anne-laure roux hôpital ambroise paré, boulogne billancourt
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Infec&onsbroncho-pulmonaires:Duprélèvementaudiagnos&cau
laboratoire
Anne-LaureRouxHôpitalAmbroiseParé,BoulogneBillancourt
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Indica&onsdesprélèvementspourlediagnos&cd’uneinfec&onbroncho-pulmonaire
• Modifica?ondelapriseenchargethérapeu?que• Situa?onscliniquesoùlesprélèvementsprésententlameilleuresensibilité
à Lechoixdutypedeprélèvementestfonc?ondessymptômes
à Bilansystéma?quedespa?entsimmunodéprimés
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Quelprélèvementpourquelmicroorganisme?
• Prélèvementsrespiratoires«invasifs»àbactériesetchampignons
• Sécré?onsnasalesoutrachéo-bronchiquesàvirus
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Performancesdesprélèvementsrespiratoires
• Absencedetraitementan?-infec?euxpréalable
• Rapiditédutransport
• Rapiditédepriseenchargeaulaboratoire
• Qualitéduprélèvement
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Délaid’acheminementdesprélèvementsrespiratoires
• Moinsde2heuresàT°ambiante
• Conserva?onà+4°Caumaximumpendant24h
• Excep?onpourlesmycobactéries/Legionella:maximum72hà+4°C
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Lesexpectora&ons
• Prélèvementrarementcontribu?fetsourced’erreur
• Contamina?onpardelasalivedansplusde50%descas
• Indica?ons:– Surinfec?ondebronchitechronique– Infec?onsàmycobactérie– Infec?onschezpa?entsa\eintsdemucoviscidose,BPCO
– RecherchedePneumocys/sjiroveciiparPCR6
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Lavagebroncho-alvéolaire
• Indica?ons:– Documenta?ondespneumopathiesacquisessousven?la?onmécanique(PAVM)
– Documenta?ondespneumopathiesaiguëscommunautaireschezlespa?entsimmunodéprimésouencasd’échecdutraitementempirique
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Brossagebronchique
• Mêmesindica?onsqueleLBA
• Meilleureprélèvementpourlesculturesviralesetlacytologie
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Traitementdesprélèvementsaulaboratoiredebactériologie
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TYPE DE PRELEVEMENT DILUTIONS MILIEUX USUELS MILIEUX COMPLEMENTAIRES COLORATIONS
EXPECTORATION ASPIRATION BRONCHIQUE ASPIRATION TRACHEALE
1ösede100µl(2gouttes)prélèvementdeladilution10-39mlEPT10-310-5EPT=EauPhysiologiqueStérile
AérobieCOSDRIGAnaérobieCOSCO2PVXSCG(REA)Culture:100µlenrâteau(saufDDB)
ANCCANDMSACETRICEPPVX
ProtocoleDDBPur10µLenquadrant
LAVAGE BRONCHO-ALVEOLAIRE
1mlde100µlprélèvementdeladilution10-19mlEPT10-110-3
AérobieCOSAnaérobieCOSCO2PVXSCG(REA)
DRIGANCCAND
PRELEVEMENT DISTAL PROTEGE BROSSE
1ml2gouttesEPTdupur18gouttesEPTPUR10-1
AérobieCOSAnaérobieCOSCO2PVXSCG(REA)
DRIGANCCAND
GRAMObjx100
MGGObjx10
GRAMObjx100
MGGObjx10
GRAMObjx100
MGGObjx10
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Colora&ondeMayGrunwaldGiemsa
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Colora&ondeGram
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Choixdesmilieuxdeculture/atmosphères
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Défini&ondesseuilsdesignifica&vité
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REMIC,2015
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Interpréta&ondesrésultatsdeculture
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Recherchesspécifiques
• Legionellasppàimmunofluorescence+miseenculturesurmilieuspécifique
• Nocardiasppetautresac?nomycètesàexamenbactériologiquestandard+conserva?onpluslonguedesmilieuxdeculture
• Aspergillussppàexamenmycologiquestandard• Pneumocys/sjiroveciiàimmunofluorescence+PCR• Mycobactériesàexamenmycobactériologique• HistoplasmoseàleLBAestleprélèvementleplusadapté
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Legionellaspp
• Immunofluorescencedirecte:techniqueu?lisantdesan?corpsmonoclonauxreconnaissanttouslessérogroupes
• Culturedeslégionelles:lente(ledélaideréponseestde10jours)etdifficile.
