aplicaciones de la pcr y otras técnicas de genética molecular en ganadería: enfermedades...
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Aplicaciones de la PCR y otras técnicas de genética molecular en ganadería:
enfermedades hereditarias y no hereditarias
Inmaculada Martín BurrielInmaculada Martín [email protected]@unizar.es
Enfermedad genética
Desviación del estado de salud debida total o parcialmente a la constitución genética del individuo, en el que factores ambientales pueden cumplir una función importante en la expresión y gravedad de los defectos o síntomas
¿Cómo reconocerlas?
Historia familiar – análisis de pedigríes:
Especies: Perros, Caballos, Vacuno lechero
Reconocimiento del modo de herencia
Control de filiación
¿Cómo reconocerlas?
Epidemiología de la enfermedadAparición de casos puntualesAparición en estirpes
Análisis de pedigríes
Determinación del tipo de herencia
¿Cómo reconocerlas?
Examen físico:Buscar cambios estructurales, fenotipos
característicos, alteraciones en las manos, pies, piel, pelo, etc.
¿Cómo reconocerlas?
Examen laboratorial:Estudios bioquímicos, inmunológicos,
citogenéticos y de genética molecular.
Tipos de Herencia en Medicina Veterinaria
Fenotipo (enfermedad) = genotipo + ambiente
Factor genético
1. Enfermedades (o rasgos) monogénicas: • Con herencia mendeliana más o menos regular• Citrulinemia, BLAD, DUMPS,etc.
2. Enfermedades de herencia multifactorial
1. Poligénicas
2. Monogénicas con importante componente ambiental
3. Enfermedades de origen cromosómico (cromosomopatías)
1. Se detectan al microscopio
2. Se originan en la meiosis
3. No heredables o herencia irregular
4. Afectan a muchos genes cuadro grave, muchos letales
Caracteres Mendelianos
Online Mendelian Inheritance in Animals: http://omia.angis.org.au/
Perro Vaca Gato Cerdo Caballo Oveja Pollo Cabra Conejo
Fenotipos totales
489 376 280 215 193 186 179 70 49
Monogénicos 131 75 47 35 29 68 72 10 13
Caracterizados a nivel molecular
68 43 24 13 15 17 22 7 3
Modelos humana
224 126 136 70 97 68 38 25 29
Modelo en animales
280 229 215 149 135 131 72 59 39
20/01/09
Enfermedades en bovino
CVM (malformación vertebral compleja)BLADDUMPSHIPERTROFIA MUSCULAR “hm”MULEFOOT O SINDACTILISMOCITRULINEMIA
http://www.gov.on.ca/OMAFRA/english/livestock/beef/facts/93-007.htm
Aplicaciones Aplicaciones de la PCRde la PCRDiagnóstico de Diagnóstico de enfermedades:enfermedades:HereditariasHereditarias
BLADBLAD
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL
BLAD GROBET y cols. (1992)
"Enfermedad autosómica
recesiva que afecta a descendientes del toro holstein O. Ivanhoe, abuelo paterno de
C. M. Ivanhoe Bell "
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL
Difusión rápida de enfermedades hereditarias (con frecuencia baja)
17% Mejores toros de EEUU y Canada son portadores de BLAD
HOLSTEINIZACION
ESPAÑA
MOET IA
Shuster y cols. (1992)
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL
BLAD
Un gen autosómico letal recesico
Ganado vacuno Holstein
BASE MOLECULAR:
Deficiencia de la proteína Mac-1 (Complejo CD 11B/CD18)
Leucocitos no pueden trasportarse desde la sangre a lugares de infección
BTA 1 (U 10)
CONTROL:
AFECTA:
LOCALIZACION:
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMALBLADBLAD
SINTOMAS
Muerte de las 7 semanas a los 8 meses
Fiebre Diarreas
Ulceraciones Gingivitis Anorexia
Retraso creto. Infecciones Pneumonia
Ganglios grandes
LESIONES
*Necrosis ganglionar *Riñones atroficos *Serositis en rumen *Enteritis ulcerativa
*Ausencia de neutrofilos en tejidos blandos *Hiperplasia de foliculos linfoides *Edema en áreas paracorticales
*Congestión esplénica *Vasos dilatados
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL
Alteraciones del complejo
CD11/CD 18
VACUNO BLAD
HUMANA LAD
PERRO "Sindrome de
granulopatía canina"
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMALBASE MOLECULAR
Dos mutaciones
Silente
Sustitución en la posición 128 de A por G
(Glicina por Ac. Aspártico) D128G
ALTERACION DE LA PROTEINA Mac1 (CD 11/CD 18)
Secuencia anómala del gen CD18: Defecto de expresión del CD18
Falta subunidad en la integrina 2
Alelo raro "D128G"
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL
FRAGMENTO AMPLIFICADO: 58 b. p. del gen CD11/CD18
OLIGONUCLEOTIDOS:
CONDICIONES DE AMPLIFICACION:
94º C., 10' Desnaturalización 94º C.. 15" Hibridación Elongación
69º C., 20"35 x
VISUALIZACION DEL FRAGMENTO:Gel de agarosa al 4 % y tinción con Br Et. (luz U. V.)
