LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

MANTAS BELECKAS

ANTIOKSIDACINIAI KANADINĖS RYKŠTENĖS (SOLIDAGO

CANADENSIS) AUGALINIŲ EKSTRAKTŲ TYRIMAI NAUDOJANT

ESC-ABTS POKOLONĖLINĮ METODĄ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

prof. dr. L. Ivanauskas

Kaunas, 2015

2

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERISTETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis

ANTIOKSIDACINIAI KANADINĖS RYKŠTENĖS (SOLIDAGO

CANADENSIS) AUGALINIŲ EKSTRAKTŲ TYRIMAI NAUDOJANT ESC-ABTS

POKOLONĖLINĮ METODĄ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo Vadovas

Liudas Ivanauskas

Data

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantas

Mantas Beleckas

Data Data

Kaunas, 2015

3

Turinys

SANTRAUKA ................................................................................................................................. 5

SUMMARY ..................................................................................................................................... 6

SANTRUMPOS ............................................................................................................................... 7

ĮVADAS ........................................................................................................................................... 8

DARBO TIKSLAS IR DARBO UŢDAVINIAI ............................................................................. 9

1. LITERATŪROS APŢVALGA ................................................................................................ 10

1.1. Kanadinė rykštenė (Solidago canadensis L.) .................................................................. 10

1.2. Kanadinės rykštenės veikliosios medţiagos ................................................................... 11

1.3. Kanadinės rykštenės panaudojimas medicinoje .............................................................. 12

1.4. Solidago canadensis L. kaupiami fenoliniai, bei antioksidaciniu efektyvumu

pasiţymintys veiklieji junginiai ................................................................................................. 13

1.5. Antioksidaciniai junginiai aptinkami Solidago L.: chlorogeno rūgštis, rutinas,

isokvercitrinas ir hiperozidas ..................................................................................................... 14

1.6. Antioksidantai, jų aktyvumas ir veikimo mechanizmas ................................................. 17

1.7. ESC pokolonėliniai metodai taikomi antioksidacinio aktyvumo nustatymui ................. 18

1.7.1. ESC-DPPH antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodikos .................................. 19

1.7.2. ESC-ABTS antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodikos .................................. 19

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA .................................................................................. 21

2.1. Tyrimo objektas .............................................................................................................. 21

2.2. ESC-ABTS pokolonėliniui metodui naudojamos medţiagos ir įrengimai ..................... 22

2.3. Kanadinės rykštenės mėginių paruošimas ir ekstrakcija ................................................ 24

2.4. ABTS darbinio tirpalo ruošimas ..................................................................................... 24

2.5. ESC taikymas Solidago canadensis L. veikliųjų junginių kokybiniam įvertinimui ....... 25

4

2.6. ESC-ABTS pokolonėlinis antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodas .................... 25

2.6.1. Duomenų statistinis įvertinimas ................................................................................ 26

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ..................................................................... 27

3.1. ESC-ABTS pokolonėlinės metodikos optimizavimas .................................................... 27

3.2. ESC-ABTS pokolonėlinio metodo validacija ................................................................. 28

3.3. 7 Lietuvos regionų Solidago canadensis L. antioksidacinių junginių ir antioksidacinio

aktyvumo palyginimas ............................................................................................................... 30

3.4. 24 Lietuvos vietovių Solidago canadensis L. antioksidacinių junginių ir antioksidacinio

aktyvumo palyginimas ............................................................................................................... 33

4. IŠVADOS ................................................................................................................................ 37

5. LITERATŪROS SĄRAŠAS ................................................................................................... 38

5

SANTRAUKA

M. Belecko magistro baigiamasis darbas „Antioksidaciniai kanadinės rykštenės (Solidago

canadensis) augalinių ekstraktų tyrimai naudojant ESC-ABTS pokolonėlinį metodą―/mokslinis vadovas

prof. dr. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos

fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas.

Raktiniai ţodţiai: Solidago canadensis, kanadinė rykštenė, efektyvioji skysčių chromatografija

(ESC), antioksidacinis aktyvumas, ABTS.

Šio magistro baigiamojo darbo tiriamasis objektas Solidago canadensis L. ţiedų metanoliniai

(70%) ekstraktai. Rykštenė – daugiametis augalas, priklausantis astrinių (Asteraceae) šeimos augalas.

Kanadinės rykštenės pasiţymi diuretiniu, priešuţdegiminiu, antibakteriniu, antioksidaciniu,

priešgrybeliniu, priešvėţiniu poveikiu.

Šio darbo tikslas – nustatyti kanadinės rykštenės (Solidago canadensis L.) ţiedų ekstraktuose

esančių veikliųjų junginių antioksidacinį aktyvumą efektyviosios skysčių chromatografijos-2,2'-azino-

bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ESC-ABTS) pokolonėliniu metodu.

Buvo paruošti kanadinės rykštenės ţiedų metanoliniai (70%) ekstraktai. Jie buvo analizuojami

ESC-ABTS pokolonėliniu metodu. Tyrimo metu buvo identifikuoti 5 antioksidaciniai junginiai, kurie

pasiţymėjo antioksidaciniu aktyvumu: chlorogeno rūgštis, rutinas. kvercitrinas, hiperozidas ir vienas

neţinomas junginys.

Vertinant kanadinės rykštenės ţiedų antioksidacinius junginius ir jų antioksidacinį aktyvumą,

pagal ţaliavos rinkimą 7 Lietuvos regionuose, Solidago canadensis ţiedų metanoliniuose ekstraktuose

antioksidacinai junginiai kito nuo 0 µmol/g (hiperozido) iki 44,18µmol/g. Bendras antioksidacinis

aktyvumas kito nuo 75,671 µmol/g iki 85,821 µmol/g. Didţiausias (85,821 µmol/g) nustatytas ekstrakte iš

4 regiono (Molėtų r.), maţiausias (75,671 µmol/g) - ţieduose rinktuose 7 regione (Vilniaus m./r.).

Vertinant kanadinės rykštenės ţiedų antioksidacinius junginius ir jų antioksidacinį aktyvumą,

pagal ţaliavos rinkimą 24 Lietuvos vietovėse, antioksidacinai junginiai Solidago L. ekstraktuose kito nuo

0 µmol/g (hiperozido) iki 51,054 µmol/g (neţinomo junginio). Antioksidacinis aktyvumas kanadinės

rykštenės ekstraktuose keitėsi nuo 56,52 µmol/g (Utenos rajono, Atkočiškių kaimo) iki 109,03 µmol/g

(Utenos rajono, Antalgės kaimo).

Atlikta ekstraktuose gautų junginių ir jų antioksidacinio aktyvumo statistinė analizė lyginant

pagal ţaliavos rinkimo regioną ir pagal vietovę.

Šis mokslinis darbas finansuotas Lietuvos Mokslo Tarybos (Nr. MIP-50/2013).

6

SUMMARY

M. Beleckas Master‗s thesis ―Antioxidant properties determintion of Canadian goldenrod

(Solidago canadensis) extracts by HPLC-ABTS post column method―, scientific manager prof. dr. L.

Ivanauskas; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Farmacy,

Department of Analytical and Toxicological Chemistry. – Kaunas.

Keywords: Solidago canadensis, Canadian goldenrod, high-performance liquid chromatography,

antioxidant activity, ABTS.

The object of this Master‗s thesis was Solidago canadensis L.flowers methanol (70%) extracts.

Goldenrod is a perennial plant, that belongs to the Asteraceae family. Canadian goldenrod has diuresis,

anti-inflammatory, antibacterial, anti-oxidative, antifungal and anti-tumor functions.

The aim of work was to determine antioxidants and their activity in Solidago canadensis

L.flowers extracts using HPLC-ABTS post column method.

Canadian goldenrod flores extracts were made using methanol (70%) solutions. They were

investigated by HPLC-ABTS post column method. 5 antioxidants were determined wich had antioxidation

qualities: chlorogenix acid, rutin, isoquercitrin, hyperoside and one unknown compund.

Identifying Canadian goldenrod‗s flowers antioxidant properties ant their activity, by 7

Lithuania‗s regions in which raw material was gathered, in Solidago canadensis flowers metanol extracts

antioxidants in extracts varied from 0 µmol/g (hyperoside) to 44,18µmol/g (uknown compund).

Antioxidation activity in Canadian goldenrod changed from 75,671 µmol/g to 85,821 µmol/g. Biggest

activity (85,821 µmol/g) was in ekstacts from 4 region (Molėtai d.), lowest (75,671 µmol/g) in flowers

gathered from 7 region (Vilnius city/ d.).

Identifying Canadian goldenrod‗s flowers antioxidant properties ant their activity, by 24

Lithuania‗s location in which raw material was gathered, in Solidago canadensis flowers metanol extracts

antioxidants in extracts varied from 0 µmol/g (hyperoside) to 44,18µmol/g (uknown compund).

Antioxidation activity in Canadian goldenrod changed from 56,52 µmol/g (Utena district, Atkočiškiai

village) to 109,03 µmol/g (Utena district, Antalgė village).

Statistical analis was done with antioxidant and their activity comparing by wich region and

location raw material was taken

7

SANTRUMPOS

ABTS 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) radikalas

BMR branduolių magnetinis rezonansas

CGA chlorogeno rūgštis

DMD diodų matricos detektoriaus

DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas

ESC efektyvioji skysčių chromatografija

KFE kietafazė ekstrakcija

MAN minimali aptikimo riba

MNK minimali nustatymo koncentracija

R2 koreliacijos koeficientas

RNS reaktyvios azoto formos

ROS reaktyvios deguonies formos

RSD radikalų surišimo detekcija

SSN santykinis standartinis nuokrypis

TE elektronų perdavimas

TEAC trolokso ekvivalento antioksidacinė geba

TEAC troloksui ekvivalentiškų antioksidantų talpumo tyrimas

UV ultravioletinės šviesos spinduliuotė

VAP vandenilio atomo perdavimas

VIS regimosios šviesos spinduliuotė

8

ĮVADAS

Susidomėjimas augaliniais preparatais pastaruoju metu vis didėja, nes daugėja gydymo

cheminiais vaistais sukeltų ligų, ypač nuo be saiko vartojamų temperatūrą maţinančių, priešuţdegiminių,

antibakterinių, antihistamininių vaistų. Šiuolaikinis mokslas atranda vis naujų medţiagų, padedančių

organizmui apsisaugoti nuo ardančio laisvųjų radikalų poveikio. Ypač tyrinėjama augalinės kilmės

antioksidantų įtaka apsauginių ląstelių savybių stiprinimui, bei įvairių ligų profilaktikai.

Šio tyrimo objektas yra viena iš daugelio vaistinių augalų – kanadinė rykštenė (Solidago

canadensis L.). Augalo genties pavadinimas Solidago L. kildinamas iš lotyniško ţodţio solide, kuris

reiškia „gydyti―, „sutvirtinti― [1]. Rykštenės augaliniai vaistiniai preparatai plačiausiai naudojami kaip

diurezę skatinanti priemonė [2]. Kanadinės rykštenės ţolė taip pat pasiţymi priešuţdegiminiu,

antibakteriniu, priešgrybeliniu, priešvėţiniu poveikiu [3]. Augalo pavadinimas taikliai atspindi jo savybes

– gydanti auksinė rykštė. Atliktų mokslinių tyrimų metu nustatyta, kad rykštenėje gausu fenolinių

junginių, kurie pasiţymi atioksidaciniu aktyvumu, todėl pagaminti augaliniai ekstraktai turi teigiamos

įtakos sveikatai [2].

Svarbu atlikti kanadinės rykštenės ţaliavų, natūraliai augintų Lietuvos sąlygomis, ekstraktuose

esančius veikliuosius junginius bei jų antioksidacinio anktyvumo tyrimus. Šie moksliniai tyrimai suteiktų

vertingos informacijos apie gydomąsias Solidago canandensis savybes ir galėtų būti naudojami efektyvių

augalinių preparatų gamybai . Be to antioksidacinės savybės Lietuvoje maţai tyrinėtos [2].

Šis mokslinis darbas finansuotas Lietuvos Mokslo Tarybos (Nr. MIP-50/2013).

