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Aplicaciones de la PCR en el diagnóstico genético

Dr. Carlos Ruiz Lafora

Director Técnico

[email protected]

2

PCRReacción de Cadena de la Polimerasa

© 2015 IMEGEN – Información confidencial. Todos los derechos reservados.

Aplicaciones

de la PCR

➢ Es una técnica de amplificación enzimática “in vitro”. Permite amplificar un fragmento

específico de ADN situado entre dos regiones de secuencia conocida.

3

PCRReacción de cadena de la polimerasa


Aplicaciones

de la PCR


SSR

AFLPS

SNP

RAPD

RFLP

ISSR

IRAP

Secuencias de ADN polimórficas

Permiten realizar mapas genéticos y estudios indirectos

Aplicaciones

de la PCR

Marcadores moleculares


...AGTCCTGGCCTGAACACCACCAC...CACCACCACTCCTTAACTGGT...

...TCAGGACCGGACTTGTGGTGGTG...GTGGTGGTGAGGAATTGACCA...

REGIÓN MICROSATELITE

( CAC)n

➢ Regiones del genoma que son repeticiones en tandem de secuencias cortas de nucleótidos ( cac, gaca, ta, gt, ctt,... )

➢ No están asociados a ninguna patología

➢Mediante marcadores polimórficos “etiquetamos” cada uno de los genes

➢ Hacemos haplotipos y análisis de ligamiento

➢Estudios indirectos

Aplicaciones

de la PCR

Microsatélites (SSR)


I:1 I:2

II:1 II:2II:3

III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6

II:4

III:7 III:8III:9

IV :1 IV :2 IV :3 IV :4 IV :5 IV :6

III:10

IV :7 IV :8

III:11

IV :9

III:12

IV :10

7q32.2

I:1117 119157 155222 214276 276220 198104 102151 153

D7S680D7S514D7S635

D7S2501D7S1875D7S530

D7S2544

I:1123 119157 155220 214276 276212 198100 102151 153

D7S680D7S514D7S635

D7S2501D7S1875

D7S530D7S2544

I:2125 119153 157214 218274 266202 200100 100153 153

?

II:1119 119155 157214 218276 266198 200102 100153 153

D7S680D7S514D7S635

D7S2501D7S1875

D7S530D7S2544

ADN-2089

IMEGEN-198

ADN-2081

IMEGEN-197

ADN-2080

IMEGEN-196

ADN-2094

IMEGEN-195

Distrofia muscular de cinturas

Autosómica dominante

ligada a la región 7q32.2

I:1117 119157 155222 214276 276220 198104 102151 153

D7S680D7S514D7S635

D7S2501D7S1875D7S530

D7S2544

I:1123 119157 155220 214276 276212 198100 102151 153

D7S680D7S514D7S635

D7S2501D7S1875

D7S530D7S2544

I:2125 119153 157214 218274 266202 200100 100153 153

?

II:1119 119155 157214 218276 266198 200102 100153 153

D7S680D7S514D7S635

D7S2501D7S1875

D7S530D7S2544

ADN-2089

IMEGEN-198

ADN-2081

IMEGEN-197

ADN-2080

IMEGEN-196

ADN-2094

IMEGEN-195

Aplicaciones

de la PCR

Análisis de ligamiento


I:1246 242193 197146 146130 126

D15S646D15S128D15S122D15S210

I:2242 244195 199142 148130 128

?

II:1242 244195 199142 148130 128

D15S646D15S128D15S122D15S210

Síndrome del Prader-Willi (15q11_13)

➢ Deleción en el cromosoma de origen paterno

➢ Disomia uniparental materna

➢ Defectos en el imprinting del cromosoma 15 paterno

D15S646

D15S128

D15S122

D15S210

REGIÓN PW/ ANG

Aplicaciones

de la PCR

Análisis de ligamiento


(CAG)nHD, SCA

5’UTR 3’UTRExón Intrón

(CGG)nFRAXA

(CTG)nDM

(GAA)nAF

(GCG)nOPMD

Exón

➢ Regiones del genoma que son repeticiones

en tandem de secuencias cortas de

nucleótidos ( cac, gaca, ta, gt, gata,... )

➢ No están asociados a ninguna patología

Microsatelites (SSRs)

➢ Regiones del genoma que son repeticiones

en tandem de secuencias cortas de

nucleótidos ( tripletes CGG, CAG... )

➢ Están asociados a una patología

Mutaciones dinámicas

Aplicaciones

de la PCR



Inestabilidad de repeticiones de tripletes en tándem

❑ Número de repeticiones es polimórfico en población

❑ Adquieren un tamaño patológico

❑ Inestabilidad Intergeneracional

❑ Fenómeno de anticipación

❑ Enfermedades neurológicas

ACTATATGCTAGCTAGCTAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGACTGATCTAGCTGATCGT

ACGATCAGCTAGATCAGTCCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTAGCTAGCTAGCATATAGT

Núm. repeticiones = A - (B + C)

3

AB C

Aplicaciones

de la PCR



(CAG)nHD

5’UTR 3’UTRExón Intrón Exón

Enfermedad de Huntington➢Alelos normales. 6-26 repeticiones

➢ Alelos intermedios: 27-35 repeticiones

➢Alelos asociados al HD: > 36 repeticiones.

