apostila_trichoderma_2012

Embrapa Meio Ambiente - Jaguariúna, SP

18 a 20 de setembro de 2012

Avaliação da

qualidade de produtos à base de Trichoderma

IV CURSO TEÓRICO E PRÁTICO

Avaliação da qualidade de produtos à base de Trichoderma

Trichoderma é o principal agente de biocontrole de doenças de

plantas comercializado no Brasil. A maioria dos produtos comerciais à base

de Trichoderma está em processo de registro no MAPA. Com isso, surgiu a

necessidade de padronizar as metodologias para a avaliação da qualidade

desses produtos, tanto para o setor de qualidade das biofábricas quanto

para os órgãos de fiscalização. Assim, no âmbito do projeto Qualibio foram

desenvolvidas metodologias para realizar essas avaliações, com a

participação da Embrapa Meio Ambiente, Embrapa Arroz e Feijão, Empresa

de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais - Epamig/Viçosa, Instituto

Biológico - IB, Ceplac/Cepec e Universidade Federal de Pelotas – UFPel.

Essas metodologias estão sendo transferidas à sociedade por meio

do “Curso Teórico e Prático – Avaliação da qualidade de produtos à base de

Trichoderma”. Até o momento foram realizados dois cursos na Embrapa

Meio Ambiente, Jaguariúna-SP e um na Universidade Federal de Lavras,

Lavras-MG, com retorno positivo dos participantes, que já estão utilizando

as metodologias como rotina nos laboratórios.

O uso das metodologias padronizadas está auxiliando na promoção e

legalização dos produtos, bem como em garantir a sua qualidade e

1

efetividade, repercutindo na melhoria dos produtos biológicos nacionais e

consequentemente aumentando seu mercado consumidor.

PROGRAMAÇÃO

18/09/2012

8:30h – Abertura – Wagner Bettiol

9:00h - Importância da padronização de metodologias para avaliação da

conformidade de produtos contendo agentes de biocontrole – Marcelo A. B.

Morandi

9:30h – Aspectos gerais sobre Trichoderma como agente biológico para o

controle de doenças de plantas – Cleusa M. M. Lucon

10:30h – coffee break

11:00h – Metodologias para quantificação de Trichoderma para formulados

em pó-molhável, esporos concentrados e grânulos – Zayame Vegette Pinto

12:00h - Almoço

14:00h – Preparo e execução das metodologias para a análise quali-

quantitativa de produtos comerciais a base de Trichoderma spp.– Zayame

V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely

Nascimento,Patrícia E. Haddad.

15:30h- coffee break

16:00h - Continuação do preparo e execução das metodologias para a

análise quali-quantitativa de produtos comerciais a base de Trichoderma

spp.– Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos

Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E. Haddad.

19/09/2012

8:00h – Leitura do número de esporos ativos e germinados ao microscópio

óptico – Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos

Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E. Haddad.

10:30h – coffe break

2

11:00h- Contagem do número de esporos ao microscópio óptico - Cleusa

M. M. Lucon, Zayame V. Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos

Santos Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E. Haddad.

12:00h - Almoço

14:00h - Identificação molecular e morfológica de Trichoderma – Ricardo

HaraKava.

15:30h- coffe-break

16:00h - Preservação de isolados de Trichoderma – Cleusa M. M. Lucon e

Zayame V. Pinto

16:00h – Avaliação de contaminantes presentes em produtos a base de

Trichoderma - Cleusa M. M. Lucon e Zayame V. Pinto

20/09/2012

09:00h – Avaliação do teste de microgotas - Zayame V. Pinto, Cleusa M.

M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely Nascimento, Patrícia E.

Haddad.

10:00h – Determinação do número de UFC de Trichoderma. Zayame V.

Pinto, Cleusa M. M. Lucon, Elen Ribeiro dos Santos Agostini, Rosely

Nascimento, Patrícia E. Haddad.

10:30h - coffe-break

11:00h – Análise dos resultados e discuusão – Wagner Bettiol, Marcelo A.

B. Morandi, Zayame Vegette e Cleusa M. M. Lucon.

13:00h Almoço e visita a casa de vegetação onde Trichoderma é utilizado

em larga escala.

17:00h - Encerramento

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ÍNDICE

I. METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS

BIOLÓGICOS À BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM PÓ-MOLHÁVEL,

GRÂNULOS DISPERSÍVEIS E SUSPENSÃO CONCENTRADA.

I. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NÚMERO DE CONÍDIOS

I.II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS –

PORCENTAGEM DE CONÍDIOS VIÁVEIS

I. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS – UNIDADE

FORMADORA DE COLÔNIA

II METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS

BIOLÓGICOS À BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM PÓ-DE-ESPORO.

II. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NÚMERO DE CONÍDIOS

II. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS –


II. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS – UNIDADE


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I. METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS

BIOLÓGICOS À BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM PÓ-MOLHÁVEL,

GRÂNULOS DISPERSÍVEIS E SUSPENSÃO CONCENTRADA.

I. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NÚMERO DE CONÍDIOS

1. PRINCÍPIO

Este é um método quantitativo em que o resultado é expresso em número de conídios

por massa ou volume de produto biológico formulado. Tem como base a preparação de

suspensão de conídios de Trichoderma e contagem do número de conídios com auxilio

de uma Câmara de Neubauer (hemacitômetro) ao microscópio óptico.

2. APLICAÇÃO

Aplicável aos produtos nas formulações pó-molhável, grânulos dispersíveis e suspensão

concentrada que tem como ingrediente ativo estruturas do fungo Trichoderma.

