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Apports de la cytométrie en flux dans le diagnostic des immunodéficiences
primaires Françoise Mascart, MD, PhD
Liliane Schandené, PhD Immunobiology Clinic, Hôpital Erasme
Laboratory of Vaccinology and Mucosal Immunity Université Libre de Bruxelles, U.L.B.
Séminaire d’hématologie – ULB 23 avril 2013
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Déficits immunitaires primaires
• Maladies génétiques rares < mutations affectant un ou plusieurs gènes qui contrôle(nt) l’expression et les activités des réponses immunes.
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• prévalence ~ 1/5.000 • >200 déficits décrits
• >150 gènes identifiés
• en général symptomatiques dès les 1ères années de vie (10 signes d’alerte parmi lesquels des infections sévères, récurrentes et/ou inhabituelles)
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Mais plus récemment:
● DIPs conférant une prédisposition à un agent et/ou une famille d’agents pathogènes àdiagnostic plus tardif souvent à l’âge adulte (plus fréquents??) ● DIPs de l’homéostasie immunitaire: manifestations auto-inflammatoires ou auto-immunes, lymphoproliférations, néoplasies…
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q Defects of innate immunity q Defects of adaptative immunity
• Phagocytes • An?gen-‐presen?ng cells • NK lymphocytes
• T Lymphocytes • B Lymphocytes
q Defects in immune regula?on
The type of infec-on is a guide to which part of the immune system is deficient
• Pyogenic bacteria
• Pyogenic bacteria
• Persistent fungal skin infec?on
• Recurrent viral infec?ons • Intracellular bacteria
Cellules immunitaires affectées <> agents infectieux
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Classification of DIPs
• Déficits immunitaires combinés (T et B) • Déficits immunitaires humoraux (B) • Déficits immunitaires syndromiques • Déficits de régulation du système immunitaire • Déficits des cellules phagocytaires • Autres déficits de l’immunité innée • Déficits immunitaires du complément • Désordres auto-inflammatoires
International Union of Immunological Societies (IUIS) Expert Committee on Primary Immunodeficiency New York June 2011
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Rôle de la cytométrie en flux
Anamnèse, examen clinique ê
1/Hémogramme, dosage IgG-A-M, sérologies post-vaccinales et infectieuses
ê 2/ Phénotypage lymphocytaire T,B,NK
+-Tests fonctionnels ê
Diagnostic Traitement ê
Confirmation génétique: - diagnostic définitif - conseil génétique
Autres marqueurs
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Numération des lymphocytes T, B et NK
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Interprétation en % et en valeurs absolues
-normes en fonction de l’âge Evolution en nombre absolus des sous-populations
lymphocytaires en fonction de l'âge
0
1
2
3
4
5
6
7
8
neon
atal (n
=35)
1w-2m
o (n=
13)
2-5mo
5-9mo
9-15m
o
15-24
mo2-5
y5-1
0y
10-16
yad
ults
âge
nom
bre
abso
lu (x
109/
L)
lymphocytesCD19+CD3+CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+TCRab+CD3+TCRgd+CD3-CD16+56+
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Déficits immunitaires combinés (T et B)
-a/ déficits immunitaires combinés sévères, lymphopénie T sévère, diminution des IgG-A-M
Cc
Mort des thymocytes/lymphocytes T-B-NK- déficit en ADA
Défaut de réarrangement de VDJ T-B-NK+
déficit RAG1/2, Artemis, Ligase IV Anomalies du TCR ou du pré-TCR T-B+NK+
CD45, CD3E, CD3D, CD3G, CD3Z, ZAP70 Défaut de signalisation cytokinique
déficit IL-2RG, JAK3 T-B+NK- IL-7RA T-B+NK+
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Exemple de DICS T-B+NK-
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Apport de la cytométrie en flux:
Expression de la chaîne IL-2Rγ négativeàT-B+NK-
Expression de la chaîne IL-2Rγ+ mais Il-7Rα -àT-B+NK+
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Déficits immunitaires combinés (T et B)
-b/ déficits immunitaires combinés lymphopénie T variable, B présents,
Ig normales ou diminuées plus de 20 types
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Déficit CMH de classe II: lymphopénie T CD4, diminution IgG-A, taux élevé ou normal IgM (voir déficits humoraux)
Facteurs de transcription (CIITA, RFX-ANK, RFX5, RFXAP)
Apport de la cytométrie en flux
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Syndrome d’Omenn: T présents mais hétérogénéité restreinte diminution des IgG-A-M sauf IgE, hyperéosinophilie Différentes mutations hypomorphiques: le plus souvent RAG1
ou RAG2, Artémis, IL7RA.
