Antibiyotik Duyarlılık Testlerinde Etest Prensibi, Önemi ve Saklama

Koşulları

E.İnci TUNCER

S.Ü.Selçuklu Tıp Fakültesi

Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı,KONYA

1

Tarihçe

• Penisilin

– İlk keşfedilen antibiyotik

– 1929, Alexander Flemming

• Penicillum türü küflerin

• Stafilokok kolonilerinin

üremesini durdurduğu fark etti

2

Tarihçe

• Howard Florey ve Ernst Chain-1946

– Stafilokok, Streptokok infeksiyonlarının tedavisinde

• Penisilini kullandı

Penicillium notatum 3

Tarihçe (direnç gelişimi)

1940-Penisiline 1950-M.tuberculosis’de

Streptomisine

1953-Shigella’da Çoklu ilaca

1965-E.coli’de Ampisiline

1970-P.aeruginosa, Klebsiella’da Çoklu ilaca

1983-K.pneumoniae’de 3.Kuşak Sefalosporinlere

Son yıllarda tüm Dünyada Birçok mikroorganizmada gözlenen direnç

genleri

4

Duyarlılık test yöntemleri

1. Fenotipik test yöntemleri– Antimikrobiyal aktivite ve breakpoint temeline dayananlar

a. MİK belirleyenler (sıvı, agar, gradient)b. Disk difüzyon (Kirby-Bauer)c. Otomatize sistemler

2. Genotipik test yöntemleri– Bir direnç geninin veya onun ürününün tanımlanması temeline

dayanır a. mec A, Van A, Van B…PBP2, diğer beta-laktamaz

3. Gözlenen sonuçdan rapora…a. mec A geni pozitif yada GSBL pozitif ise

– Tüm beta-laktam antibiyotikleri dirençli rapor ediniz

b. Eritromisin direnci var ise– Azitromisin ve klaritromisini dirençli rapor ediniz

5

Duyarlılık test yöntemleri 2

1. Fenotipik test yöntemleri• Göreceli (test sonuçlarını etkileyen değişimler)

• Duyarlılık veya direnci tahmin etmek

• Duyarlılık homojendir veya ölçülemez

• Direnç heterojendir ve ölçülebilir

2. Genotipik test yöntemleri• Direnç tahmin edilebilir- direnç yoksa sonucun duyarlı

olduğunu göstermez

• Direnç kesindir

3. Gözlenen sonuçdan rapora…• Duyarlılık ve direnç kesindir

6

Etest®(=Epsilometer test)

Temel Prensipler

7

Etest

• Agar difüzyon ve MİK değerini– kantitatif olarak belirleme esasına dayanır

• Kantitatif sonuç verir• Gittikçe artan konsantrasyonlarda antibiyotik

içeren– inert plastik şeritler kullanılır

• 35°C de 18-20 saat inkübasyon• Elips seklindeki inhibisyon alanının stripi kestiği

nokta– MİK değerini verir

8

9

Etest - Antibiyotik Duyarlılık Stripleri ve gereçler

Seçici Antibiyotik Gradiyent Bölmeleri

• Gradientler

– Sabit dalgalanmalarla ilerlemektedir

• Antibiyotik difüzyonu ile üreme arasında

– Dinamik bir bağ var

10

11

Konsantrasyon Gradiyentlerinin Şematik Gösterimi

12

Disk difüzyonu ile Gradiyent Stabilitesinin karşılaştırılması

Disk - UNSTABİL

Etest - STABİL

Zaman saat

42 6 24

Kons/ zon

Disk Difüzyon için Kısıtlamalar

• Yavaş üreyen narin organizmalar ve anaeroblar

o Pneumococcus, Streptococcus vb.

• Değişken üreme oranları

o Gram negatif fermentatif, mantarlar vb.

• Düşük inokülum miktarı

o Hatalı geniş zonlar

• “Zayıf” agar besiyeri (besleyici madde eksikliği)

• yavaş üreme

• Büyük moleküllü antibiyotiklerin difüzyon oranları (glikopeptidler)

13

MİK ile dirençli Disk ile Duyarlı!!

