INSTITUTO FEDERAL DE SANTA CATARINA - IFSC

CURSO TÉCNICO EM BIOTECNOLOGIA - CÂMPUS GAROPABA

JASMINE COSTA JARDIM

Aplicação de técnicas moleculares para a identificação de microrganismos e

revisão de técnicas de extração de DNA de leveduras

GAROPABA, 2016

JASMINE COSTA JARDIM

Aplicação de técnicas moleculares para a identificação de microrganismos e

revisão de técnicas de extração de DNA de leveduras

Relatório técnico apresentado como requisito para aprovação no Programa Propicie, Edital 36/2015.

Prof. Dr Liliana Mabel Gerard Prof. Orientador do IFSC Jaciara Zarpellon Mazzo

GAROPABA, 2016

RESUMO

O objetivo desse estudo foi adaptar um protocolo de extração de DNA sem

fenol para leveduras. Empregou-se a levedura Saccharomyces spp. isolada de mel e

inoculou-se em Ágar Batata Dextrosado. A amostra foi incubada a 30 ±1°C por 48

horas. Variou-se a extração de DNA em relação ao protocolo base nos meios de

cultura utilizados, na adição de esfriamento da amostra em gelo, nos tempos de

centrifugação (14000 rpm por 10 minutos), agitação em vórtex (25 hertz por 15

segundos) e nas quantidades de reagentes. O protocolo aperfeiçoado é constituído

pela remoção de proteínas com Proteinase K e dodecil sulfato de sódio a 20%.

Demais contaminantes são removidos por precipitação seletiva com a adição de

CTAB e NaCl e subsequente centrifugação com clorofórmio e álcool isoamílico (24:1

respectivamente). Posteriormente precipita-se DNA com isopropanol, conservando

amostra em buffer Tris-EDTA 1X. Analisou-se a qualidade do DNA extraído em

eletroforese horizontal (1% agarose) e quantificou-se as amostras, obtendo

quantidade de DNA da amostra do protocolo aperfeiçoado de 1,819 μg/mL, com

razão (260/280) de 1,899. Recomenda-se o protocolo para subsequentes técnicas

de PCR devido à integridade apresentada em eletroforese e razão em

espectrofotômetro considerada ideal, sendo o protocolo mais prático que os já

existentes devido a utilização do versátil reagente CTAB e a ausência de esferas de

vidro.

Palavras chave: Identificação molecular. Extração de DNA. Levedura.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................ 5

1.1 Leveduras: microrganismos de importância econômica, social e cultural.......... 5

1.1.1 Garopaba e região: como a cultura está relacionada com fungos.................. 7

1.2 Biologia de leveduras...................................................................….................. 11

1.2.1 Estrutura celular...................................................................…....................... 13

1.2.2 Constituição genética...................................................................…............... 16

1.2.3 Nutrição e crescimento................................................................................... 18

1.2.4 Fermentação alcoólica...................................................................…............. 23

1.2.4.1 Hidromel: fermentação do mel em produto biotecnológico......................... 24

2 DESENVOLVIMENTO........................................................................….............. 30

2.1 OBJETIVO GERAL........................................................................................ 30

2.1.1 Objetivos específicos.......................................................................…........ 30

2.2 METODOLOGIA.................................................................................…........ 30

2.2.1 Método e foco de estudo...................................................................…......... 32

2.2.2 Caracterização das leveduras....................................................................... 33

2.2.3 Assepsia......................................................................................................... 34

2.2.4 Cultura...................................................................…..................................... 38

2.2.5 Extração de DNA.....................................................................…................... 46

2.2.6 Eletroforese em gel de agarosa.................................................................. .. 48

2.2.7 Espectrofotometria de absorção no UV visível............................................... 49

2.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS..............…………………………..…… 50

2.3.1 Autoclave de Chamberland............................................................................. 50

2.3.2 Isolamento de leveduras.............................................................…................ 51

2.3.3 Cultura de leveduras...................................................................…................ 52

2.3.4 Extração de DNA de leveduras...................................................................… 54

2.3.5 Eletroforese em gel de agarosa...................................................................... 58

2.3.6 Espectrofotometria de absorção no UV visível............................................... 60

2.4 RESULTADOS.............……………………………………………………….....… 60

3 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES..............……………….……..........… 75

ANEXO A – Extração de DNA por Ausubel et. al. (2003)......…….............. 76

REFERÊNCIAS................………………………………………………..…….... 78

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1 INTRODUÇÃO

1.1 Leveduras: microrganismos de importância econômica, social e ambiental

As leveduras são importantes para a sociedade. Sua ação pode ser benéfica,

quando relacionada à produção de alimentos, por exemplo, através de fermentações

alcoólicas (como pães, vinhos e cervejas); ou maléfica, quando provocam doenças e

problemas de saúde (como a perda capilar e a candidíase) em seres humanos ou

quando são responsáveis por perdas na agricultura (SHAH, 2012). É provável que

os fungos, de uma forma geral, sejam os maiores responsáveis pela perda de

alimentos no mundo (BETTS).

As leveduras são indispensáveis para o meio ambiente. Esses

microrganismos desempenham o papel de fungos, ou seja, auxiliam na degradação

de resíduos orgânicos e poluição. Determinadas espécies de leveduras apresentam

a capacidade de biorremediação, um tratamento biotecnológico de residuos (SHAH,

2012).

Os fungos podem ser divididos em leveduras e bolores e a principal diferença

está em suas características celulares: as leveduras são unicelulares e os bolores

são pluricelulares. As leveduras podem desenvolver-se em um potencial

hidrogeniônico (pH) baixo, atividade de água baixa e concomitantes a conservantes

químicos comuns em alimentos – tornando esses microrganismos potentes

alteradores de alimentos e provocadores de grandes perdas econômicas (BETTS).

Acredita-se que a descoberta do potencial benéfico das leveduras ocorreu

quando matérias-prima de alimentos entraram em contato acidental com leveduras

no meio em que estavam, como no local de armazenamento de alimentos (BETTS).

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O hidromel, bebida alcoólica a base de mel fermentado por leveduras e produto

biotecnológico é considerado a bebida alcoólica mais antiga conhecida. Acredita-se

que sua descoberta ocorreu na Idade da Pedra quando o mel entrou em contato

com a chuva e leveduras fermentaram a mistura (BETTS). Além disso, acredita-se

que o pão surgiu há aproximadamente 5.000 anos atrás no Antigo Egito, quando a

massa para pão foi contaminada por leveduras que produziram dióxido de carbono

como resultado da fermentação de açúcares na massa – aumentando o tamanho do

pão e conferindo-o textura, sabor e cheiro característicos (BETTS).

Considerando todo o potencial e problemas relacionados às leveduras,

entende-se que seu estudo é vital, especialmente para profissionais que trabalham

com o processamento de alimentos (BETTS) e profissionais nas áreas de

biotecnologia e medicina, pelas suas possíveis aplicações em tecnologias

emergentes.

Na medicina, as leveduras são foco de estudo devido a doenças em

pacientes, especialmente por causa do aumento de espécies patógenas. Descobriu-

se que espécies antes consideradas saprófitas, que apenas realizavam a

decomposição de compostos orgânicos, em determinadas situações agem como

microrganismos oportunistas e causadores de doenças (PINCUS; ORENGA;

CHATELLIER, 2007). Em condições favoráveis, mais do que as 12 espécies hoje

classificadas como leveduras patógenas podem, de fato, provocar problemas de

saúde (PINCUS; ORENGA; CHATELLIER, 2007).

Além disso, diversas espécies de leveduras apresentam resistência a

medicamentos antifúngicos, sendo as infecções causadas por leveduras

relacionadas à altas taxas de mortalidade. Esse fato torna imperativo a identificação

precisa de espécies de leveduras para o tratamendo de doenças de forma

apropriada, além de possibilitar o descobrimento de espécies patógenas então

desconhecidas (PINCUS; ORENGA; CHATELLIER, 2007).

Outras possíveis aplicações das leveduras na medicina relacionam-se com o

desenvolvimento de uma vacina para a hepatite B (BOTSTEIN; FINK, 2011) e para o

vírus do papiloma humano (NIELSEN, 2015) preparada a partir de leveduras, além

7

de outros medicamentos como a insulina, os opioides (preparados através da

engenharia genética de leveduras, gerando como produto biotecnológico um potente

medicamento para a dor) e o soro de albumina (NIELSEN, 2015).

Além dessas aplicações biotecnológicas na medicina, as leveduras podem

ser utilizadas em áreas emergentes da biotecnologia como no estudo de células

eucarióticas e na engenharia genética de circuitos. Isso deve-se à conclusão de que

leveduras são o organismo ideal para experimentos em biologia moderna,

considerando-as "modelo para qualquer célula eucariótica devido a facilidade de

estabelecer-se relações entre a estrutura dos genes e a função das proteínas"

(Botstein; Fink, 1988, p. 1440 et al Botstein, Fink, 2011). As leveduras também são

recomendadas para produção em larga escala de produtos biotecnológicos devido

ao baixo custo de seus meios de cultura e pela ampla gama de tecnologias

aperfeiçoadas e específicas para leveduras, sendo a própria levedura um produto

comercializável como alimento para animais e, portanto, não gera custos adicionais

para a retirada de microrganismos após fermentação. Essas vantagens são ainda

mais importantes para a indústria de biocombustíveis e no Brasil e na China já

utiliza-se leveduras para produzir combustíveis à base de etanol (BOTSTEIN; FINK,

2011).

Demais aplicações na indústria relacionam-se com a produção industrial de

produtos químicos como ácido láctico, resveratrol e ácido succínico, além de

biocombustíveis de maior complexidade como o isobutanol (NIELSEN, 2015).

1.1.1 Garopaba e região: como a cultura está relacionada com fungos

As quilombolas são comunidades de descendentes de africanos. A quilombola

do Morro do Fortunato localiza-se em Garopaba, mais especificamente na Lagoa do

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Siriú. Ela foi fundada em terras que pertenceram a um produtor da região, que doou

as terras para uma mulher e seu filho após a abolição da escravatura. Eles

utilizaram essa terra para plantar e através da história da quilombola seus

descendentes conseguiram a regularização da terra reconhecida pelo estado de

Santa Catarina. Essa luta pelo direito à terra deles inova a própria palavra

“quilombola”, agora com o significado de luta: pela sua permanência, luta para o seu

reconhecimento na região, luta para preservar sua cultura preciosa e única.