IOTest® Beta Mark PN IM3497 TCR Vβ Repertoire Kit
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Clonogramme: expression de la diversité des TCR Vβ
expansion de lymphocytes T activés DR+ mémoires CD45RO+ avec un répertoire TCR Vβ restreint, oligoclonal
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Déficits immunitaires humoraux -a/ diminution Ig (au moins 2 isotypes) T présents, B normaux ou diminués
Défauts d’expression de marqueurs B de surface
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Déficit en CD81: fillette de 6 ans d’origine marocaine, hypo IgG, IgA suboptimales, IgM normales, thrombopénie, syndrome inflammatoire, absence de réponse vaccinale
M.C. van Zelm, J. Smet, B. Adams, F. Mascart, L. Schandené et al. J. Clin Invest. 120(4), 1265-1274, 2010
Contrôle Patient
Apport de la cytométrie en flux
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Déficit immunitaire commun variable (DICV): Fourre-tout de ttes les hypo IgG (hypo IgA ou IgM), mutation non définie, diminution des lymphocytes B mémoires switchés
Lymphocytes totaux Lymphocytes B
B naïfs CD19+CD27-IgM+IgD+ B mémoires CD19+CD27+IgM++IgD+ (Zone marginale de la rate) B mémoires switchés CD19+CD27+IgD-IgM-(IgG+,IgA+)
NB: normes suivant l’âge
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-b/ diminution IgG et A, IgM normale ou élevée T présents, B normaux ou diminués
Déficits immunitaires humoraux
Défaut de coopération T-B/monocytes au sein des organes lymphoïdes, essentielle pour la commutation isotypique des Ig
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Apport de la cytométrie en flux
CD69 CD40L
4 hrs in vitro s?mula?on of PBMC (PMA+Ionomycin)
Déficit CD40L: T présents, diminution IgG-A, taux élevé ou normal IgM, neutropénie transitoire cf déficit en CD40
absence d’expression du CD40L (CD154) par les lymphocytes T activés
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Déficits immunitaires humoraux
-c/ diminution Ig (tous les isotypes) T présents, B fortement diminués ou absents
7 types décrits
Agammaglobulinémie de Bruton ou agammaglobulinémie liée à X: -mutation du gène BTK (Bruton Tyrosine Kinase) qui code pour une tyrosine kinase impliquée dans l’ontogénie B
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Apport de le cytométrie en flux: marqueurs intracytoplasmiques
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Déficits de régulation du système immunitaire
-a/ lymphohistiocytoses hémophagocytaires ou syndromes hémophagocytaires:
génétiques acquises
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-causée par la prolifération incontrôlée de lymphocytes activés et d’histiocytes secrétant de grandes quantités de cytokines inflammatoires
-hémophagocytose
Défauts cytotoxiques des T CD8 et des NK
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Défauts moléculaires associés aux formes génétiques peuvent affecter différentes étapes de l’exocytose des granules
cytotoxiques vers la cible
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Activité cytotoxique
CD107a=LAMP « lysosomal associated membrane proteins »
CD107a
Cytométrie en flux: Test de dégranulation CD107a
-sang total (IL-2) incubé avec K562 et PHA
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CD3-‐ CD1
6+CD
56+
No s?mula?on K562
CD107
Control
Pa?ent 1
Pa?ent 2
Pa?ent 3
CD3-‐ CD1
6+CD
56+
Perforin
Griscelli FHLH-3 FHLH-2
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Déficits de régulation du système immunitaire
-b/ syndromes avec autoimmunité:
Le syndrome lymphoprolifératif avec auto-immunité ou autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS): -autoimmunité, lymphadénopathie chronique non-maligne +- splénomégalie -déficits de l’apoptose lymphocytaire, 5 sous-types
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Mécanismes de l’apoptose Fas-induite
-mutation homozygote du gène Fas ALPs 0
-mutation hétérozygote du gène Fas (TNFRSF6) ALPS type Ia
-mutation du gène caspase-10 ou 8 ALPs type IIa
-mutation hétérozygote du gène FasL ALPS type Ib
-mutation inconnue, ou mutation somatique ALPS type III
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C. Picard IL-‐10 et FasL soluble dans le sérum