Desnaturalización previa
DIGESTION CON ENZIMAS DE RESTRICCION:
Taq I 65º C. Hae III 37º C.
> 4 horas
VISUALIZACION DEL PRODUCTO DIGERIDO:Gel de agarosa al 5 % y tinción con Br Et. (luz U. V.)
5' TCCGGAGGGCCAAGGGCTA 3' 5' GAGTAGGAGAGGTCCATCAGGTAGTACAGG 3'
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMALAMPLIACION POR PCR:
58 bp del gen CD18
D128/D128 :
Heterocigotos Sanos, portadores
Homocigotos recesivos Enfermos
Homocigotos dominantes Sanos, no portadores
3 GENOTIPOS
D128/D128G :
D128G/D128G :
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL
G G C C T C G A C C
G G C C T C G G C C
7 bases 13 bases
7 bases 13 bases
30 bases
28 bases
8 9 10 11 25 26 2827
8 9 10 11 25 26 2827 29 30
Hae III
Hae III
Taq I
Hae III
19 bases9 bases
9 bases 49 bases
25 bases 33 bases
58 bases (Taq I no encuentra secuencia de corte)
Alelo MUTADO (D 128 G)
Secuencia reconocida por Taq I Secuencia reconocida por Hae III
Lugar de corte de Taq I Lugar de corte de Hae III
Fragmento originado por digestión con Taq I Fragmento originado por digestión con Hae III
Leyenda
* La mutación se produce en la base 28
Alelo NORMAL(D 128)
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL
T H N
T H N
T H N
19 bp
9 bp
25 bp 30 bp 33 bp
49 bp
58 bp
+
_
Individuo NORMAL (TL) D 128 / D 128
Individuo PORTADOR (BL) D 128 / D 128 G Individuo ENFERMO D 128 G / D 128 G
T: DNA digerido con Taq I H: DNA digerido con Hae III N: DNA no digerido
DIAGNOSTICO DE BLAD
Diagnóstico: PCR + Taq I
G/G D/GD/GD/GD/G D/D
VI JORNADAS PRODUCCION ANIMAL
DIAGNOSTICO COLECTIVO
" A partir de la muestra recogida de un tanque leche de una explotación, conocer de forma rápida y
económica la existencia de hembras portadoras "
Método PCR detecta: " Presencia de un portador en una muestra de un tanque de leche correspondiente al
ordeño de 40 hembras "
Aplicaciones Aplicaciones de la PCRde la PCRDiagnósticoDiagnóstico de de enfermedades:enfermedades:HereditariasHereditarias
SSPSSP
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)
$
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)
MUTACIÓN EN EL GEN DE RYR-l Receptor de la ryanodina
Cambio de C (alelo Normal) por T (alelo mutado)
HerenciaAutosomica
recesiva
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)
DETECCIÓN POR LIGAMIENTO- Halotano- Polimorfísmos bioquímicos (Hb,PGD y GPI)
DETECCIÓN DEL SINDROME DE ESTRÉS PORCINO (PSS)
C
199bp
PCR 199bp
T 165bp 34bp
BsiHKA I
Diagnóstico de Diagnóstico de enfermedades:enfermedades:HereditariasHereditarias
Susceptibilidad/ResistenciaSusceptibilidad/ResistenciaGenéticaGenéticaScrapieScrapie
Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETsGen PRNP Genética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de
abasto:EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
ENCEFALOPATÍAS ESPONGIFORMES TRANSMISIBLES
ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS
- hereditaria- esporádica- infecciosa
Animales
Humanas
KuruEnfermedad de Creutzfeld-JakobInsomnio Familiar Fatal
Encefalopatía Espongiforme BovinaEnfermedad Transmisible del VisónSCRAPIE (Tembladera) ovino y caprino
Susceptibilidad genética
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
Encefalopatías Espongiformes Transmisibles
CARACTERÍSTICAS HISTOPATOLÓGICAS COMUNES
Depósitos de PrPSc Pérdida neuronal y gliosis
Espongiosis Vacuolización
Encefalopatías Espongiformes Transmisibles
Agente causal de tipo infeccioso
PrP (Proteína Prión)
PrPC PrPSc
Cambio de conformación
Proteína sensible a proteasas Proteína resistente a proteasas
depósito en tejidos celulares
Sistema linfoide SNC
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
GEN PRNP (Proteína prión)
• Secuencia muy conservada en un gran número de especies (230-256 aa)
• Alto grado de polimorfismo
relacionado conSUSCEPTIBILIDAD
Período de incubación(humano, ovino ycaprino)
Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETsGen PRNP Genética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de
abasto:EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
Implicaciones genéticas de las EETs
NPU (1961): Selección intra-raza según la resistencia a la infección de scrapie experimental
Interacción entre el genotipo del hospedador y las cepas de scrapie.