FIGURA 1: Morro do Fortunato. Fonte: Maiara Leonel Pereira.

A cultura que a quilombola do Morro do Fortunato traz é inestimável, mas

constata-se que se está perdendo o conhecimento tradicional na quilombola. Os

moradores são obrigados a sair da comunidade para trabalhar e o conhecimento

transmitido durante décadas de plantio, colheita e produção de alimentos poderia ser

perdido por falta da prática desse conhecimento no cotidiano dos moradores. Para

resgatar esse conhecimento tradicional, foi realizado um projeto para a produção de

geleias com os produtos gerados dentro da própria quilombola, como a cana de

açúcar e frutas. Portanto, a produção de geleia representa uma forma de expressão

cultural da comunidade, resgatando o conhecimento tradicional e utilizada como

fonte de renda pelos moradores.

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FIGURA 2: Morro do Fortunato. Fonte: Diário Catarinense de 09/09/2014.

Entretanto, algumas geleias após poucos dias ficam inutilizadas devido ao

crescimento de leveduras e bolores. Na figura 3 pode-se visualizar em (A) geleia de

maçã, que em quatro dias foi fotografada e (B), geleia de acerola e gengibre, que em

um mês chegou a esse estado, ambas sem refrigeração. A maior diferença entre as

duas é a consistência: a geleia de maçã é mais líquida que a outra geleia. A

alteração como vista pode gerar a desvalorização dos produtos da comunidade e a

perda de consumidores.

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FIGURA 3: Geleia de maçã à esquerda (A) e geleia de acerola e gengibre à direita (B).

Contaminação por fungos.

Esse é um exemplo local da importância dos estudos sobre os fungos como

alteradores de alimentos, especialmente nas geleias devido a características do

alimento que inibem o crescimento bacteriano (e consequentemente criam

oportunidade para fungos desenvolverem-se). Dentre essas características

destacam-se: baixa atividade de água (ou seja, baixa quantidade de água disponível

para microrganismos utilizarem em seu metabolismo, o que inibe principalmente as

bactérias) e alta pressão osmótica (devido a maior porcentagem de açúcar no

alimento, sendo nesse caso o açúcar metabolizado por leveduras osmofílicas, que

sobrevivem em meios de alta pressão osmótica).

As leveduras alteram a geleia através de fermentações, que produzem como

resultado álcool etanol e outros produtos secundários. Os fungos de forma geral

alteram permanentemente o sabor, o cheiro e a segurança de consumo do produto.

A alteração do alimento por leveduras deve-se a uma junção de fatores,

dentre os quais pode-se citar:

➢ Contaminação da matéria prima ou no processamento: a comunidade utiliza

matéria prima não industrial e plantada no próprio terreno, sendo suscetível à

contaminação por leveduras e outros fungos provenientes do ar em sua colheita,

transporte, armazenamento e/ou processamento do produto. Essa contaminação, se

constatada veredicta, pode ser corrigida através de um processamento com a

eliminação total de microrganismos ou com a alteração de práticas e normas atuais.

➢ Concentração insuficiente de açúcar: a quantidade insuficiente de açúcar

adicionado ou a pureza do açúcar insuficiente pode alterar o grau Brix (°Bx) e o

produto pode não alcançar a atividade de água necessária para impedir o

crescimento de fungos. Pode ser facilmente corrigida através do aumento da

quantidade de açúcar ou na diminuição considerável da quantidade de água

adicionada. Como exemplo toma-se a geleia de maçã que, como produto final

sólido, poderia prorrogar a alterção do alimento. Essa correção pode ser suficiente

para evitar futura alteração dos produtos por fungos.

11

➢ Rotulagem insuficiente: deve-se mencionar no rótulo a necessidade de

refrigeração após o produto ser aberto para evitar que consumidores não

armazenem o produto na geladeira, o que estimularia a deterioração do produto.

Assumindo que a comunidade da quilombola não irá industrializar seu produto

pela proposta de um produto natural e sem conservantes químicos (além do açúcar)

e, portanto, não irá alterar o manejo de matérias-prima e seu subsequente

processamento, conclui-se que a adição no rótulo da necessidade de refrigeração e

a solidificação da geleia podem ser suficientes para evitar a alteração do produto

comercializado sem alterar os costumes e conhecimentos tradicionais da

quilombola, preservando assim a cultura de Garopaba e o comércio da cidade

turística.

1.2 Biologia de leveduras

As leveduras são fungos unicelulares e eucariontes. Sua nomenclatura deriva

do latim levare, levantar, referindo-se ao efeito que produzem em alguns alimentos

como o já mencionado pão, efeitos estes que surgem através das fermentações

realizadas pelas leveduras. Elas são imóveis (não possuem aparelho para

locomoção), quimio-heterotróficas e aeróbias facultativas.

A classificação das leveduras é realizada em dois grupos filogenéticos:

➢ ascomicetos (teleomórficas e anamórficas), que produzem ascos contendo

esporos sexuados, os ascosporos;

➢ basidiomicetos (teleomórficas e anamórficas), que produzem esporos

(basídios).

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A classificação sexual das leveduras difere-as em teleomórficas, as que

possuem reprodução assexual e anamórficas, as que possuem reprodução sexual.

Além dessa classificação, as leveduras podem ser classificadas dependendo:

➢ de sua morfologia, seja esta esférica, ovóide, cilíndrica, triangular, apicular ou

ogival;

➢ presença ou ausência de pseudomicélios e micélios;

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FIGURA 4: Morfologia de leveduras. Fonte: Veira e Queiroz (2012).

1.2.1 Estrutura celular

14

As leveduras são organismos eucarióticos de estrutura simples. Apresentam

diversas organelas, mencionando-se em especial a parede celular, responsável pela

forma da levedura. Observa-se na espécie de levedura Saccharomyces cerevisiae

(espécie muito estudada em função de suas propriedades fermentativas) uma

parede formada por glicano (de 30 a 34%) e manano (30%) segundo Veira e Queiroz

(2012). Nota-se que a organela é mais fina em células jovens e mais espessa em

adultas. Outros componenetes da parede celular são as proteínas (de 6 a 8%), os

lipídeos (de 8,5 a 13,5%) e a quitina, esta última com quantidade variável de espécie

a espécie, representando aproximadamente de um a dois porcento da parede celular

(VEIRA; QUEIROZ, 2012).

É necessário mencionar que a constituição da parede celular é uma

preocupação para métodos de extração de DNA devido à rigidez e dificuldade para

realizar a lisis celular de leveduras (primeira etapa para uma extração de DNA).

Devido a essa dificuldade, utiliza-se muitas vezes esferas de vidro para auxiliar na

lisis celular.

Outra organela presente nas leveduras é o citoplasma, líquido no qual as

organelas estão dispostas. O citoplasma contém enzimas, carboidratos de reserva

como o glicogênio, ribossomos e polifosfato, além de uma porção de DNA (VEIRA;

QUEIROZ, 2012).

Já a membrana citoplasmática localiza-se abaixo da parede celular, sendo

sua função a seleção dos compostos que entram e saem da célula, protegendo a

levedura de possíveis perdas de pequenas moléculas por vazamento do citoplasma

(VEIRA; QUEIROZ, 2012). Essa membrana é constituída por glicoproteínas, lipídeos

e, ao invés de colesterol como em mamíferos, possui ergosterol (VEIRA; QUEIROZ,

2012).

Determinadas leveduras além das organelas já apresentadas apresentam

uma substância capsular, constituída por polissacarídeos.

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Já o núcleo dessas células eucariontes é pequeno, esférico e reniforme (em

formato de rim) e existe uma membrana semipermeável ao seu entorno, com

funções tanto metabólicas quanto reprodutivas (VEIRA; QUEIROZ, 2012).

Ademais, a estrutura celular apresenta vacúolos, de forma esférica, cercados

por uma membrana simples, constituídos de substâncias de transporte armazenadas

nessa organela como enzimas, aminoácidos livres e lipídeos, sendo também

armazenadas as enzimas hidrolíticas (que quebram substâncias em partes

menores), como descrito por Veira e Queiroz (2012).

Outra organela presente nas leveduras são as mitocôndrias, que variam de

uma a vinte por célula e são responsáveis pelos processos de conversão aeróbios

de energia (VEIRA; QUEIROZ, 2012).

Já quanto ao tamanho das células, varia-se dependendo da espécie; em uma

cultura jovem, pode-se visualizar tamanhos uniformes em determinadas espécies ou

completamente heterogêneos. O tamanho das células varia entre 5 a 30 μm de

comprimento e 1 a 5 μm de largura (VEIRA; QUEIROZ, 2012).

FIGURA 5: Estrutura celular de leveduras. Fonte: Veira e Queiroz (2012).

16

1.2.2 Constituição genética

A genética das leveduras pode ser dividida em DNA cromossômico, DNA

mitocondrial, DNA citoplasmático e RNA citoplasmático (fator killer).

Entende-se pela sigla DNA o ácido desoxirribonucleico, onde a informação do

genotipo de um organismo é armazenada. O DNA é caracterizado por duas fitas e a

diversificação de bases nitrogenadas cujo código influencia na produção de

proteínas do organismo, sendo estas bases: guanina, citosina, adenina e timina. Em

células eucariotas o DNA está presente no núcleo de uma célula em forma de

cromossomo, ou seja, de uma junção de nucleossomos (estes compostos de DNA

enrolado em proteínas chamadas histonas).

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FIGURA 6: Estrutura de DNA. Fonte: <http://www.cancer.gov/images/cdr/Live/CDR761781.jpg>.

Acesso em 12 de maio de 2016.

O DNA cromossômico na levedura modelo Saccharomyces cerevisiae

representa aproximadamente 80% do DNA presente no organismo unicelular; é

dividido em 32 cromossomos lineares (16 pares de cromossomos) e cada

cromossomo possui tamanho aproximado de 200 a 2200 kb (Jiménez, 2007). O

maior cromossomo é o XII, que contém genes (genes 25S, 18S, 5.8S e 5S) que

codificam informação para o RNA ribossômico (Jiménez, 2007). Esses genes podem

ser utilizados para a identificação molecular de leveduras, em um processo posterior

à extração de DNA utilizando técnicas de PCR com o método RFLP.