3. AMOSTRAGEM

A amostra encaminhada para análise deverá estar em embalagem comercial lacrada,

contendo as seguintes informações: formulação, concentração do ingrediente ativo,

número do lote, data de fabricação, data de validade, nome do produto, nome da

empresa, responsável técnico, ingrediente ativo e inerte, bem como a forma de

armazenamento. No laboratório, as amostras podem ser armazenadas a temperatura

ambiente ou, preferencialmente, em geladeira ou câmara fria. As amostras nunca devem

ser congeladas. Deve-se tomar as amostras de acordo com os princípios microbiológicos

estabelecidos. Desta forma, as amostras serão representativas do produto a ser

analisado.

4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS

- Erlenmeyer com capacidade para 250 mL;

- Tubos de ensaio de 25 mL;

- Estante para tubos de ensaio;

5

- Autoclave;

- Balança semi analítica com faixa de trabalho de 1 a 2000 g;

- Agitador de tubo de ensaio;

- Banho de ultrassom com aquecimento e frequência de 40 kHz;

- Agitador orbital para Erlenmeyer;

- Micropipeta de 10 mL e 1000 µL;

- Ponteiras esterilizadas para micropipetas de 10 mL e 1000 µL;

- Câmara de Neubauer (ou hemacitômetro);

- Microscópio óptico;

- Contador manual;

- Agitador magnético;

- Barra magnética.

5. SOLUÇÕES

Solução salina com Tween 80 (diluente):

Ingredientes:

- NaCl P.A.: 9,0 g;

- Água destilada: 1000 mL;

-Tween 80: 1 mL.

Preparo:

Em frasco de Erlenmeyer suspender o NaCl em 1000 mL de água destilada e

acrescentar Tween 80. Misturar bem e autoclavar o diluente a 121° C e 1 atm por 20

minutos.

Observação: todas as vidrarias e soluções devem ser esterilizadas em autoclave antes

de serem utilizadas.

6. PROCEDIMENTO

6.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30 a

40 minutos antes do início da análise.

6.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 mL e completar com 90 g

do diluente (corresponde à diluição 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para cada

amostra e uma série de diluição para cada pesagem. A segunda pesagem deve ser

realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar maior

tempo de hidratação.

6

6.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90

rpm.

6.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O

nível de água do banho de ultrassom deve ultrapassar o volume da suspensão contida no

Erlenmeyer.

6.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e

tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em

cada uma das passagens. Ou colocar em agitador magnético por 5 minutos.

6.6 Transferir 1,0 mL da suspensão contida no Erlenmeyer (10-1), com auxílio de

micropipeta com ponteira esterilizada para o tubo de ensaio contendo 9,0 mL de

diluente (10-2). Descartar a ponteira em seguida.

6.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três

vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em cada uma das

passagens.

6.8 Para obter a diluição 10-3 repetir os itens 6.6 e 6.7 (diluição seriada), utilizando o

tubo da diluição anterior (10-2). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição

apropriada para contagem de conídios (Tabela 1). Para cada diluição deve-se trocar a

ponteira da micropipeta.

Tabela 1. Diluição apropriada a ser utilizada para o contagem do número de conídios,

de acordo com a concentração mencionada no rótulo do produto.

Concentração de conídios* Diluição para contagem≥ 109 10-4

≤ 108 10-3

*Quando a concentração do produto não é conhecida deve-se utilizar as duas

diluições e escolher para contagem a que apresentar mais do que 10 conídios por

subcompartimento da câmera de Neubauer, conforme observação ao

microscópio óptico.

6.9 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador de

tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando ocorrer o

turbilhonamento;

6.10 Retirar imediatamente uma alíquota representativa da suspensão com auxílio de

uma micropipeta;

7

6.11 Colocar a suspensão na canaleta da câmara de Neubauer, já coberta com a

lamínula, até o preenchimento de todo o espaço existente entre a lamínula e a câmara de

Neubauer;

6.12 Antes de iniciar a contagem, deixar a câmara de Neubauer com a suspensão de

conídios em repouso por 5 minutos, para que os conídios precipitem, facilitando a

contagem e reduzindo erros;

6.13 Realizar a contagem de conídios ao microscópio óptico, no aumento de 250X ou

400X, nos campos 1 e 2 da câmara de Neubauer (Figura 1), nos cinco quadrados

(subcompartimentos) como demarcados na Figura 2, totalizando cinco contagens por

campo da câmara de Neubauer (E1, E2, E3, E4 e E5).

Observação: Muitos conídios ficam exatamente sobre as linhas de demarcação internas

dos subcompartimentos. Recomenda-se contar apenas os conídios que estiverem nas

linhas da esquerda e superior do mesmo campo da observação para evitar que eles sejam

contados duas vezes.

Figura 1. Localização dos campo 1 e 2 na câmara de Neubauer.

8

Campo 1

Campo 2

Figura 2. Área dentro dos subcompartimentos vermelhos para contagem de

conídios de Trichoderma- E1, E2, E3, E4 e E5.

7. CÁLCULO DO NÚMERO DE CONÍDIOS

Para determinar o número de conídios utilizar a fórmula a seguir para cada repetição:

Conídios/mL={[(Campo 1+Campo 2)/2] x 2,5 x 105}

Campo 1=(E1+E2+E3+E4+E5)/5 e Campo 2=(E1+E2+E3+E4+E5)/5

Quando utilizada a diluição 10-3, multiplica-se o resultado por 103 e, quando utilizada a

diluição 10-4, por 104.

Observação: O software CALIBRA, desenvolvido no âmbito do projeto Qualibio, está

disponível para cópia no site www.cnpma.embrapa.br. Esse software realiza os cálculos

e armazena as informações para a emissão de laudos. A sugestão é que o software seja

sempre utilizado, para uma maior facilidade e precisão nas análises.