Implicaciones genéticas de las EETs
Gen Sip (Scrapie incubation period): Gen mayor que controla la duración del periodo de incubación de scrapie.
NPU:
sA (p.i. corto) > pA (p.i. largo)
Dickinson (1968):
Gen “sinc” (Scrapie incubation): Estudios experimentales en
ratones.
Comportamiento dependiente de la cepa de scrapie (ME7 y 22A)
s7 (p.i. corto) > p7 (p.i. largo)
Implicaciones genéticas de las EETs
La proteína priónica PrP aparece en la fracción infecciosa de los homogeneizados de scrapie.
Asociación genética entre el gen PRNP y la longitud del periodo de incubación de scrapie en ratón.
Identificación de mutaciones del gen PRNP en ciertas patologías humanas
En ovino el gen mayor Sip está estrechamente ligado a PRNP .
Ratones knock-out para el gen PRNP son resistentes a la enfermedad
Gen de la proteína prión (PRNP):
Factores genéticos de las EETs Implicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de
abasto:EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
Gen PRNPLongitud 16-22 kpb:
2 o 3 exones según la especie
Región codificante (ORF) en un único exón (2kpb)
Codifica una glicoproteína de membrana de entre 230 y 250 aa según la especie
Altamente conservado entre especies.
Gen PRNP
ORF 3’UTR
Exon1 Exon2 Exon3
Proteína PrP murina
Péptido señal
Repet. octapéptidos
1 23 51 90 231 254213178
196180
S S UniónGPI
CHO CHO
Proteína PrP humana
1 245
Http://www.errnm.cbcu.carn.ac.uk
Gen PRNP
Gen PRNPIdentificación y localización del gen PRNP
Especie Localización Especie Localización
Bos taurus 13q17 Homo sapiens 20pter-p12
Bufalus bufalis 14q15 Mus musculus 2
Cervus elaphus 2 Ovis aries 13q15
Capra hircus 13q17 Rattus norvegicus 3q35
Equus caballus 22 Vulpes fulva 14
Gen PRNPHomología de secuencia
Humano vs BovinoHumano vs OvinoBovino vs Ovino
66.7 %65.4 %94.0 %
Prusiner (1998)
Gen PRNP
Mutaciones puntuales:
Inserciones y delecciones de octapéptidos
GTC GCC Val Ala
PHGGGWGQ
Polimorfismos
Gen PRNP
Prusiner (1998)
Polimorfismos
Factores genéticos de las EETs Implicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de
abasto:EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
Genética de las EETs humanas
• Polimorfismo más importante: Codón 129
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
Met/MetVal/Val
Susceptibilidad
http://www.bse.org.uk/report/volume2
Genética de las EETs humanas
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
• Mutación más común en el codón 200
- Sustitución de Lisina por Glutamina
- 70% de familias
• Patologías distintas dependiendo de la combinación de mutaciones existente
Familiar
Genética de las EETs humanas
http://www.bse.org.uk/report/volume2
Genética de las EETs humanas
http://www.bse.org.uk/report/volume2
Genética de las EETs humanas
http://www.bse.org.uk/report/volume2
Genética de las EETs humanas
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob
• Hipótesis muy probable:
Se produce una mutación somática del gen PRNP
en un número muy reducido de células.
Esporádica
Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETsGen PRNPGenética de las EETs en humanosGenética de las EETs en ratónGenética de las EETs en especies de
abasto:EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
Genética de las EETs en ratón
Polimorfismos genéticos del gen Prnp murino
Polimorfismos en los codones 108 y 189 determinan diferencias en el periodo de incubación de scrapie.