O DNA mitocondrial possui apenas um cromossomo, circular, de

aproximadamente 75 a 85 kb (Foury 1998, apud Jiménez, 2007). Já o DNA

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citoplasmático presente na espécie S. cerevisiae é circular, de aproximadamente 2

μm de tamanho, 6,3 kb e 60 a 100 cópias no citoplasma.

O RNA citoplasmático presente em determinadas cepas de leveduras é de

vital importância para a indústria alimentícea porque pode afetar a produção de

alimentos que dependem da fermentação. Isso deve-se ao fato de agirem como

fenômeno chamado de fator killer. O fator killer pode ser descrito como a produção

de toxinas de atividade antimicrobiana, que afetam microrganismos suscetíveis

através de receptores na membrana celular específicos em microrganismos que

podem ser afetados. Nem todas as leveduras produzem toxinas; as leveduras que

possuem fator killer podem destruir células da mesma espécie ou de espécies

distintas, especialmente em substratos com baixo potencial hidrogeniônico (pH) e

alta concentração de açúcar (POLONELLI et al., 1991 apud PONZZES et al., 2007).

1.2.3 Nutrição e crescimento

As leveduras são microrganismos heterotróficos que requerem basicamente

uma fonte de carbono e uma de nitrogênio para realizar seu metabolismo. Seu

crescimento ocorre em uma gama de 0 °C a 47 °C, com temperatura ideal de 20 ºC

a 30 ºC, sendo imprescindível a presença de água (VEIRA; QUEIROZ, 2012).

Existem leveduras osmofílicas ou xerotolerantes, leveduras especializadas em

crescer em ambientes de pressão osmótica alta (ambientes com altas quantidades

de sal ou açúcar), onde outros microrganismos geralmente não são capazes de se

desenvolverem. Além disso, de maneira geral, o pH ideal seria o neutro, sendo que

leveduras não toleram pH alcalino (VEIRA; QUEIROZ, 2012).

Elas são capazes de crescimento anaeróbio facultativo, utilizando o oxigênio

ou um composto orgânico para gerar energia. Em presença de oxigênio, as

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leveduras "respiram" aerobicamente para metabolizar carboidratos, formando

dióxido de carbono e água; o substrato é completamente oxidado e diz-se que há

respiração (VEIRA; QUEIROZ, 2012). Na ausência de oxigênio elas fermentam

carboidratos e produzem etanol e dióxido de carbono, onde o substrato é

parcialmente degradado, acarretando na formação de metabólitos; diz-se que há

fermentação (VEIRA; QUEIROZ, 2012).

Geralmente associa-se as leveduras com a metabolização da glicose e da

sacarose. Entretanto, as leveduras são capazes de degradar uma ampla gama de

compostos químicos, dentre eles álcools, ácidos orgânicos, hidrocarbonetos e

compostos aromáticos, além da capacidade de metabolizar conservantes ácidos

comuns em alimentos utillizados para a conservação destes como o ácido benzóico,

ácido sórbico e o ácido propiônico (BETTS).

Das fontes de nitrogênio as leveduras utilizam ácidos ogânicos, sais de

amônio, sulfato, fosfato e nitrato. Já a fonte de carbono utilizada por esses

microrganismos é o açúcar, que pode ser metabolizado de forma aeróbica ou de

forma anaeróbica. As leveduras não são capazes de utilizar amido e celulose como

fonte de carbono, segundo Veira e Queiroz (2012) e aminoácidos podem ser

metabolizados como fonte de carbono ou como fonte de nitrogênio (JIMÉNEZ,

2007). Os principais açúcares metabolizados pelas leveduras são, de acordo com

Jiménez (2007):

➢ Monossacarídeos como D-glucosa, D-fructosa e D-manosa, utilizados por

determinadas espécies de leveduras através da respiração e em outras

através da fermentação;

➢ Dissacárideos como a sacarose e a maltose, fermentados por determinadas

espécies, sendo raramente fermentada a lactose;

➢ Trissacarídeos como a rafinose, metabolizados através da fermentação.

Há diversos outros componentes necessários para o crescimento e a

reprodução de leveduras além de fontes de carbono e nitrogênio e água como já

mencionado. São necessárias fontes de hidrogênio, fósforo, magnésio, vitaminas

20

como a biotina, ácido pantotênico, tiamina e quantidades mínimas de oligoelementos

como potássio, cálcio, silício, enxofre, ferro, cloro, bóro, cobre, iodo, manganês,

molibdênio e zinco.

Dependendo da quantidade de nutrientes acessíveis as leveduras, seu

crescimento pode levar tempo distinto. Entretanto, considera-se fases comuns ao

crescimento:

FIGURA 7: Fases do crescimento de leveduras. Fonte: Veira e Queiroz (2012).

Sempre deve-se utilizar um cultura nova em laboratório, de preferência em

fase log ou iniciando fase estacionária. Isso deve-se ao fato de que culturas já nas

fases posteriores possuem maior quantidade de resíduos produzidos pelas próprias

leveduras e que podem influenciar na subsequente extração de DNA.

O crescimento de leveduras pode ser de forma assexual (cerca de 50% de

leveduras apenas reproduzem-se de forma sexual, segundo Veira e Queiroz, 2012).

A reprodução assexual se realiza em forma de brotamento ou por fissão celular.

21

O brotamento, também chamado de gemulação, caracteriza-se pelo

surgimento de uma protuberância denominada broto na superfície de uma célula.

Esse broto pode separar-se e tornar-se uma nova levedura ou permanecer ligado à

célula que o originou, formando assim uma cadeia. Uma célula produz em média 24

brotos, sendo esses brotamentos sucessivos em diferentes partes da superfície da

célula original (denominada célula mãe) e que deixam uma cicatriz como resultado

da reprodução assexual (VEIRA; QUEIROZ, 2012).

FIGURA 8: Reprodução assexual de levedura por brotamento.

Fonte: Veira e Queiroz (2012).

Já a fissão celular, também chamada de cissiparidade e divisão binária,

constitui-se pela divisão da célula de forma similar a reprodução de bactérias

(VEIRA; QUEIROZ, 2012). Nesse tipo de reprodução a levedura alonga-se,

ocorrendo a divisão de organelas como o núcleo, formando-se "células-filhas" que

podem não separarem-se da "célula-mãe", ocorrendo a formação de cadeias de

células.

Já a reprodução sexuada cosntitui-se pela produção de esporos. A

esporulação é uma fase do ciclo sexual da levedura, onde as leveduras alteram

entre haplóide (quando possuem apenas uma cópia de cada cromossomo) e

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diplóide (quando cromossomos organizam-se em um par de cromossomos

homólogos). Essa alternância é importante por propiciar mudanças genéticas que

caracterizam um melhoramento genético natural.

A esporulação ocorre em condições aeróbias, pois sem oxigênio pouco ou

nenhum esporo é formado (VEIRA; QUEIROZ, 2012).

FIGURA 9: Reprodução por esporolação; ciclo de vida da levedura modelo Saccharomyces

cerevisiae, sendo que a e α referem-se aos alelos que influenciam na reprodução das leveduras.

Fonte: Jiménez (2007).

23

1.2.4 Fermentação alcoólica

O termo "fermentação" deriva-se da palavra em latim fervere, ferver,

referindo-se ao gás resultante da decomposição de compostos químicos realizada

pelas leveduras. Na produção de alimentos compreende-se como fermentação

alcoólica a etapa em que microrganismos em ausência de oxigênio transformam

açúcares em álcool (UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS, 2015). Além da

iminente produção de álcool e consequente acidificação do alimento outros

compostos também são produzidos, estes podendo resultar na alteração do aroma e

do sabor do produto final.

Geralmente o metabolismo de um microrganismo que realiza fermentação

alcoólica segue a via de Embden-Meyorhof-Parnas, como pode-se observar no

esquema abaixo.

24

FIGURA 10: via de Embden-Meyorhof-Parnas.

Sendo a reação:

Glicose + 2 ADP + 2 P + 2 H → 2 Etanol + 2 CO2 + 2 ATP + 2 H2O

Além do etanol algumas moléculas de açúcar são degradadas através de

outras rotas metabólicas, gerando produtos distintos como glicerol, ácido pirúvico,

ácido acético, acetoína, diacetilo, 2-3 butanodiol, ácido succínico, ácido láctico,

dentre outros (UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS, 2015).

A estequiometria da reação:

180 g glicose = 88 g CO2 + 92 g etanol

Para a produção de alimentos, considera-se que 2 °Bx de açúcar fermentados

irão produzir 1 % vol. de etanol.

1.2.4.1 Hidromel: fermentação do mel em produto biotecnológico

Um exemplo da importância da fermentação alcoólica de leveduras é o

hidromel. O hidromel pode ser definido como uma bebida a base de mel diluído que

é submetida à fermentação alcoólica até alcançar-se a concentração alcoólica

desejada, sendo essa fermentação realizada por leveduras (UNIVERSIDAD

NACIONAL DE ENTRE RÍOS, 2015). Além disso, o hidromel é um raro exemplo de

produto biotecnológico não produzido majoritariamente por empresas e, sim,

produzido (e não comercializado) de forma artesanal.

A preparação de hidromel pode ser dividida nas seguintes etapas:

1. Diluição e aquecimento:

25

Dilui-se o mel de concentração de açúcar de 75% - 80% até um conteúdo

final de aproximadamente 25 – 26% de forma a obter-se hidromel com nível

alcoólico de 13 %. Ferve-se o mel e elimina-se a espuma formada durante o

processo, eliminando-se leveduras e outros microrganismos naturalmente presentes

no mel.

FIGURA 11: Aquecimento da diluição de mel.

2. Fermentação:

Utiliza-se leveduras liofilizadas para uma produção mais rápida, eficiente e

com menor produção de compostos secundários ao etanol. As leveduras utilizadas

podem ser da espécie Saccharomyces bayanus.

26

FIGURA 12: Saccharomyces bayanus liofilizada em visualização macroscópica.

FIGURA 13: Saccharomyces bayanus no mosto de mel diluído em aumento de 1000 vezes

em microscópio óptico.

Após o tratamento térmico, adiciona-se outros compostos necessários para o

desenvolvimento de leveduras como o ácido tartático. Adiciona-se as leveduras

27

liofilizadas e a solução de mel diluído é fechada, garantindo um ambiente anaeróbico

para evitar a contaminação de bactérias e incentivar a fermentação de leveduras.