9

DARBO TIKSLAS IR DARBO UŢDAVINIAI

Darbo tikslas:

Nustatyti kanadinės rykštenės (Solidago canadensis L.) ţiedų ekstraktuose esančių veikliųjų

junginių antioksidacinį aktyvumą ESC-ABTS pokolonėliniu metodu.

Darbo uţdaviniai:

1. Apibendrinti mokslinę literatūrą apie kanadinę rykštenę (Solidago canadensis L.) ir darbe

pritaikomą ESC-ABTS pokolonėlinį metodą.

2. Panaudojant ESC-ABTS pokolonėlinį metodą nustatyti ir įvertinti Lietuvoje rinktos

kanadinės rykštenės turimus antioksidacinius junginius ir jų antioksidacinį aktyvumą.

3. Statistiškai įvertinti Solidago canadensis L. antioksidacinių junginių ir antioksidacinio

aktyvumo kitimą priklausomai nuo ţaliavos rinkimo vietovių ir Lietuvos regionų.

10

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Kanadinė rykštenė (Solidago canadensis L.)

Rykštenė – daugiametis augalas, priklausantis astrinių (Asteraceae) šeimos augalas (1 pav.). Tai

yra viena didţiausių šios šeimos genčių, ţinoma apie 120 jos rūšių, iš kurių dauguma auga Šiaurės

Amerikoje. Ji taip pat paplitusi ir Europos kontinente, todėl Lietuva ne išimtis [1]. Lietuvoje paplitusios

rykštenės rūšys: Paprastoji rykštenė (Solidago virgaurea), Kanadinė rykštenė (Solidago canadensis) ir

Didţioji rykštenė (Solidago gigantea). Rykštenių rūšys nereikalauja ypatingų sąlygų augimui, daţniausiai

auga ţmogaus paveiktose vietose, kur augalinė danga nepilnai susivėrusi: apleistuose dirvonuose,

pakelėse, pagrioviuose, kvartalinėse miško linijose, pamiškėse, durpynų pakraščiuose ir panašiose vietose,

iš kurių vėliau skverbiasi ir į natūralias buveines [4].

1 pav. Kanadinė rykštenė (Solidago canadensis) [5]

Rykštenės uţauga iki 1 m aukščio, nors ţinoma porūšių (pvz., S. virgaurea), kurie tepasiekia

10 cm aukštį. Stiebas turi kietą balkšvą šerdį. Augalo stiebas lapuotas, ţalsvai-geltonas arba ţalsvai-rudas,

vietomis tamsiai rausvos spalvos, sferinis, turi daugiau ar maţiau matomus griovelius, apatinėje dalyje

sklandus ir glotnus [6], o viršutinėje dalyje su plaukeliais [2]. Rykštenė viršutinėje dalyje šakojasi.

Lapai ţali, sėdintys, lancetiški, su dantytais krašteliais, maţdaug 8-12 cm ilgio ir 1-3 cm pločio.

Viršutinė lapo pusė ţalia, ganėtinai lygi, o apatinė – pilkšvai-ţalia, plaukuota, ypač aplink gyslas.

11

Ţiedynus sudaro geltoni, 6–15 mm skersmens graiţai, kurie susitelkę į gausią šakotą šluotelę

šakų viršūnėse. Kiekvienas graiţas turi vienašališkų, linijinių gelvai-ţalių paţiedţių, kuriuos supa eilė

lieţuviškų, panašaus ilgio geltonų ţiedų, skraistę. Jie išsidėstę šiek tiek aukščiau vamzdiškų ţiedų, kurie

išsidėstę graiţo viduryje ir yra tos pačios geltonos spalvos. Balti šilkiniai plaukeliai supa viršuje

prisitvirtinusią maţą, rusvą mezginę [6]. Ţydi liepos– rugsėjo mėnesiais. Sutrintas augalas skleidţia

švieţių morkų kvapą. Kartais auginamos kaip dekoratyvūs augalai, nes turi ryškius, iš toli matomus

ţiedynus [1].

1.2. Kanadinės rykštenės veikliosios medţiagos

Europoje nustatyta, kad rykštenės ţolėje yra šios įvairios medţiagos: flavonoidai (1,5%)

(kvercitrinas, kamferolis ir jo glikozidai, astragalinas ir rutozidas), antocianidai ir cianido dariniai. Kitoms

sudedamosioms medţiagoms priskiriami triterpenianiai saponinai (iki 2%), fenolinis glikozidas-

leiokarpozidas (0.08-0.48%) ir virgaureozidas A, fenolinės rūgštys (kofeino rūgštis, chlorogeno rūgštis

(0.2-0.4%), ferulinė rūgštis, sinapininė ir vanilino rūgštis) ir maţas kiekis eterinių aliejų (cadinenas, α ir β

pinenas, mircenas, limonenas, sabinenas ir germakrenas D) [7, 8]. Tyrimai parodė, kad rykštenės

dominuojančios grupės yra flavonoidai, taninai ir fenoliniai junginiai, kurie sudaro 12,5 % visų Solidago

L. augaluose kaupiamų veikliųjų medţiagų [1].

Karšta šarmine ekstrakcijos procedūra buvo išskirtas Solidago canadensis L. polifenolinis-

polisacharidinis-baltyminis kompleksas. Tyrimas parodė, kad rykštenė sudaro angliavandeniai (43%),

baltymai (27%), fenoliai (12%), urono rūgštis (10%) ir neorganinės medţiagos (8%). Ištyrus

angliavandenių sudėtį buvo rasti 5 pagrindiniai monosacharidai: ramnozė (~23%), arabinozė (~20%),

urono rūgštis (~19%), galaktozė (~17%), gliukozė (~14%) ir kitų medţiagų maţi kiekiai [9].

Plačiausiai Solidago L. veikliųjų medţiagų analizei naudojami efektyviosios skysčių

chromatografijos (ESC) ir dujų chromatografijos – masių spektrometrijos (DC-MS) analizės metodai [10,

11].

ESC–MS analizės metodu nustatyta, kad iš Solidago L. besikaupiančių biologiškai aktyvių

junginių 1,5–2,4 procento sudaro rutinas, kvercitrinas, astragalinas, izokvercitrinas, hiperozidas, o daugiau

kaip 8 proc. – triterpeniniai saponinai [12].

Naudojant DC–MS metodą nustatyti Solidago Canadensis eterinių aliejų komponentai: 6-epi-

alfa-kubabenas – 1,5 proc. ir 6-epi-beta-kubabenas – 20,5 proc. [13], taip pat nustatyti 46 komponentai, iš

12

kurių didţiausius kiekius sudaro germakrynas D – 28,6 proc., borneolio acetatas – 9,2 proc. ir limonenas –

5 proc. [14].

Lietuvoje su natūraliai augančiomis rykštenėmis tyrimų nėra labai daug, todėl būtų tikslinga jas

išsamiai ištirti ir palyginti jų skirtingų rūšių antioksidacinį aktyvumą, o vėliau palyginti su pasaulyje

augančiomis rykštenėmis.

1.3. Kanadinės rykštenės panaudojimas medicinoje

Nuo seno rykštenių antpilai pasiţymi šlapimą varančiu poveikiu, atpalaiduoja šlapimo takų

lygiųjų raumenų spazmus ir maţina skausmą. Rykštenės ypač naudingos prasidėjus ūmiam šlapimo takų,

pūslės uţdegimui, kai vargina daţnas ir skausmingas šlapinimasis [1]. Šlapimo organų infekcija (ŠOI) –

viena daţniausių bet kurio amţiaus ţmonių ligų. Daţniausi ŠOI sukėlėjai – Escherichia coli ir kitos

ţarnyno bakterijos [15]. Rykštenių ţolė taip pat naudojama esant inkstų akmenligei ir cistitui.

Rykštenės taip pat pasiţymi priešuţdegiminiu, antibakteriniu, antioksidaciniu, priešgrybeliniu,

priešvėţiniu poveikiu [3]. Solidago L. rūšies augalų antpilus galima naudoti esant peršalimui, nes skatina

prakaitavimą, taip pat kvėpavimo takų ligoms gydyti (skystina gleives ir maţina jų sekreciją) [1].

Plačiau tyrinėtas priešbakterinis Solidago canadensis L. šaknų eterinių aliejų poveikis. Tyrimai

atlikti taikant dujų chromatografiją, dujų chromatografiją/masių spektrometriją ir branduolinio magnetinio

rezonanso spektroskopiją. Buvo atpaţinta 75,4% medţiagų esančių aliejuje, tokių kaip timolis, α-kopaenas

ir karvakrolis. Aliejų antimikrobinis aktyvumas nustatytas diskų difuzijos metodu parodė, kad aliejai

turėjo reikšmingą antibakterinį poveikį prieš S. feacalis ir E. coli. Be to, nustatytas ir priešgrybelinis

poveikis prieš C. Albicans [16].

Dar vieno atlikto tyrimo metu taip pat buvo nustatinėjamas antibakterinis kanadinės rykštenės

ekstraktų poveikis. Buvo gaminami heksano, chloroformo, etilo acetato ir 50% vandeniniai etanolio

ekstraktai iš Solidago canadensis L. ţolės ir tiriami diskų difuzijos metodu naudojant Muller Hinton agaro

terpę. Antibakterinis poveikis buvo tiriamas prieš šias bakterijas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus,

coagulase-negative staphylococci, Candida albicans, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,

Salmonella typhi, Salmonella para typhi A, Salmonella para typhi B, Enterobacter aerogenes, Shigella

dysenteriae, Actinobacter baumanni, Seratia liquefaciens ir Proteus vulgaris.Visi ekstraktai pasiţymėjo

antibakteriniu veikimu, panašiu į standarto. Heksano ir chloroformo MSK buvo 300 μg/ml, o etilo acetato

ir 50% vandeninio etanolio – 200 μg/ml [17]. Šis tyrimas atskleidė, kad kanadinės rykštenės ţolė pasiţymi

priešinfekcinėmis savybėmis.

13

Dar viena svarbi savybė yra citotoksinis poveikis vėţinių ląstelių kultūroms – rykštenės lapų

ekstraktai sėkmingai ţudo prostatos ir krūties karcinomos, įvairių melanomų, taip pat smulkialąstės

plaučių karcinomos vėţines ląsteles. Bandymai su ţmonėmis dar neatlikti, bet teigiamai nuteikia tai, jog

pelėms rykštenės ekstraktų injekcijos ne tik sumaţino auglių dydį, bet ir nesukėlė jokio šalutinio poveikio

[1].

Buvo tyrinėjamas Solidago L. rūšies augalų vandeninių šakniastiebių, lapų ir ţiedynų ekstraktų

priešuţdegiminis poveikis pelėms. Tyrimas parodė, kad rykštenių ekstraktai slopino ląstelių uţdegiminį

poveikį, kurį sukėlė karageninas. Be to, šakniastiebių vandeninis ekstraktas ir jo gautos frakcijos sumaţino

uţdegimą skatinančių mediatorių išsiskirimą į uţdegiminio proceso vietą. Iš visų šakniastiebių ekstraktų

butanolinė frakcija parodė didţiausią priešuţdegiminį veikimą [18].

Kanadinės rykštenės preparatai pasiţymi stipriu antioksidaciniu efektu (saugo organizmo ląsteles

nuo laisvųjų radikalų atakos), kuris, kaip parodė atliktas tyrimas, yra stipresnis nei ţaliosios arbatos ar

askorbo rūgšties ( vitamino C) [19].

1.4. Solidago canadensis L. kaupiami fenoliniai, bei antioksidaciniu efektyvumu

pasiţymintys veiklieji junginiai

Rykštenė turi daug junginių: flavonoidų, antocianidinių ir cianidinių darinių, triterpeninių

saponinų, fenolinių glikozidų, rūgščių, bei maţas kiekis eterinių aliejų [7, 8], tačiau ne visos jos pasiţymi

antioksidaciniu poveikiu. Vieną didţiausių antrinių metabolitų grupę augaluose sudaro fenoliniai

junginiai. Šie junginiai pagal molekulės struktūrą skirstomi į penkias klases: fenolinės rūgštys,

flavonoidai, taninai, stilbenai bei kumarinai. Fenolinės rūgštys ir flavonoidai turi daugiausia junginių ir

yra labiausiai ištyrinėtos klasės [20].