8. REPETIÇÃO

9

E1 E2

E3 E4

E5

Devem ser feitas duas pesagens do produto, sendo que de cada pesagem deve ser

realizada uma série de diluição seriada. A diluição selecionada, deve-se colocar na

câmara de Neubauer para contagem.

Figura 3. Esquema das repetições utilizadas na metodologia para análise da qualidade

de produtos à base de Trichoderma.

9. PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE

Logo após as análises, as amostras deverão ser lacradas e armazenadas conforme

recomendação do fabricante até a data de validade, caso haja necessidade de repetição

dos procedimentos. Após este período ou, se não houver mais interesse nas amostras, as

mesmas deverão ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, e em seguida descartadas.

10. LIMPEZA

Antes de realizar e após o término da metodologia, a câmara de fluxo laminar (ou o

local onde será realizado o procedimento) deve ser limpa com papel toalha embebida

em álcool 70 % e depois em hipoclorito 2%.

10

I. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS –


1. PRINCÍPIO

Este é um método quantitativo onde o resultado é expresso em porcentagem de conídios

viáveis (germinados e ativos). Tem como base a dispensa de alíquota da suspensão de

conídios de Trichoderma em áreas delimitadas da placa de Petri com meio de Batata,

Dextrose e Agar (BDA), incubação em temperatura adequada para a germinação dos

conídios e contagem do número de conídios viáveis ao microscópio óptico.

2 – APLICAÇÃO



3 – AMOSTRAGEM









analisado.

4 – EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS




- Autoclave;





- Incubadora operando 25 ± 2 ºC (BOD);

- Micropipeta de 10 mL, 15 µL e 1000 µL;

- Ponteiras esterilizadas para micropipeta de 10 mL, 15 µL e 1000 µL;

11

- Placas de Petri descartável esterilizadas;


- Barra magnética.

5 – SOLUÇÕES


Ingredientes:

- NaCl P.A.: 9,0 g;

- Água destilada: 1.000 mL;

-Tween 80: 1 mL

Preparo:


acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 °C e a 1 atm

por 20 minutos.

Azul de Lactofenol

Ingredientes:

- Fenol: 20 g;

- Ácido lático: 20 g;

- Água destilada: 20 g;

- Glicerol: 40 g;

- Azul de metila (ou azul de algodão ou azul de Trypan): 0,1 g

Preparo:

Adicionar os ingredientes em um frasco e homogeneizar durante 5 minutos em agitador

magnético dentro de capela de exaustão de gases.

6. MEIO DE CULTURA

Meio de Batata Dextrose Agar (BDA):

Ingredientes:

-Meio de Batata Dextrose Agar comercial: recomendação do fabricante;

-Água destilada: 1000 mL;

Preparo:

Em frascos de Erlenmeyer misturar a água destilada ao meio de Batata Dextrose Agar e

autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL do meio

por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o meio, as placas devem ser

invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e para avaliar a condição de

12

esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA podem ser estocadas em local

escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.



7. PROCEDIMENTO



7.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 mL e completar com 90 g

do diluente (corresponde à diluição 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para cada

amostra e uma série de diluição para cada pesagem (item 8). A segunda pesagem deve

ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar maior

tempo de hidratação.


rpm.



Erlenmeyer.


tirando três vezes do aparelho quando observar o turbilhonamento da suspensão. Ou

colocar em agitador magnético por 5 minutos.






passagens.

7.8 Para obter a diluição 10-3 repetir os itens 7.6 e 7.7 (diluição seriada), utilizando o

tubo da diluição anterior (10-2). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição



13

Tabela 1. Diluição apropriada a ser utilizada para o teste de viabilidade de conídios, de

acordo com a concentração mencionada no rótulo do produto.

Concentração de conídios Diluição≥109 10-4

≤ 108 10-3

*Quando a concentração do produto não é conhecida deve-se utilizar as duas diluições e

escolher para contagem a que obtiver melhor visualização dos conídios, conforme

observação ao microscópio óptico.



turbilhonamento.

7.10 Pipetar imediatamente cinco vezes de 15 µL da diluição apropriada em placas de

Petri com meio de Batata Dextrose Agar (Figura 1). Repetir este passo para mais uma

placa.

Figura 1. Placa de Petri com meio BDA com as marcações e os 15 µL da suspensão

para análise da viabilidade – porcentagem de conídios viáveis.

7.11 Transferir as placas em BOD a 25 ± 2º C, no escuro.

7.12 Após iniciar a germinação (apresenta variação de 9 a 20 h após o plaqueamento em

função do produto) em uma das placas, colocar uma gota de azul de lactofenol (8 µL)

em cada ponto (local onde foi colocada a diluição apropriada) com a suspensão (cinco

pontos por placa) (Figura 1).

14

7.13 Avaliar a viabilidade usando microscópio óptico no aumento de pelo menos 400x.

7.14 O conídio é considerado viável, quando estiver ativo ou germinado (Figura 2 -

Glossário).

7.15 Contar os conídios viáveis e não viáveis nos cinco pontos. Contar pelo menos 100

conídios por ponto.

7.16 Se necessário, fazer nova avaliação na segunda placa, seguindo o item 7.10 a 7.13.

7.17 Calcular a taxa média de viabilidade utilizando a fórmula:

Viabilidade (%)=(média do número de conídios viáveis das pesagens/total de conídios) X 100

Deve ser realizado o cálculo para cada gota de cada pesagem de cada diluição,

separadamente. Posteriormente, obter a média aritmética de cada pesagem.

