(PCL)10-OH 9,53 ± 0,12 2,38 ± 0,03

B3 HO-(PCL)18-(PEG)97-(PCL)18-OH 12,31 ± 0,36 3,16 ± 0,09

B4 (mPEG)80-(PCL)19-OH 9,27 ± 0,14 2,42 ± 0,04

En la figura 25 se observa el contenido de AmB (%) cargado en las micelas para cada

composición de copolímero bioconjugado y su correspondiente precursor sin terpeno o

copolímero blanco. Se destaca que sin importar el terpeno asociado al copolímero el

contenido de fármaco cargado es mayor en todos los materiales bioconjugados. Sin

embargo, los materiales que alcanzaron mayores contenidos encapsulados son aquellos

con unidades de RET en su estructura, esto implica, que las interacciones tipo π-π entre

la cadena de poliéno junto con la cadena de isopreno generan un microambiente con

mayor afinidad a la AmB que las interacciones hidrofóbicas de los bioconjugados con

colesterol. Otra fuerte dependencia que incrementa la solubilización de AmB se observa

en los copolímeros tipo ABA, los copolímeros COP-RET1 y COP-COL1 encapsularon

mayor cantidad de AmB comparados con los copolímeros tipo AB que presentabas la

misma longitud de PCL (1,5 kDa) es decir los COP-COL3 y COP-RET2. También se

observa que una mayor longitud del segmento hidrofóbico de PCL equivalente a 3 kDa en


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59

los copolímeros COP-COL2 y COP-COL4 también tuvo incidencia en una mayor

solubilización de AmB, sin embargo, su efecto es menos sobresaliente con respecto a la

bioconjugación con los terpenos.

Figura 25. Contenido de AmB (%) cargado en las micelas

En estudios recientes, Villamil, Parra y Pérez, autoensamblaron micelas poliméricas

compuestas por PEG-b-PCL y PEG-b-PCL-CH (colesterol) para ser usadas como

precursores de vehículos de AmB, los resultados de los contenidos de fármaco expresados

como porcentaje fueron 5,8% para PEG-b-PCL y 12,5% para PEG-b-PCL-CH [8], de

acuerdo con estos resultados, las micelas que contenían colesterol mejoraron la capacidad

de encapsular AmB, tal como los materiales desarrollados en este estudio. Por su parte,

copolímeros con unidades de RET en aplicación de encapsulación AmB en sistemas

micelares a la fecha no han sido reportados, por lo que esta investigación es pionera en

este desarrollo.

5.3.1.1. Efecto de la carga del fármaco sobre el tamaño de las

micelas

Después de la carga del fármaco se estudió el efecto de la carga de AmB sobre el tamaño

de las partículas a temperaturas de 25 °C y 37 °C, los resultados se detallan en la tabla 7.


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60

Tabla 7. Efecto de la carga de AmB en el diámetro hidrodinámico de las micelas

Muestra Diámetro hidrodinámico (Dh) (nm)

25 °C PDI 37 °C PDI

COP-RET1 91,0 0,66 115,3 0,70

COP-RET2 80,2 0,83 81,7 0,81

COP-COL1 345,9 0,89 415,2 0,60

COP-COL2 354,1 0,66 471,9 0,82

COP-COL3 220,2 0,71 244,1 0,62

COP-COL4 190,0 0,76 338,0 0,76

B1 57,7 0,59 69,0 0,49

B2 45,9 0,80 67,8 0,55

B3 53,6 0,61 61,6 0,72

B4 51,1 0,73 65,9 0,78

Como se observa para todas las muestras evaluadas se genera un aumento del Dh como

resultado de una asociación intermicelar. El Dh medido a 37 °C incrementa levemente en

comparación con las medidas realizadas a 25 °C, tal como se detalló en las micelas sin

carga de AmB este efecto es promovido por la deshidratación del segmento hidrofílico.