3. Trasfega e amadurecimento

Separa-se a solução de mel diluído dos sólidos resultantes da fermentação

alcoólica e a solução é armazenada em garrafas para o amadurecimento e

finalização da produção de hidromel.

FIGURA 14: Armazenamento de garrafas de vidro com mosto para hidromel em geladeira. A direita

observa-se protótipo para a produção de hidromel, em envase diferente, onde pode-se observar

mangueira que é submersa em água, permitindo a contagem de bolhas por minuto em um pote.

Analisa-se o processo de produção de acordo com a seguinte tabela:

Mel diluído (produto

inicial)

Mosto (analisado

semanalmente, durante o

processo de

fermentação)

Hidromel (produto final)

°Bx °Bx °Bx

Potencial hidrogeniônico

(pH)

Potencial hidrogeniônico

(pH)

Potencial hidrogeniônico

(pH)

Açúcares redutores diretos

(método Fehling-Causse-

Açúcares redutores diretos

(método Fehling-Causse-

Açúcares redutores diretos

(método Fehling-Causse-

28

Bonnans) Bonnans) Bonnans)

CO2 (bolhas por minuto) Graduação alcoólica

Os graus brix (°Bx) são medidos com refratômetro. Os açúcares redutores

diretos são medidos através do método Fehling-Causse-Bonnans. O potencial

hidrogeniônico é analisado com pHmetros regularmente calibrados antes da análise

das amostras. A graduação alcoólica pode ser determinada através da utilização de

protocolos como visto no estudo de Benavent e Esparza (1996). Já a medição de

dióxido de carbono (CO2) é realizada por uma média da quantidade de bolhas por

minuto em um recipiente conectado com a tampa da garrafa com a solução de mel

diluído (como observado no protótipo da figura anterior).

FIGURA 15: Refratômetro.

29

FIGURA 16: Reação química durante o método Fehling-Causse-Bonnans.

30

2 DESENVOLVIMENTO

2.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolver e aperfeiçoar um protocolo para a extração de DNA de

leveduras, obtendo DNA com a purificação e integridade necessárias para uma

posterior identificação molecular.

2.1.1 Objetivos específicos

➢ Isolar leveduras a partir de amostras naturais.

➢ Aperfeiçoar uma metodologia básica para extração de DNA a partir de

leveduras usando o método CTAB

➢ Determinar a qualidade e integridade do DNA obtido para ser usado em

técnicas de PCR.

2.2 METODOLOGIA

31

A metodologia utilizada nesse estudo foi cuidadosamente escolhida a partir de

artigos reconhecidos e com equipamentos disponíveis no laboratório de

Biotecnologia da Universidad Nacional de Entre Ríos. Os métodos utilizados nesse

estudo são descritos sucintamente no diagrama a seguir (figura 17) e descritos em

maiores detalhes nas próximas seções, sendo os protocolos utilizados descritos na

seção de procedimentos experimentais.

FIGURA 17: Metodologia utilizada nesse estudo. (1) Isolamento de levedura. (2) Repicagem

em placas de Petri e/ou tubos de vidro. (3) Extração de DNA. (4) Análise da qualidade de DNA por

eletroforese e quantificação de DNA por espectrofotômetro.

32

2.2.1 Método e foco de estudo

A pesquisa científica é o resultado de um inquérito ou exame minucioso,

realizado com o objetivo de resolver um problema, recorrendo a procedimentos

científicos. Investiga-se uma pessoa ou grupo capacitado (sujeito da investigação),

abordando um aspecto da realidade (objeto da investigação), no sentido de

comprovar experimentalmente hipóteses (investigação experimental), ou para

descrevê-la (investigação descritiva), ou para explorá-la (investigação exploratória).

A metodologia adotada no presente estudo é a pesquisa experimental. Para Gil

(2007) apud Gerhardt; Silveira (2009),

"a pesquisa experimental consiste em determinar um objeto de

estudo, selecionar as variáveis que seriam capazes de influenciá-lo,

definir as formas de controle e de observação dos efeitos que a

variável produz no objeto".

O foco do presente estudo foi definido pela importância das leveduras na

atualidade e pela ausência de protocolos para extração de DNA com materiais

facilmente adquiridos na américa latina e sem a necessidade de equipamentos mais

sofisticados, como esferas de vidro, sendo esse último equipamento utilizado na

grande maioria dos protocolos existentes para a extração de ácidos nucleicos de

leveduras como visto em Querol et al. (1992), embora não seja aplicável para

análises de DNA em larga escala. Além disso, constitui-se de vital importância a

descrição detalhada e coerente de protocolos de extração, pois há artigos que

apresentam protocolos de extração de DNA com as características citadas mas que

não possuem reproducibilidade devido à falta de informação, como pode-se

observar em Silva et al. (2012). Com a disseminação de técnicas molecurares a

comparação e validação de informações de pesquisas científicas de diferentes

laboratórios requer a padronização de protocolos, sendo a extração de DNA

intrinsecamente dependente do tipo e do tamanho dos materiais e equipamentos

utilizados; um protocolo para a extração de DNA é a mais importante variável

quando compara-se informações entre diferentes laboratórios (MINAS et al., 2011)

33

e, por isso, é de vital importância a padronização de um protocolo para laboratórios

com materiais de fácil aquisição, para análise de amostras em larga escala e

detalhado o suficiente para sua reproducibilidade futura, tendo em vista as

biotecnologias emergentes relacionadas com leveduras.

2.2.2 Caracterização das leveduras

As leveduras utilizadas nesse estudo foram isoladas de mel de eucalipto

produzido na cidade de Concordia (Argentina) identificadas como Saccharomyces

spp. As leveduras isoladas estavam conservadas em freezer até serem repicadas

para uma placa de Petri e foram novamente conservadas em freezer.

FIGURA 18: Caracterização macroscópica de leveduras encontradas em mel da cidade de

Concordia, Argentina.

34

FIGURA 19: Caracterização microscópica de leveduras encontradas em mel da cidade de Concordia,

Argentina, em aumento de 1000 vezes em microscópio óptico.

O mel é um alimento produzido por abelhas a partir do pólen. É um alimento

que possui diversos nutrientes com potencial de serem metabolizados por leveduras,

além de diminuição de outros tipos de microrganismos devido à baixa atividade de

água. Por isso, diversas espécies de leveduras podem ser encontradas na microflora

natural do mel, especialmente leveduras osmofílicas.

2.2.3 Assepsia

35

Entende-se por assepsia um conjunto de métodos capazes de descontaminar

pessoas ou objetos de microrganismos (patógenos ou maléficos para determinada

técnica). Em microbiologia é uma prática vital devido à alta possibilidade de

contaminação de amostras e, portanto, todos os equipamentos utilizados

especialmente na fase de cultura de microrganismos devem ser previamente

esterilizados. Todas as técnicas empregadas nesse estudo estão de acordo com as

normas da Universidad Nacional de Entre Ríos (2016).

A esterilização é um tratamento que possui como objetivo a eliminação de

toda e qualquer forma de vida microbiana incluindo esporas e vírus em um objeto ou

uma substância (UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS, 2016). Diversos

métodos podem ser utilizados, dependendo do que vai ser esterilizado e sua

utilização posterior.

FIGURA 20: Métodos de esterilização de acordo com normas da Universidad Nacional de Entre Ríos

(2016) utilizados no presente estudo.

Calor seco:

O calor seco elimina os microrganismos através da desidratação. Um dos

métodos mais utilizados é o de flambar um material em um bico de Bunsen. Utiliza-

se essa técnica para esterilizar pinças, alças, bocas de tubos de ensaio, dentre

outros materiais de vidro e metal sempre imediatamente antes e depois de utilizar o

material. Dependendo da técnica em que o material é utilizado – como em contato

com culturas de microrganismos e para a repicagem – deve-se esperar esfriar antes

Métodos de esterilização

CalorAntisépticos

Húmido Seco

Vapor com pressão Chama

36

de colocar o material em contato com os microrganismos estudados para não

eliminar os microrganismos, sem que o material entre em contato com qualquer

outro tipo de superfície para evitar recontaminação do material.

É vital trabalhar-se próximo de um bico de Bunsen, pois essa prática visa

diminuir microrganismos no campo de trabalho. Utiliza-se apenas a zona oxidante e

a zona redutora para flambar materiais.

FIGURA 21: Zonas de uma chama em um bico de Bunsen.

FIGURA 22: Flambando material em bico de Bunsen. Fonte: <http://tse4.mm.bing.net/th?

id=OIP.M00ba48090dbf4ae4e9a05d85b9f82dfbo0&pid=15.1Z> Acesso em 05 de maio de 2016.

Calor úmido:

37

O calor úmido utiliza vapor de água para eliminar microrganismos através da

osmose, pela coagulação do protoplasma dos microrganismos. Há diferentes

métodos que podem ser utilizados e durante esse estudo utilizou-se vapor a

pressão. A esterilização por vapor a pressão realiza-se em equipamento

denominado autoclave de Chamberland. Para uma esterilização completa e,

portanto, a eliminação de esporos (estado de latência de organismos, conferindo-os

resistência ao calor e outros intempéries) deve-se submeter o material a pressão de

1 atm, temperatura de 121 °C durante 15 minutos.

FIGURA 23: Autoclave de Chamberland.

Fonte: <http://tse4.mm.bing.net/th?id=OIP.Mfff2f1eab0714a26425a4734e309fa40o0&pid=15.1>.

Acesso em 05 de maio de 2016.

➢ Antissépticos:

São substâncias que inibem ou eliminam microrganismos, depedendo da

concentração utilizada. Eliminam microrganismos através da coagulação de

proteínas, inativação de enzimas ou através de modificações na permeabilidade da

membrana celular. Um exemplo de antiséptico utilizado durante esse estudo é o

etanol a 70% (completado com água destilada).

38

2.2.4 Cultura

Cultura define-se como um método para a multiplicação de microrganismos.

Microrganismos são inoculados em meio de cultura e são incubados, isso é, são

armazenados em estufa com temperatura adequada para seu crescimento,

formando assim colônias (junção de grande quantidade de microrganismos,

tornando-se visível ao olho humano sem necessidade de microscópio).

Há diversas técnicas para a realização de um cultura de microrganismos e a

escolha de um método depende do propósito da cultura, do microrganismo cultivado

e dos materiais que estão disponíveis em determinado laboratório, como meios de

cultura e o método da técnica (dependendo de ser uma semeadura, a introdução de

microrganismos em um meio de cultura, ou uma repicagem, a passagem de uma

colônia de microrganismos de um cultura para outra). Dentre algumas regras gerais:

✔ A alça bacteriológica (ou o equipamento utilizado com fim semelhante) deve

ser esterilizada por flambagem imediatamente antes e após sua utilização.