Figura 2. Vista dos conídios de Trichoderma viáveis (germinados e ativos não

germinados) ou inativos em microscópio óptico, após 14 horas de incubação.

8. REPETIÇÃO

Devem ser feitas duas pesagens do produto (7.2), sendo que de cada pesagem deve ser

realizada uma diluição seriada (itens 7.6 e 7.8). Da diluição selecionada, deve-se colocar

cinco gotas por placa em duas placas diferentes (item 7.10 e Figura 1).

15

Conídio inativo

Conídio ativo não germinado

Conídio germinado








10. LIMPEZA




11. GLOSSÁRIO

Conídio: estrutura não sexual de reprodução de fungos.

Conídio ativo ou em processo de germinação: o conídio que aumentou de tamanho

em relação ao não germinado, mas que ainda não emitiu tubo germinativo.

16

Conídio germinado: o conídio apresenta tubo germinativo com pelo menos o mesmo

comprimento que o tamanho do conídio.

Conídios inativos: conídios não viáveis.

Conídios não germinados: conídios que podem ou não estar viáveis, porém não

formou tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do

conídio.

Conídios viáveis: são os conídios ativos e os germinados.

Conidióforo: estrutura do fungo produtora de conídios.

Grânulos: tipo de formulação de produto biológico em forma de grânulos que se

desfazem na presença de água.

Pó-molhável: tipo de formulação de produto biológico composta pelo ingrediente ativo

e inerte que permita a mistura com água, formando suspensões dotadas de grande

estabilidade.

I. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS – UNIDADE


1 – PRINCÍPIO

Este é um método quantitativo, onde o resultado é expresso em unidades formadoras de

colônia (UFC/mL). Tem como base a homogeneização do produto biológico com o

diluente esterilizado (solução salina com adição de Tween 80). A partir dela é realizado

diluições decimais, as quais são distribuídas em placas sobre meio BDA com Triton e

incubadas a 25 ± 2 °C no escuro para posterior contagem do número de colônias

formadas pelo Trichoderma.

2 – APLICAÇÃO



3 – AMOSTRAGEM







17



analisado.





- Autoclave;






- Micropipeta para 10 mL, 20 µL, 100 µL e 1000 µL;

- Ponteiras estéreis para micropipeta de 10 mL, 20 µL, 100 µL e 1000 µL;

- Placas de Petri descartável esterilizada;

- Alça de Drigalski esterilizada;


- Barra magnética;


- Lâmina de microscopia e fita adesiva transparente.

5 – SOLUÇÕES


Ingredientes:

- NaCl P.A.: 9,0 g;

- Água destilada: 1000mL;

-Tween 80: 1mL.

Preparo:


acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121° C e 1 atm

por 20 minutos.

6 - MEIO DE CULTURA


Ingredientes:

18



Preparo:







Meio de Batata Dextrose Agar com adição de Triton (BDA + T):

Ingredientes:



-Triton X-100: 25 g;

Preparo:

O modo de preparo do meio deve seguir a recomendação do fabricante. Em frascos de

Erlenmeyer misturar a água destilada e Triton X-100 (redutor de colônia) ao meio de

Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter

aproximadamente 20 mL por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o

meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e

para avaliar a condição de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA+T

podem ser estocadas em local escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.



7 – PROCEDIMENTO

7.1 TESTE DE MICROGOTAS:

7.1.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30

a 40 minutos antes do início da análise.

7.1.2 Pesar 10 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250 mL e completar com 90

g do diluente (corresponde à diluição 10-1). Devem ser realizadas duas pesagens para

cada amostra e duas séries de diluições para cada pesagem (item 8). A segunda pesagem

deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra para evitar

maior tempo de hidratação.

19

7.1.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90

rpm.

7.1.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O


Erlenmeyer.

7.1.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e



7.1.6 Transferir 1,0 mL da suspensão contida no Erlenmeyer (10-1), com auxílio de



7.1.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três


passagens.

7.1.8 Para obter a diluição 10-3 repetir os itens 7.1.6 e 7.1.7 (diluição seriada), utilizando

o tubo da diluição anterior (10-2). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição



Tabela 1. Máximo de diluição seriada que deve ser realizado para obtenção da diluição

apropriada.

Informação do fabricante Diluir até105 10-6

106 10-7

107 10-8

108 10-9

109 10-10

1010 10-11

1011 10-12

1012 10-13

7.1.9 Riscar com caneta de retroprojetor a base das placas contendo meio BDA,

dividindo-as em 4 quadrantes.

7.1.10 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador

de tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando

ocorrer o turbilhonamento.

20

7.1.11 Pipetar imediatamente três alíquotas de 20 µL de cada diluição preparada para a

superfície do meio de BDA de cada um dos quadrantes, conforme representado na

Figura 1.

Figura 1. Placa de Petri com meio de Batata Dextrose e Agar dividida em 4 quadrantes

com três alíquotas de 20µL da diluição seriada referente a marcação da placa.

7.1.12 Os tubos com as diluições devem ser guardados sobre refrigeração (2-8° C) por

no máximo 48 horas para serem utilizados no teste de unidade formadora de colônia;

7.1.13 Esperar para que os 20µL de cada diluição sejam absorvidos no meio de cultura e

transferir as placas em BOD, por 24 a 48 horas, 25 ± 2° C, no escuro, antes de continuar

o procedimento;

7.1.14 Observar quais as diluições houve o crescimento de colônias de Trichoderma e

selecionar as três últimas diluições que apresentaram o crescimento do fungo nas três

gotas das duas pesagens realizadas para a realização do teste de unidade formadora de

colônia.