Utilizado como modelo para confirmar la importancia de las mutaciones detectadas en el gen PRNP humano.
Identificación de QTLs ligados al periodo de incubación del la enfermedad.
Genética de las EETs en ratónBúsqueda de QTLs asociados a las EETs QTL: Quantitative Trait Loci
Caracteres cuantitativos determinados por el efecto aditivo de la acción de varios genes.
El periodo de incubación es un carácter cuantitativo El ratón como animal modelo:
Razones económicas Control del manejo Disponibilidad de líneas consanguíneas con
periodos de incubación muy distintos.
Loyd et al. (2001)
Genética de las EETs en ratónBúsqueda de QTLs asociados a las EETs
CAST/Ei NZW/OlaHsd CAST/EiNZW/OlaHsd
F1
F2
Loyd et al. (2001)
Genética de las EETs en ratón
Análisis de la F2:• Inoculación intracerebral con scrapie• Determinación del periodo de incubación (1000 anim)• Análisis de 150 microsatélites (marcadores altamente polimórficos dispersos por todo el genoma)• Análisis de ligamiento entre el genotipo de los marcadores y el periodo de incubación.
Chr. 2
Chr. 11
Chr. 12
Loyd et al. (2001)
Otros QTLs:Chr. 9 y 11 (Stephenson et al., 2001)
Existen otros genes relacionados con el periodo de incubación de la enfermedad
Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de
abasto:EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
Genética de las EETs en ovino
Gen PrP ovino
Tamaño del gen 20kpb Proteína de 256 aa Homología con bovino (94%)
Secuencia aminoacídica de la PrP bovina de la ovina en 7 u 8 posiciones
Localización: 13 (13q17/18)
INTRODUCCIÓN
GEN PRNP OVINO
• Más de 45 cambios aminoacídicos (Vaccari y cols., 2007)
Codones136154171
SCRAPIE CLÁSICO
Codón141
SCRAPIE ATÍPICO
(Nor98)
4 codones asociados a susceptibilidad
En scrapie y EEB experimentales y ensayos in vitro:
M137T, I142K, H143R, R151C, P168L, N176K
(Goldmann y cols., 2006; Vaccari y cols., 2007; Bossers y cols., 2000)
Efecto protector
Estudios de los diferentes codones según la
raza
Codón 136
VV136 SusceptibilidadAV136 SusceptibilidadAA136 SusceptibilidadAA depende de la raza:
CheviotIle de FranceFlemishSwifter
Resistencia
SwaledaleTexelLacauneRomanov
Susceptibilidad
Genética de las EETs en ovino
Genética de las EETs en ovino
Estudios de los diferentes codones según la raza
Codón 154
Codón 171
RR154 No determinadoRH154 Cierta resistenciaHH154 Resistencia
QQ171 ResistenciaQR171 ResistenciaRR171 Resistencia 1 Suffolk en Japón
Genética de las EETs en ovino
Definidos los codones se establecen las posibles variantes
A R R
A H Q
A R H
A R Q
V R Q
Cierta resistencia
Cierta susceptibilidad
Susceptibilidad
Según el genotipo del animal y su comportamiento frente a la
enfermedad se definen 5 categorías de riesgo:
R1: Riesgo muy bajo individual y de la progenie
R2: Riesgo bajo individual y de la progenie
R3: Riesgo bajo individual y progenie dependiente del otro
parental
R4: Scrapie ocasional y progenie con mayor riesgo que
R5: El mayor riesgo a scrapie
Genética de las EETs en ovino
Genética de las EETs en ovino
Riesgo 4ARQ/ARQ
ARR/VRQ
Riesgo 5ARQ/VRQ
VRQ/VRQ
Riesgo 3ARR/ARQ
Riesgo 1ARR/ARR
Categoría de riesgoGenotipo
Razas: Charolaise y Blue de Maine
Genética de las EETs en ovino
Razas: Bluefaced y Leicester
Riesgo 2ARR/AHQ
AHQ/AHQ
Riesgo 4ARR/ARQ
ARQ/ARQ
Riesgo 5ARQ/ARQ
Riesgo 1ARR/ARR
Categoría de riesgoGenotipo
Genética de las EETs en ovino
¿Qué sucede en nuestras razas?
Comunidad Autónoma de Aragón
¿Qué sucede en los animales con scrapie
pertenecientes a nuestras razas?
¿Qué sucede en otras razas Mediterráneas?