Forma juvenil 60 rep

118 pb 17 rep197 pb 43 rep

127 pb 20 rep191 pb 41 rep

124 pb 19 rep

146 pb 26 rep

Aplicaciones

de la PCR



5’UTR 3’UTRExón Intrón

(CTG)nDM

Exón

Distrofia Miotónica

➢Alelos normales. 5-34 repeticiones

➢ Alelos pre-mutados : 35-49 repeticiones

➢Alelos asociados a DM1 mínima : 50-150 repeticiones

➢Alelos asociados a DM1 clásica: ~100- ~1000 repeticiones

➢Alelos asociados a DM1 congénita: > 2000 repeticiones

91 pb 12 rep ¿ ?

66 pb 5 rep ¿ ?

66 pb 5 rep 94 pb 13 rep

88 pb 11 rep ~253 pb 66 rep

Aplicaciones

de la PCR



TP-PCR (Triplet repeat primed PCR)

…ACTACGTAGCTGACTGCTGCTGCTGCTGCTG…CTGCTGCTGCTGCTGCACTGATGCTACGTG…

…TGATGCATCGACTGACGACGACGACGACGAC…GACGACGACGACGACGTGACTACGATGCAC…

Aplicaciones

de la PCR



Distrofia Miotónica

Aplicaciones

de la PCR



X Frágil (FMR1; Xq27.3) Interrupción de las repeticiones

Aplicaciones

de la PCR



Detección de deleciones/ duplicaciones

MLPA CGH array

NGS

A pequeña escala A gran escala


1 experimento permite la cuantificación relativa de hasta 48 secuencias distintas de ADN.

Es rápido, sencillo y.... barato

Aplicaciones

de la PCRMLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification


3-PCR con los primers universales X e Y

2-Ligación

1-Hibridación

4-Electroforesis capilar


Control

Paciente

5-Interpretación de los resultados

Aplicaciones

de la PCRMLPAMultiplex Ligation-dependent Probe Amplification


➢ Detección de aneuploidías

➢Análisis de las regiones subteloméricas

➢ Detección de duplicaciones/ deleciones desde un exón a todo un gen

o región cromosómica (MLPA diseñado para más de 100 genes)

➢Detección de duplicaciones/ deleciones regiones cromosómicas (20

síndromes distintos de microdeleción)

Aplicaciones

de la PCRMLPAPrincipales indicaciones clínicas


13-verde21-rojo

18-azulY-rojoX-verde


Diagnóstico prenatal de aneuploidías (P095)


➢Detección de aneuploidías.


➢Detección de duplicaciones/ deleciones desde un exón a todo un gen o

región cromosómica (MLPA diseñado para más de 100 genes)

➢Detección de duplicaciones/ deleciones regiones cromosómicas (20


Aplicaciones



Reordenamientos subtelomericos submicroscopicos

Chr 8

Chr 16

Traslocación 8:16

Aplicaciones



ControlControl

Deleción 18q

Aborto espontaneo: 46, XY, (18) (18:20) (q21:p13) mat

Madre: 46, XX, t(18:20) (q21:p13)

Duplicación 20p

Aplicaciones





➢Detección de duplicaciones/deleciones desde un exón a todo un gen o

región cromosómica (MLPA diseñado para más de 100 genes)

➢Detección de duplicaciones/deleciones regiones cromosómicas (20


Aplicaciones



DMD

Limitaciones: No es posible detectar duplicaionesNi mujeres portadoras de deleciones

Distrofia Muscular de Duchenne

Aplicaciones



64

65 66 67

Control

Paciente con DMD

Diagnóstico de DMD/DMB (P034/P035)

Aplicaciones



Control

Paciente con DMD; dup2-7

Aplicaciones



PMP22

Duplicación= CMT1A

Deleción= HNPP

Multiplex-A Multiplex-B

CONTROL NEGATIVO

CHMT- 1A

HNPP

D17S1356D17S1357

D17S261

D17S955D17S261

D17S261 D17S1358D17S921

D17S1356 D17S261

D17S955 D17S1357

D17S1356D17S261 D17S955

D17S1357

D17S1358D17S921D17S261D17S261

D17S261 D17S261D17S921

D17S1358

Limitaciones: Marcadores no informativos. A veces difícil interpretación

Duplicación / Deleciónde la región 17p11

Aplicaciones



Salsa Mix P033

Control

HNPP

CMT1A

Aplicaciones





➢Detección de duplicaciones/ deleciones desde un exón a todo un gen o región cromosómica (MLPA diseñado para más de 100 genes)