7.2 TESTE DE UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA (UFC):

7.2.1 Retirar os tubos de cultura com as diluições seriadas da refrigeração por 30 a 40

minutos antes do início da análise.

7.2.2 Misturar o conteúdo dos tubos de cultura com as diluições escolhidas em agitador

para tubos de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando

ocorrer o turbilhonamento;

7.2.3 Transferir de cada diluição apropriada, com uma micropipeta estéril, 100µL para a

superfície de cinco placas de Petri com meio de Batata Dextrose Agar com adição de

Triton;

7.2.4 A diluição é distribuída uniformemente sobre a superfície do meio com uma alça

de Drigalski esterilizada, imediatamente após a transferência. Para cada grupo de cinco

placas utilizar uma alça de Drigalski.

21

7.2.5 Fazer uma placa controle antes de iniciar o item 7.2.3, espalhando 100µL da

solução salina com Tween em placa com meio de Batata Dextrose Agar com adição de

Triton com alça de Drigalski esterilizada;

7.2.6 Incubar as culturas a 25 ± 2º C, no escuro, de 48 horas a 72 horas, e contar o

número de colônias crescidas;

7.2.7 Incubar em BOD a 25 ± 2º C, no escuro, novamente as culturas até 7 dias para

verificar se as colônias formadas são realmente de Trichoderma, por meio da

visualização da colônia na placa e das estruturas do fungo em microscópio óptico.

7.2.8 Para observar em microscópio óptico as estruturas do fungo, deve-se com colocar

a parte adesiva da fita adesiva transparente sobre a colônia desenvolvida na placa de

Petri com meio de BDA + T e transferir a fita para uma lâmina de microscopia, com o

lado adesivo sobre a lâmina. Observar a estrutura do fungo (geralmente, conidióforos e

conídios) em microscópio óptico em aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se a

estrutura observada é de Trichoderma utilizar livros ou sites de identificação de fungos,

como: Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS

Press, 1998.

8 - REPETIÇÃO

Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.1.2), sendo que de cada pesagem

deve ser realizada uma diluição seriada (item 7.1.6). Das três diluições selecionadas,

deve-se plaquear no mínimo cinco repetições por diluição (7.2.3).

22



9– CONTAGEM DE COLÔNIAS

Fazer a contagem do número de unidades formadoras de colônias, por placa, no tempo

de 72 horas (facultativo na 96 h), segundo a fórmula:

UFC/mL= número médio de colônias nas placas X diluição escolhida da amostra X 10*

* este 10 refere-se ao fato de terem sido plaqueados apenas 100µL de suspensão.

Observação: Ideal é que cada placa tenha de 30 a 300 colônias.

10 - PRESERVAÇÃO DAS AMOSTRAS APÓS A ANÁLISE E DESCARTE





11. LIMPEZA

23




24

II METODOLOGIAS PARA CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS

BIOLÓGICOS À BASE DE Trichoderma FORMULADOS EM PÓ-DE-ESPORO.

II. I - METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DO NÚMERO DE CONÍDIOS

1. PRINCÍPIO

Este é um método quantitativo em que o resultado é expresso em número de conídios

por massa ou volume de produto biológico formulado. Tem como base a preparação de

suspensão de conídios de Trichoderma e contagem do número de conídios com auxilio

de uma Câmara de Neubauer (hemacitômetro) ao microscópio óptico.

2. APLICAÇÃO

Aplicável aos produtos na formulação pó-de-esporo que tem como ingrediente ativo

estruturas do fungo Trichoderma.

3. AMOSTRAGEM









analisado.

4. EQUIPAMENTOS E VIDRARIAS




- Autoclave;

25





- Micropipeta de 10 mL e 1000 µL;

- Ponteiras esterilizadas para micropipetas de 10 mL e 1000 µL;

- Câmara de Neubauer (ou hemacitômetro);


- Contador manual;


- Barra magnética.

5. SOLUÇÕES


Ingredientes:

- NaCl P.A.: 9,0 g;

- Água destilada: 1000 mL;

-Tween 80: 1 mL.

Preparo:


acrescentar Tween 80. Misturar bem e autoclavar o diluente a 121° C e 1 atm por 20

minutos.



6. PROCEDIMENTO



6.2 Pesar 0,1g do produto em erlenmeyer de 250mL e completar para 99,9 g com

solução salina com Tween a 0,1 % (corresponde às diluição 10-3). Devem ser realizadas

duas pesagens para cada amostra e uma série de diluição para cada pesagem. A segunda

pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira amostra

para evitar maior tempo de hidratação.


rpm.

26



Erlenmeyer.


tirando três vezes do aparelho até ser observado o turbilhonamento da suspensão, em

cada uma das passagens. Ou colocar em agitador magnético por 5 minutos.



diluente (obter a suspensão 10-4). Descartar a ponteira em seguida. Utilizar para a

contagem a diluição apropriada segundo a Tabela 1.



passagens.

Tabela 1. Diluição apropriada a ser utilizada para o contagem do número de conídios,

de acordo com a concentração mencionada no rótulo do produto.

Concentração de conídios* Diluição para contagem≥ 109 10-4

< 108 10-3

*Quando a concentração do produto não é conhecida deve-se utilizar as duas

diluições e escolher para contagem a que apresentar mais do que 10 conídios por

subcompartimento da câmera de Neubauer, conforme observação ao

microscópio óptico.



turbilhonamento;

6.9 Retirar imediatamente uma alíquota representativa da suspensão com auxílio de uma

micropipeta;

6.10 Colocar a suspensão na canaleta da câmara de Neubauer, já coberta com a

lamínula, até o preenchimento de todo o espaço existente entre a lamínula e a câmara de

Neubauer;

6.11 Antes de iniciar a contagem, deixar a câmara de Neubauer com a suspensão de

conídios em repouso por 5 minutos, para que os conídios precipitem, facilitando a

contagem e reduzindo erros;

27

6.12 Realizar a contagem de conídios ao microscópio óptico, no aumento de 250X ou

400X, nos campos 1 e 2 da câmara de Neubauer (Figura 1), nos cinco quadrados

(subcompartimentos) como demarcados na Figura 2, totalizando cinco contagens por

campo da câmara de Neubauer (E1, E2, E3, E4 e E5).