Flavonoidai gausiai paplitę augaliniame pasaulyje. Augaluose jų veikimas būna įvairus: suteikia

lapams spalvą veikdami kaip pigmentai, katalizuoja elektronų pernašą nuo šviesos priklausančioje

fotosintezės fazėje, veikia kaip fermentų inhibitoriai, saugo nuo ţalingų UV spindulių. Taip pat jie yra

svarbūs augalų fiziologiams bei biocheminiams procesams [21].

Fenolinės – rūgštys dariniai, kurie sudaryti iš benzoinės rūgšties ir cinamono rūgšties. Valgomieji

augalai hidroksibenzoinių rūgščių grupės atstovų turi retai – jų aptinkama tik kai kuriuose raudonos

spalvos vaisiuose, svogūnuose, juoduosiuose ridikuose (iki kelių dešimčių miligramų kilograme švieţios

ţaliavos). Svarbus galo rūgšties šaltinis yra arbatmedţio lapai. Kur kas daţniau augaluose randami

hidroksicinamono rūgščių grupės atstovai – didţiausia jų koncentracija aptinkama mėlynėse, kiviuose,

14

slyvose, vyšniose, obuoliuose, o kavos rūgštis – kavoje. Daţniausiai aptinkamos šios fenolinės rūgštys –

p-kumaro, kavos, ferulinė ir sinapo rūgštys [22].

Šių medţiagų kiekis svyruoja ir priklauso nuo augalo brendimo stadijos. Taip pat junginių kiekio

svyravimas gali būti paveiktas ir dėl augalo augimo sąlygų, kaip ir skiriasi skirtingose augalo dalyse

(lapuose, šakniastiebiuose, ţiedynuose ir kt.) [23].

Solidago canadensis L.ţaliavoje iš fenolinių rūgčių junginių suteikiančių antioksidacinių savybių

galima rasti chlorogeno rūgštį, o iš flavonoidų – rutiną, izokvercitriną, hiperozidą ir kt [7].

1.5. Antioksidaciniai junginiai aptinkami Solidago L.: chlorogeno rūgštis, rutinas,

isokvercitrinas ir hiperozidas

2 pav. Chlorogeno rūgšties cheminė struktūra [24]

Chlorogeno rūgštis (CGA)- C16H18O9, (1S,3R,4R,5R)-3-[(3,4-Dihidroksicinamoil)oksi]-1,4,5-

trihidrokiciklohexankarboksilinė rūgštis. Tai balti arba beveik balti kristaliniai milteliai ar adatėlės, laisvai

tirpstančios verdančiame vandenyje, acetone ir etanolyje (96%) [25]. Chlorogeno rūgštis gali turėti keletą

izomerų: kriptochlorogeno rūgštį, neochlorageno rūgštį ir kitas dėl funkcinėse grupėse atsiradusių

izomerizacinių posūkių. [26]

Chlorogeno rūgštis – daţnai augaluose aptinkama temperatūrai jautri fenolinė rūgštis, kuri

susidaro kavos ir chino rūgščių esterifikacijos metu (2 pav.). Chlorogeno rūgštis yra viena labiausiai

paplitusių fenolinių rūgščių augaluose. Obuoliuose ši rūgštis yra viena dominuojančių polifenolinių

junginių, obuolio minkštime chlorogeno rūgšties kiekis sudaro apie 90 proc. visų polifenolinių junginių

[27]. Chlorogeno rūgštis yra plačiai tiriama dėl savo galimų farmakologinių savybių, be to tyrimai parodė,

15

kad ji lengvai pasisavinama ir metabolizuojama ţmogaus organizme CGA gaunant su ţaliaja arbata, jei

augalas jos turi [28]. CGA pasiţymi antioksidacinėmis, antidiabetinėmis ir antilipideminėmis savybėmis

[29, 30]. Ji taip pat gali būti naudojama medicinoje, kaip junginys atsparus ŢIV sukeliamam AIDS

susirgimui [31].

3 pav. Rutino cheminė struktūra [24]

Rutinas (2-(3,4-dihidroksifenil)-5,7-dihidroksi-3-[α-L-ramnopuranozil-(1→6)-β-D-gliukopirano-

ziloksi]-4H-chromen-4-onas) yra flavonoido kvercitrino glikozidas, kuris po hidrolizės skyla į kvercitriną

ir rutinozidą (pav. 3). Tai geltoni kristaliniai milteliai, tamsėja veikiami šviesos spindulių, maţai tirpūs

vandenyje ir etanolyje (96%), tirpūs amoniake [32].

Atlikus tyrimus su pelėmis nustatyta, kad rutinas maţina trombų susidarymą [33]. Taip pat

tyrimą atlikus su ţiurkėmis nustatytas priešuţdegiminis rutino poveikis [34]. In vitro tyrimu nustatytas

antioksidacinis rutino aktyvumas [35].

Buvo atliktas tyrimas su vėţį turinčiomis laboratorinėmis pelėmis. Tyrimo rezultatai parodė, kad

ekstraktai su rutinu pasiţymėjo citotoksiniu poveikiu, nes gydytų pelių išgyvenamumo laikas padidėjo

50 dienų [35].

16

4 pav. Izokvercitrino cheminė struktūra [24]

Izokvercitrinas (2-(3,4-dihidroksifenil)-3-(β-D-gliukofuranosiloksi)-5,7-dihidroksi-4H-1-benzo-

piran-4-onas) yra flavonoido kvercetino glikozidas [37].

Atliktų tyrimų metu nustatyta, jog izokvercitrinas pasiţymi dideliu antioksidaciniu poveikiu [38,

39]. Jis turėjo didţiausia efektą stabdant ląstelių mirtį, kurios buvo paveiktos vandenilio peroksidu [38].

Taip pat nustatytas priešuţdegiminis, antihipertenzinis ir diuretinis poveikis [40, 41, 42].

5 pav. Hiperozido cheminė struktūra [24]

Hiperozidas (2-(3,4-dihidroksifenil)-5,7-dihidroksi-4-okso-4H-chromen-3-il-β-D-galakto-

piranozidas) – blankiai geltonų, adatų formos, kvercetino galaktozidas [43].

17

Atlikti tyrimai parodė, kad hiperozidas, kaip ir kiti kvercetino glikozidai pasiţymi

priešuţdegiminiu [44], antioksidaciniu [45], priešgrybeliniu [46], antimikrobiniu bei antivirusiniu veikimu

[47].

1.6. Antioksidantai, jų aktyvumas ir veikimo mechanizmas

Antioksidantas – tai medţiaga, kuri efektyviai redukuoja prooksidantą sudarydama

netoksiškus arba maţai toksiškus junginius, taip išvengiami arba sumaţinami biologinių taikinių

oksidaciniai paţeidimai [48]. Labai didelę prooksidantų dalį biologinėse sistemose sudaro reaktyvios

deguonies formos (ROS) ir reaktyvios azoto formos (RNS), kurios skirstomos į dvi grupes – radikalus

ir neradikalus. Prooksidantai veikia baltymus, nukleorūgštis ir lipidus, todėl gali lemti su amţiumi

susijusių ligų, tokių kaip širdies ar kraujagyslių susirgimų, Parkinsono ir Alzhaimerio ligos,

kataraktos, bei vėţinių susirgimų, etiologiją, todėl antioksidantų atliekami tyrimai yra svarbūs [49].

Antioksidaciniai junginiai ROS/RNS radikalus ir neradikalus inaktyvuoja dviem pagrindiniais

mechanizmais: vandenilio atomo perdavimo (VAP) ir elektronų perdavimo (EP) reakcijomis [50].

VAP ir EP reakcijos daţnai vyksta vienu metu ir dominuojantis mechanizmas priklauso nuo

antioksidanto struktūros ir jo savybių (tirpumo, pasiskirstymo koeficiento) bei terpės (tirpiklio tipo,

pH). Jungties disociacijos energija ir jonizacijos potencialas yra du pagrindiniai faktoriai, kurie lemia

antioksidantinio poveikio mechanizmą ir antioksidantų efektyvumą [51]. Suminis antioksidantinis

aktyvumas apima:

1) ROS/RNS generacijos slopinimą ir jų surišimo gebėjimą;

2) redukcinę galią;

3) pereinamųjų metalų sujungimo gebėjimą;

4) antioksidantinių fermentų aktyvavimą;

5) oksidacinių fermentų slopinimą.

Įvairiapusiškam fenolinių junginių antioksidantiniam poveikiui nusakyti, atliekami tyrimai

dirbtinėse modelinėse sistemose in vitro skirtingais reakcijų mechanizmais su įvairiais oksidantais ir jų

taikiniais [52]. Pagal atliktus tyrimus prognozuojamos antioksidacinių junginių veikimas in vivo

sistemose.

VAP reakcijomis pagrįstuose antioksidantinio aktyvumo nustatymo metoduose antioksidantas

suriša laisvąjį radikalą atiduodamas vandenilio atomą ir sudarydamas stabilius junginius. VAP

reakcijų neįtakoja tirpiklio rūšis ir terpės pH. Jos yra labai greitos, trunka nuo kelių sekundţių iki

18

keliolikos minučių. Redukuojančių priemaišų (pvz.: metalų jonų) buvimas VAP reakcijomis

pagrįstuose metoduose įtakoja klaidingai didesnį antioksidantinį aktyvumą [50].

Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai, priklausantys EP reakcijoms, matuoja

antioksidanto gebėjimą atiduoti vieną elektroną ir redukuoti oksidantą, kuris yra stabilus laisvasis

radikalas arba kintamo valentingumo metalo jonas [52]. EP reakcijomis pagrįstuose antioksidantinio

aktyvumo nustatymo metoduose tiriamio junginio reaktyvumas priklauso nuo jo reaktyvių funkcinių

grupių jonizacijos potencialo ir deprotonizacijos prie tam tikrų pH sąlygų [50]. Šios reakcijos yra

priklausomos nuo pH, nes didėjant terpės pH reikšmei, maţėja jonizacijos potencialas ir yra didinama

deprotonizacija. Todėl, tiriamasis junginys lengviau atiduoda savo elektronus. EP reakcijomis

pagrįstuose metoduose pH reikšmingai įtakoja tiriamų junginių redukcinę galią (rūgštinėje terpėje

antioksidacinio junginio redukcinė galia gali sumaţėti, o bazinėje- išaugti) [53, 54]. EP reakcijos

santykinai lėtos, reikalaujančios daug laiko kol pasiekiama pusiausvyros būsena. EP reakcijomis

pagrįsti metodai susideda iš dviejų komponentų: ţinomo (standartinio) oksidanto ir tiriamo

antioksidanto. Vyksta nekonkuruojanti reakcija, kurios metu antioksidantas atiduoda elektroną

standartiniam oksidantui. Redukuojantis standartiniam oksidantui, stebimas absorbcijos spektro

pokytis regimosios šviesos srityje [55]. Reakcijos mišinio spalvos pokyčiai yra proporcingi

antioksidanto redukcinei galiai. Galimas rezultatų kintamumas dėl fiksuoto laiko skirtumų, taip pat dėl

įvairių priemaišų (ypač metalo jonų) įtakos [50].

Daţniausiai naudojami EP reakcijomis pagrįsti antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai

yra: DPPH radikalų surišimo metodas, ABTS radikalų-katijonų surišimo metodas, geleţies redukcijos

antioksidantinė galia (FRAP) ir vario redukcijos antioksidantinė galia (CUPRAC) [52].

1.7. ESC pokolonėliniai metodai taikomi antioksidacinio aktyvumo nustatymui

Pastaruoju metu vis plačiau taikomi efektyviosios skysčių chromatografijos pokolonėliniai

antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai. Juose taikomas efektyvus biologiškai aktyvių junginių

skirstymas ir pokolonėlinės reakcijos naudojant įvairius reagentus (daţniausiai DPPH ir ABTS

radikalai) [56, 57, 58, 59].