✔ Todos os recipientes (como materiais esterilizados e Erlenmeyers com meios

de cultura) devem ser abertos próximos a chama de um bico de Bunsen.

✔ Recomenda-se a utilização de um fluxo laminar específico para microbiologia

para evitar contaminação de amostras. Caso isso não seja possível, deve-se

esterilizar apropriadamente a bancada de trabalho sempre antes e depois de

trabalhar com microrganismos, evitando que materiais de cultura

permaneçam abertos durante a cultura, além de nunca colocar-se as tampas

de tubo sobre a bancada. Nota-se que a não utilização de um fluxo laminar

aumenta consideravelmente o risco de contaminação por microrganismos

provenientes de outras fontes além da amostra e, embora o fluxo laminar seja

39

dispensado no treinamento de técnicas microbiológicas, esse equipamento

torna-se vital para resultados de confiança.

✔ Toda amostra realizada em laboratório deve ser efetuada em duplicata.

Meios de cultura podem ser definidos como uma mistura de nutrientes em

concentrações adequadas para garantir o crescimento de um microrganismo

(UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS, 2016). A utilização de meios de

cultura apropriados é fundamental para o crescimento de microrganismos e sua

posterior utilização nas mais diversas técnicas de microbiologia e biotecnologia. O

crescimento de um microrganismo está diretamente relacionado com a interação

desse microrganismo com o meio que está inserido, sendo essa interação

influenciada por fatores intracelulares e extracelulares. Portanto, os componentes de

um meio de cultura devem ser cuidadosamente selecionados para que possam

cumprir os requisitos de crescimento e de formação de produtos (produtos formados

através de, por exemplo, fermentações) além de surprir a necessidade de energia

utilizada para o metabolismo celular. A maioria dos meios de cultura e substâncias

químicas para meios de cultura são comercializados em pó e devem ser

conservados nos seus frascos originais com a tampa fortemente fechada, sendo sua

preparação de acordo com as instruções do fabricante e adicionando-se água

destilada para hidratar o pó, posteriormente esterilizando o meio de cultura em

autoclave (UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS, 2016).

Adiciona-se aos meios de cultura um agente solidificante para culturas em

placas de Petri, como o ágar (polissacarídeo obtido de determinadas algas

marinhas). Meios de cultura também podem ser líquidos, chamados de caldos. A

escolha do tipo de meio de cultura depende da finalidade de sua utilização. Nesse

estudo ambos tipos de meios de cultura são utilizados com a finalidade de renovar

os microrganismos. Essa renovação é extremamente importante para técnicas de

extração de DNA, pois na fase estacionária e de declínio no crescimento microbiano

a quantidade de impurezas em um cultura eleva-se em função dos produtos criados

pelos microrganismos e tal elevação de impurezas pode influenciar diretamente na

extração de DNA. Nesse trabalho inicia-se uma cultura com meio de cultura sólido e

após o crescimento em uma placa de Petri transfere-se colônias desse

40

microrganismo para tubos de vidro contendo um caldo e, posteriormente, transfere-

se microrganismos desse caldo para outros tubos de vidro, com o propósito de

renovação contínua de microrganismos através de tubos, utilizando para os

experimentos o tubo de cultura mais recente (de aproximadamente 24 a 48 horas).

O ágar utilizado nesse estudo é Ágar Batata Dextrosado, meio recomendado

pela APHA (American Public Health Association) para cultura, identificação e

contagem de fungos em derivados de leite e outros alimentos, sendo o aspecto do

meio preparado âmbar claro.

O extrato de malte é o caldo utilizado nesse estudo, ideal para a cultura de

leveduras e bolores devido à sua alta concentração de nutrientes metabolizados por

leveduras (como o dissacarídeo maltose como fonte de energia, a dextrina e a

glicerina como fontes de carbono e a peptona como fonte de nitrogênio) e potencial

hidrogeniônico ácido, esse último com o potencial de inibir o crescimento de

bactérias.

Além do que já foi apresentado, o isolamento de microrganismos é uma

técnica vital para práticas em microbiologia. Para uma extração de DNA bem

sucedida deve-se utilizar apenas uma espécie de organismo e, geralmente, esse

microrganismo é proveniente de alimento ou de outros meios, como o solo e a água.

O isolamento de um microrganismo requer que todas as práticas sejam realizadas

com métodos estrictos de assepsia, além de rotulagem cuidadosa de cada parte do

isolamento. Inicia-se o isolamento em fluxo laminar, pesando a amostra de alimento

ou de outro meio em esterilidade, realizando-se uma primeira diluição. Dessa

diluição, realiza-se as demais diluições necessárias dependendo da amostra e

insere-se parte das soluções de amostras diluídas em placas de Petri. Pode-se

realizar essa parte através de diferentes técnicas (UNIVERSIDAD NACIONAL DE

ENTRE RÍOS, 2016).

41

FIGURA 24: Diluições em série de uma amostra. Na figura observa-se diluição de uma amostra com

microrganismos. Após diluição, pode-se acrescentar a amostra diluída em meio de cultura em placa

de Petri ou em tubo, como observado na imagem. Fonte: Veira e Queiroz (2012).

42

FIGURA 25: Diluições em série de uma amostra. Na figura observa-se efeito das diluições no

subsequente crescimento microbiano após incubação. Para a extração de DNA recomenda-se utilizar

colônias isoladas. Fonte:

<http://classes.midlandstech.edu/carterp/courses/bio225/chap06/Slide22.JPG> Acesso em: 12 de

maio de 2016.

Há diferentes técnicas que podem ser empregadas, dependendo do objetivo

do pesquisador, que muitas vezes as utiliza para obter um determinado resultado

final. Essas técnicas diferenciam-se de acordo com o meio de cultura utizado na

parte inicial e final da técnica (sólido, semissólido, líquido) e de acordo com a forma

de dispor o meio de cultura (com uma adição inicial ou após a inserção do meio de

cultura).

➢ De tudo para tubo, ambos com caldo. Mergulha-se a alça na cultura,

agitando-a e mergulha-se a alça no segundo tubo, agitando novamente.

43

FIGURA 26: Inoculação de amostra em meio líquido. Fonte: Veira e Queiroz (2012).

➢ Tubo para tubo em meio semissólido. Mergulha-se agulha na cultura do tubo,

inserindo-a novamente no meio de cultura do segundo tubo.

FIGURA 27: Inoculação de amostra em meio semissólido. Fonte: Veira e Queiroz (2012).

➢ Tubo para tubo, de meio líquido para meio sólido. Mergulha-se alça na cultura

do tubo; posteriormente realiza-se estrias na superfície do tubo com ágar.

44

FIGURA 28: Inoculação de amostra em superfície em meio sólido. Fonte: Veira e Queiroz (2012).

➢ Tubo para placa de Petri, técnica de esgotamento. Divide-se com o auxílio de

uma caneta retroprogetor na parte de baixo da placa, a placa de Petri em três

partes. Mergulha-se alça em tubo com cultura e realiza-se estrias em cada

divisão, respeitando as linhas e utilizando da melhor forma possível a

superfície da placa.

FIGURA 29: Inoculação de amostra em superfície em meio sólido. Fonte: Veira e Queiroz (2012).

➢ Placa de Petri, técnica de Pour-plate. Adiciona-se determinada quantidade de

amostra na placa de Petri, vertendo cuidadosamente ágar em estado líquido

(o suficientemente quente para não solidificar, mas frio o bastante para poder

segurar-se o meio de cultura com a mão com a intenção de não eliminar os

microrganismos da amostra). A placa é então submetida a movimentos de

homogenização, em formato de oito e/ou horizontalmente e verticalmente. O

meio deve solificar antes de ser movido para uma estufa. Dependendo da

45

técnica e do microrganismo deve-se adicionar mais uma vez ágar na placa de

Petri.

FIGURA 30: Inoculação com técnica de Pour-plate. Fonte: <https://s-media-cache-

ak0.pinimg.com/736x/3b/5e/4d/3b5e4d6c72d43f66998ab4cabb37e12c.jpg>. Acesso em 12 de maio

de 2016.

➢ Método de espalhamento em placa ou Spread Plate method implica na adição

inicial de meio de cultura e posterior homogenização da amostra sobre o meio

de cultura com o auxílio de uma espátula de Drigalski ou alça.

FIGURA 31: Inoculação de amostra com o método de espalhamento em placa. Fonte: <https://s-

media-cache-ak0.pinimg.com/736x/3b/5e/4d/3b5e4d6c72d43f66998ab4cabb37e12c.jpg>. Acesso em

12 de maio de 2016.

A inoculação de microrganismos em um meio de cultura deve ser seguida da

incubação, momento em que armazena-se amostra em estufa por determinado

período de tempo de forma a estimular o crescimento microbiano segundo a

temperatura adequada para um crescimento eficiente. Pode-se posteriormente

repicar a quantidade de vezes necessárias para manter um cultivo novo.

46

Após a semeadura e/ou repicagem, incubação e utilização, armazena-se as

culturas até descarte posterior, geralmente em refrigeração (4 ºC), congelação (-20

ºC, -70 ºC ou -180 ºC) ou liofilizadas; a conservação a longo prazo realiza-se com o

emprego de substâncias crioprotetoras, como o glicerol (ABELHO, 2013).

O descarte é realizado através de nova esterilização em autoclave de todas

as culturas e posterior descarte em lixo regular, eliminando-se assim riscos

biológicos decorrentes de culturas de microrganismos, de acordo com a norma de

biossegurança utilizada pela Fiocruz (que baseia-se em normas do livro

"Biossegurança em Laboratórios de Saúde Pública", do Ministério da Saúde, 1998).

2.2.5 Extração de DNA

Há diversos métodos utilizados para a extração de DNA. Esses métodos

dependem intrinsicamente dos equipamentos e materiais disponíveis no laboratorio,

sendo a qualidade da extração de DNA de vital importância para a maioria dos

métodos de biologia molecular (MINAS et al., 2011)

Há diversas técnicas para a extração de DNA de leveduras que diferem de

técnicas de extração de outros microrganismos devido a sua parede celular, que

confere maior resistância a lisis celular. Utiliza-se degradação enzimática ou esferas

de vidro, seguido de lisis celular causada por detergentes e a remoção de proteínas

e outras impurezas com, por exemplo, clorofórmio e fenol (LÕOKE; KRISTJUHAN;

KRISTJUHAN, 2011). A resultante solução de ácidos nucleicos é posteriormente

concentrada e purificada através de etanol ou isopropanol (LEE et al., 2011).