Observação: Muitos conídios ficam exatamente sobre as linhas de demarcação internas

dos subcompartimentos. Recomenda-se contar apenas os conídios que estiverem nas

linhas da esquerda e superior do mesmo campo da observação para evitar que eles sejam

contados duas vezes.

Figura 1. Localização dos campo 1 e 2 na câmara de Neubauer.

Figura 2. Área dentro dos subcompartimentos vermelhos para contagem de

conídios de Trichoderma- E1, E2, E3, E4 e E5.

28

Campo 2

Campo 1

E5

E4E3

E2E1

7. CÁLCULO DO NÚMERO DE CONÍDIOS

Para determinar o número de conídios utilizar a fórmula a seguir para cada repetição:

Conídios/mL={[(Campo 1+Campo 2)/2] x 2,5 x 105}

Campo 1=(E1+E2+E3+E4+E5)/5 e Campo 2=(E1+E2+E3+E4+E5)/5

Para obter a concentração do produto original, o resultado obtido deve ser multiplicado

pela diluição utilizada. Quando utilizada a diluição 10-3, multiplica-se o resultado por

103e, quando utilizada a diluição 10-4, por 104.

O resultado final será a média das 4 repetições.

Observação: O software CALIBRA, desenvolvido no âmbito do projeto Qualibio, está

disponível para cópia no site www.cnpma.embrapa.br. Esse software realiza os cálculos

e armazena as informações para a emissão de laudos. A sugestão é que o software seja

sempre utilizado, para uma maior facilidade e precisão nas análises.

8. REPETIÇÃO

Devem ser feitas duas pesagens do produto, sendo que de cada pesagem deve ser

realizada uma série de diluição seriada. A diluição selecionada, deve-se colocar na

câmara de Neubauer para contagem.

29








10. LIMPEZA




II. II - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS –


30

1. PRINCÍPIO

Este é um método quantitativo onde o resultado é expresso em porcentagem de conídios

viáveis (germinados e ativos). Tem como base a dispensa de alíquota da suspensão de

conídios de Trichoderma em áreas delimitadas da placa de Petri com meio de Batata,

Dextrose e Agar (BDA), incubação em temperatura adequada para a germinação dos

conídios e contagem do número de conídios viáveis ao microscópio óptico.

2 – APLICAÇÃO



3 – AMOSTRAGEM









analisado.





- Autoclave;






- Micropipeta de 10 mL, 15 µL e 1000 µL;

- Ponteiras esterilizadas para micropipeta de 10 mL, 15 µL e 1000 µL;

- Placas de Petri descartável esterilizadas;


31

- Barra magnética.

5 – SOLUÇÕES


Ingredientes:

- NaCl P.A.: 9,0 g;

- Água destilada: 1.000 mL;

-Tween 80: 1 mL

Preparo:


acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121 °C e a 1 atm

por 20 minutos.

Azul de Lactofenol

Ingredientes:

- Fenol: 20 g;

- Ácido lático: 20 g;

- Água destilada: 20 g;

- Glicerol: 40 g;

- Azul de metila (ou azul de algodão ou azul de Trypan): 0,1 g

Preparo:

Adicionar os ingredientes em um frasco e homogeneizar durante 5 minutos em agitador

magnético dentro de capela de exaustão de gases.

6 - MEIO DE CULTURA


Ingredientes:



Preparo:







32



7 – PROCEDIMENTO



7.2 Pesar 0,1 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar para 99,9

g com solução salina com 0,1% (corresponde às diluições 10-3). Devem ser realizadas

duas pesagens para cada amostra e duas séries de diluições para cada pesagem (item 8).

A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação de água na primeira

amostra para evitar maior tempo de hidratação.


rpm.



Erlenmeyer.






diluente (10-4). Descartar a ponteira em seguida. Escolher a diluição apropriada segundo

a Tabela 1.



passagens.

Tabela 1. Diluição apropriada a ser utilizada para o teste de viabilidade de conídios, de

acordo com a concentração mencionada no rótulo do produto.

Concentração de conídios Diluição≥109 10-4

< 108 10-3

*Quando a concentração do produto não é conhecida deve-se utilizar as duas diluições e

escolher para contagem a que obtiver melhor visualização dos conídios, conforme

observação ao microscópio óptico.

33



turbilhonamento.

7.9 Pipetar imediatamente cinco vezes de 15 µL da diluição apropriada em placas de

Petri com meio de Batata Dextrose Agar (Figura 1). Repetir este passo para mais uma

placa.

Figura 1. Placa de Petri com meio BDA com as marcações e os 15 µL da suspensão

para análise da viabilidade – porcentagem de conídios viáveis.

7.10 Transferir as placas em BOD a 25 ± 2º C, no escuro.

7.11 Após iniciar a germinação (apresenta variação de 9 a 20 h após o plaqueamento em

função do produto) em uma das placas, colocar uma gota de azul de lactofenol (8 µL)

em cada ponto (local onde foi colocada a diluição apropriada) com a suspensão (cinco

pontos por placa) (Figura 1).