19

1.7.1. ESC-DPPH antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodikos

Pirmieji ESC pokolonėlinį metodą išvystė Koleva ir kt. panaudodami DPPH (2,2-difenil-1-

pikrilhidrazilo) tirpalą, kuris suriša ir atrinka laisvuosius radikalus kompleksiniuose mišiniuose. ESC

išskirstyti veiklieji junginiai reaktoriuje reaguoja su DPPH radikalais ir uţrašomos neigiamos smailės

prie 514 nm bangos ilgio, gautos po absorbcinio detektoriaus fiksacijos įvykus redukcijai. Tyrimo

metu naudota 15 m 0,25 mm vidinio diametro PEEK vamzdelio reakcijos kilpa. Pertraukiamo veikimo

švirštinio siurblio pagalba į reaktorių buvo tiektas DPPH tirpalas. Autoriai optimizavo metodą ir

nustatė, kad geriausios tiriamųjų junginių aptikimo ribos pasiekiamos naudojant 10-5 M

koncentracijos DPPH metanolinį tirpalą, kai reakcija vyksta 30s. Metodo jautrumą maţino didelis

organinio tirpiklio kiekis ir rūgštinė terpė. Autorių nuomonę ESC-DPPH pokolonėlinis metodas yra

pigus, paprastas ir universalus antioksidaciniam kompleksinių mišinių nustatymui, todėl tyrimą plėtojo

ir tobulino daug kitų mokslininkų [60].

Pukalskas ir kt. [61] panaudojo ankstesnių mokslininkų tyrimus ir išvystė sudėtingą ESC-

RSD-DMD-KFE-BMR sistemą tiesioginiam antioksidantų tyrimui. Eliuentas su atskirtais tiriamaisiais

junginiais po diodų matricos detektoriaus (DMD) yra dalijamas į 2 skirtingas tėkmes: 1- patenka į

radikalų surišimo detekcijos (RSD) sistemą, kur sumaišomas su DPPH ir amonio acetato buferiniu

tirpalu, 2- į kietafazės ekstrakcijos (KFE) ir branduolių magnetinio rezonanso (BMR) aptikimo

sistemą. Šio metodo pagrindinė problema, kad BMR detektorius pasiţymi menku jautrumu, kurį

pavyko patobulinti Exachou ir kt. [62]. Autoriai įmontavo 2 kelių voţtuvą taip pašalindami prieš tai

aptarto metodo trūkumą. Patobulintas metodas leidţia tirti tik antioksidacinių savybių turinčius

junginius.

1.7.2. ESC-ABTS antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodikos

ABTS (2,2‗- azino- bis-(3 –etilbenzotiazolino –6- sulfoninės rūgšties) radikalų surišimo metodas

yra vienas iš daţniausiai taikomų antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodų. ABTS radikalas-

katijonas (ABTS•+) yra stabilus, ilgai išsilaikantis spalvotas radikalas, kuris regimosios šviesos spektre

turi kelis absorbcijos maksimumus prie 415, 650, 734 ir 815 nm bangos ilgių. ABTS•+ sukuriamas

cheminių reakcijų pagalba arba fermentinių būdų [63]. Pirmasis – originalus metodas buvo pavadintas

TEAC ir pagrįstas metmioglobino aktyvacija. Jos metu metmioglobinas sujungiamas su H2O2 ir

pagaminami ferilmioglobino radikalai, kurie reaguoja su bespalviu ABTS reagentu ir sudaromi spalvoti

20

ABTS•+. Taip pat šis reagentas gali būti gaunamas vandeninėje ar organinėje terpėje ABTS radikalą

veikiant kalio persulfatu, mangano oksidu ir 2,2′-azo-bis(2-aminopropanu) [57]. Antiradikaliniu aktyvumu

pasiţymintys junginiai surišami su susidariusiais ABTS radikaliniais katijonais, nes originaliame TEAC

metode ABTS•+ susidarymas vyksta vėliau nei mėginio įdėjimas. Tiriamojo bandinio antiradikalinis

aktyvumas įvertinamas pamatavus reakcijos mišinio absorbciją, kuri parodo nesurištų ABTS•+ kiekį.

Tačiau šis metodas buvo iškritikuotas, nes taip dedant medţiagas antioksidantai gali susijungti su H2O2 ir

gaunamas klaidingai rodomas antiradikalinis aktyvumas [56].

Naujesnis ABTS radikalų- katijonų surišimo metodas yra patobulintas, kuriame prieš reakciją

sudaromas stabilus ABTS•+ ir įvedamas kartu su tiriamais antioksidantais. Šis reagentas gaunamas

vandeninėje ar organinėje terpėje ABTS radikalą veikiant kalio persulfatu, mangano oksidu, 2,2′-azo-

bis(2-aminopropanu) ir reakcijos metu reaguoja tik su gautu ABTS•+ radikalu- katijonu (6 pav.) [57].

Atliekant antioksidantinio aktyvumo tyrimą ABTS+ radikalų – katijonų surišimo metodu ABTS+

radikalas reaguoja su tam tikru junginiu, pasiţyminčiu antioksidantinėmis savybėmis. Po reakcijos

ABTS+ koncentracija sumaţėja. Spalvotas ABTS+ katijonas redukuojamas į pradinę bespalvę ABTS

formą. ABTS radikalų surišimo aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentu

[58].

6 pav. ABTS•+ gavimas ir panaudojimas [64]

Antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodas, naudojant ABTS+ radikalą yra stabilus,

patikimas, jautrus, lengvas, patikimas, nebrangus [56]. ABTS•+ privalumas, tai kad jis tirpus vandenyje ir

organiniuose tirpikliuose, kas leidţia nustatyt hidrofilinių ir lipofilinių junginių antioksidacinį aktyvumą

[63]. Šis metodas taip pat turi keletą trūkumų, nes bet koks junginys, kurio redokso potencialas maţesnis

nei ABTS•+ (0,68 V) gali reaguoti su šiuo radikalu-katijonu, tačiau šis surišimo metodo trūkumas nėra

esminis ir netrukdo plačiam jo pritaikymui vaistinių augalinių ţaliavų ekstraktų [59]. Pastarasis metodas

bus taikomas šio tyrimo metu.

21

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Kanadinės rykštenės (Solidago canadensis L.) ţiedai surinkti iš įvairių Lietuvos miestų ir jų

rajonų 2012 metais ţydėjimo metu. Ţaliava dţiovinta šildomoje dţiovykloje 45°C temperatūroje, saugoma

tamsioje, tamsioje, vėsioje ir vėdinamoje patalpoje. 1 lentelėje pateikiamos ţaliavos rinkimo vietos:

Lietuvos regionas ir geografinė padėtis pagal koordinates.

1 lentelė. Solidago canadensis L. ţaliavų rinkimo vietovės

Ţaliavos numeris (Regiono nr.) Lietuvos vietovė Geografinė padėtis

RŢ1 (Reg.1) Anykščių r.,Traupis 55° 30' Š. Plat. 24° 44' R.Ilg

RŢ2 (Reg.2) Ignalinos m. 55° 19' Š. Plat. 26° 10' R.Ilg

RŢ3 (Reg.3) Kaunas, Islandijos pl. 54° 56' Š. Plat. 23° 56' R.Ilg

RŢ4 (Reg.3) Kaunas, Raudondvario pl. 54° 55' Š. Plat. 23° 48' R.Ilg

RŢ5 (Reg.4) Molėtų r.,Cezariškiai 55° 14' Š. Plat. 25° 27' R.Ilg

RŢ6 (Reg.5) Tauragės apsk., Birbintė 55° 08' Š. Plat. 22° 08' R.Ilg

RŢ7 (Reg.5) Tauragės apsk., Birbintė 1 55° 08' Š. Plat. 22° 08' R.Ilg

RŢ8 (Reg.5) Tauragės r. Oplankys 55° 10' Š. Plat. 22° 08' R.Ilg

RŢ9 (Reg.5) Tauragės r. Oplankys 1 55° 10' Š. Plat. 22° 08' R.Ilg

RŢ10 (Reg.6) Utena, Aukštaičių g. 55° 29' Š. Plat. 25° 38' R.Ilg

RŢ11 (Reg.6) Utena, Eţero g. 55° 29' Š. Plat. 25° 35' R.Ilg

RŢ12 (Reg.6) Utena, K.Ladygos g. 55° 28' Š. Plat. 25° 36' R.Ilg

RŢ13 (Reg.6) Utena, Kupiškio g. 55° 30' Š. Plat. 25° 34' R.Ilg

RŢ14 (Reg.6) Utena, Pievų g. 55° 30' Š. Plat. 25° 37' R.Ilg

RŢ15 (Reg.6) Utena, Uţpalių g. 55° 30' Š. Plat. 25° 37' R.Ilg

RŢ16 (Reg.6) Utena, Uţpalių g. 1 55° 30' Š. Plat. 25° 37' R.Ilg

22

RŢ17 (Reg.6) Utena, Uţpalių g. 2 55° 31' Š. Plat. 25° 37' R.Ilg

RŢ18 (Reg.6) Utena, Uţpalių g. 3 55° 31' Š. Plat. 25° 37' R.Ilg

RŢ19 (Reg.6) Utenos r., Liaumuškos 55° 27' Š. Plat. 25° 34' R.Ilg

RŢ20 (Reg.6) Utenos r., Politiškės 55° 27' Š. Plat. 25° 46' R.Ilg

RŢ21 (Reg.6) Utenos r., Tauragnai 55° 26' Š. Plat. 25° 47' R.Ilg

RŢ22 (Reg.6) Utenos r., Vosgėliai 55° 27' Š. Plat. 25° 31' R.Ilg

RŢ23 (Reg.6) Utenos r., Vosgėliai 1 55° 27' Š. Plat. 25° 31' R.Ilg

RŢ24 (Reg.6) Utenos r.,Antalgė 55° 29' Š. Plat. 25° 28' R.Ilg

RŢ25 (Reg.6) Utenos r.,Antalgė 1 55° 29' Š. Plat. 25° 28' R.Ilg

RŢ26 (Reg.6) Utenos r.,Atkočiškės 55° 31' Š. Plat. 25° 34' R.Ilg

RŢ27 (Reg.6) Utenos r.,Deguliai 55° 26' Š. Plat. 25° 31' R.Ilg

RŢ28 (Reg.6) Utenos r.,Velbiškės 55° 24' Š. Plat. 25° 31' R.Ilg

RŢ29 (Reg.7) Vilniaus r. Papiškės 54° 43' Š. Plat. 25° 07' R.Ilg

RŢ30 (Reg.7) Vilniaus r. Riešė 54° 47' Š. Plat. 25° 16' R.Ilg

RŢ31 (Reg.7) Vilniaus r. Riešė 1 54° 47' Š. Plat. 25° 16' R.Ilg

RŢ32 (Reg.7) Vilniaus r. Riešė 2 54° 47' Š. Plat. 25° 16' R.Ilg

RŢ33 (Reg.7) Vilniaus r. Riešė 3 54° 47' Š. Plat. 25° 16' R.Ilg

RŢ34 (Reg.7) Vilniaus r. Riešė 4 54° 47' Š. Plat. 25° 16' R.Ilg

RŢ35 (Reg.7) Vilnius, Kalvarijų g. 54° 43' Š. Plat. 25° 16' R.Ilg

RŢ – kanadinės rykštenės ţiedų mėginiai

2.2. ESC-ABTS pokolonėliniui metodui naudojamos medţiagos ir įrengimai

Analizės metu naudojamos medţiagos:

Išgrynintas vanduo (Vandens gryninimo sistema Millipore (Bedfordas, MA, JAV));

Acetonitrilas (ACN) (Roth GmbH (Karlsruhas, Vokietija));

23

Metanolis 70% (Roth GmbH (Karlsruhas, Vokietija));

Etanolis (Stumbras (Kaunas, Lietuva));

99% grynumo trifluoracto rūgštis ( TFA) (Sigma-Aldrich (Buchs, Šveicarija));

98% ABTS (Sigma-Aldrich (Steinheimas, Vokietija) ir (St. Louis, JAV));

98% troloksas (Fluka Chemika (Buchs, Šveicarija));

99% TFA (Fluka Chemika (Buchs, Šveicarija));

Natrio citratas (Sigma-Aldrich (Steinheimas, Vokietija);

Citrinos rūgštis (Sigma-Aldrich (Steinheimas, Vokietija);

Kalio persulfatas (Sigma-Aldrich (Steinheimas, Vokietija);

95,33% chlorogeno rūgštis (HWI ANALYTIK GmbH (Ruelzheimas, Vokietija));

97,11% rutino trihidratas (HWI ANALYTIK GmbH (Ruelzheimas, Vokietija));

94,16% isokvercitrinas (HWI ANALYTIK GmbH (Ruelzheimas, Vokietija)).