* Determinación del riesgo genético de las razas ovinas aragonesas:
Rasa Aragonesa. Ojinegra. Cartera. Maellana. Ansotana.
* Búsqueda de nuevos polimorfismos en el gen PRNP.
Polimorfismo de PRNP en ovino aragonés
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
Material y Métodos
- Razas estudiadas :
Rasa Aragonesa. (4 Rebaños) Ojinegra. (4 Rebaños) Cartera. (2 Rebaños) Maellana. (2 Rebaños) Ansotana. (1 Rebaño)
- De cada rebaño: Todos los machos reproductores y hasta 50 de hembras.
- Extracción y purificación del DNA de sangre entera, usando el Kit de Amersham® GFX Genomic DNA blood Minikit.
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
- Condiciones de la PCR:
Componentes de la Componentes de la reacciónreacción
Volumen / Volumen / ReacciónReacción
(ml)(ml)
Concentración Concentración finalfinal
Tp10XTp10X 2,52,5 1X1X
dNTPsdNTPs 2,42,4 120120mMmM
ClCl22MgMg0,750,75 1,5mM1,5mM
Cebador-FrCebador-Fr0,250,25 0,2mM0,2mM
Cebador-RCebador-R0,250,25 0,20,2mMmM
HH22O hasta O hasta 2525 ------
94ºC 5min
72ºC 5min
94ºC 30secTaºC 30sec72ºC 1min
(x40)
Material y Métodos
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
* Codones 136 y 154 con BspHI. (O’Doherty et al., 2000)
* Codón 171 con BslI y AccI. (Yuzbasiyan-Gurkan et al., 1999)
- PCR/RFLPs:
- SECUENCIACIÓN:
* Amplificación de toda la región codificante.
- F: 5’-ATGGTGAAAAGCCACATAGGCAGT-3’ - R: 5’-CTATCCTACTATGAGAAAAATGAG-3’
* Purificación del producto PCR (NúcleoTraPCR, Marcherey-Nagel®) y secuenciación.
Material y Métodos
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
Resultados
136 y 154
171
- PCR/RFLPs:
368241179+189
AR AH VR
127
R Q/H
918160
PCR
PCR171
R/Q H PCR171149125
PC
R
AR
R/A
RR
AR
R/A
HQ
AH
Q/A
HQ
AR
R/A
RQ
AR
Q/A
HQ
AR
R/A
RH
AH
Q/A
RH
AR
Q/A
RQ
AR
Q/A
RH
AR
Q/V
RQ
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
Resultados
R1
R2
R3
R4
R5
Ansotana Cartera Maellana
Ojinegra Rasa Aragonesa
44%31%
15%
39%47%
14%
6% 4%
26%
48%
26%
83%
12%
2.5% 2.5%
72%
24%
2% 2%
Porcentaje de animales según su nivel de riesgo
Su
scep
tib
ilid
ad
–
+
R. Aragonesa:46 ARQ/ARQ2 ARR/ARQ
Acín et al. (2004) Vet Rec
Scrapie
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
Resultados
* Se detectó (Ojinegra) la variante rara (Lisina) en el codon 171.
* Se detectaron polimorfismos en 14 codones.
* Se detectaron nuevos polimorfismos en la especie ovina:
101 (Q R) 151 (R G) 151 (R H) 172 (Y D) 175 (Q E)
- SECUENCIACIÓN:
* Se ha confirmado la mayoría de los resultados de RFLPs.
Codon 171
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
Conclusiones
* Las razas ovinas autóctonas analizadas se presentan como razas muy susceptibles al padecimiento de scrapie.
* El gen PRNP presenta una gran variabilidad en el ovino autóctono.
* La técnica de PCR/RFLPs presenta un riesgo de error en la lectura debido a la presencia de alelos raros.
* La técnica de secuenciación evita los riesgos de falsas lecturas, permitiendo además detectar nuevos polimorfismos.