• Bactériesexigeantes,nécessitantl'u?lisa?ondemilieuxspécialisésàmilieuBCYE.LeslégionellessontdesbactériesaérobiesstrictesdontlacroissanceestfavoriséeparlaprésencedeCO2(2,5%).aspectcaractéris?quedescoloniesditen“verrefriMé”
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Legionellaspp
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Coloniesen«verrefri\é»surmilieuBCYE
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Nocardiasppetac&nomycètes
• Diagnos?cexclusivementdirect• Examendirectetmiseenculture
– BacillesàGramposi?framifiésavecunaspectmouchetéou?gré– Culturesurmilieuxstandards(géloseausang,gélosechocolat)enaérobioseou
sous5%deCO2.
!Nécessitédeprolongerl’incuba&ondesmilieuxaumoins10joursü 30%deculturesposi?vesen48heuresü 50%après5jours
DemandespécifiéeparleclinicienderecherchedeNocardiaobligatoire!!!
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Nocardiasppetac&nomycètes
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Aspergillusspp,examenmicroscopique
• Miseenévidencedefilamentsmycéliensde«typeaspergillaire»• Entrelameetlamelle,ilsmesurentde2à4µmdediamètre,apparaissenthyalins,cloisonnés,etparfoisramifiés(dichotomieavecanglesaigusà45°)• U?lisa?ondeméthodesdemarquage(noirchlorazol)oudecolora?onspécifiques(Gomori-Groco\)
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Aspergillusspp:Cultureetiden&fica&on
• Milieufongiquespécifique(Sabouraud+/-an?bio?ques)èiden?fica?onprécisedugenreetdel’espèceduchampignon.Aspergilluspousseen3à5joursà37°C.L’aspectmacroscopiqueestrasàpoudreux,veloutéparfoiscotonneux,etdecouleurvariéeenfonc?ondel’espèce• Examendirectàpar&rdelaculture!orienta&ondiagnos&que• Iden&fica&onparspectrométriedemasse
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Aspergillusspp:autrestechniques
• Biologiemoléculaire– Techniquesd’amplifica?ongéniquespécifiquesd’Aspergillus– Sérum,prélèvementsrespiratoires– Intérêt:bonnevaleurprédic?venéga?vedanslesérum– Limites:• Equipementspécifique• Trèssensiblesèdis?nc?onentrecolonisa?on(portageasymptoma?que)etinfec?onplusdifficile
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Pneumocys6sjirovecii
• Intérêtdelacolora?ondeMGGpourvoirlesformesvégéta?ves
• Immunofluorescencedirecte
• LaPCRquipermetdedétecterdefaibleschargesfongiques
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Lediagnos&cdelatuberculoseaulaboratoire:étapesprincipales
Méthodesclassiques
ü examenmicroscopique
ü culture
ü iden?fica?on
ü an?biogramme
Méthodesgéné&ques
ü amplifica?ond’ADN/ARNmycobactériendansleprélèvement
ü iden?fica?onparsondegéné?que
ü iden?fica?ondesmuta?onsconférantlarésistanceauxan?bio?quesdanslesgènescibles
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Lesprélèvements:quelquesprincipes
ü Onpeutchercherlesmycobactériesdanstouslesprélèvements! avecplusoumoinsdesuccès!
ü Emissionirrégulièredesbacillestuberculeux→nécessitéderépéterlesprélèvements
ü 10à30%descasdetuberculosesontdiagnos?quésuniquementsurlaclinique
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ü Crachatspontané,lema?nàjeunsipossible(2à3mlminimum)ü Crachatinduitü Tubagegastrique
→àrépéterdeux(outrois)jourssuccessifsDansun2èmetemps:ü Aspira?onbronchiqueü Lavagebroncho-alvéolaire
Prélèvementspulmonaires
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Hygièneetsécurité
ü Lesespècesducomplexetuberculosisàl’excep?ondelasouchevaccinaleBCGàbactériesdugroupederisquebiologique3
→protec&onadéquatedespersonnelsetdel’environnement:mesuresdeconfinementd’unniveau3(laboratoireL3)
Laboratoire L3
Accès sécurisé via un sas
Pression négative
Masque FFP2 en permanence
Manipulation sous Poste de Sécurité
Microbiologique
Sécurisé, couteux et contraignant
Laboratoire L3
Accès sécurisé via un sas
Pression négative
Masque FFP2 en permanence
Manipulation sous Poste de Sécurité
Microbiologique
Sécurisé, couteux et contraignant MasqueFFP2 PSM2
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Etapededécontamina&on=étapeessen&elle
ü Elimina?ondelafloreoro-pharyngéedanslesprélèvementsrespiratoires
ü Elimina?ondelafloredanslesprélèvementsurinairesetdiges?fs
→méthodedeKubica:Nacétyl-L-cystéine/citratedesodium/NaOH
éliminelaflore,maisaussiunepar?edesBAAR!