Tyrimo metu naudota aparatūra ir įrengimai:

Vandens gryninimo sistema Millipore (Bedfordas, MA, JAV);

Chromatografas Waters 2695 (Waters Corporation, Milfordas, CT, JAV);

Ultragarso vonelė BioSonic UC100 (Mahwah, JAV);

Fotodiodų matricos detektorius Waters 996 (Waters Corporation);

3 μm YMC kolonėlė 150×4,6 mm (YMC Europa Gmbh, Dinslakenas Vokietija);

Waters 2487 UV/VIS detektorius (Waters Corporation).

Principinė ESC pokolonėlinio metodo naudojant ABTS reagentą schema naudojant išvardintą

aparatūrą pavaizduota (7 pav.)

24

7 pav. ESC- ABTS pokolonėlinės reakcijos principinė schema [69]

2.3. Kanadinės rykštenės mėginių paruošimas ir ekstrakcija

Solidago L. genties augalų, ţiedų ekstraktai buvo paruošti pagal metodus, kuriuos naudojo kiti

mokslininkai savo tyrimuose [65]. Mėginiams paruošti naudota ultragarso vonelė BioSonic UC100

(Mahwah, JAV). Grynos ţaliavos ekstrakcijai atlikti buvo pasirinktas vandeninis 70% metanolio tirpalas

(V/V). Metanolis buvo pasirinktas dėl savo didelio poliškumo laisviems radikalams [66]. Tiriamos

ţaliavos ekstraktai buvo gaminami santykiu 1:100 (masė/tūris), tiriamojo objekto sveriant 0,1 gramo ir

uţpilant tirpikliu iki 10 ml ţymos. Paruošti ekstraktai buvo laikomi ultragarso vonelėje 50 min, palaikant

pastovią 25ºC temperatūrą.Prieš ekstraktų injekaciją į ESC sistemą visi mėginiai buvo filtruoti per 0,22

µm sterilius nailoninius švirkštinius filtrus (diametras-13 mm, gauta iš –Carl Roth GmbH & Co. KG,

Vokietija).

2.4. ABTS darbinio tirpalo ruošimas

ABTS milteliai ištirpinami išgrynintame vandenyje (2 mM) ir pridedama kalio persulfato (0,7

mM). Mišinys laikomas 16-17 h. tamsoje kambario temperatūroje kol pasiekiama reakcijos pusiausvyra.

Gautas pradinis ABTS radikalo-katijono tirpalas skiedţiamas išgrynintu vandeniu iki darbinės 110 μM

ABTS•+ koncentracijos. Atliekant ESC-ABTS pokolonėlinių metodų palyginamuosius tyrimus, pradinis

ABTS radikalo-katijono tirpalas iki darbinės 110 μM koncentracijos skiedţiamas acetatiniu buferiu (300

mM, pH 3,6) [67].

25

2.5. ESC taikymas Solidago canadensis L. veikliųjų junginių kokybiniam

įvertinimui

Analizė buvo atlikta su Waters 2695 chromatografu (Waters Corporation, Milfordas, JAV) bei

fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 PDA (Waters Corporation). Veikliųjų junginių atskyrimui

naudota 150×4,6 mm, 3 µm YMC kolonėlė ( YMC Europe Gmbh, Dinslakenas, Vokietija), kuri visos

analizės metu laikyta išoriniame termostate, palaikant pastovią 25ºC temperatūrą. Analizės metu injekuota

10 µl tiriamo tirpalo, mobilios fazės tėkmės greitis – 1,0 ml/min. Taikyta gradientinė sistema, kurios

eliuacijos sąlygos skirtingais laiko intervalais nurodytos 2 lentelėje. Chromatografinių smailių viršūnių

identifikavimas atliktas pagal analičių ir standartinių junginių sulaikymo laikų bei UV absorbcijos spektrų

210 – 400 nm ribose sutapimus. Individualių serijų standartų tirpalai buvo ruošiami su 70% etanoliu.

Flavonoidų ir fenolinių rūgščių aptikimas atitinkamai atliktas prie 355 nm ir 324 nm bangos ilgių.

2 lentelė. Eliuacijos sąlygos skirtingais laiko intervalais

Laikas Trifluoracto rūgštis (A) (%) Acetonitrilas (B) (%)

0 min 95 5

5 min 88 12

50 min 70 30

51 min 10 90

56 min 10 90

57 min 95 5

2.6. ESC-ABTS pokolonėlinis antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodas

Antioksidacinių medţiagų nustatymui iš kanadinės rykštenės augalinės ţaliavos buvo pasirinktas

efektyviosios skysčių chromatografijos pokolonėlinis metodas naudojant ABTS reagentą.

Įvedus mėginius į efektyviosios skysčių chromatografijos metodo detekcijos sistemą, judri fazė

su tiriamais junginiais per reakcijos kilpą eina į maišymo trišakį, kur tuo pačiu metu yra tiekiamas ABTS

reagento tirpalas 0,5ml/min Gilson pump 305 (Middletonas, WI, JAV) siurblio pagalba. ESC-ABTS

sistemoje naudojama 3 m (vidinis diametras 0,25 mm, išorinis diametras 1,58 mm) reakcijos kilpa, kuri

teramostatuojama 50°C temperatūroje. Antioksidacinių medţiagų reakcija su ABTS pasireiškė reagento

26

spalvos pasikeitimu nustatant naudojant Waters 2487 UV/VIS detektorių (Waters Corporation). Tiriamųjų

tirpalų detekcija atliekama prie 650 nm šviesos bangos ilgio. Signalo stiprumas išreiškiamas neigiamų

aktyvių junginių (isokvercitrino, rutino, hiperozido, chlorogeno rūgšties ir neţinomo junginio) pikais.

Ekstraktų junginių antioksidacinis aktyvumas pokolonėliniu metodu buvo vertinamas pagal trolokso

standarto ekvivalentą. Kalibravimo kreivės paruoštos naudojant trolokso etanolinį tirpalą aštuoniuose

praskiedimuose, koncentracijų intervalas: 0,625- 80 mg/ml. Metodas pritaikyta pagal ankstesnius

mokslininkų atliktus tyrimus [65].

2.6.1. Duomenų statistinis įvertinimas

Grafiniam gautų rezultatų pavaizdavimui naudota MS Excel (Microsoft, JAV) kompiuterinė

programa. Duomenys statistiškai įvertinti „SPSS 20‖ (―IBM, JAV)‖ statistikos programa. Apskaičiuoti

regresijos koeficientai, koreliacijos koeficientai, standartinės paklaidos. Rezultatai laikyti statistiškai

reikšmingais, kai p<0,05.

27

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. ESC-ABTS pokolonėlinės metodikos optimizavimas

Solidago canadensis L. ţiedų, rinktų skirtinguose Lietuvos regionuose, metanolinių ekstraktų

antioksidacinių junginių nustatymui pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos-ABTS

pokolonėlinis metodas. Jis pasirinktas dėl lengvo, patogaus ir daug laiko bei sąnaudų nereikalaujančio

antioksidacinių medţiagų kokybinio ir kiekybinio nustatymo mėginiuose. Buvo identifikuoti penki

Solidago canadensis ţiedų ekstraktuose nustatyti antioksidacinių junginių kiekiai: chlorogeno rūgšties

(1), rutino (2), izokvercitrino (3), hiperozido (4) ir vieno neţinomo junginio (5), kurių sulaikymo laikai

matomi PDA ir UV/VIS detektorių chromatogramose (8 pav.). Kadangi dirbant su ABTS reagentu,

reakcijos trukmė maţiau reikšminga nei eliucijos zonų plitimas, reagentas turi perspektyvą taikymui su

trumpomis kilpomis tokiose derivatizacijos metodikose, kuriose chromatografinis skirstymas yra

formuojamas atsiţvelgiant į ,,greičio― rodiklį arba į jautrumą. Esamoje chromatrografinio skirstymo

aplinkoje Solidago canadensis ţaliavos antioksidacinio aktyvumo įvertinimo tyrimams su ABTS reagentu

taikytos optimaliausios sąlygos yra 3 metrų kilpa, ją termostatuojant prie 50oC. Junginių aptikimas atliktas

prie 650 nm šviesos bangos ilgio. Metodikos nustatymai atlikti pagal ankstesnius mokslininkų tyrimus

[65].

Atlikto tyrimo metu nepavyko nustatyti tik vienos medţiagos, tačiau ji turėjo didelę įtaką

antioksidaciniam aktyvumui dėl didelio jos kiekio ir buvo įtraukta į rezultatus. ESC-ABTS pokolonėline

metodika gauti rezultatai yra tikslūs, o duomenys atsikartojantys. Ši optimizuota metodika yra tinkama

atlikti antioksidacinių junginių nustatymui.

28

8 pav. Solidago canadensis L. ţiedų metanolinių ekstraktų PDA ir UV/VIS detektorių

chromatogramos. Chromatogramos pikai: 1 – chlorogeno rūgšties; 2 – rutino; 3 – izokvercitrino;

4 – hiperozido; 5 – neţinomas junginio

3.2. ESC-ABTS pokolonėlinio metodo validacija

Pokolonėlinės analizės efektyviam junginių atskirimui yra svarbu uţtikrinti optimalias

chromatografinio skirstymo sąlygas, bet taip pat svarbu yra įsitikinti metodo patikimumu. ESC-ABTS

metodas buvo validuotas nustatant šiuos parametrus: specifiškumą, tiesiškumą, preciziškumą, minimalią

nustatymo koncentraciją (MNK) bei minimalią aptikimo ribą (MAR). Taip pat svarbūs kriterijai metodikai

įteisinti yra kalibracinės kreivės lygtis ir koreliacijos koeficientas. Minėti kriterijai ir atspindi kritinius

kiekybinio vertinimo taškus. Duomenys pateikti 3 lentelėje.

ESC pokolonėlinio metodo jautrumas buvo įvertintas atsiţvelgiant į minimalią aptikimo ribą

(MAR) ir minimalią nustatymo koncentraciją (MNK). Ribos buvo apibrėţtos nustatant signalo – triukšmo

santykį. Minimalios aptikimo ribos signalo triukšmo santykis 3:1, minimalios nustatymo koncentracijos –

10:1.

29

Metodo specifiškumas buvo įvertintas atsiţvelgiant į du parametrus: sulaikymo trukmę, kuri

atsispindėjo tiriamųjų junginių chromatogramose ir PDA spektro atitikimą standartui. Chromatogramose

tiriamųjų junginių sulaikymo trukmė turi sutapti su standartų sulaikymo trukmėmis bei spektriniais

duomenimis.

Metodo preciziškumas buvo nustatytas pagal pakartojamumo bei tarpinio preciziškumo

parametrus. Pakartojamumas buvo nustatytas 4 analičių (chlorogeninės rūgšties, rutino, izokvercitrino,

trolokso) penkiais vertinimais tą pačią dieną, nekeičiant tyrimo sąlygų (tie patys reagentai, tiriamieji

pavyzdţiai ir instrumentai). Metodo tarpinio preciziškumo įvertinimas buvo atliktas analizę atliekant

trimis skirtingomis dienomis. Pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas buvo išreikštas santykinio

standartinio nuokrypio dydţiu (SSN). SSN – tai atsitiktinio dydţio standartinio nuokrypio ir vidurkio

santykis, kuris išreiškiamas procentais.

Gauti pokolonėlinio metodo ESC-ABTS pakartojamumo ir atkuriamumo variacijos koeficientai,

kurie neviršijo 3.00 proc. Toks rezultatas yra priimtinas kiekybiniam junginių antiradikalinio aktyvumo

įvertinimui.