7.12 Avaliar a viabilidade usando microscópio óptico no aumento de pelo menos 400x.

7.13 O conídio é considerado viável, quando estiver ativo ou germinado (Figura 2 -

Glossário).

7.14 Contar os conídios viáveis e não viáveis nos cinco pontos. Contar pelo menos 100

conídios por ponto.

7.15 Se necessário, fazer nova avaliação na segunda placa, seguindo o item 7.10 a 7.13.

7.16 Calcular a taxa média de viabilidade utilizando a fórmula:

34

Viabilidade (%)=(média do número de conídios viáveis das pesagens/total de conídios) X 100

Deve ser realizado o cálculo para cada gota de cada pesagem de cada diluição,

separadamente. Posteriormente, obter a média aritmética de cada pesagem.

Figura 2. Vista dos conídios de Trichoderma viáveis (germinados e ativos não

germinados) ou inativos em microscópio óptico, após 14 horas de incubação.

8 - REPETIÇÃO

Devem ser feitas duas pesagens do produto (7.2), sendo que de cada pesagem deve ser

realizada uma diluição seriada (itens 7.6). Da diluição selecionada, deve-se colocar

cinco gotas por placa em duas placas diferentes (item 7.9 e Figura 1).

35

Conídio inativo

Conídio ativo não germinado

Conídio germinado








10. LIMPEZA




11. GLOSSÁRIO

Conídio: estrutura não sexual de reprodução de fungos.

Conídio ativo ou em processo de germinação: o conídio que aumentou de tamanho

em relação ao não germinado, mas que ainda não emitiu tubo germinativo.

36

Conídio germinado: o conídio apresenta tubo germinativo com pelo menos o mesmo

comprimento que o tamanho do conídio.

Conídios inativos: conídios não viáveis.

Conídios não germinados: conídios que podem ou não estar viáveis, porém não

formou tubo germinativo com pelo menos o mesmo comprimento que o tamanho do

conídio.

Conídios viáveis: são os conídios ativos e os germinados.

Conidióforo: estrutura do fungo produtora de conídios.

Grânulos: tipo de formulação de produto biológico em forma de grânulos que se

desfazem na presença de água.

Pó-molhável: tipo de formulação de produto biológico composta pelo ingrediente ativo

e inerte que permita a mistura com água, formando suspensões dotadas de grande

estabilidade.

II. III - METODOLOGIA PARA A VIABILIDADE DE CONÍDIOS – UNIDADE


1 – PRINCÍPIO

Este é um método quantitativo, onde o resultado é expresso em unidades formadoras de

colônia (UFC/mL). Tem como base a homogeneização do produto biológico com o

diluente esterilizado (solução salina com adição de Tween 80). A partir dela é realizado

diluições decimais, as quais são distribuídas em placas sobre meio BDA com Triton e

incubadas a 25 ± 2 °C no escuro para posterior contagem do número de colônias

formadas pelo Trichoderma.

2 – APLICAÇÃO



3 – AMOSTRAGEM






37




analisado.





- Autoclave;






- Micropipeta para 10 mL, 20 µL, 100 µL e 1000 µL;

- Ponteiras estéreis para micropipeta de 10 mL, 20 µL, 100 µL e 1000 µL;

- Placas de Petri descartável esterilizada;

- Alça de Drigalski esterilizada;


- Barra magnética;


- Lâmina de microscopia e fita adesiva transparente.

5 – SOLUÇÕES


Ingredientes:

- NaCl P.A.: 9,0 g;

- Água destilada: 1000mL;

-Tween 80: 1mL.

Preparo:


acrescentar Tween 80 (0,1%). Misturar bem e autoclavar o diluente a 121° C e 1 atm

por 20 minutos.

6 - MEIO DE CULTURA


38

Ingredientes:



Preparo:







Meio de Batata Dextrose Agar com adição de Triton (BDA + T):

Ingredientes:



-Triton X-100: 25 g;

Preparo:

O modo de preparo do meio deve seguir a recomendação do fabricante. Em frascos de

Erlenmeyer misturar a água destilada e Triton X-100 (redutor de colônia) ao meio de

Batata Dextrose Agar e autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter

aproximadamente 20 mL por placa descartável esterilizada. Depois de solidificado o

meio, as placas devem ser invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por uma noite para secar e

para avaliar a condição de esterilidade do meio. As placas preparadas com BDA+T

podem ser estocadas em local escuro e sob refrigeração (2-8° C) por sete dias.



7 – PROCEDIMENTO

7.1 TESTE DE MICROGOTAS:

7.1.1 As amostras a serem testadas devem ser colocadas à temperatura ambiente por 30

a 40 minutos antes do início da análise.

7.1.2 Pesar 0,1 g do produto a ser testado em Erlenmeyer de 250mL e completar para

99,9 g com solução salina com 0,1% (corresponde às diluições 10-3). Devem ser

realizadas duas pesagens para cada amostra e duas séries de diluições para cada

39

pesagem (item 8). A segunda pesagem deve ser realizada 10 minutos após a colocação

de água na primeira amostra para evitar maior tempo de hidratação.

7.1.3 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em agitador orbital por 60 minutos a 90

rpm.

7.1.4 Colocar o Erlenmeyer com a suspensão em banho de ultrassom, por 5 minutos. O


Erlenmeyer.

7.1.5 Misturar o conteúdo do Erlenmeyer em agitador de tubo de ensaio, colocando e



7.1.6 Transferir 1,0 mL da suspensão contida no Erlenmeyer (10-3), com auxílio de



7.1.7 Homogenizar o conteúdo em agitador de tubo de ensaio, colocando e tirando três


passagens.