➢Detección de duplicaciones/ deleciones regiones cromosómicas (20 síndromes distintos de microdeleción)

Aplicaciones



1p36 deletion syndrome*

2p16 microdeletion

3q29 microdeletion

9q22.3 microdeletion

15q24 deletion syndrome*

17q21 microdeletion*

22q13 / Phelan-McDermid*

Cri du Chat syndrome, 5p15*

DiGeorge syndrome 22q11*

DiGeorge region 2, 10p15

Langer-Giedion syndrome, 8q

Miller-Dieker syndrome, 17p*

NF1 microdeletion syndrome

Prader-Willi / Angelman*

MECP2 / Xq28 duplication*

Rubinstein-Taybi syndrome

Smith-Magenis syndrome*

Sotos syndrome 5q35.3*

Wagr syndrome

Williams syndrome*

Wolf-Hirschhorn 4p16.3*

Aplicaciones



dup 7q11

no por FISH

pero…

si por MLPA

Aplicaciones



Aplicaciones



3-PCR

2-Ligación

1-Hibridación

Falso positivo: Presencia de una mutación puntual en una

zona de unión de la sonda

Aplicaciones


36

PCR a tiempo real


Aplicaciones

de la PCR

37

PCR a tiempo real


Aplicaciones

de la PCR

Nº de ciclos

Log [ADN]

Detección

en agarosa

1. Exponencial: En cada ciclo se duplica la cantidad inicial del ADN diana

(asumiendo un 100% de eficiencia).

2. Lineal: Los componentes de la reacción empiezan a consumirse, la reacción

es mas lenta y algunos de los reactivos o enzimas empiezan a degradarse

3. Plateau: La amplificación está parada, no se producen nuevos productos.

Algunos productos de PCR se pueden degradar. Esta fase es la que se detecta

en la PCR tradicional.

38

PCR a tiempo real


Aplicaciones

de la PCR

Plateau

Lineal

Exponencial

Ciclos

Pro

ducto

PC

R

Análisis a tiempo final en gel de agarosa

o ?

Ct

39

PCR a tiempo real


Aplicaciones

de la PCR

Análisis en fase exponencial Análisis en tiempo final

◼ Alta concentración/Alta Eficiencia

◼ Alta concentración/Baja Eficiencia

◼ Baja concentración/Alta Eficiencia

40

PCR a tiempo real


Aplicaciones

de la PCR

41

PCR a tiempo real


Aplicaciones

de la PCR

Sondas TaqMan


Desnaturalización


Hibridación de primers y sonda


Amplificación y degradación de la sonda

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• Detección mediante dos sondas Taqman de los alelos diana.

• Técnica muy rápida e interpretación de los resultados sencilla

-Preparación de la PCR

-Amplificación PCR a tiempo real

-Interpretación de los resultados (máxima precisión y fiabilidad)

Detección de mutaciones


Aplicaciones

de la PCR

Factores de coagulación

Homocigoto normal Heterocigoto Homocigoto mutante

57

PCR a tiempo real


Aplicaciones

de la PCR

Sondas FRET

58© 2015 IMEGEN – Información confidencial. Todos los derechos reservados.

Aplicaciones

de la PCR

Análisis curvas de melting

Mismatch

Perfect match

Temperatura

baja media alta



Aplicaciones

de la PCR

Policitemia vera JAK2 (p.Val617Phe )

Método semicuantitativo

Tmaa

(p.Val617Phe)Genotipo

59ºC - Val / ValHomocigoto

normal

59ºC 63ºC Val / Phe Heterocigoto

- 63ºC Phe / PheHomocigoto

mutante


60

Aplicaciones

de la PCR

Fundamentos de la Cuantificación mediante PCR en Tiempo Real

Cuantificación mediante PCR a tiempo real

▪ Dependiendo de la concentración inicial se detectará antes o después la

fluorescencia

▪ En el termociclador se detecta, en tiempo real, la cantidad de amplificado

existente

2x105 copias

2x104 copias

Nn =No x E n

- Nn es la concentración de una

muestra en un número de ciclos dado

- No es la concentración de partida de

la muestra

- E es la eficiencia de la reacción

- n es el número de ciclos

61

Aplicaciones

de la PCR

Fundamentos de la Cuantificación mediante PCR en Tiempo Real


❑ Con una serie de patrones sepuede realizar una recta deregresión, empleando estarecta se puede cuantificar unamuestra