3 lentelė. Tiesioginio ESC-ABTS metodo tiesiškumo, preciziškumo, minimalios aptikimo ribos

(MAR) ir minimalios nustatymo koncentracijos (MNR) reikšmės

a Pakartojamumas

b Tarpinis presiziškumas

Parametrai

ABTS pokolonėlinis metodas

Troloksas Chlorogeninė rūgštis Rutinas Izokvercitrinas

Tiesiškumas (µg/ml) 0.625-80 1.88-60 0.94-30 1.00-33

Preciziškumas:

pakartojamumas

SSN (%)a

Tarpinis

preciziškumas SSN

(%)b

0.30

0.40

2.20

2.50

2.20

2.90

1.20

1.30

MNK (µg/ml) 0.26 0.78 0.39 0.42

MAR (µg/ml) 0.36 2.62 1.75 1.39

30

Kanadinės rykštenės (Solidago canadensis L.) ţiedų ekstraktuose, esančių veikliųjų junginių

antioksidacinio aktyvumo nustatymui išreikšti naudojamas etaloninis trolokso standartinis tirpalas.

Rykštenės ekstraktų radikalinių medţiagų koncentracijos signalo priklausomybė pagrįsta pagal trolokso

standarto kalibracinę kreivę. Ji buvo apskaičiuota pagal trolokso koncentraciją reikalingą sukelti

ekvivalentišką antioksidacinį aktyvumą (μm). Antioksidacinių junginių kiekybiniam įvertinimui nustatyti

buvo sudaryta trolokso kalibracinė kreivė. Buvo įvesti aštuoni skirtingi ABTS reagento trolokso tirpalai,

kurių koncentracijos vyravo 0.625-80 µg/mL. Tiesioginė koreliacija tarp trolokso kiekio ir neigiamų

viršūnių dydţio buvo apibrėţta aukščio koreliacijos faktoriumi- ABTS (R2). Kalibracinės kreivės

išreikštos pagal troloksą buvo kvadratinės išraiškos: ABTS-(R2) = 0,9991 (Y=-1,54·10

2x

2+4,16·10

4·x-

2,08·104). Atliekant kalibracinės kreivės sudarymą, pirmiausia taikyta tiesinės priklausomybės lygtis,

tačiau po pakartotų analizių determinacijos koeficientų (R2) išraiška gavosi nepatikima kiekybiniams

tyrimams. Dėl to buvo pasirinkta ne tiesinė, o kvadratinė kalibracinės kreivės išraiška. Rezultatams įtakos

galėjo turėti, sąlyginai didelės trolokso reagento koncentracijos.

3.3. 7 Lietuvos regionų Solidago canadensis L. antioksidacinių junginių ir

antioksidacinio aktyvumo vidurkių palyginimas

Tyrimo metu augalinė ţaliava buvo paimta iš 7 skirtingų Lietuvos regionų ir apskaičiuotas jose

nustatytų antioksidacinių junginių ir jų aktyvumo vidurkis, kad būtų galima palyginti ţaliavą tarp skirtingų

regionų . Kanadinės rykštenės ţiedų mėginiuose nustatyti 5 antioksidaciniai junginiai, iš kurių didţiausiu

antioksidaciniu aktyvumu pasiţymėjo neidentifikuotas junginys. Taip pat rykštenės ekstraktuose

nustatytas didelis chlorogeno rūgšties kiekis. Antioksidacinis aktyvumas išreikštas standartinio

antioksidanto trolokso ekvivalentais (TEAC) gramui ţaliavos. Tyrimo rezultatai pateikti 4 lentelėje.

4 lentelė. Solidago L. ţiedų ekstraktuose, esančių junginių antioksidacinis aktyvumas (µmol/g) pagal

ţaliavos rinkimo regioną

Regionas Chlorogeninė rūgštis Rutinas Izokvercitrinas Hiperozidas Neţinomas j.

Reg. 1 26,876 12,754 2,221 0,673 42,842

Reg. 2 21,078 15,321 1,639 0,424 44,18

Reg. 3 23,874 15,73 1,961 0,068 42,903

Reg. 4 24,083 19,475 3,47 0 38,792

Reg. 5 28,101 14,914 1,115 0,26 40,761

Reg. 6 24,126 14,374 2,72 0,281 38,7

Reg. 7 23 11,601 2,055 0,267 38,748

31

9 pav. Antioksidacinių junginių procentinis pasiskirstymas Solidago canadensis L. augalinių ţaliavų

ekstraktuose rinktų iš skirtingų regionų

Kaip matoma iš 4 lentelės ir 9 pav. neţinomas junginys ir chlorogeno rūgštis kanadinės rykštenės

ţaliavos metanoliniuose ekstraktuose pasiţymi didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu proc. ir kiekybiškai.

Didţiausias chlorogeno rūgšties antioksidacinis aktyvumas (28,101 µmol/g) nustatytas ekstraktuose

rinktuose 5 regione (Tauragės apsk./r.), maţiausias (21,078 µmol/g) – 2 regione (Ignalinos mieste). Rutino

antioksidacinis aktyvumas Solidago canadensis L. ţiedų ekstraktuose varijavo nuo 11,601 µmol/g iki

19,475 µmol/g. Daugiausiai rutino nustatyta ekstraktuose rinktuose 4 regione (Molėtų r.), o maţiausiai 7

regione (Vilniaus m./r.). Izokvercitrino antioksidacinis aktyvumas vyravo nuo 1,115 µmol/g iki 3,47

µmol/g – didţiausias 4 regione rinktų ţaliavų (Molėtų r.), maţiausias – 5 regione (Tauragės apsk./r.).

Hiperozido antioksidacinis aktyvumas lyginant su kitais junginiais buvo labai maţas ir jo visiškai

nenustatyta ekstraktuose iš 4 regiono (Molėtų r.), o didţiausias kiekis (0,673 µmol/g) 1 regione rinktų

ţaliavų (Anykščių r.). Neţinomas junginio antioksidacinis aktyvumas buvo didţiausias ir svyravo nuo

38,7 µmol/g iki 44,18 µmol/g, atitinkamai maţiausias buvo ekstraktuose iš 6 regiono (Utenos m./r.),

didţiausias - 2 regiono ekstraktuose (Ignalinos mieste).

Vertinant Solidago canadensis L. ţiedų, rinktų 7 skirtinguose Lietuvos regionuose, metanolinius

ekstraktus, nustatytas bendras antioksidacinis aktyvumas pagal vidutinį antioksidacinių junginių kiekį

pasiskirsčiusį regionų ţaliavoje. Jis kito nuo 75,671 µmol/g iki 85,821 µmol/g. Didţiausia reikšmė

(85,821 µmol/g) nustatyta ekstrakte iš 4 regiono (Molėtų r.), maţiausia (75,671 µmol/g) - 7 regione

(Vilniaus m./r.). Rezultatai pateikti 10 pav.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Reg. 1 Reg. 2 Reg. 3 Reg. 4 Reg. 5 Reg. 6 Reg. 7

An

tiok

sid

aci

nių

ju

ngin

ių p

roc.

pasi

skir

tym

as

au

gali

niu

ose

ekst

rak

tuose

Neţinomas j.

Hiperozidas

Izokvercitrinas

Rutinas

Chlorogeno rūgštis

32

10 pav. Bendras Solidago canadensis L. antioksidacinis aktyvumas (µmol/g) ţiedų ekstraktuose

Tyrimo rezultatus apdorojus statistiškai, buvo bandoma išsiaiškinti ar priklausomai nuo Lietuvos

regionų, kuriuose rinkti Solidago canadensis ţiedai, priklauso ir jų antioksidacinių junginių kiekis ir

antioksidacinis aktyvmas, tačiau statistinis reikšmingumas nenustatytas (p>0,05)(p- patikimumo lygmuo).

Pateiktoje 5 lentelėje Solidago canadensis kiekvienas antioksidacinis junginys ir jo aktyvumas buvo

statistiškai vertinamas tarp skirtingų regionų ir nustatyta statistinė reikšmė.

5 lentelė. Solidago canadensis L. ţiedų ekstraktuose, esančių antioksidacinių junginių statistiniai

duomenys pagal regionus

Antioksidacinis junginys p statistinė reikšmė

Chlorogeno rūgštis 0,784

Rutinas 0,398

Izokvercitrinas 0,456

Hiperozidas 0,401

Neţinomas j. 0,684

Kadangi skirtinguose regionuose Solidago canadensis L. ţiedų ekstraktuose esantys

antioksidaciniai junginiai neparodė statistinio reikšmingumo buvo lyginamos visos rinktos ţaliavos pagal

vietoves.

70

72

74

76

78

80

82

84

86

88

Reg. 1 Reg. 2 Reg. 3 Reg. 4 Reg. 5 Reg. 6 Reg. 7

An

tiok

sid

aci

nis

ak

tyvu

mas

(µm

ol/

g)

7 Skirtingi Lietuvos regionai, kuriuose rinkta kanadinės rykštenės ţaliava

33

3.4. 24 Lietuvos vietovių Solidago canadensis L. antioksidacinių junginių ir

antioksidacinio aktyvumo palyginimas

Tolimesnio tyrimo metu paimti Solidago canadensis L. ţaliavos n=35 ėminiai iš 24 skirtingų

Lietuvos vietovių. Kanadinės rykštenės ţiedų ekstraktuose nustatyti 5 antioksidaciniai junginiai, kurių

pasiskirstymas kito nei regionuose. Lietuvos vietovėse rinktuose ir tirtuose kanadinės rykštenės

ekstraktuose neţinomo junginio kiekis taip pat pasiţymėjo didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu.

Antioksidacinis aktyvumas išreikštas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TEAC) gramui

ţaliavos.

Iš informacijos pateiktos 9 pav. matome, kad Solidago canadensis L. ţaliavų ekstraktuose,

panašiai kaip ir regionuose, vyravo chlorogeno rūgštis ir neţinomas junginys. Maţesni chlorogeno

rūgšties kiekiai nustatyti ekstraktuose rinktuose Utenoje, Uţpalių gatvėje (1) ir Vilniuje, Kalvarijų gatvėje

atitinkamai 14,038 µmol/g ir 14,136 µmol/g. Didţiausias šio antioksidanto aktyvumas nustatytas

metanoliniuose ekstraktuose rinktuose Vilniaus rajone, Riešėje (3) (37,294 µmol/g), nors iš šalia tos

pačios vietovės rinktose ţaliavose (Vilniaus r., Riešėje (2)) jo nustatyta 15,225 µmol/g. Rutino

antioksidacinis aktyvumas Solidago canadensis L. ţiedų ekstraktuose keitėsi nuo 5,239 µmol/g iki 23,900

µmol/g. Maţiausias rutino antioksidacinis aktyvumas nustatytas ekstraktuose iš Utenos m. Uţpalių gatvėje

(1), o didţiausias Utenos r. Atkočiškėse. Izokvercitrino antioksidacinis aktyvumas vyravo nuo 0,479

µmol/g iki 6,109 µmol/g – svarbu tai, kad didţiausias aktyvumas nustatytas ekstraktuose rinktuose Utenos

r. Antalgės kaime, o maţiausias tame pačiame kaime iš netoli esančios kitos vietos. Nustatytas hiperozido

antioksidacinis aktyvumas buvo maţiausias iš visu 5 junginių. 12 Solidago canadensis L. ţiedų

ekstraktuose nenustatyta hiperozido, kurie buvo rinkti Kauno mieste prie islandijos plento, Molėtų rajone,

Cezariškiuose, Utenos mieste Eţero g., Kupiškio g. ir Utenos uţpalių g., taip pat Utenos rajono Vosgėlių,

Vosgėlių (1), Antalgės Atkočiškių ir Degulių kaimuose ir miesteliuose, bei Vilniaus miesto Kalvarijų

gatvėje ir Papiškėse. Didţiausias (6,101 µmol/g) hiperozido antioksidacinis aktyvumas nustatytas

ţaliavoje iš Utenos r. Antalgės (1) kaimo. Neţinomas junginio antioksidacinis aktyvumas ekstraktuose,

rinktuose iš 24 skirtingų vietovių, buvo didţiausias ir varijavo nuo 27,228 µmol/g iki 51,054 µmol/g,

atitinkamai maţiausias – Utenos r. Antalgės kaime rinktuose ţieduose, didţiausias – Utenos rajone,

Tauragnuose prie ţvyro karjero rinktuose ţieduose.