Acín, Martín-Burriel et al. (2004) J Gen Virol
POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN OVINO MARROQUÍ
Serrano et al. (2007) Vet Rec
MATERIAL Y MÉTODOS
OVINO MARROQUÍ: 154 animales
• Animales
89 D’man 43 Boujâad 22 Sardi
• Extracción de DNA de sangre entera
Genomic Blood DNA Purification Kit (GE Healthcare)
• Amplificación por PCR
Fragmento de 768 pb: región codificante de PRNP
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
Serrano et al. (2007) Vet Rec
ComponentesConcentración
finalVolumen
(µl)Tampón 10X 1X 5
dNTPs (1,25mM) 120µM 4,8
Cl2Mg (50mM) 1,5 1,5
Cebador-F (20mM)5’-GGCAGTTGGATCCTGGTTCTC-3’
0,2 0,5
Cebador-R (20mM)5’-ACAGGAAGGTTGCCCCTATCC-3’
0,2 0,5
DNA 100-500ng 2
Taq polimerasa (5U/ml) 0,05U/µl 0,5
H2O milliQ hasta -- 50
PROTOCOLO de PCR
Programa
94ºC 2min
94ºC 15seg60ºC 15seg72ºC 20seg
72ºC 5min
x 30 ciclos
Purificación del producto de PCR
ExoSAP-IT (USB)
SECUENCIACIÓN
MATERIAL Y MÉTODOSPolimorfismos de PRNP en ovino marroquí
Serrano et al. (2007) Vet Rec
Química: Kit Big Dye Terminator (ddNTPs fluorescentes)
• Optimización de la reacción de secuenciación
ComponentesVolumen / Reacción
(ml)
Mix (Big Dye) 4
Producto PCR 1Cebador-F / R (3,2mM)
1
H2O milliQ 4
TOTAL 10
Programa
96ºC 1min
96ºC 10seg50ºC 5seg60ºC 4min
x 25 ciclos
Precipitación con Etanol/EDTA y desnaturalización
ABI PRISM 3100
MATERIAL Y MÉTODOS
• Análisis estadístico (GENEPOP) : cálculo de frecuencias alélicas, haplotípicas y genotípicas
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
Serrano et al. (2007) Vet Rec
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquí
Electroferogramas de los fragmentos DNA
Análisis de las secuencias (Chromas, BioEdit)
CGT CAT (His Arg)
Raza D’man
Codón 114
Codón 146
AAT AGT (Asn Ser)
Raza Boujâad
171176
114
146
Nuevo
Nuevo
10 polimorfismos
conocidos (112, 136, 141, 143, 154, 171, 172, 176, 231, 237)
RESULTADOS
silentes
Serrano et al. (2007) Vet Rec
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS
• Polimorfismos relacionados con susceptibilidad
Frecuencias de haplotipo y genotipo / codones 136, 154, 171
ARQ ALTA SUSCEPTIBILIDAD
ARR CIERTA RESISTENCIA
ARQ/ARQ
ARR/ARQ
SUSCEPTIBILIDAD
(razas mediterráneas)
(Mutaciones en codón 171)
Haplotípicas Genotípicas
Serrano et al. (2007) Vet Rec
0
20
40
60
80
Boujâad D'man Sardi
Fre
cu
enci
a (%
)
ARQ
ARR
ARH
0
10
20
30
40
50
60
Boujâad D'man SardiF
rec
uen
cia
(%) ARQ/ARQ
ARR/ARQ
ARR/ARR
ARH/ARQ
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS
• Otros polimorfismos Frecuencias alélicas
228943Total
2.32.252.35KAAA
97.797.7597.65NAAC176
017.950DGAT
10082.05100YTAT172
001.17SAGT
10010098.83NAAT146
2.37.8517.5RCGT
97.792.1582.5HCAT143
4.5019.8FTTT
95.510080.2LCTT141
02.80RCGT
10097.2100HCAT114
2.31.70TACG
97.798.3100MATG112
SardiD’manBoujâadAminoácido
SecuenciaCodón
NUEVO
NUEVO
(Acín y cols., 2004)
Nor98
Serrano et al. (2007) Vet Rec
Haplotipos Sardi D’man Boujâad
ARR 31.83 25.85 30.23
ARH - - 3.49
ARQ 54.55 41.57 25.58
T112ARQ 2.27 1.68 -
R114ARQ - 2.80 -
AF141RQ 4.54 - 19.77
AR143RQ 4.54 7.87 17.44
AS146RQ - - 1.16
ARQD172 - 17.98 -
ARQK176 2.27 2.25 2.33
Total 22 89 43
10 haplotipos (2 nuevos) 27 genotipos diferentes
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS
Frecuencias haplotípicas
Serrano et al. (2007) Vet Rec
Primer análisis del gen PRNP en poblaciones ovinas
africanas
Gran variabilidad genética
Susceptibilidad a scrapie clásico y atípico, a pesar de ausencia de casos de scrapie (= Australia y Nueva Zelanda)
Las mutaciones detectadas aparecen también en otras
razas mediterráneas, posiblemente debido a la influencia de
las migraciones desde el continente africano
Polimorfismos de PRNP en ovino marroquíRESULTADOS Y DISCUSIÓN
Serrano et al. (2007) Vet Rec
Factores genéticos de las EETs Introducción Implicaciones genéticas de las EETs Gen PRNP Genética de las EETs en humanos Genética de las EETs en ratón Genética de las EETs en especies de