Para determinadas técnicas de PCR poderia apenas utilizar-se da lisis celular

através da centrifugação da amostra, mas essa preparação não apresenta pureza

47

suficiente para posterior digestão com enzimas de restrição, técnica utilizada

comumente para a identificação molecular de organismos (LEE et al., 2011).

Como base para esse estudo escolheu-se um protocolo já utilizado pela

faculdade para bactérias devido à já presença de todos os materiais e

equipamentos necessários. O protocolo desenvolvido por Ausubel et al. (2003)

baseia-se na lisis celular e remoção de proteínas através de digestão com

proteinase K. Substâncias da parede celular, polissacarídeos e proteínas restantes

são então removidas por uma precipitacao seletiva com o detergente CTAB e

posteriormente precipita-se o DNA com isopropanol.

O protocolo utilizado nesse estudo é uma adaptação do protocolo

desenvolvido por Ausubel et al. (2003), no Anexo A, destinado para bactérias.

A análise da qualidade da extração de DNA é realizada através de análise em

eletroforese; também analisa-se o DNA quantificando-o através de

espectrofotômetro.

2.2.6 Eletroforese em gel de agarosa

A eletroforese é um método utilizado para verificar a qualidade de DNA. Essa

técnica é possível graças à carga negativa do ácido nucleico, que através de uma

carga elétrica pode ser impulsionado para uma carga positiva. Ao passar por um gel

com poros de diferentes tamanhos, separa-se fragmentos de DNA com diferentes

quantidades de pares de base, ou seja, diferentes tamanhos.

48

FIGURA 32: Equipamento para eletroforese. Pode-se observar gel no interior da cuba eletroforética;

visualiza-se o buffer de carga (parte azul) com amostras.

A taxa de migração das moléculas através dos poros do gel é afetada pelo

tamanho e forma das moléculas, densidade do gel e força da corrente elétrica. Além

disso, pode-se utilizar diferentes substâncias para tingir o DNA como o brometo de

etídio, corante que intercala-se entre o DNA e que emite radiação apenas observada

em luz ultravioleta.

As amostras são adicionadas com um buffer de carga que confere peso à

amostra de DNA (devido à presença de glicerol) e visualização do movimento da

amostra sem a necessidade de luz ultravioleta. Além das amostras, adiciona-se em

um poço de gel um marcador de peso molecular com fragmentos de DNA de

tamanhos conhecidos, com o objetivo de estimar o tamanho dos fragmentos da

amostra comparando as bandas formadas. O tamanho de cada fragmento ou banda

é medido em pares de base (pb).

Medidas de segurança devem ser adotadas para o manejo de brometo de

etídio e de qualquer material possivelmente contaminado por essa substância

cancerígena. Deve-se utilizar guardapó e luvas para manejar todos os materiais e

equipamentos em área de seguranca específica para o manejo de brometo de etídio,

49

não utilizando novamente as luvas com outros materiais não específicos para essa

área (GABRIEL DORADO PÉREZ).

2.2.7 Espectrofotometria de absorção no UV visível

A espectrofotometria de absorção no UV visível é um método utilizado para a

quantificação de DNA, graças à característica do DNA de absorver luz ultravioleta

(UV) quando entra em contato com ondas (λ) de comprimento de 260 nm. Sabe-se

que a densidade óptica de 1 com o comprimento de onda de 260 nm iguala-se à

concentração de DNA de 50 ng por litro e, com essa informação, determina-se a

absorção ou densidade óptica do DNA em comprimento de ondas de 260 e 280 nm

para determinar a quantidade de DNA em uma amostra (UNIVERSITY OF

ARKANSAS, 2007). A qualidade do DNA pode ser determinada pela quantidade de

proteína em uma amostra; determina-se a razão de absorção em ondas de 260 e

280 nm. Proteínas possuem maior absorção em ondas de 280 nm e, portanto, a

razão de absorção irá diminuir com a contaminação de proteínas.

A razão de ondas 260/280 nm deve ser próxima a 2,0 para uma amostra de

DNA puro, íntegro e com ausência de proteínas. Uma razão muito abaixo de 1,9

indica contaminação do DNA por proteínas ou outros compostos com maior

absorção de ondas de 280 nm (UNIVERSITY OF ARKANSAS, 2007).

2.3 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

50

Nesta seção, são descritos todos os protocolos utilizados no estudo como

apresentados na medotologia.

2.3.1 Autoclave de Chamberland

Seguiu-se os seguintes protocolos para a preparação de materiais para

esterilização em autoclave.

➢ Tubos de ensaio:

1. Tampar tubos de ensaio com tampas de plástico ou algodão.

2. Dispor tubos de ensaio em cesta ou juntar aproximadamente 10 tubos com

um elástico.

3. Cobrir a cesta ou os tubos com papel Craft preso com elástico. A parte

superior dos tubos deve estar tampada com papel Craft.

➢ Erlenmeyers:

O conteúdo dos erlenmeyers varia de água destilada a meios de cultura.

1. Tampar erlenmeyers com algodão. O algodão deve ser dobrado nas laterais e

posteriormente enrolado antes de colocá-lo no erlenmeyer.

2. Cubrir a tampa com papel Craft e prendê-lo com elástico.

➢ Placas de Petri:

1. Colocar placa de Petri no meio de um pedaço de papel Craft e dobrar as

bordas sobre a placa.

2. Colocar em porta placas previamente a sua esterilização.

51

➢ Autoclavagem:

1. Verificar o nível de água da autoclave, funcionamento da válvula de

segurança e deixar a saída de gás por uma mangueira aberta.

2. Colocar na autoclave os materiais para esterilização (erlenmeyers, tubos de

ensaio, placas de Petri).

3. Fechar a tampa.

4. Abrir a válvula de gás e acender a autoclave.

5. Eliminar o ar de dentro da câmara de esterilização da autoclave, que pode ser

observado ao constatar a saída contínua de vapor pela saída de gás (pela

mangueira).

6. Fechar a saída de gás. O vapor irá acumular-se na autoclave e elevará a

pressão. A partir do momento que a autoclave alcança a pressão desejada (1

atm) constatada no manômetro, inicia-se a contagem do tempo.

7. Uma vez transcorridos 15 minutos, apagar as chamas e fechar a válvula de

entrada de gás. Esperar diminuir a pressão até 0 atm e abrir a saída de gás

novamente. Esperar esfriar a autoclave e retirar o material esterilizado.

2.3.2 Isolamento de leveduras

1. Identifique previamente um erlenmeyer com 90 mL de água de peptona estéril

com referência de 10-1 e um tubo de ensaio contendo 9 mL de água de

peptona estéril com a referência de 10-2.

52

2. Homogenize a suspensão de microrganismos fornecida (como em um

stomacher) e, em condições de assepsia, transfira 1 mL com uma pipeta para

o erlenmeyer (diluição de 10-1);

3. Descarte a pipeta e homogenize a suspensão diluída;

4. Com outra pipeta esterilizada retire 1 ml da diluição (diluição 10-1) e introduza-

a num segundo tubo de diluição, para obtenção da diluição 10-2;

5. Semeie através dos métodos já descritos; vertido em placa, colocando 1 mL

de amostra de cada diluição por duplicata em placa de Petri e depois

adicionando-se meio de cultura.

6. Espera-se solidificar o meio de cultura, inverte-se a placa de Petri com a

menor parte para cima e coloca-se a placa em estufa para incubação durante

48 horas em temperatura de aproximadamente 30 °C.

2.3.3 Cultura de leveduras

➢ Meios de cultura:

Preparou-se os seguintes meios de cultura com a concentração como

descrito na tabela e utilizando o seguinte protocolo:

Ágar Batata Dextrosado Extrato de malte

A quantidade adicionada de meio

de cultura segue as

recomendações do rótulo do

produto.

2 g extrato de malte

2 g dextrosa anhidra

1 g peptona de carne

53

1. Ler o rótulo do meio de cultura (Ágar Batata Dextrosado) ou os componentes

para o meio de cultura (Extrato de malte).

2. Calcular a quantidade de pó necessário de acordo com as instruções do

rótulo e o volume total que será preparado.

3. Pesar a quantidade de pó em erlenmeyer e adicionar água destilada. Esperar

um minuto para umidecer o ágar, se for o caso.

4. Se o meio conter ágar, esquentar em tripé com bico de Bunsen e agitar

continuamente até chegar ao ponto de ebulição. O ágar ao fundir-se com a

água perde turbidez. Esquenta-se em banho maria, colocando o erlenmeyer

dentro de um béquer com água (não destilada). Geralmente os caldos não

necessitam passar por esse processo.

5. Rotular com o tipo de meio de cultura e a data de sua preparação.

6. Esterilizar de acordo com as instruções do rótulo. Uma vez preparado e

esterilizado debe ser conservado entre 2 °C e 8 °C salvo se descrito diferente

no rótulo, sempre mantendo-os fechados. Se for utilizado para placas de Petri

e conter ágar, colocá-lo em ebulição em banho maria como descrito na etapa

4 antes de utilizar.

➢ Repicagem:

O protocolo a seguir refere-se à repicagem de placa de Petri para tubo de

vidro. Pode-se também utilizar esse protocolo para semeadura de microrganismos

ou de tubo de vidro para placa de Petri, formando-se estrias na superfície como

descrito anteriormente.

1. Esterilizar bancada de fluxo laminar com etanol 70%. Mover os materiais

necessários para o fluxo laminar.

2. Limpar meios de cultura com etanol 70%, se necessário. Colocar etiquetas ou

rotular com marcador permanente os materiais para a amostra.

3. Ligar bico de Bunsen e esterilizar alça com calor seco.

54

4. Esfriar extremidade do cabo nas paredes do tubo esterilizado e rotulado para

uma amostra.

5. Tocar alça em uma colônia, raspando de leve. Colocar em outra placa de Petri

ou em tubo de vidro (esterilizando antes a boca do tubo), nesse último

chacoalhando fortemente para a colônia sair da alça.