34

11 pav. Solidago canadensis L. ţieduose rinktuose iš 24 skirtingų vietovių ekstraktuose, esančių

junginių antioksidacinis aktyvumas (µmol/g)

0 10 20 30 40 50

Anykščių r.,Traupis

Ignalina, Agarinio g.

Kaunas, Islandijos pl.

Kaunas, Raudondvario pl.

Molėtų r.,Cezariškiai

Tauragės apsk., Birbintė

Tauragės apsk., Birbintė 1

Tauragės r. Oplankys

Tauragės r. Oplankys 1

Utena, Aukštaičių g.

Utena, Eţero g.

Utena, K.Ladygos g.

Utena, Kupiškio g.

Utena, Pievų g.

Utena, Uţpalių g.

Utena, Uţpalių g. 1

Utena, Uţpalių g. 2

Utena, Uţpalių g. 3

Utenos r., Liaumuškos

Utenos r., Politiškės

Utenos r., Tauragnai

Utenos r., Vosgėliai

Utenos r., Vosgėliai 1

Utenos r.,Antalgė

Utenos r.,Antalgė 1

Utenos r.,Atkočiškės

Utenos r.,Deguliai

Utenos r.,Velbiškės

Vilniaus r. Papiškės

Vilniaus r. Riešė

Vilniaus r. Riešė 1

Vilniaus r. Riešė 2

Vilniaus r. Riešė 3

Vilniaus r. Riešė 4

Vilnius, Kalvarijų g.

Kanadinės rykštenės ektraktų antioksidacinis junginių aktyvumas (µmol/g)

Lie

tuvos

vie

tov

ė

Neţinomas j.

Izokvercitrinas

Hiperozidas

Rutinas

Chlorogeno r

35

12 pav. Solidago canadensis L. ţiedų ekstraktų bendras antioksidacinis aktyvumas lyginant ţaliavą

pagal 24 rinkimo vietoves (µg/g)

85,37

82,64

81,63

87,44

85,82

68,30

99,53

92,36

80,42

84,53

82,46

93,61

76,95

79,08

61,96

56,87

70,13

71,48

72,13

101,69

100,95

76,64

66,75

56,52

100,88

109,03

83,37

78,76

71,49

83,09

62,79

65,12

104,20

80,55

62,46

0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00

Anykščių r.,Traupis

Ignalina, Agarinio g.

Kaunas, Islandijos pl.

Kaunas, Raudondvario pl.

Molėtų r.,Cezariškiai

Tauragės apsk., Birbintė

Tauragės apsk., Birbintė 1

Tauragės r. Oplankys

Tauragės r. Oplankys 1

Utena, Aukštaičių g.

Utena, Eţero g.

Utena, K.Ladygos g.

Utena, Kupiškio g.

Utena, Pievų g.

Utena, Uţpalių g.

Utena, Uţpalių g. 1

Utena, Uţpalių g. 2

Utena, Uţpalių g. 3

Utenos r., Liaumuškos

Utenos r., Politiškės

Utenos r., Tauragnai

Utenos r., Vosgėliai

Utenos r., Vosgėliai 1

Utenos r.,Antalgė

Utenos r.,Antalgė 1

Utenos r.,Atkočiškės

Utenos r.,Deguliai

Utenos r.,Velbiškės

Vilniaus r. Papiškės

Vilniaus r. Riešė

Vilniaus r. Riešė 1

Vilniaus r. Riešė 2

Vilniaus r. Riešė 3

Vilniaus r. Riešė 4

Vilnius, Kalvarijų g.

Antioksidacinis aktyvumas µmol/g

Lie

tuvos

vie

tovė

36

Vertinant n=35 Solidago canadensis L. ţiedų, rinktų dvidešimt keturiuose skirtingose Lietuvos

vietovėse, ekstraktus nustatytas antioksidacinis aktyvumas pagal bendrą antioksidacinių junginių kiekį

esantį ţaliavoje. Jis varijavo nuo 56,52 µmol/g iki 109,03 µmol/g. Ţaliava su didţiausiu antioksidaciniu

aktyvumu rinkta iš Utenos rajono, Atkočiškių kaimo, maţiausia iš Utenos rajono, Antalgės kaimo.

Rezultatai pateikti 12 pav.

Tyrimo rezultatus apdorojus statistiškai, buvo bandoma išsiaiškinti ar priklausomai nuo Lietuvos

vietovių, kuriose rinkti Solidago canadensis ţiedai, priklauso ir jų antioksidacinių junginių kiekis ir

antioksidacinis aktyvmas, tačiau statistinis reikšmingumas nenustatytas (p>0,05).

Galima teigti, jog rezultatams įtakos galėjo turėti kanadinės rykštenės ekstraktų paruošimui

naudoto metanolio koncentracijos nuokrypiai, naudota metodika ir jos jautrumas, taip pat Solidago

canadensis ţiedų rinkimo laikas, augavietės ypatumai, bei regionų ir vietovių skirtumai.

37

4. IŠVADOS

1. Tyrimo metu išanalizuota mokslinė literatūra apie kanadinę rykštenę (Solidago canadensis L.),

jos ekstraktuose esančius veikliuosius junginius, bei jų antioksidacinį aktyvumą. Darbe aptarti ESC

pokolonėliniai metodai. Pritaikytas ESC-ABTS pokolonėlins metodas.

2. Naudojant ESC-ABTS pokolonėlinį metodą buvo tiriami Solidago canadensis L. ţiedų,

suskirstytų pagal jų rinkimo regioną, metanoliniai (70%) ekstraktai. Tyrimo metu buvo identifikuoti

5 antioksidaciniai junginiai, kurie pasiţymėjo antioksidaciniu aktyvumu: chlorogeno rūgštis, rutinas,

kvercitrinas, hiperozidas ir vienas neţinomas junginys, kuris pasiţymėjo didţiausiu antioksidaciniu

aktyvumu. Kanadinės rykštenės ţiedų metanoliniuose ekstraktuose antioksidacinai junginiai kito nuo

0 µmol/g (hiperozido) iki 44,18µmol/g. Bendras antioksidacinis aktyvumas kito nuo 75,671 µmol/g iki

85,821 µmol/g. Didţiausias (85,821 µmol/g) nustatytas ekstrakte iš 4 regiono (Molėtų r.), maţiausias

(75,671 µmol/g) – ţieduose rinktuose 7 regione (Vilniaus m./r.).

3. Naudojant ESC-ABTS pokolonėlinį metodą buvo tiriami n=35 Solidago canadensis L. ţiedų,

surinktų iš 24 skirtingų vietovių, metanoliniai (70%) ekstraktai. Tyrimo metu buvo identifikuoti

5 antioksidaciniai junginiai, kurie pasiţymėjo antioksidaciniu aktyvumu: chlorogeno rūgštis, rutinas,

kvercitrinas, hiperozidas ir vienas neţinomas junginys, kuris pasiţymėjo didţiausiu antioksidaciniu

aktyvumu. Antioksidacinai junginiai Solidago L. ekstraktuose kito nuo 0 µmol/g (hiperozido) iki

51,054 µmol/g (neţinomo junginio). Antioksidacinis aktyvumas kanadinės rykštenės ekstraktuose keitėsi

nuo 56,52 µmol/g (Utenos rajono, Atkočiškių kaimo) iki 109,03 µmol/g (Utenos rajono, Antalgės kaimo).

4. Atlikus gautų duomenų statistinę analizę gauta, kad antioksidaciniai junginiai ir jų

antioksidacinio aktyvumo pasiskirstymas, Solidago canadensis L. ekstraktuose, neturi statistinio

reiškimingumo nei pagal regionų, nei pagal vietovių ţiedų rinkimo vietas (p>0,05).

38

5. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Šiukšta R. Paprastoji rykštenė – Solidago virgaurea L. 2008. Prieiga per internetą:

http://www.botanikos-sodas.vu.lt/lt/zalieji-puslapiai/augalu-gentys/rykstene

2. Marksa M., Radušienė J., Marksienė R., Kiliuvienė G. Rykštenės (Solidago. L) rūšies augalų ir

rykštenėje besikaupiančių veikliųjų medţiagų svarba gydant šlapimo organų ligas. Medicinos

teorija ir praktika T. 18 (Nr. 2), 201.. p. 158-160 Prieiga per internetą:

http://www.mtp.lt/files/medicina_TP_2012_2_str07.pdf

3. Prieiga per internetą http://medicinalplants.us/goldenrod-background-actions.

4. Viltrakytė J, Karpavičienė B, Radušienė J. „Invazinių rykštenių rūšių geografinis ir ekologinis

paplitimas Lietuvoje―. Konferencijos pranešimų santraukos. Studentų mokslinė praktika, 2013.

p. 60. Prieiga per internetą:

http://studentai.lmt.lt/DOKUMENTAI/KONFERENCIJOS/2013_SMP_I_FBTZ.pdf#page=61

5. Pavek, P.L.S.. Plant guide for Canada goldenrod (Solidago canadensis). USDA-Natural Resources

Conservation Service. Pullman, WA 2011. Prieiga per internetą:

http://plants.usda.gov/plantguide/pdf/pg_soca6.pdf

6. European Pharmacopoeia 7.0, 01/2008. 1892. p. 1141- 1142

7. Doc. Ref. EMEA/HMPC/285759/2007 London, 4 September 2008.

8. Tao Jiang, Bao-Kang Huang, Lu-Ping Qin. A survey of chemical and pharmacological studies on

Solidago. Journal of Chinese Integrative Medicine; Volume 4, July, 2006.

9. M. Sutovska, P. Capek, M. Kocmalova, S. Franova, I. Pawlaczyk, R. Gancarz. Characterization

and biological activity of Solidago canadensis complex. International Journal of Biological

Macromolecules, 25 September, 2012. Prieiga per internetą:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813012003753

10. Güntner C, Barra M.V. Cesio, Dellacassa E, Ferrando L, Ferreira F, García C. Antioxidant

Properties of Solidago Chilensis L. Flavonoids. II Wocmap Congress Medicinal and Aromatic

Plants, Part 2: Pharmacognosy, Pharmacology, Phytomedicine, Toxicology. 1999.

11. Lendl A, Reznicek G. Two New Saponins from Solidago gigantea. Scientia Pharmaceutica (Sci.

Pharm.) 75, 2007. p. 111-120.

12. Catherine A, Rice-Evans, Packer L. Flavonoids in health and disese. University of Southern

California School of Pharmacy, 2005. p. 40.

39

13. Kasali AA, Ekundayo O, Paul C, König WA. epi-Cubebanes from Solidago canadensis.

Phytochemistry 2002. 59(8): 805-10.

14. De Qiang Li, Sheng Hao Pan, Xi Wu Zhu, Lin Tan, Yue Fen Cao. Anticancer Activity and

Chemical Composition of Leaf Essential Oil from Solidago canadensis L. in China. Advanced

Materials Research, 2011.

15. Kaltenis P. Šlapimo organų infekcijos – problemos ir jų sprendimas. Medicinos teorija ir praktika,

2007.

16. Mishra, Devendra, Shivani Joshi, Ganga Bisht, and Sangeeta Pilkhwal. "Chemical composition

and antimicrobial activity of Solidago canadensis Linn. root essential oil." J Basic Clinc Phar 1,

no. 003 2010. p. 187-190. Prieiga per internetą:

www.researchgate.net/publication/235999795_Journal_of_Basic_and_Clinical_Pharmacy_CHEM

ICAL_COMPOSITION_AND_ANTIMICROBIAL_ACTIVITY_OF_SOLIDAGO_CANADENSI

S_LINN._ROOT_ESSENTIAL_OIL/file/60b7d5156e1f212e69.pdf

17. Deepa, N., and V. Ravichandiran. "Antimicrobial activity of extractives of Solidago canadensis

L." International Journal of Research in Pharmaceutical Sciences 1, no. 4 2010. p. 411-413.

