Applicazioni FARMACOLOGICHE: viene fornita un’indicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della struttura opportuna in funzione del bersaglio del farmaco. In questo campo, la costruzione di strutture calibrate permette di ridurre la ricerca ad un ristretto raggio d’azione.

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E’ il punto di partenza per quasi tutti i processi biologici. Un modello di riconoscimento tra molecole biologiche prevede che le molecole interagiscono in una maniera altamente specifica: modello CHIAVE-SERRATURA (Fisher e Ehrilch)

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La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante all’interno dei processi biologici.

La capacità di un recettore di agganciarsi al suo ligando selettivamente e con alta affinità è dovuta alla formazione di una serie di legami deboli (legami H, ionici, interazioni di Van der Waals) sommati ad interazioni favorevoli (es. idrofobiche).

Gli atomi del sito di legame forniscono l’impalcatura necessaria per conferire alla superficie un dato contorno e particolari proprietà chimiche

Variazioni anche piccole di tali amminoacidi spesso compromettono la funzionalità del recettore

Metodi computazionali per la predizione della struttura 3D di complessi proteina-ligando (o anche applicabile a modelli proteina/proteina).

Insieme di tecniche che consentono di simulare interazioni tra vari sistemi (sito attivo di un enzima e una nuova molecola di inibitore) e di valutare approssimativamente le nuove interazioni che si creano.

docking

In quest’ultimo caso, viene trovato il corretto modo di legame di un composto tramite il campionamento dello spazio conformazionale nel sito di legame, attraverso la valutazione di funzioni che stimano l’energia di ogni combinazione conformazionale ligando-recettore.

Tali funzioni valutano fattori quali:

•Complementarità fra superficie

•Energia libera di solvatazione

•Interazioni elettrostatiche e idrofobiche

AUTODOCK, DOCK, FlexX, GOLD, …AUTODOCK, DOCK, FlexX, GOLD, …

Algoritmi di docking.

Posizionano ligandi – flessibili o semi-flessibili - in siti di binding proteici generalmente rigidi.

algoritmi

Prendendo in considerazione anche la flessibilità del recettore allora andrebbero considerati centinaia o anche migliaia di gradi di libertà.

Il ligando durante il binding cambia la sua struttura tridimensionale in termini di angoli di torsione per trovare il miglior adattamento spaziale ed energetico nel sito di binding della proteina. Questa assunzione segue il modello “chiave-serratura.

Elemento chiave: scoperta di composti guida nuovi e innovativi

Composto guida = composto che mostra “affinità” per un dato recettore, che ha attività biologica e che può essere strutturalmente modificato per migliorare la bioattività

farmaci

1. Ricerca del composto guida (1-2 anni)2. Ottimizzazione del composto guida (1-2 anni)3. Saggi di attività in vitro e in vivo (1-2 anni)4. Test tossicologici (1-3 anni)5. Test per la sicurezza sull’uomo (1 anno)6. Test per l’efficacia sull’uomo (1-2 anni)

è di grande importanza l’identificazione RAPIDA E AFFIDABILE di ligandi ad alta affinità

Tempo totale per lo sviluppo di un nuovo farmaco: 6-12 anni

Costo totale: circa $ 500 000 000

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Screening sperimentale:test in vitro di grandi librerie di composti. Ignora, in genere, le proprietà strutturali del recettore

Metodi computazionali detti Rational Design:si basano su informazioni strutturali del recettore e/o del ligando

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Metodi computazionali

Struttura 3D del recettore NON nota Struttura 3D del recettore nota

Structure Based Drug DesignQSAR (Quantitaive Structure-Activity Relationship)Stabilisce una relazione tra la struttura molecolare e l’attività biologica di una serie di composti attivi. Predice la attività e la affinità di composti non noti dall’analisi delle loro similitudini e differenze strutturali, fornendo informazioni sui requisiti strutturali del recettore.

De Novo DesignI nuovi composti vengono generati nel sito di legame a partire da atomi o frammenti preposizionati nel sito e che successivamente vengono trasformati in molecole intere da softwares specifici.

Screening VirtualeLibrerie di molecole (esistenti o ipotetiche) vengono analizzate cercando ligandi con caratteristiche in accordo con i requisiti del sito di legame

Docking

Drug discovery

Il termine di drug discovery viene utilizzato per indicare tutti quei processi che portano all’identificazione o allo sviluppo di un nuovo farmaco.

Identificazione di un bersaglio (target) a cui è correlata una certa patologia su cui intervenire con un farmaco.

Identificazione di una molecola attiva

Studio delle molecole attive al fine di realizzare derivati con un più definito profilo di attività, metabolismo e tossicità (lead compounds)

.

Studi pre-clinici (animali).

Studi clinici (uomo).

Drug discovery

Il tempo è il “peggior nemico” nella drug discovery…

Portare un nuovo farmaco sul mercato puo’ richiedere 8-14 anni e costi tra 400 e 900 milioni di dollari

Riconoscimento molecolare

E’ il punto di partenza per quasi tutti i processi biologici. Le molecole interagiscono in una maniera altamente specifica: modello CHIAVE-SERRATURA

La complementarità geometrica e chimico-fisica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante all’interno dei processi biologici.

Riconoscimento molecolare

La capacità di un recettore di agganciarsi al suo ligando selettivamente e con alta affinità è dovuta alla formazione di una serie di legami deboli (legami H, ionici, interazioni di Van der Waals, interazioni idrofobiche…).

Gli atomi del sito di legame forniscono l’impalcatura necessaria per conferire alla superficie un dato “contorno” e particolari proprietà chimiche

Variazioni anche piccole di tali amminoacidi spesso compromettono la funzionalità del recettore

Perché un farmaco possa esplicare la propria azione deve interagire con un bersaglio chiamato recettore.