abasto:EETs en ovino (Scrapie)EETs en caprino y bovino
GEN PRNP CAPRINO
INTRODUCCIÓN
• 24 cambios aminoacídicos descritos en la región codificante (Acutis y cols., 2008)
• 6 codones asociados con susceptibilidad a scrapie:
I142M
H154R
W102G + 3 repeticiones
de octapéptidos
Período de incubación(Goldmann y cols., 1996; Billinis y cols., 2002; Vaccari y cols., 2006)
Resistencia (Billinis y cols., 2002; Papasavva-Stylianou y cols.,
2007;Vaccari y cols., 2006)
H143R
N146S y N146D
Q222K
• Mutación más frecuente: S240P (TCC CCC)
POLIMORFISMOS DEL GEN PRNP EN POBLACIONES CAPRINAS
MARROQUÍES
Serrano et al. (en prensa) An Genet
CAPRINO MARROQUÍ: 137 animales
MATERIAL Y MÉTODOSPolimorfismos de PRNP en caprino marroquí
80 D’man 57 Chaouni
• Animales
• Identificación de polimorfismos: Secuenciación (= ESTUDIO 1)
• Análisis estadístico: GENEPOPARLEQUIN (estimación de frecuencias haplotípicas)
• Determinación y diferenciación de haplotipos: PCR alelo-específicaSecuenciación
Serrano et al. (en prensa) An Genet
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADO
S
145
138 139
101
Análisis de electroferogramas (BioEdit)
3 NUEVAS MUTACIONES
AGC AGG (Arg Ser)
D’man
Codón 139
Codón 145
GGC GAC (Gly Asp)
Chaouni y D’man
CGG CAG (Gln Arg)
D’man
Codón 101
10 polimorfismos conocidos
Serrano et al. (en prensa) An Genet
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS
• Nuevas mutaciones
Codón SecuenciaAminoácido
Chaouni D’man
101CAG Q 100 98.1CGG R 0 1.9
139AGG R 100 98.8AGC S 0 1.3
145GGC G 98.2 99.4GAC D 1.8 0.6
Total 57 80
Frecuencias alélicas
Frecuencias bajas (< 2 %)
Serrano et al. (en prensa) An Genet
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS• Polimorfismos conocidos
Codón SecuenciaAminoácido
Chaouni D’man
37GGG G 93 100GTG V 7 0
127GGC G 98.2 100AGC S 1.8 0
137ATG M 95.6 97.5ATA I 4.4 2.5
142ATA I 99.1 99.4ATG M 0.9 0.6
154CGT R 74.6 77.5CAT H 25.4 22.5
222CAG Q 98.2 98.8AAG K 1.8 1.3
240TCC S 41.2 40CCC P 58.8 60
Total 57 80
Frecuencias alélicas
CIERTA RESISTENCIA
FRECUENCIAS INTERMEDIAS
Serrano et al. (en prensa) An Genet
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS
• Mutaciones silentes:
Codón 181: GAC GAT (Asp) (1.8% en raza D’man)
Codón 42:
Codón 138:
CCA CCG (Pro)
AGC AGT (Ser)
LIGADOS AL DIMORFISMO S240P (TCC CCC)
(Goldmann y cols., 1996; Kurosaki y cols., 2005; Acutis y cols., 2006; Babar y cols, 2007)
Serrano et al. (en prensa) An Genet
CC CCAG
Codón 42 Codón 240Codón 138
CCA TCCCA/GG AGCAGG/C GG/AC CG/AT
Codón 101
Codón 139
Codón145
Codón 154
GGT(PrP) Rev
42 240138101 139 145 154
PCR alelo-específica
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí
PP240 PS240 SS240
Secuenciación (cebador específico- S240)
139138
Heterocigotos
Serrano et al. (en prensa) An Genet
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquíRESULTADOS
• Determinación de haplotipos PCR alelo-específicaS240
P240
Haplo 37 101 127 137 139 142 145 154 222 240 Chaouni D’man1 G Q G M R I G R Q S 15.8 26.22 G Q G M R I G R Q P 41.1 43.73 V Q G M R I G R Q S 7 04 G R G M R I G R Q P 0 1.95 G Q S M R I G R Q P 1.8 06 G Q G I R I G R Q P 4.4 2.57 G Q G M S I G R Q P 0 1.38 G Q G M R M G R Q P 0.9 0.69 G Q G M R I D R Q S 1.8 0.6
10 G Q G M R I G H Q S 14.9 1011 G Q G M R I G H Q P 10.5 11.912 G Q G M R I G R K S 1.8 1.3
Frecuencias haplotípicas17 Estimados
(ARLEQUIN)
10 Chaouni
13 D’man
12 haplotipos (3 nuevos)
28 genotipos diferentes
(4 no reales)Serrano et al. (en prensa) An Genet
Primer análisis de PRNP en poblaciones caprinas africanas
Gran variabilidad genética
Cierta resistencia a scrapie (H154)
Proximidad genética con razas caprinas mediterráneas deItalia y Grecia
Polimorfismos de PRNP en caprino marroquí
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Serrano et al. (en prensa) An Genet
Genética de las EETs en bovino
Secuencia aminoacídica de la PrP bovina
de la ovina en 7 u 8 posiciones.