❑ Para cuantificar una muestra debemos obtener el nº de ciclo en el quese detecta la fluorescencia y comparar con un estándar con cantidadesconocidas del analito

62

Aplicaciones

de la PCR

Reordenamientos en Oncohematología: BCR-ABL p210


➢ Cuantificación Enfermedad Mínima Residual

➢ Análisis reordenamiento y gen de referencia

➢ Límite de Cuantificación 0,01%

ABLBCR-ABL

63

Aplicaciones

de la PCR

Cuantificación de Quimeras Hematopoyéticas


ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL

64

Aplicaciones

de la PCR

Cuantificación de Quimeras Hematopoyéticas


➢ Cuantificación polimorfismos de inserción/deleción y alelos nulos

➢ Análisis InDel y gen de referencia

➢ Comparación frente a un calibrador (muestra pre-trasplante)


➢ Límite detección 0,01%


Aplicaciones

de la PCR

PCR Digital

66

PCR Digital


Aplicaciones

de la PCR


Aplicaciones

de la PCR

PCR Digital

68

PCR Digital

Aplicaciones

de la PCR


Aplicaciones

de la PCR

PCR Digital

70

La PCR a tiempo real basa su resultado en la estimación de un Ct

Mediante PCR digital se obtienen resultados en copias por ml.


Resultado Método Variabilidad

La PCR a tiempo real permite realizar cuantificaciones relativas

Mediante PCR digital se pueden obtener resultados absolutos sin necesidad de estándares

La PCR a tiempo real se ve afectada por la eficiencia de la reacción, el equipo empleado, el material de referencia, inhibición en el ADN

PCR Digital

Aplicaciones

de la PCR


PCR Digital

Aplicaciones

de la PCR

dPCR

AVG

1.75

SD

0.74

AVG

3.25

SD

0.86

AVG

1.75

SD

0.1

AVG

3.25

SD

0.3

dPCR


Policitemia vera JAK2 (p.Val617Phe )

Método semicuantitativo

Aplicaciones

de la PCR

PCR Digital


➢Enfermedad neuromuscular infantil

➢Autosómica recesiva

➢Frecuencia de portadores 1/50

➢Gen SMN1 (5q13)

➢Gen SMN2 Modificador del fenotipo

Aplicaciones

de la PCR

Atrofia muscular espinal


❑ Estudios de ligamiento

❑ PCR a tiempo real

❑ MLPA

❑ PCR digital

• Gen normalizador

• Cuantificación de SMN1

• Cuantificación de SMN2

Aplicaciones

de la PCR





❑ MLPA

❑ PCR digital

1 1 2 2

1 x SMN1

2 x SMN2

Aplicaciones

de la PCR



4 x SMN1

0 x SMN2

Aplicaciones

de la PCR


1 1 2 2


3 x SMN1

1 x SMN2

Aplicaciones

de la PCR


1 1 2 2




❑ MLPA

❑ PCR digital

Aplicaciones

de la PCR


79

Aplicaciones

de la PCRCuantificación de Quimeras hematopoyéticas

ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL

80

➢ Cuantificación polimorfismos de inserción/deleción y alelos nulos

➢ Análisis InDel y gen de referencia

➢ Comparación frente a un calibrador (muestra pre-trasplante)


➢ Límite detección 0,01%

Aplicaciones



Receptor 49,87%Donante 0%Quimera 0,32%Quimera 3,79%

Aplicaciones


82

Aplicaciones



Sample Informative marker FAM/VIC* Het Conversion

XXX-T1 Q116-3i 1.04% 2.07%

XXX-T1 Q116-7i 1.04% 2.08%

XXX-T1 Q116-32i 1.05% 2.10%

XXX-T2 Q116-3i 16.63% 33.26%

XXX-T2 Q116-7i 16.64% 33.28%

XXX-T2 Q116-32i 16.32% 32.63%

XXX-T3 Q116-3i 35.87% 71.75%

XXX-T3 Q116-7i 36.92% 73.83%

XXX-T3 Q116-32i 34.33% 68.66%

XXX-T1

XXX-T2

XXX-T3

83

Aplicaciones


A-pre A-post

Q116-11i; 1.23%

Q116-10d; 1.37%

Average*2 (Heterozygous correction): 2.60% | STD DEV: 0.14%

Q116-10d, Negative Control


Clinical Chemistry 59:12 (2013)

Detección de DNA libre circulante post-transplante de hígado

Aplicaciones


85

Muchas gracias


Instituto de Medicina Genómica SL

Agustín Escardino 9,

Parc Científic de la Universitat de València

46980 Paterna (Valencia, España)

+34 963 212 340

Imegen.es


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