7.1.8 Para obter a diluição 10-5 repetir os itens 7.1.6 e 7.1.7 (diluição seriada), utilizando

o tubo da diluição anterior (10-4). Proceder assim repetidamente até alcançar a diluição



Tabela 1. Máximo de diluição seriada que deve ser realizado para obtenção da diluição

apropriada.

Informação do fabricante Diluir até105 10-6

106 10-7

107 10-8

108 10-9

109 10-10

1010 10-11

1011 10-12

1012 10-13

7.1.9 Riscar com caneta de retroprojetor a base das placas contendo meio BDA,

dividindo-as em 4 quadrantes.

40

7.1.10 Misturar o conteúdo do tubo de ensaio com a suspensão apropriada em agitador

de tubo de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando

ocorrer o turbilhonamento.

7.1.11 Pipetar imediatamente três alíquotas de 20 µL de cada diluição preparada para a

superfície do meio de BDA de cada um dos quadrantes, conforme representado na

Figura 1.

Figura 1. Placa de Petri com meio de Batata Dextrose e Agar dividida em 4 quadrantes

com três alíquotas de 20µL da diluição seriada referente a marcação da placa.

7.1.12 Os tubos com as diluições devem ser guardados sobre refrigeração (2-8° C) por

no máximo 48 horas para serem utilizados no teste de unidade formadora de colônia;

7.1.13 Esperar para que os 20µL de cada diluição sejam absorvidos no meio de cultura e

transferir as placas em BOD, por 24 a 48 horas, 25 ± 2° C, no escuro, antes de continuar

o procedimento;

7.1.14 Observar quais as diluições houve o crescimento de colônias de Trichoderma e

selecionar as três últimas diluições que apresentaram o crescimento do fungo nas três

gotas das duas pesagens realizadas para a realização do teste de unidade formadora de

colônia.

7.2 TESTE DE UNIDADE FORMADORA DE COLÔNIA (UFC):

7.2.1 Retirar os tubos de cultura com as diluições seriadas da refrigeração por 30 a 40

minutos antes do início da análise.

7.2.2 Misturar o conteúdo dos tubos de cultura com as diluições escolhidas em agitador

para tubos de ensaio colocando e tirando três vezes. O tubo deve ser retirado quando

ocorrer o turbilhonamento;

7.2.3 Transferir de cada diluição apropriada, com uma micropipeta estéril, 100µL para a

superfície de cinco placas de Petri com meio de Batata Dextrose Agar com adição de

Triton;

41

7.2.4 A diluição é distribuída uniformemente sobre a superfície do meio com uma alça

de Drigalski esterilizada, imediatamente após a transferência. Para cada grupo de cinco

placas utilizar uma alça de Drigalski.

7.2.5 Fazer uma placa controle antes de iniciar o item 7.2.3, espalhando 100µL da

solução salina com Tween em placa com meio de Batata Dextrose Agar com adição de

Triton com alça de Drigalski esterilizada;

7.2.6 Incubar as culturas a 25 ± 2º C, no escuro, de 48 horas a 72 horas, e contar o

número de colônias crescidas;

7.2.7 Incubar em BOD a 25 ± 2º C, no escuro, novamente as culturas até 7 dias para

verificar se as colônias formadas são realmente de Trichoderma, por meio da

visualização da colônia na placa e das estruturas do fungo em microscópio óptico.

7.2.8 Para observar em microscópio óptico as estruturas do fungo, deve-se com colocar

a parte adesiva da fita adesiva transparente sobre a colônia desenvolvida na placa de

Petri com meio de BDA + T e transferir a fita para uma lâmina de microscopia, com o

lado adesivo sobre a lâmina. Observar a estrutura do fungo (geralmente, conidióforos e

conídios) em microscópio óptico em aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se a

estrutura observada é de Trichoderma utilizar livros ou sites de identificação de fungos,

como: Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS

Press, 1998.

8 - REPETIÇÃO

Devem ser feitas duas pesagens do produto (item 7.1.2), sendo que de cada pesagem

deve ser realizada uma diluição seriada (item 7.1.6). Das três diluições selecionadas,

deve-se plaquear no mínimo cinco repetições por diluição (7.2.3).

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9– CONTAGEM DE COLÔNIAS

Fazer a contagem do número de unidades formadoras de colônias, por placa, no tempo

de 72 horas (facultativo na 96 h), segundo a fórmula:

UFC/mL= número médio de colônias nas placas X diluição escolhida da amostra X 10*

* este 10 refere-se ao fato de terem sido plaqueados apenas 100µL de suspensão.

Observação: Ideal é que cada placa tenha de 30 a 300 colônias.






43

11. LIMPEZA




44

Wagner BettiolEmbrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 -Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000Jaguariúna, SP. [email protected]

Marcelo Augusto Boechat MorandiEmbrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 -Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000Jaguariúna, SP. [email protected]

Zayame Vegette PintoEmbrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 -Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000Jaguariúna, SP. [email protected]

Rosely NascimentoEmbrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 -Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000Jaguariúna, SP. [email protected]

Elen Ribeiro dos Santos AgostiniEmbrapa Meio Ambiente, Rod. SP 340, km 127,5 -Caixa Postal 69, Tanquinho Velho, 13.820-000Jaguariúna, SP. [email protected]

Cleusa Maria Mantovanello LuconInstituto Biológico de São Paulo, Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252, 04014-002, São Paulo, SP. [email protected]

Ricardo HarakavaInstituto Biológico de São Paulo, Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252, 04014-002, São Paulo, SP. [email protected]

Patrícia E. HaddadInstituto Biológico de São Paulo, Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252, 04014-002, São Paulo, SP. [email protected]

45

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]

apostila_trichoderma_2012

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