6. Esterilizar boca de tubo de vidro e alça.

7. Incubar a 30 °C. A cultura utilizada é de 24 horas a 72 horas.

2.3.4 Extração de DNA de leveduras

➢ Preparação de soluções:

As seguintes soluções foram preparadas para a extração de DNA:

SDS 20% NaCl 5 M CTAB (NaCl 0,7 M)

10%

Proteinase K

Concentração:

0,2 g SDS com 1

mL de água

bidestilada.

Concentração:

2,92 g NaCl com

100 mL de água

bidestilada.

Concentração:

0,41 g NaCl + 1 g

CTAB com 10 mL

de água bidestilada.

Concentração:

0,002 g ou 2 μg de

Proteinase K com

100 μL de água

bidestilada.

As soluções são preparadas pesando-se em balança analítica a quantidade

indicada e adicionando-se água bidestilada, dissolvendo a solução em banho maria

(utilizou-se AccuBlock™ Digital Dry Baths - Labnet International, Inc.).

55

➢ Adaptações do Protocolo Base:

Utilizou-se a centrífuga Spectrafuge™ 16M Microcentrifuge (Labnet

International, Inc).

Adaptou-se o protocolo descrito na metodologia de extração de DNA da

seguinte forma:

Identificação e data

do experimento

Alteração ou indagação Detalhes técnicos

A (07/03/2016) Seguiu-se o protocolo com

bactérias acetogênicas.

Foram utilizadas as cepas da

faculdade C1 e A21.

Utilizou-se essa etapa como

amostra controle, isso é, para

testar o protocolo com a certeza

de um resultado positivo, além

de testar a eficiência de todos

os materiais utilizados.

B (14/03/2016) Quantidade de amostras e

tempo de agitação em

vórtex.

Amostra B1 possui 1 mL de

cultura e foram adicionados 0,5

mL de água destilada estéril.

Amostra B2 possui 1,5 mL de

cultura transferido de tubos com

extrato de malte.

Tempo de agitação em vórtex

de 1 minuto na velocidade de

40 hertz.

C (16/03/2016) Tempo de cultura. Amostra C1 possui 15 horas de

cultura de 48 horas em tubo

com extrato de malte. Amostra

C2 possui metade com cultura

novo nas mesmas condições da

56

amostra número 1, e metade

com o cultura da amostra

anterior.

Obs.: eletroforese com 35

minutos de corrimento a 100 v.

D (21/03/2016) Quantidade de vezes que o

clorofórmio foi adiconado e a

amostra posteriormermente

centrifugada.

Na mostra D1 houve a adição

de clorofórmio apenas uma vez.

Na amostra D2 houve adição

de clorofórmio duas vezes.

E (29/03/2016) Alteração do tempo em

vórtex. Alteração dos meios

de cultura.

Tempo em vórtex de 15

segundos em 25 hertz. Amostra

E1 e E2 foram retiradas de

tubos com extrato de malte.

Amostra E3 foi retirada

diretamente da placa de Petri,

onde colônias foram

adicionadas ao tubo e

adicionou-se água destilada

estéril para completar o volume

de 1,5 mL de amostra.

F (01/04/2016) Alteração de tempo entre a

adição de NaCl e CTAB

(NaCl 0,7 M) 10% para o

caso de falta de CTAB (NaCl

0,7 M) 10% acondicionado a

57 ±1°C.

Amostras F1 e F2 foram

extraídas de colônicas em placa

de Petri resuspendidas em

água destilada estéril. O tempo

entre a adição do CTAB (NaCl

0,7 M) 10% e o NaCl foi de

vinte minutos.

G (05/04/2016) Comparação entre culturas

de tubos com extrato de

malte e de placas de Petri.

Amostra G1 constituiu-se de 1,5

mL de cultura de tubo com

extrato de malte. Amostra G2

57

constituiu-se de colônicas em

placa de Petri resuspendidas

em água destilada estéril.

H (13/04/2016) Comparação entre a

quantidade de pellet (sólido)

após a centrifugação inicial.

Amostra H1 consistia em menor

quantidade de pellet. Amostra

H2 consistia em uma maior

quantidade de pellet,

abrangendo inteiramente o

fundo do tubo de polipropileno.

2.3.5 Eletroforese em gel de agarosa

➢ Preparação do gel de agarosa:

1. Certificar-se de trabalhar com equipamento de segurança adequado: luvas,

guardapó. Deve-se trabalhar em espaço específico destinado apenas para o

uso de brometo de etídio, com todos os equipamentos no local utilizados

apenas para esse fim por indivíduos com o material de segurança adequado.

2. Adicionar 50 mL de buffer TBE (5x diluído em 1:4 com água bidestilada) em

erlenmeyer.

3. Adicionar 0,5 g de agarosa.

4. Aquecer erlenmeyer em banho maria até fundir (banho maria: béquer com

água não deionizada em tripé com bico de Bunsen).

5. Adicionar 2,5 μL de Brometo de Etídio; homogenizar.

6. Colocar solução em câmara propriada para a solidificação do gel. Inserir

pente, sem encostar na parte inferior. Esperar solidificar, cobrindo com

alumínio.

58

➢ Eletroforese:

1. Adicionar buffer TBE em câmara de eletroforese. Colocar o gel de agarosa,

ou a parte utilizada, dentro da câmara de eletroforese.

2. Preparar amostras com buffer de carga como descrito a seguir.

Substâncias Quantidade

Amostra de DNA com buffer de carga

Buffer de carga utilizado: 6x Loading Dye

(com 0,03% xylene cyanol) (Genbiotech).

5 μL com adição de 4 μL de buffer de

carga, homogenizando com micropipeta

com um volume final de 7 μL.

Marcador de DNA

Utilizado: DNA Ladder (10000 – 500 bp)

(Genbiotech).

4 μL

3. Adicionar cada amostra em poços separados no gel, evitando contaminação

das amostras através da troca de tips da micropipeta.

4. Certificar-se que o gel esteja fixo e em um canto da câmara de eletroforese.

5. Iniciar eletroforese a 100 V de 30 a 45 minutos. Utilizou-se equipamento

ENDURO™ Gel XL Electrophoresis System da empresa Labnet International,

Inc.

6. Visualizar gel em transiluminador (o utilizado foi UV Transiluminator TM-26 da

empresa Labnet International Inc.). Realiza-se uma foto da imagem

observada através do transiluminador; utilizou-se câmera Kodak EasyShare

Z981.

2.3.6 Espectrofotometria de absorção no UV visível

59

Utilizou-se a seguinte diluição, pois, como pode-se observar na seção de

resultados, uma diluição menor apresenta quantidade consideravelmente superior

aos parâmetros o que, portanto, não apresentaria confiabilidade nos resultados.

Utilizou-se espectrofotômetro UV – 1800 UV-VIS Spectrophotometer da empresa

Shimadzu.

1. Adicionar 49 μL de água destilada em cubeta.

2. Adicionar 1 μL de amostra de DNA.

3. Colocar cubeta no espectrofotômetro e iniciar a quantificação automática de

DNA.

4. Anota-se os resultados segundo a diluição, o comprimento de onda (λ = 260

e/ou 280), a quantidade de DNA e a quantidade de proteínas. O equipamento

utilizado ocasionalmente apresentava quantidade negativa de proteínas,

número esdrúxulo (a empresa responsável pelo equipamento não pode

explicar a razão desse resultado e, por isso, desconsidera-se anotações de

números negativos).

2.4 RESULTADOS

Os resultados da extração de DNA de leveduras foram obtidos através de

alterações no protocolo utilizado pela universidade, de Ausubel et al. (2003).

Observa-se na figura a seguir um gráfico dos resultados obtidos após quantificação

de amostras em espectrofotômetro com o objetivo de definir a qualidade da extração

de DNA.

60

FIGURA 33: Gráfico dos resultados obtidos de amostras na extração de DNA segundo quantificação

por espectrofotômetro utilizando a razão entre a absorção de ondas de 260 nm e de 280 nm.

➢ Amostras (A)

As amostras foram utilizadas como controle, isso é, para testar a efetividade e

qualidade do protocolo de bactérias acetogênicas com bactérias, antes de realizar

testes com leveduras. A nomenclatura utilizada para as amostras difere do nome das

demais amostras por serem uma exceção. Possui-se o conhecimento das cepas

utilizadas (A21 e C1) e o restante das amostras não são identificadas de acordo com

sua cepa.

A quantificação por eletroforese, como pode-se observar na figura a seguir,

obteve resultados satisfatórios na extração de DNA embora a amostra C1 não

apresente grau de purificação suficiente por apresentar uma banda de proteínas no

poço e uma segunda banda entre 1000 e 500 pares de base.

61

FIGURA 34: Eletroforese das amostras A.

As amostras apresentaram a qualidade mínima para a quantificação por

espectrofotômetro como apresentado pela tabela a seguir. Para determinar a

diluição, diluiu-se a amostra C1 em: 1 μL de amostra em 49 μL de água destilada e

10 μL de amostra em 40 μL de água destilada. Embora a quantificação de proteínas

na primeira diluição em algumas amostras como a amostra C1 não seja possível

devido a resultado exdrúxulo, definiu-se essa diluição como a ideal para avaliar a

qualidade do DNA extraído.

Amostra Diluição Leitura λ =

260 nm

Leitura λ =

280 nm

Razão

260/280

DNA (μg

mL−1)

Proteína

(μg mL−1)

C1 1 μL de

amostra

em 49 μL

de água

destilada.

0,021 0,008 2,6760 2,1161 Quantida-

de

negativa

não

considera-

da.

62

C1 10 μL de

amostra

em 40 μL

de água

destilada.

0,161 0,111 1,4557 12,291 99,452

A21 1 μL de

amostra

em 49 μL

de água

destilada.

0,022 0,012 1,8305 1,8677 3,9118

➢ Amostras (B)

O DNA foi extraído com alterações como descrito nos procedimentos

experimentais, seção de extração de DNA. A amostra B1 contém cultura de tubo

com extrato de malte e água estéril; a amostra B2 contém apenas cultura do tubo,

sendo a velocidade de vórtex de 40 hertz por 1 minuto.

A quantificação por eletroforese, como pode-se observar na figura a seguir,

obteve resultados satisfatórios na extração de DNA. Pode-se explicar a diferença de

visualização entre as amostras devido a diluição da amostra B1 com água estéril.

63

FIGURA 35: Eletroforese das amostras B.