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Méthodesclassiques
ü examenmicroscopique
ü culture
ü iden?fica?on
ü an?biogramme
Méthodesgéné&ques
ü amplifica?ond’ADN/ARNmycobactériendansleprélèvement
ü iden?fica?onparsondegéné?que
ü iden?fica?ondesmuta?onsconférantlarésistanceauxan?bio?quesdanslesgènescibles
Lediagnos&caulaboratoire:étapesprincipales
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ü Colora?ondeZiehl-Neelsen(méthodederéférence)
ü Colora?onàl’auraminefluorescente=méthodedeDegommier
ü Nonspécifique
ü Peusensible:5.103à104bacilles/ml
ü RendudesrésultatsennombredeBAARparlameouparchamps
Examenmicroscopique
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Résultatsrendus
BAARvusàlacolora&on
Résultatsrendus Fluorescence
X250 x400
AucunBAARdétecté 0 0
PrésencedeBAARentrèsfaiblenombre
1-2 1-2
+ 1-9(lame) 1-9(lame)
++ 1-9(1champ) 4-36(10champs)
+++ 1-90(1champ) 4-36(1champ)
++++ >90(1champ) >36(1champ)
REMIC,2015
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Colora&ondeZiehl-Neelsen
Diagnos?cen15min
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Colora&onàl’auraminefluorescente
Diagnos?cen3min
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èLestestscommercialisésnesontvalidésquepourlesprélèvementsrespiratoires!
1. EnhancedAmplifiedMycobacteriumtuberculosisDirectTest(E-AMTDT)
2. AmplicorMycobacteriumtuberculosisTest3. Inno-LiPA-Rif.TBTest4. GenoTypeMycobacteriaDirectTest5. GeneXpertMTB/RIF(recommandéparl’OMS)
Méthodesgéné&ques:PCRdirectessuréchan&llons
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ü Détec?onducomplexeM.tuberculosis
ü Détec?ondemuta?onsdanslegènerpoBconférantlarésistance
àlarifampicine
→directementàpar?rd’unprélèvement
→sansextrac?onpréalable
→complètementautoma?sée
ü Extrac?on,amplifica?onetdétec?onparlatechniquedePCRen
tempsréeldansuneseulecartouche
PrincipedutestXpert®MTB/RIF
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Tempsdeprépara&ondel’échan&llon:20minutes
ProtocoledutestXpert®MTB/RIF
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MaislaPCRnerésoutpastout…
Tuberculose Sensibilité Spécificité
M+ 98% 98%
M- 72% 96%
Extra-respiratoire
(M-)
30% 98%
VPP:98%etVPN:90%
UnePCRnéga?venepermetpasd’exclureunetuberculose
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Méthodesclassiques
ü examenmicroscopique
ü culture
ü iden?fica?on
ü an?biogramme
Méthodesgéné&ques
ü amplifica?ond’ADN/ARNmycobactériendansleprélèvement
ü iden?fica?onparsondegéné?que
ü iden?fica?ondesmuta?onsconférantlarésistanceauxan?bio?quesdanslesgènescibles
Lediagnos&caulaboratoire:étapesprincipales
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ü SurmilieudeLöwenstein-Jensen
ü Aspectdescoloniescaractéris?quepourcertainesespèces
ü sensibilitéde102à103bacilles/ml
→diagnos?cdelaplupartdescas(avecorienta?onsurl’espèceencause)
→délaimoyende14-21jourssiBAAR+/21-42jourssiBAAR-
Culture-surmilieusolide
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M.tuberculosissurLoewenstein-Jensen-Medium
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ü MilieudeMiddlebrook(7H9ou7H10)+supplémentOADC(acideoléique,albumine,catalase,dextrose)+/-mélanged’an?bio?ques
ü Croissancedétectéegrâceàdesautomatesd’incuba?onàlecturecon?nue² Composéfluorescentsensibleàlaconcentra?ond’oxygène² Larespira?ondesmycobactériesencroissanceconsomme
l’oxygènedumilieuetpermetl’ac?va?ondelafluorescence
→délaimoyende5-10jourssiBAAR+/10-28jourssiBAAR-
Culture-surmilieuliquide(MGIT©)
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LatechniqueMGIT©
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Conclusions
ü Lecontextecliniqueetépidémiologiqueguidelesexamensàme\reenœuvre
ü Aucunou?lmicrobiologiquen’est100%sensiblenispécifique
ü Obliga?ondedemandesexplicitesduclinicienpourlarecherchedemicroorganismesatypiques
ü Lediagnos?caulaboratoire=examenmicroscopique+culture
ü Apportmajeurdestechniquesdebiologiemoléculaire