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Cytométrie en flux: défauts subtils Accumulation dans le sang et les organes lymphoïdes secondaires d’une population polyclonale de lymphocytes T TCRαβ doubles négatifs CD4-CD8- (TCRαβ CD4-CD8->2 % des CD3+)
Contrôle Pa?ent
àTCRαβ CD4-CD8-=7 % des CD3+ àTCRαβ CD4-CD8-=1.51 % des CD3+
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Apoptose Fas-induite des lymphoblastes PHA
Contrôle anti-Fas 1 µg/ml anti-Fas 0.1 µg/ml anti-CD3 1 µg/ml anti-CD3 0.1 µg/ml
J=0 30%J=1 30% 38% 34% 38% 40%J=2 64% 55% 57% 52% 58%J=3 78% 79% 84% 73% nd
Résultats exprimés en % de cellules apoptotiques
Conclusion: déficit de l’apoptose Fas-médiée
Apoptose Fas-induite des lymphoblastes- lignée PHA IL-2
0102030405060708090
0 1 2 3
Jours d'incubation
% a
popt
ose
anti-Fas CH11
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Déficits de régulation du système immunitaire
-b/ syndromes avec autoimmunité:
Le syndrome IPEX « immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked » -eczéma, manifestations autoimmunes importantes, sévères et précoces (entéropathie, diabète, thyroïdite, et cytopénie) avec des auto-anticorps -déficits (absence ou fonction) des T régulateurs
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Mutations dans le gène FOXP3
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Cytométrie en flux: détection d’un marqueur nucléaire
-facteur de transcription FoxP3
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Déficits de l’immunité innée
Déficits de l’adhésion leucocytaire -chimiotactisme PMN anormal (PMN++ en périphérie), foyer d’infections sans pus, cicatrisation lente (chute tardive du cordon) -déficit d’expression de la chaîne β de 3 intégrines: CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18
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Apport de la cytométrie en flux
C. Picard
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Déficits de l’immunité innée
Déficits de l’explosion oxydative -granulomatose septique chronique, XL -déficit dans le complexe NADPH oxydase (sous-unité gp91phox)àproduction déficiente d’H2O2 et de superoxyde par les cellules phagocytaires, formation de granulomes
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Cytométrie en flux: test fonctionnel
- Stimulation PMN avec PMA
- H2O2 production - conversion du colorant
intracellulaire dihydrorhodamine-1,2,3 en un composé fluorescent lié à l’oxydation
fluorescence
Even
ts
Classiquement : réduction du nitrobleu de tétrazolium (NBT)
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Déficits de l’immunité innée
Syndrome de prédisposition mendélienne aux infections mycobactériennes -sensibilité accrue à Mycobacterium bovis du BCG et/ou mycobactéries atypiques (M Avium..) -infection associée fréquente: cf salmonellose -aujourd’hui 7 défauts génétiques identifiés <<mutations identifiées dans gènes affectant l’axe IL-12/IL-23/IFN-γ
IL12RB1, IL12B, IFNGR1, IFNGR2, STAT1
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Axe IL-12/IFN-γ Defects in the collabora?on between APC and T lymphocytes: defects of the IL-‐12; IL-‐23/ IFN-‐γ signaling pathway
Phagocytic cells/ dendritic cells NK cells/ T lymphocytes
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Exemples de deux patients: 1/ Patient de 30 ans, d’origine martiniquaise Admis pour: T° 38.5°C avec frissons et sudations nocturnes < 3-4 semaines, perte de poids +++ (10 kg en 3 semaines), dyspnée avec obstruction des voies aériennes supérieures, grosses adénopathies cervicales fluctuantes <adénite cervicale à Salmonella D 2/Patiente de 37 ans , d’origine belge Adénite cervicale avec fièvre, PCR identifie 16sr DNA of Mycobacterium Tilburgii
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Déficit d’expression de la chaîne β 1 du récepteur à l’IL-12 par les lymphocytes périphériques (sang total)
TEMOIN
PATIENT
Cytométrie en flux
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Cytométrie en flux: ce n’est pas tout
Control
-d’autres cellules cf cellules dendritiques
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-tests fonctionnels: prolifération, profil cytokinique, facteurs de transcription, phosphoprotéines…;
Hyper IgE syndrome (Job syndrome )
Th17 defect < STAT3 muta?ons
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