Considerou-se a amostra B2 – de melhor visualização e que não foi

previamente diluída (o que poderia mudar o resultado no espectrofotômetro) – como

a que apresentou qualidade mínima para a quantificação por espectrofotômetro

como apresentado pela tabela a seguir.

Amostra Diluição Leitura λ =

260 nm

Leitura λ =

280 nm

Razão

260/280

DNA (μg

mL−1)

Proteína

(μg mL−1)

B2 1 μL de

amostra

em 49 μL

de água

destilada.

0,033 0,025 1,3004 2,3172 28,701

➢ Amostras (C)

64

O DNA foi extraído com alterações como descrito nos procedimentos

experimentais, seção de extração de DNA. A amostra C1 contém apenas cultura de

15 horas de incubação; a amostra C2 contém metade da cultura de 15 horas e

metade do cultura utilizado na amostra anterior, já com 48 horas.

A quantificação por eletroforese, como pode-se observar na figura a seguir,

obteve resultados insatisfatórios na extração de DNA. A amostra C1 não é

visualizada e a amostra C2 apresenta banda sutil, sendo a parte inferior a 500 pares

de base mais visível que a banda de DNA. Isso demonstra que é necessário cultura

de ao menos 24 horas para a extração de DNA.

FIGURA 36: Eletroforese das amostras C.

As amostras não apresentaram a qualidade mínima para a quantificação por

espectrofotômetro.

➢ Amostras (D)

O DNA foi extraído com alterações como descrito nos procedimentos

experimentais, seção de extração de DNA. Adicionou-se clorofórmio uma vez na

amostra D1 e duas vezes na amostra D2.

65

A quantificação por eletroforese, como pode-se observar na figura a seguir,

obteve resultados insatisfatórios; a amostra D1 apresentou múltiplas bandas devido

à contaminação dessa amostra por bactérias; a amostra D2 é difícil de visualizar,

comprovando que ao contrário de bactérias, na extração de DNA de leveduras não

se deve adicionar duas vezes clorofórmio.

FIGURA 37: Eletroforese das amostras D.

66

FIGURA 38: Contaminação de amostra por bactérias. Observa-se leveduras na ponta da seta

envoltas de bactérias em microscópio óptico no aumento de 1000 vezes.

Quantificou-se a amostra D1 em espectrofotômetro como apresentado pela

tabela a seguir. Comprova-se ser de vital importância a constatação da pureza do

cultura da amostra previamente às técnicas de identificação molecular, pois a

quantificação em espectrofotômetro não irá constatar a impureza do cultura e

posterior uso para a identificação molecular de espécies ficará comprometido.

Amostra Diluição Leitura λ =

260 nm

Leitura λ =

280 nm

Razão

260/280

DNA (μg

mL−1)

Proteína

(μg mL−1)

D1 1 μL de

amostra

em 49 μL

de água

0,058 0,041 1,4152 4,3157 39,092

67

destilada.

➢ Amostras (E)

O DNA foi extraído com alterações como descrito nos procedimentos

experimentais, seção de extração de DNA. A amostra E1 e E2 foram retiradas de

cultura em tubos e a amostra E3 foi retirada de cultura de placa de Petri, sendo a

velocidade de vórtex de 25 hertz por 15 segundos.

A quantificação por eletroforese, como pode-se observar na figura a seguir,

obteve resultados satisfatórios apenas para a amostra E3 (embora apresente banda

de proteínas no poço).

FIGURA 39: Eletroforese das amostras E.

Considerou-se a amostra E3, de melhor visualização, como a que apresentou

qualidade mínima para a quantificação por espectrofotômetro como apresentado

pela tabela a seguir.

Amostra Diluição Leitura λ =

260 nm

Leitura λ =

280 nm

Razão

260/280

DNA (μg

mL−1)

Proteína

(μg mL−1)

E3 1 μL de 0,034 0,021 1,5981 2,7616 14,626

68

amostra

em 49 μL

de água

destilada.

➢ Amostras (F)

O DNA foi extraído com alterações como descrito nos procedimentos

experimentais, seção de extração de DNA. As amostras F1 e F2 foram retiradas de

cultura de placa de Petri. Alterou-se o tempo entre a adição de cloreto de sódio e o

detergente CTAB, o que pode haver ocasionado a falta de bandas na quantificação

por eletroforese (figura a seguir).

FIGURA 40: Eletroforese das amostras F.

As amostras não obtiveram qualidade mínima para uma subsequente

quantificação por espectrofotômetro.

➢ Amostras (G)

69

O DNA foi extraído com alterações como descrito nos procedimentos

experimentais, seção de extração de DNA. A amostra G1 contém cultura de tubo

com Extrato de malte e a amostra G2 contém cultura de placa de Petri.

A quantificação por eletroforese, como pode-se observar na figura a seguir,

obteve resultados satisfatórios na extração de DNA, embora a amostra G2

apresente grande quantidade de impurezas abaixo de 1000 pares de base e banda

de proteína no poço.

FIGURA 41: Eletroforese das amostras G.

Ambas amostras foram quantificadas em espectrofotômetro como

apresentado pela tabela a seguir.

Amostra Diluição Leitura λ =

260 nm

Leitura λ =

280 nm

Razão

260/280

DNA (μg

mL−1)

Proteína

(μg mL−1)

G1 1 μL de

amostra

em 49 μL

0,015 0,005 2,9231 1,5378 Quantida-

de

negativa

70

de água

destilada.

não

considera-

da.

G2 1 μL de

amostra

em 49 μL

de água

destilada.

0,021 0,005 4,7708 2,2333 Quantida-

de

negativa

não

considera-

da.

➢ Amostra (H)

O DNA foi extraído com alterações como descrito nos procedimentos

experimentais, seção de extração de DNA. As amostras H1 e H2 foram retiradas de

cultura em placa de Petri, com a diferença na quantidade de pellet após

centrifugação inicial das amostras.

A quantificação por eletroforese, como pode-se observar na figura a seguir,

obteve resultados satisfatórios na extração de DNA.

71

FIGURA 42: Eletroforese das amostras H.

Quantificou-se ambas amostras em espectrofotômetro como apresentado

pela tabela a seguir.

Amostra Diluição Leitura λ =

260 nm

Leitura λ =

280 nm

Razão

260/280

DNA (μg

mL−1)

Proteína

(μg mL−1)

H1 1 μL de

amostra

em 49 μL

de água

destilada.

0,021 0,011 1,8991 1,8193 2,4814

H2 1 μL de

amostra

em 49 μL

de água

destilada.

0,027 0,009 2,9674 2,7719 Quantida-

de

negativa

não

considera-

da.

Com base nos resultados obtidos aperfeiçoa-se o protocolo base como

descrito a seguir:

1. Semear/repicar leveduras em placa de Petri com Ágar Batata Dextrosado e

incubá-las durante 48 horas a 30 ±1°C.

2. Colocar 1,5 mL de cultura em tubo de polipropileno de 1,8 mL.

3. Visualizar em microscópio a amostra em objetiva de 100, assegurando-se de

não haver contaminação na amostra.

4. Colocar reagentes em banho maria (digital) com temperatura de

aproximadamente 57 ±1°C. Nota: reagentes como a Proteinase K não

deverão ser esquentados; consultar notas do produto.

5. Centrifugar amostras a 14000 rpm durante 10 minutos e eliminar o

sobrenadante.

72

6. Resuspender pellet (parte sólida) da amostra em 520 μL de buffer TE.

Entende-se por resuspender o ato de pipetear cuidadosamente e de forma

repetida sem retirar líquido da amostra com o propósito de homogenizar o

pellet com o líquido inserido.

7. Adicionar reagentes: 30 μL de SDS 20% e 3 μL de Proteinase K (este último

reagente deve ser adicionado dentro da amostra). Agitar em vórtex durante 15

segundos na velocidade de 25 hertz.

8. Incubar amostras em estufa com temperatura de aproximadamente 37 ±1°C

durante 60 minutos.

9. Adicionar reagentes: 150 μL de NaCl 5M e 140 μL CTAB (NaCl 0,7 M) 10%.

Homogenizar invertendo a amostra repetidamente. Agitar em vórtex durante

15 segundos na velocidade de 25 hertz.

10. Colocar amostras em banho maria (digital) com temperatura de

aproximadamente 57 ±1°C durante 10 minutos.

11. Colocar em contato direto com gelo (como em um freezer) durante 5 minutos.

12. Adicionar reagente: 500 μL de clorofórmio e álcool isoamílico (proporção de

24:1). Homogenizar.

13. Centrifugar amostras a 14000 rpm durante 10 minutos.

14. Transferir sobrenadante para um novo tubo de 1,8 mL. Deve formar-se uma

separação dentro da amostra; caso a parte superior esteja com resíduos,

pode-se suspeitar contaminação da amostra.

15. Adicionar reagente: 380 μL de álcool isopropílico. Homogenizar.

16. Centrifugar amostras a 14000 rpm durante 5 minutos e eliminar

sobrenadante.

17. Adicionar reagente: 150 μL de etanol 70% frio (armazenado em freezer).

Homogenizar.

73

18. Centrifugar amostras a 14000 rpm durante 10 minutos e eliminar

sobrenadante.

19. Secar amostra em estufa por aproximadamente 10 minutos.

20. Adicionar 50 μL de buffer TE e resuspender a amostra.

21. Refrigerar amostras até sua utilização.

74

3 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES

Em virtude dos resultados obtidos na análise do protocolo de extração de

DNA de leveduras aperfeiçoado, recomenda-se o protocolo para o subsequente

emprego de técnicas de PCR devido à integridade apresentada em eletroforese

horizontal (1% agarose) e razão em espectrofotômetro considerada ideal, sendo o

protocolo mais prático que os já existentes. Essa praticidade deve-se à aplicação do

método CTAB; método versátil graças a sua ampla gama de utilização como com a

extração de DNA de animais, bactérias e leveduras. Essa versatilidade é vital para

laboratórios que realizam extração de DNA de diferentes organismos, além de gerar

economia financeira ao eliminar a necessidade de um equipamento adicional para a

extração especificamente de leveduras (as esferas de vidro).

75

ANEXO A – Extração de DNA por Ausubel et. al. (2003)

76

77

REFERÊNCIAS

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básicos em microbiologia. Coimbra: Escola Superior Agrária Instituto Politécnico de

Coimbra, 2013.

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