Los Dh obtenidos tras la carga del fármaco confirman la fuerte influencia de la naturaleza

química de la AmB, dado que es una molécula anfifílica puede autoagregarse formando

estructuras más grandes como dímeros o tetrámeros [69]. En investigaciones previas,

otros autores han estudiado este comportamiento, sus resultados revelan que el carácter

autogregado de la AmB modifica la actividad y características estructurales de la molécula

[70]. Esta misma característica ha sido encontrada en sistemas micelares de

BP(DMAEMA-co-MAEBA-co-DTDMA)(PMAIGP)ns (BSP-H) empleados en administración

de doxorrubicina (DOX), los diámetros de BSP-H cargados con DOX fueron más grandes

que los de sus precursores, esto debido al incremento de hidrofobicidad del núcleo

consecuencia del enlace covalente entre DOX y las cadenas de polímero [71].

Micelas empleadas como vehículos de AmB de copolímeros en bloque han sido reportadas

con diferentes Dh, los valores son dependientes del tipo de copolímero de partida. Por

ejemplo, las micelas obtenidas de copolímeros de PEG-b-DSPEI colesterol tienen tamaños

entre 16 y 65 nm, los resultados dependen del grado de colesterol contenido en el


______________________________________________________________________________

61

copolímero [72]. Shim y colaboradores, realizaron el autoensamblaje de copolímeros de

PCL-b-PDMAEMA obteniendo tamaños en el rango de 65 y 85 nm [50]. De acuerdo con

los resultados, los copolímeros obtenidos en la presente investigación son similares a los

reportados para otros sistemas micelares.

5.3.2. Estudio de liberación controlada de AmB

Los experimentos de liberación controlada de AmB se estudiaron in vitro empleando un

medio de liberación compuesto por DNa:DMSO a una temperatura de 37 °C. La

concentración de AmB liberada al medio fue determinada empleando espectroscopia UV-

Vis a una longitud de onda de 406 nm. En la figura 26, se detallan los perfiles de liberación

de AmB para los diez sistemas micelares cargados con el fármaco, como se puede

observar la liberación de AmB se da de manera controlada durante las 96 h del ensayo.


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62

Figura 26. Perfiles de liberación para las micelas de copolímeros anfifílicos

bioconjugados cargados con AmB

Adicionalmente, los perfiles de liberación evidencian que los materiales conducen una

liberación controlada durante las 96 h del experimento. Cada uno de los perfiles de

liberación presentan dos zonas distintas, la primera indica una liberación rápida durante

las primeras 6 horas y posteriormente una liberación lenta a partir de las 24 horas.


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63

Figura 27. Porcentaje de liberación de AmB máximo obtenido en cada sistema micelar

Al relacionar los resultados observados en las figuras 26 y 27, con la composición de los

copolímeros anfifílicos, se observa que los copolímeros blanco presentan un porcentaje de

liberación mayor con respecto a la los bioconjugados con terpenos. Este mismo

comportamiento ha sido observado por otros investigadores encontrando velocidades de

liberación lentas cuando la concentración del fármaco en el núcleo es mayor [38]. Un mayor

contenido de fármaco solubilizado en las micelas produce genera mayor interacción ya sea

hidrofóbica o tipo π-π, ya sea en los conjugados con colesterol o retinol, respectivamente,

esto incide en una liberación más lenta cuando las unidades de terpeno están presentes

en la cadena del copolímero, lo cual retarda la salida de AmB al medio de liberación.

Estudios previos de liberación controlada de AmB han sido determinados en otras

investigaciones, por ejemplo, se ha estudiado el efecto de la sustitución de ácidos grasos

de micelas compuestas por PEO-b-PHSA en la liberación de AmB, hallando que el grado

de sustitución de los ácidos graso retarda la liberación de AmB [47]. Vakil y Kwon

compararon la liberación de AmB a partir de micelas poliméricas compuestas por PEG-

DSPE en diferentes soluciones buffer, donde se observan retardo en la liberación cuando

se emplea buffers que promueven la formación de diferentes agregados, esto se debe a

que los agregados dificultan los procesos de difusión del fármaco hacia el medio de


______________________________________________________________________________

64

liberación, asimismo, deducen que la presencia de colesterol en las micelas retrasa la

liberación de AmB [72].