Progettazione razionale di molecole bioattive

Avvalendosi di tecniche computazionali, nota la struttura tridimensionale del recettore o un suo modello (tecniche di docking molecolare)

L’obiettivo è quello di ottenere un modello chiamato farmacoforo sulla base del quale verranno progettate le nuove molecole attive.

E’ l’insieme delle caratteristiche chimico-fisiche della molecola di un farmaco necessarie all’interazione col recettore.

Gruppo cariconegativamente

Gruppo accettoredi legami d'idrogeno

Spaziatore

Gruppo idrofobico

Il docking molecolare

Si tratta di un approccio computazionale per lo studio delle interazioni fra un generico ligando (es. potenziale molecola attiva) e una macromolecola bersaglio (target).

E’ necessario conoscere la struttura 3D sia del ligando, sia della macromolecola bersaglio.

Le informazioni estrapolabili da uno studio di docking possono servire per:

l’identificazione degli elementi strutturali chiave per l’interazione sia del ligando, sia del recettore (modello farmacoforo);

la progettazione di nuove molecole attive con maggiore affinità e, conseguentemente con maggiore potenza;

ipotizzare un plausibile meccanismo d’azione.

Struttura 3D del ligando

C19H23NO5Formula chimica

3D

Struttura 3D del recettore

Può trattarsi di un problema estremamente complesso soprattutto se non si dispongono di informazioni sperimentali sufficienti, viste le elevate dimensioni che un recettore presenta (> 50.000 atomi).

Cristallografia a raggi X

Risonanza magnetica nucleare (NMR)

Predizione della struttura 3D

Accuratezzadella struttura 3D

•Metodica sperimentale•Metodica computazionale

Docking molecolare

L’operatore è guidato dalla grafica computerizzata e programmi appositi che posizionano il ligando nella tasca del recettore.

Ligando

Recettore

Docking

La validità del complesso (o orientamento) risultante è stimata mediante un punteggio energetico.

Valutare la validità delle soluzioni proposte dal punto di vista chimico-farmaceutico-biologico.

Lo screening virtuale di librerie di potenziali ligandi

Strumento basato su metodiche computazionali atto all’identificazione di composti biologicamente attivi a partire da banche dati di strutture reali o puramente virtuali.

Modello farmacoforoModello farmacoforo

Database di composti(milioni)

Database di composti(milioni)

Molecole potenzialmenteattive (decine)

Molecole potenzialmenteattive (decine)

Virtuale

Test farmacologicoTest farmacologico

Sintesi chimica(decine)

Sintesi chimica(decine)

Molecole attive(alcune unità)

Molecole attive(alcune unità)

Reale

Lo screening virtuale

Modello farmacoforoModello farmacoforo

Database di compostireali (migliaia)

Database di compostireali (migliaia)

Molecole potenzialmenteattive (decine)

Molecole potenzialmenteattive (decine)

Virtuale

Test farmacologicoTest farmacologico

Molecole attive(alcune unità)

Molecole attive(alcune unità)

Reale

Situazione tipica di un’industria farmaceutica.Vantaggi: risparmio di tempo nello sviluppo = risparmio di denaro.

La neuroaminidasi del virus dell’influenza

Lo screening random d’inibitori della sialidasi virale non ha dato buoni risultati nella ricerca di nuovi farmaci anti-influenzali mentre il drug design basato sulla struttura ha portato alla progettazione di nuove molecole (analoghi dello stato di transizione della reazione catalizzata dalla sialidasi) attualmente in uso.

Infatti il virus dell’influenza e’ in continua evoluzione, ogni anno nuovi ceppi. La denominazione del virus si riferisce a due tipi di molecole che ricoprono la superficie del virus: emoagglutinina e la neuroaminidasi (sialidasi). Esse determinano l’infettivita’ del virus. Diversi sottotipi neuroaminidasi N1-N9.

Questi inibitori in uso interferiscono con il rilascio della progenie del virus dell’influenza dalle cellule infettate, bloccando in questo modo l’infezione. La sialidasi entra in gioco quando il virus abbandona la cellula infettata. Assicura che il virus non resti legato ai polisaccaridi della superficie (derivati dell’ acido sialico) tagliando le loro catene.

Meccanismo d’azione di inibitori della Neuroaminidasi

Struttura 3D Neuroaminidasi

La sialidasi virale è un enzima costituito da 4 subunità identiche ancorato alla membrana del virus.

L’abilità degli analoghi dello stato di transizione del substrato della sialidasi virale nell’inibirla è conosciuta dagli anni ‘70. La progettazione d’inibitori più efficenti, però, è stata possibile solo quando la prima struttura 3D dell’enzima è stata risolta mostrando l’orientazione degli amminoacidi nel sito catalitico.

Struttura 3D Neuroaminidasi

Questo farmaco anti-influenzale è in commercio sotto il nome di Tamiflu (oseltamivir). E’ un anello a 6 atomi di carbonio che mima i substrati naturali della sialidasi e ottimizza le interazioni con i residui degli amminoacidi del sito attivo.

I ricercatori sono riusciti a progettarlo studiando le strutture della neuroaminidasi. Si lega fortemente al sito attivo e ne blocca l’azione indispensabile per il rilascio del virus.

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Le tecniche computazionali rappresentano uno strumento molto utile per:•la modellazione di sistemi proteici•la comprensione dei processi biologici•la comprensione della relazione struttura-attività•la scoperta e ottimizzazione dei composti guida farmacologici

Vantaggio dal punto di vista biologico, chimico e farmaceutico, riducendo i tempi e completando e indirizzando le conoscenze sperimentali