P. aeruginosa - Gentamisin

14

Yüksek Molekül Ağırlıklı Antibiyotikler

Büyük Moleküller

Disk’e karşı önceden tanımlanmış gradiyentler

Vankomisin

15

Strip üzerinde MİK!

16

Etest

• Stabil MİK gradiyenti olup– Patentli GRADİYENT teknolojisi

• Kesin ÖLÇEKLİ değerler

• 15 dilüsyonlu GENİŞ KONSANTRASYON ARALIĞI

• Mikrooganizma ve İlaç SAYISI YÜKSEK

• “Makrometod”taki ekim miktarını TOLERE EDER

• AGAR formatının avantajları

• Direnç tespitinde FLEKSİBİLİTE sağlar

• Çok sayıda REFERANS’a sahiptir 17

Tüp dilüsyon ve Etest dilüsyon aralıkları

18

Etest – MİK’de İnovasyon mudur?

C 0.002 0.004 0.008 0.016 0.032 0.064 0.125

0.25 0.5 1 4 8 16 32

Tek bir plastik strip üzerinde 16 buyyon tüp veya agar dilüsyon petrisi!

2

2005

2000

1995

1990

DİRENÇYeni oluşan mekanizmalar

ORGANİZMANarin organizmalar için güvenilir

MİKKritik türler

OTOMASYONMİK’i basitleştirmek

Etest İhtiyaçları karşılıyor mu? 2010Kritik vakalar

H.influenzae

N.gonorrhoeae

N.meningitidis

H.pylori

Anaeroblar

Pneumococcus

Streptococcus

Abiotrophia vb.

Narin Mikroorganizmalar

H.influenzae, MHC/ 5% CO2

Organizma Kapsamı

21. Yüzyılın Nozokomiyal patojeni?

Clostridium difficile

ArcanobacteriaBordetellaBartonellaBrucellaHACEKFranciscellaListeriaLegionellaNocardia MycobacteriaMycoplasmaDiğerleri…….

Zor üreyen mikroorganizmalar

N.asteroides, MHA/ 1McF/ 48-72 saat

Mikobakteri için Etest

M.FortuitumKanlı agar

M.avium intracellularKanlı agar

M.TuberculosisMiddle Brook

25

Etest - Maya, Küf, Dermatofitler

A.flavus A.fumigatusA.terreus

2005

2000

1990

DİRENÇYeni oluşan mekanizmalar

ORGANİZMANarin organizmalar için güvenilir

MİKKritik türler

OTOMASYONMİK’i basitleştirmek

Etest İhtiyaçları karşılıyor mu? 2010Kritik vaka

1995

27

• Hetero-direnç

• indüklenebilir-direnç

• Hiper-mutatörler

• Yavaş mutatörler

• Küçük koloni varyantları

• İnokülum artışına tolerans

• Fizyolojik direnç

MİK

P.aeruginosaBroth dil 0.06 Agar dil 0.125 Etest MİK >32

Antimikrobiyal Direnç Tespiti

İnokulum Direnç Tespiti(disk difüzyon ile karşılaştırmalı)

“İdeal test” Az’dan çok’a inokulum miktarı

Duyarlı izolat S S

Dirençli İzolat

- heterojen S/I R

- alt-popülasyon S R

- homojen R R

İnokulum Toleransı

E. coli ATCC 25922/Gentamisin

102 103 104 105 106 107

CFU/mL

Yüksek İnokulum’da Direnç

102 103 104 106 109

CFU/mL

S.aureus ATCC 29213 ( ß-laktamaz pozitif)

107

Etest Makrometod*

• GISA/ hGISA testi!

– Zengin besiyeri = BHI

– Yüksek inokulum = 2McF

– Uzatılmış inkübasyon = 48h

31

EtestÇift taraflı gradiyent ile Direnç Tespiti

Fenotipik direnç markırları: ESBL, MBL, GRD, AmpC

ESBL için Etest

Ceftazidime ND Cefotaxime ND

Cefepime ESBL +

K. pneumoniae 915

34

Mueller Hinton’da pozitif

RISK - IsoSensitest Üzerinde Yalancı Negatif!