5.3.3. Estado de agregación de AmB

El comportamiento no selectivo de la AmB frente a los esteroles de las membranas

celulares, ergosterol en hongos y colesterol en mamíferos, es una de las principales causas

de la toxicidad del fármaco en mayor medida cuando este se encuentra agregado. Por este

motivo [73]. Por este motivo, un sistema de administración de AmB que encapsule y libere

el fármaco de forma monomérica es deseable ya que causa menor toxicidad, además de

incrementar la selectividad de la AmB por el ergosterol y no por el colesterol [74].

El estado de agregación fue determinado a partir del espectro UV-Vis de AmB. las figuras

28 y 29 muestran los resultados obtenidos para AmB solubilizada en PBS (DMSO 1%v/v),

DMSO y en cada uno de los sistemas micelares en medio acuoso.

Figura 28. Espectros UV-Vis de absorción de AmB en DMSO y en PBS (DMSO 1% v/v)


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65

Figura 29. Espectros UV-Vis de absorción los copolímeros anfifílicos bioconjugados con

terpenos

En la figura 24 se observa el espectro de absorción de AmB disuelta de DMSO, en el

espectro se destacan los picos de absorción a 350, 370, 390 y 420 nm (bandas I, II, III y

IV), que corresponden a la AmB en forma monomérica. Por su parte, la figura 25 muestra

los espectros UV-Vis de adsorción de AmB cargada en los copolímeros anfifílicos

bioconjugados con colesterol y retinol. Estos espectros son comparables con el

comportamiento de AmB en PBS donde el fármaco esta agregada. Se observa el

comportamiento batocrómico donde las agregaciones se distinguen por bandas de menor

intensidad a longitudes de onda cercanas a 320, 360, 380 y 410 nm. Estas

autoagregaciones incluyen la mezcla de moléculas de AmB con diferente grado de

asociación y por ende diferentes tamaños, así como también, la interacción que presenta

con el disolvente [47].

Tomando como referencia la relación de intensidades de las bandas I y IV, se puede

calcular el estado de agregación en cada una de las formulaciones, cuando la AmB se

encuentra en estado monomérico esta relación (I/IV) da como resultado valores pequeños

(≤0,3) [14], [70], [73]. Los estados de agregación obtenidos en los copolímeros anfifílicos

bioconjugados se muestran en la tabla 6. En ella se observa que todas las formulaciones

obtenidas se encuentran en un estado agregado, sin embargo, la composición del

copolímero y el contenido de fármaco en la micela proporciona mayor o menos agregación

a la formulación.


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66

Tabla 8. Estado de agregación de AmB basado en la relación de la intensidad de las

bandas I y IV (I/IV) del espectro UV-Vis.

Muestra Relación (I/IV) Estado de agregación

DMSO 0,31 No agregada

PBS (DMSO 1% v/v) 4,2 Agregada

COP-RET1 1,8 Agregada

COP-RET2 1,5 Agregada

COP-COL1 1,3 Agregada




B1 1,3 Agregada

B2 1,2 Agregada

B3 1,3 Agregada

B4 1,2 Agregada


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67

6. Conclusiones

En esta investigación se sintetizaron copolímeros en bloque anfifílicos tipo AB y ABA

bioconjugados con colesterol o retinol con diferente segmento hidrofílico (mPEG o

PEG-diol) y variaciones en la longitud del segmento hidrofóbico de PCL (1,5 kDa y 3,0

kDa). Los resultados mostraron una síntesis exitosa empleando polimerización por

apertura de anillo y esterificación de Steglich. Los materiales obtenidos se basaron en

copolímeros del tipo mPEG-b-PCL-Terpeno (AB) y Terpeno-PCL-b-PEG-b-PCL-

Terpeno (ABA) con diferentes grados de polimerización. La caracterización estructural,

la composición, distribución de peso molecular, índices de dispersión y los pesos

moleculares promedio en número (Mn) se obtuvieron a partir de espectroscopia

RMN1H, GPC y FTIR, obteniendo materiales con composición de peso molecular

definida, valores de dispersión de peso cercanos a la unidad y rendimientos de reacción

supriores a 70%. Las características térmicas de los materiales mostraron una

disminución de la cristalinidad y punto de fusión al bioconjugarse con COL y RET.