18. Stella Goulart, Maria Izabel Goularte Mortiz, Karen Luise Lang, Rafael Liz, Eloir Poulo Schenkel,

Tania Silvia Forde. Anti-inflammatory evaluation of Solidago chilensis Meyen in a murine model

of pleurisy, Journal of Ethnopharmacology 2007. Prieiga per internetą: http://ac.els-

cdn.com/S0378874107003248/1-s2.0-S0378874107003248-main.pdf?_tid=fffc3e64-fcd2-11e4-

b06a-00000aacb35f&acdnat=1431894569_a2bebe6c8b85d68528a4605b08d29706

19. Letitia M. McCune, Thimothy Johns. Antioxidant activity in medical plants associated with the

symptoms of diabetes mellitus used by Indigenous Peoples of the North American boreal forest.

Journal of Ethnopharmacology 28 June 2002. p. 197- 205 Prieiga per internetą: http://ac.els-

cdn.com/S0378874102001800/1-s2.0-S0378874102001800-main.pdf?_tid=07ceb3b6-fcdc-11e4-

ae3b-00000aab0f01&acdnat=1431898448_5e994d57e718cd5ab15f9abcb4e705ac

20. Bravo L. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance. Nutr

Rev 1998;56:317-33.

21. Middleton Jr. E, Kandaswami C, Theoharides TC. The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian

Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease, and Cancer. Pharmacological Reviews 2000;

52:673-751.

22. Dai J., Mumper R.J. Plant phenolics: extraction, analysis and their antioxidant and anticancer

properties. Molecules 2010; 15: 313-7352.

40

23. Stalikas C. D. editor. Extraction, separation and detection methods for phenolic acids and

flavonoids. J. Sep. Sci. 2007;30, p. 3268 – 3295.

24. Prieiga per internetą: http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/

25. European Pharmacopoeia 7.0, 2010. p. 398.

26. Clifford, M. N.; Johnston, K. L.; Knigh, S.; Kuhnert, N. Hierarchical Scheme for LC-MS

Identification of Chlorogenic Acids. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2003; 2900–

2911.

27. Liaudanskas M., Viškelis P., Janulis V., Polifenoliniai junginiai obuoliuose: cheminė sudėtis,

struktūros ypatumai, biologinis poveikis (apţvalga) 31(1-2) 2012.

28. Farah A., Monteiro M., Donangelo C. M., Lafay S. Chlorogenic Acids from Green Coffee Extract

are Highly Bioavailable in Humans. American Society for Nutrition 2008.

29. K.W. Ong, A. Hsu, B.K.H. Tan, Anti-diabetic and anti-lipidemic effects of chlorogenic acid are

mediated by ampk activation. Biochem. Pharmacol. 2013;85 1341–1351.

30. S.I. Mussatto, L.F. Ballesteros, S. Martins, J.A. Teixeira, Extraction of antioxidant phenolic

compounds from spent coffee grounds. Purif. Technol. 2011;83 173–179.

31. J.G. Xu, Q.P. Hu, Y. Liu, Antioxidant and DNA-protective activities of chlorogenic acid isomers,

J. Agric. Food Chem. 2012;60 11625–11630.

32. European Pharmacopoeia 7.0, 2010. p. 460.

33. Choi J-H., Kim D-W., Park S-E., Lee H-J., Kim K-M., Kim K-J., Kim M-K., Kim S-J., Kim S.

Anti-thrombotic effect of rutin isolated from Dendropanax morbifera Leveille 2014.

34. Guardia, Teresita, Alejandra Ester Rotelli, Américo Osvaldo Juarez, and Lilian Eugenia Pelzer.

Anti-inflammatory properties of plant flavonoids. Effects of rutin, quercetin and hesperidin on

adjuvant arthritis in rat. Il farmaco 56, no. 9. 2009;683-687.

35. Metodiewa, Diana, Agata Kochman, and Stefan Karolczak. Evidence for antiradical and

antioxidant properties of four biologically active N, N‐Diethylaminoethyl ethers of flavaone

oximes: A comparison with natural polyphenolic flavonoid rutin action.. IUBMB Life 41, no.

1997;5:1067-1075.

36. Alonso-Castro A. J., Dominguez F., Garcia- Carranca A. Rutin Exerts Antitumor Effects on Nude

Mice Bearing SW480 Tumor. 2013.Archives of Medical Reasearch 44 346-351.

37. European Pharmacopoeia 7.0, 2010. p. 430.

41

38. Sang Hoon J., Kim B. J., Lee E. H., Osborne N. N. Isoquercitrin is the most effective antioxidant

in the plant Thuja orientalis and able to counteract oxidative-induced damage to a transformed cell

line (RGC-5 cells). Neurochemistry international 57, no. 2010;7:713-721.

39. Silva, C. G., R. J. Raulino, D. M. Cerqueira, S. C. Mannarino, M. D. Pereira, A. D. Panek, J. F. M.

Silva, F. S. Menezes, and E. C. A. Eleutherio. In vitro and in vivo determination of antioxidant

activity and mode of action of isoquercitrin and Hyptis fasciculata. Phytomedicine 16, no.

2009;8:761-767.

40. Rogerio, A. P., A. Kanashiro, C. Fontanari, E. V. G. Da Silva, Y. M. Lucisano-Valim, E. G.

Soares, and L. H. Faccioli. Anti-inflammatory activity of quercetin and isoquercitrin in

experimental murine allergic asthma. Inflammation research 56, no. 2007;10: 402-408.

41. Gasparotto Junior, Arquimedes, Francielly Mourão Gasparotto, Emerson Luiz Botelho Lourenço,

Sandra Crestani, Maria Elida Alves Stefanello, Marcos José Salvador, José Eduardo da Silva-

Santos, Maria Consuelo Andrade Marques, and Cândida Aparecida Leite Kassuya.

Antihypertensive effects of isoquercitrin and extracts from Tropaeolum majus L.: Evidence for the

inhibition of angiotensin converting enzyme. Journal of ethnopharmacology 134, no. 2011;2:363-

372.

42. Gasparotto Junior, Arquimedes, Francielly Mourão Gasparotto, Marcos Aurelio Boffo, Emerson

Luiz Botelho Lourenço, Maria Élida Alves Stefanello, Marcos José Salvador, José Eduardo da

Silva-Santos, Maria Consuelo Andrade Marques, and Cândida Aparecida Leite Kassuya. Diuretic

and potassium-sparing effect of isoquercitrin—An active flavonoid of Tropaeolum majus L.

Journal of ethnopharmacology 134, no. 2011;2:210-215.

43. European Pharmacopoeia 7.0, 2010. p. 427.

44. Kim, Su-Jin, Jae-Young Um, Seung-Heon Hong, and Ju-Young Lee. Anti-inflammatory activity of

hyperoside through the suppression of nuclear factor-κB activation in mouse peritoneal

macrophages.The American journal of Chinese medicine 39, no. 2011;01 p. 171-181.

45. Liu, Zhiyong, Xinyi Tao, Chongwei Zhang, Yanhua Lu, and Dongzhi Wei. Protective effects of

hyperoside (quercetin-3-o galactoside) to PC12 cells against cytotoxicity induced by hydrogen

peroxide and tert- butyl hydroperoxide. Biomedicine & pharmacotherapy 59, no. 2005;9:481-490.

46. Li, Shiyou, Zhizhen Zhang, Abigail Cain, Bo Wang, Melissa Long, and Josephine Taylor.

Antifungal activity of camptothecin, trifolin, and hyperoside isolated from Camptotheca

acuminata. Journal of agricultural and food chemistry 53, no. 2005;1:32-37.

42

47. Orhan, I., B. Özçelik, M. Kartal, B. Özdeveci, and H. Duman. HPLC quantification of vitexine-2

″-O-rhamnoside and hyperoside in three Crataegus species and their antimicrobial and antiviral

activities. Chromatographia 66, no. 2007;1:153-157.

48. Halliwell B, Murcia MA, Chirico S, Aruoma OI. Free radicals and antioxidants in food and in

vivo: what they do and how they work. Crit Rev Food Sci 1995;35:7-20.

49. Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MTD, Mazur M, Telser J. Free radicals and antioxidants

in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 2007;39:44-84.

50. Prior RL, Wu X, Schaich K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity

and phenolics in foods and dietary supplements. J Agric Food Chem 2005;53:4290-302.

51. Wright JS, Johnson ER, DiLabio GA. Predicting the activity of phenolic antioxidants: theoretical

method, analysis of substituent effects, and application to major families of antioxidants. J Am

Chem Soc 2001;123:1173-83.

52. Miguel MG. Antioxidant activity of medicinal and aromatic plants. Flavour Frag J 2010;25:291-

312.

53. Foti MC, Daquino C, Geraci C. Electron-transfer reaction of cinnamic acids and their methyl

esters with the DPPH radical in alcoholic solutions. J Org Chem 2004;69:2309-14.

54. Huang D, Ou B, Prior RL. The chemistry behind antioxidant capacity assays. J Agric Food Chem

2005;53:1841-56.

55. Ozgen M, Reese RN, Tulio AZ, Scheerens JC, Miller R. Modified 2,2-azino-bis-3-

ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) method to measure antioxidant capacity of selected

small fruits and comparison to ferric reducing antioxidant power (FRAP) and 2,2-diphenyl-1-

picrylhydrazyl (DPPH) methods. J Agric Food Chem 2006;54:1151-7.

56. O. Erel. A novel automated direct measurement method for total antioxidant capacity using a new

generation, more stable ABTS radical cation. Clinical Biochemistry 2004;37:277-85.

57. Durmaz G. Freeze-dried ABTS+ method: A ready-to-use radical powder to assess antioxidant

capacity of vegetable oils. Food Chem. 2012;133(4):1658–63.

58. Chang CL, Chen HS, Shen YC, Lai GH, Lin PK, Wang CM. Phytochemical composition,

antioxidant activity and neuroprotective effect of Crataegus pinnatifida fruit. South Afr J Bot.

2013;88:432–7.

59. Surveswaran S, Cai Y-Z, Corke H, Sun M. Systematic evaluation of natural phenolic antioxidants

from 133 Indian medicinal plants. Food Chem 2007;102:938-53.

43

60. Koleva II, Niederlander HA, van Beek TA. An on-line HPLC method for detection of radical

scavenging compounds in complex mixtures. Anal Chem 2000;72:2323-8.

61. Pukalskas A, van Beek TA, de Waard P. Development of a triple hyphenated HPLC-radical

scavenging detection-DAD-SPE-NMR system for the rapid identification of antioxidants in

complex plant extracts. J Chromatogr A 2005;1074:81-8.

62. Exarchou V, Fiamegos YC, van Beek TA, Nanos C, Vervoort J. Hyphenated chromatographic

techniques for the rapid screening and identification of antioxidants in methanolic extracts of

pharmaceutically used plants. J Chromatogr A 2006;1112:293-302.

63. A. Wojdyło, J. Oszmian´ski, R. Czemerys. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32

selected herbs. Food Chemistry 2007;105:940-9.

64. Schaich K. M., Tian X., Xie j., Hurdles and pitfalls in measuring antioxidant efficacy: A critical

evaluation of ABTS, DPPH, and ORAC assays. Journal of functional foods 2015;14:111-125.

65. Marksa M., Radušienė J., Jakštas V., Ivanauskas L., Marksienė R. Development of an HPLC post-

column antioxidant assay for Solidago canadensis radical scavengers. 2015. Prieiga per internetą:

http://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/14786419.2015.1027703

66. Ali IBEH, Bahri R, Chaouachi M, Boussaı¨d M, Harzallah-Skhiri F. 2014. Phenolic content,

antioxidant and allelopathicactivities of various extracts of Thymus numidicus Poir. organs. Ind

Crop Prod. 2014;62:188–195.

67. R. Raudonis Skysčių chromatografijos pokolonėlinių metodų optimizavimas augalinių

antioksidantų tyrimams. 2012. Prieiga per internetą: http://vddb.laba.lt/fedora/get/LT-eLABa-

0001:E.02~2012~D_20120918_151438-68335/DS.005.0.01.ETD