Acinetobacter spp. (IMP-1 genotip)

Zn2+

Zn2+ physiologic

MBL için Etest

AmpC için Etest

E. coli DHA-1

E. coli CMY-2

2005

1990

DİRENÇYeni oluşan mekanizmalar

ORGANİZMANarin organizmalar için güvenilir

MİKKritik türler

OTOMASYONMİK’i basitleştirmek

Etest İhtiyaçları karşılıyor mu? 2010Kritik vaka

1995

2000

MİK’in Klinikte kullanım alanları

KRİTİK İNFEKSİYONLAR KRİTİK HASTALAR

Menenjit Yoğun bakım üniteleri

Endokardit Transplant

Bakteremi, fungemi Onkoloji

Pnömoni ve VİP Yanıklar

İntra abdominal infeksiyonlar Yenidoğan ve pediyatrikhastalar

Kistik fibrozis Hematoloji

MİK nasıl kullanılır?

• Her Kritik Hasta Farklıdır!- MİK’e karşı ilaç seviyeleri, MİK’e karşı breakpoint- Seçim, doz, rejim

• Direncin erken tespiti ile- Testi doğrula (inokulumu azaltarak tekrar et, modifiye et)

ve tedaviyi değiştir

• Tuhaf, kuşkulu Antibiyogram sonuçlarını doğrulamada

• Yoğun bakım ünitesi empirik rejimlerini doğrulamada kullanılmaktadır

Etest ÖZET

• İNOKULUM TOLERANSI• Çeşitli inokulum yoğunluğu kabul edilir

• Agar-bazlı: tek veya çoklu mikrobiyal kontaminantları gözlemleme

• Kromojenik agar ve aynı gün okuma (4-6saat)

Referanslar:- Kan (Gram pozitif ve negatifler, anaeroblar, maya)

- BOS, diğer steril sıvılar/dokular

- Kistik fibrözis: balgam, diğer bronşiyal sıvılar

- VİP: balgam, bronşiyal aspirasyonlar, Bronkoalveolar lavaj (BAL)

39

Antibiotic resistant infections in the critically ill adult. Paterson et al, 2004, CLM

“Ciddi hastalarda kategorize edilmiş duyarlılık sonuçlarından çok, gerçek MİK’in bulunması

infeksiyonların yönetiminde laboratuvarların önemli bir görevidir!”

Etest® (=Epsilometer test) Okuma

41

Etest Okuma

• Etest Teknik ve Okuma Klavuzları’na Başvurunuz

• Endpoint kriterleri şunlarla ilişkilidir

– Teknik konuların bilinmesi

– İlaç ve mikroorganizma spesifik olması

– Direnç mekanizmalarının bilinmesi

42

43

Etest Okuma

• Üremenin strip ile kesiştiği noktada MİK’iokuyun

• Eğer değerler arasındaysa bir üstteki MİK değerini okuyun

• Sidal ilaçlar için üremenin tümüyle inhibeedildiği (bulanık, mikro ve makrokoloniler) noktayı okuyun

• Statik ilaçlar için %80 inhibisyonu okuyun

• Sidal/Statik ilaç listesi, keskin ve bulanık endpoint’ler için kılavuzlara başvurunuz

Etest Okuma AlgoritmasıEndpoint’in keskin sınırları varmı?

Hayır

İlaç bakteriyostatik mi bakterisid mi?

• Üremenin strip ile kesiştiği değeri okuyun

• Eğer değerler arasında ise bir sonraki MİK değerini okuyun

BAKTERİSİDAL İLAÇLAR

• %100 İnhibisyonu okuyun

• Üremenin olduğu alandaki tüm inhibisyonu okuyun (Bulanıklık, mikro ve makrokoloniler)

BAKTERİYOSTATİK İLAÇLAR

• %80 İnhibisyonu okuyun

• Üremenin inhibe olduğu en belirgin ilk noktayı okuyun

• İzleri ve mikrokolonileri görmezden gelin

Evet

44

45

Taşıyıcı üzerindeki bölge sınırında olan kesişme MİK’i

verir

S.marcescens, İmipenem

46

Değerler Arası

Üst değeri okuyun

S, I, R’nin Kategorizasyonu

• MİK breakpoint’leri– CLSI, EUCAST veya kabul ettiğiniz otoritenin en güncel

kılavuzlarından kontrol edilmeli

• Eğer mevcut değilse, literatürlerden bakılmalı

• Etest 2-kat dilüsyonlar arasındaki değerleri vermektedir – S, I, R’den önce bir sonraki değere yuvarlayabilirsiniz