Polimorfismos: 22 mutaciones silentes
12 cambios aminoacídicos
Repeticiones de octapéptidos 5 copias (5/5).
6 copias (6/6). El más común
5 y 6 copias (5/6) (Heterocigoto).
Gen PrP bovino
Sin relación con la susceptibilidad a
BSE
Genética de las EETs en bovino Posible control genético:
Formas clásicas de BSE: cambios en la expresión de PrPC:
23 bp del en la región promotora elimina un sitio de unión de RP58
12 bp del en intrón 1 elimina el sitio SP1 de unión de FT.
Forma atípica: USA 2006:
E211K: análogo al humano E200K responsable de TSE hereditaria
¿Otros genes?
Posibles QTLs en BTA5, 10 y 20 (Hernández-Sánchez et al. 2002);
BTA17, X/YPS y posibles en BTA1, 6, 13 y 19 (Zhang et al., 2004).
Aplicaciones Aplicaciones de la PCRde la PCRDiagnósticoDiagnóstico de de enfermedades:enfermedades:No HereditariasNo Hereditarias
LeishmaniosisLeishmaniosis
ENFERMEDADES ENDEMICAS
SALUDImpacto económico y social
Diagnóstico precoz
SALUDImpacto económico y social
Diagnóstico precoz
PROTOZOOS del género Leishmania Enfermedad que afecta al hombre y perro ZOONOSIS ENDEMICA EN ARAGON (OMS indicadora de SIDA)
Riesgo calidad de vida - SaludMorbilidad y mortalidad
LEISHMANIOSIS
Presencia de factores ecológicos:VECTORES
RESERVORIOS ANIMALES COMO EL PERRO
Presencia de factores ecológicos:VECTORES
RESERVORIOS ANIMALES COMO EL PERRO
TECNICAS CLASICASObservación microscópica en ganglio o médulaMétodos serológicos:IFI
NUEVAS TECNICASReacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Diagnóstico problemático
PCRSENSIBLE
ESPECIFICA
ECONOMICO
EFICAZ
Cebadores - Zona del genoma del parásito de varias copias
Kinetoplastos: Pequeños círculos de DNA con genes repetidos
SSUrRNA
18SrRNA
Zonas bien conocidas en más de 100 especies: Leishmania infantum, Trypañosoma brucei,
Trypanosoma cruzi, ...
Comparar-Zona candidataSecuencias hospedador: humano y perro Secuenias del vector: artrópodo Secuencias del Kinetoplasto: parásito
Diagnóstico directo del agente etiológico: Diferenciar portadores, enfermos y sanos
PCR
Ampliación del DNA
94ºC --- 5' 94ºC --- 1' 60ºC --- 1' 72ºC --- 1' 72ºC ---10' 4ºC --- hasta recoger muestra
Termociclador 9600 Perkin Elmer
35 ciclos
muestra 15l.
ACTIVIDADES REALIZADAS
Análisis de los fragmentos amplificados
Comprobación: Digestión con enzimas de restricción - RFLP Comparar modelos de Leishmania con bibliografía Evitar falsos positivos: - Análisis de un animal sano - Control negativo ( muestra sin DNA) - Control positivo (DNA de enfermo) - Control de DNA (en muestras de amplificación -)
Electroforesis horizontal gel agarosa 2% Tinción:Bromuro de Etidio - UVA
Fragmento de 603 bp
DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIA
Amplificación del gen SSU rRNA repetido mas de 100 veces
Muestra: Médula ósea, Ganglio linfático y Sangre.
+++ -