Por otro lado, las propiedades coloidales de las micelas poliméricas obtenidas por el

autoensamblaje en medio acuoso de los copolímeros mostraron un efecto significativo

por el tipo de segmento hidrofílico y la hidrofobicidad del núcleo terpénico, el efecto del

aumento de hidrofobicidad arrojo CMC más bajas (0,7 mg/L) favoreciendo la

estabilidad termodinámica al reducir la energía libre del sistema. Esto sugiere, que las

micelas poliméricas obtenidas de los copolímeros tipo ABA son más estables que las

de copolímeros tipo AB. Los diámetros hidrodinámicos evaluados en las micelas a

temperaturas de 25 °C y 37 °C arrojaron valores inferiores a 136,8 nm lo que posibilita

su empleo en sistemas de administración con bajo reconocimiento por el sistema

reticuloendotelial (SRE).

Los resultados de las micelas obtenidas empleadas como precursores de

formulaciones de AmB, mostraron que la presencia de colesterol y retinol en las

cadenas del copolímero mejoran la capacidad del núcleo micelar para solubilizar el

fármaco logrando contenidos de fármaco máximos en los copolímeros tipo ABA de

10,21% para retinol y 5,88% para colesterol. Asimismo, los estudios de liberación in

vitro indicaron velocidades de liberación lentas para los copolímeros bioconjugados

con terpenos facilitando la salida de AmB en un estado no agregado.


______________________________________________________________________________

68

La presente investigación mostro un nuevo enfoque de formulaciones para AmB a partir

de copolímeros bioconjugados con unidades de terpeno como una alternativa promisoria

en el tratamiento de afecciones fúngicas sistémicas. Se evidenció que la posibilidad de

modificar la arquitectura del copolímero en bloque formando materiales biohíbridos entre

moléculas bioactivas y copolímeros biocompatibles de PEG y PCL, genera materiales con

mayor capacidad de encapsular AmB y liberarla de manera controlada, sin afectar la

estabilidad del sistema micelar.


______________________________________________________________________________

69

7. Anexos

7.1. Curva de calibración AmB

7.2. Concentración mínima inhibitoria (MIC) de las

formulaciones

Esta investigación se encuentra incluida dentro de un macroproyecto interdisciplinario en

asociación con la Pontificia Universidad Javeriana (PUJ). Actualmente, las formulaciones

sintetizadas en la presente investigación se encuentran en estudio de concentración

mínima inhibitoria (MIC), características hemolíticas y capacidad antifúngica in vitro. A

continuación, se muestra la MIC obtenida para las formulaciones de AmB comparada con

la formulación comercial de Fungizone®:

Concentración mínima inhibitoria

Muestra Candida albicans SC5314 Candida auris 537 Candida auris 435

Fungizone® 0,46 µg/mL 3,75 µg/mL 0,93 µg/mL

COP-RET1 <0,11 µg/mL 7,50 µg/mL 0,93 µg/mL

COP-RET2 <0,11 µg/mL 7,50 µg/mL 0,93 µg/mL

COP-COL1 <0,11 µg/mL 0,46 µg/mL 0,23 µg/mL





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70

B1 <0,11 µg/mL 1,87 µg/mL 0,93 µg/mL

B2 <0,11 µg/mL 0,93 µg/mL 0,46 µg/mL

B3 <0,11 µg/mL 0,93 µg/mL 0,46 µg/mL

B4 <0,11 µg/mL 0,93 µg/mL 0,46 µg/mL

Candida auris 537:

Candida auris 435:


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