• Sadece kesin MİK’i ve S, I, R’yi raporlayınız

47

48

Ara Dilüsyonu Yorumlama

S: ≤ 0.064

I: 0.125 - 1

R: ≥ 2

MİK 1.5, MİK 2 µg/mL olur

Kategori = R

R

I

S

49

Çok fazla inokulum’dan kaçının

50

Strip boyunca oluşan üreme tünelini değerlendirmeyin

51

Eğer tek taraflı bir kesişme varsa

Dilusyon > 1 ise test tekrarlanmalıdır

Dilüsyon ≤ 1 isebir sonraki değeri okuyun

52

Küçük molekül, daha geniş elips Büyük molekül, daha küçük elips

Molekül Boyutu

53

Proteus – Yığını okumayın!

54

Hemolizi okumayın!

Bakterisidal İlaçlar

• Tüm inhibisyonu okuyun

– Bulanıklığa, mikro ve makrokolonilere bakın

β-laktamlar İzoniyazid

Karbapenemler Aminoglikozidler

Sefalosporinler Kinolonlar

Etambutol Metranidazol

Glikopeptitler Rifampisin

Fosfomisin Amfotericin B

55

56

Pneumococcus - Pen G

• Mikrokolonilere ve bulanıklığa dikkat edin

MİK: 4.0 µg/mL

57

Dipteki kolonilere dikkat edin

58

8 den 32’ye kadarki mikrokolonilere bakın

%100 inhibisyon yapan ilaçtır

Mikrokolonileri gözardı etmeyiniz

59

Kinolonlarda bulanıklığı okuyun

60

Paradoks etki

Antimikrobiyal’in yüksek konsantrasyonlarında tekrar üreme indüklenmektedir

En yüksek değeri okuyunuz

Bakteriyostatik İlaçlar

• %80 inhibisyon okuyunuz

– önemli değişimin olduğu ilk noktayı gözle belirleyin

Tetrasiklinler Linkomisinler

Streptograminler Kloramfenikol

Oksazolidinonlar Sülfonamidler

Makrolidler Trimetoprim

Azoller

61

62

Bakteriyostatik ilaçlar için %80’i okuyunuz

Bakteriyostatik ilaçlar

Endpoint kuralı:%80 inhibisyon

MİK: 0.032 µg/mL

Yorum:

önemli değişimin olduğu ilk noktayı gözle belirleyin

63

Linezolid

Bu ilaç için özel

%90 inhibisyonun olduğu statik endpoint

S.aureus ATCC 29213

MİK: 1 µg/mL

İzlem: 0.5 – 4 µg/mL

64

MRSA – Düşük seviye heterodirenç

Olası hatalar!

• Etest için kullanılan

– Agarın

1. Muller Hinton, kanlı vb. yüzeyinin ıslak olması

2. Kalın veya ince dökülmüş olması

– Etkene karşı test edilecek antibiyotik striplerinin

1. Yanlış seçilmesi

2. Uygunsuz saklama koşulları

65

Acinetobacter baumannii

66

Kurutulmamış MHAKurutulmuş MHA

Klebsiella pneumoniae

67

4 mm kalınlığında MHA 6 mm kalınlığında MHA

Etest striplerinin saklama koşulları

• Üretici firmanın saklama talimatlarına uyulmalıdır

– Etest stripleri için saklama ortamı sıcaklığı

• Örneğin;1. -20°C’de

2. +4 ila+8°C’de

3. +22 (oda derecesi)

– Isı kadar nemde önemli olup

• Nemi önleyici düzeneklerle birlikte saklayınız

68

Sonuç olarak;

• Etest

– Agar difüzyon esasına dayanan

– MİK değerini kantitatif olarak belirleyen

– Bir çok direnç mekanizması hakkında fikir veren

– Her klinik mikrobiyoloji laboratuvarında uygulanabilen

– Klinikte birçok hastalığın sağaltımı için yönlendirici olan bir yöntemdir

69