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ANÁLISIS ESTRUCTURAL Y DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD
TÓXICA DE LAS MUTANTES 8CRY11L553F, 8CRY11L556W, Y
8CRY11L553F-L556W OBTENIDAS POR MUTAGÉNESIS SITIO DIRIGIDA
EN LARVAS DE PRIMER ESTADIO DE Aedes aegypti.
Diego Fernando Herrera Pineda
Universidad de Santander
Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Agropecuarias
Programa de microbiología industrial
Bucaramanga
2018
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ANÁLISIS ESTRUCTURAL Y DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD
TÓXICA DE LAS MUTANTES 8CRY11L553F, 8CRY11L556W, Y
8CRY11L553F-L556W OBTENIDAS POR MUTAGÉNESIS SITIO DIRIGIDA
EN LARVAS DE PRIMER ESTADIO DE Aedes aegypti.
Diego Fernando Herrera Pineda
Trabajo de grado para optar al título de microbiólogo industrial
Director
Miguel Orlando Suárez Barrera, Msc.
Codirectora
Nohora Juliana Rueda Forero, Msc.
Universidad de Santander
Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Agropecuarias
Programa de microbiología industrial
Bucaramanga
2018
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HOJA DE CALIFICACIÓN
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AGRADECIMIENTOS
A Miguel Orlando Suarez Barrera, Msc. Y Nohora Juliana Rueda Forero
Msc., por su colaboración, experiencia y conocimientos compartidos.
Muchas gracias.
Al equipo de trabajo del Laboratorio de Biología Molecular y
Biotecnología UDES.
A mis cóndores: Juliana, María Angélica, María Cristina y Natalia. Gracias
por todo su apoyo.
A mis compañeros de carrera (Z), que de no ser por ellos, me hubiese
graduado hace 6 meses. Gracias por todas las experiencias brindadas.
5
DEDICATORIA
A mis padres, por el apoyo y la confianza brindada,
A Sofía, por ser mi ejemplo de lucha diaria,
A Summer, por enseñarme que los sueños se cumplen,
A todos aquellos que me brindaron su apoyo en todo este proceso.
6
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................... 15
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................ 20
3. JUSTIFICACIÓN ............................................................................ 23
4. HIPOTESIS .................................................................................... 26
4.1 Hipótesis de Investigación. .......................................................... 26
4.2 Hipótesis alternativa. ................................................................... 26
4.3 Hipótesis Nula.............................................................................. 26
5. MARCO TEORICO ......................................................................... 27
5.1 Generalidades de Bt .................................................................... 27
5.2 Proteínas Cry ............................................................................... 28
5.3 Mecanismos de acción de las toxinas Cry de Bt ......................... 35
5.4 Proteínas Cry11 ........................................................................... 40
5.5 Mejoramiento genético de proteínas ............................................ 42
6. ESTADO DEL ARTE ...................................................................... 46
7. OBJETIVOS ................................................................................... 50
7.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................. 50
7.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ....................................................... 50
8. METODOLOGÍA ............................................................................. 51
8.1 Diseño del estudio: ...................................................................... 51
8.2 Metodología. ................................................................................ 51
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8.2.1 Análisis de secuencias deducidas de las mutantes 8Cry11,
8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W respecto a la parental
Cry11Aa. ............................................................................................ 52
8.2.2 Determinación de compoosciones ideales para el medio de
cultivo ................................................................................................ 52
8.2.3 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo. ............................ 53
8.2.4 Obtención de cultivos finales de las cepas bacterianas. ........... 54
8.2.5 Extracción total de proteínas. ................................................... 54
8.2.6 Cuantificación de proteínas. ..................................................... 54
8.2.7 Digestión de proteínas Cry con proteasas. ............................... 55
8.2.8 Determinación de los patrones electroforéticos. ....................... 55
8.2.9 Estimación peso seco. .............................................................. 56
8.2.10 Ensayos de letalidad. .............................................................. 56
8.2.11 Consideraciones éticas. .......................................................... 56
9. RESULTADOS ............................................................................... 58
10. DISCUSIÓN ................................................................................ 70
11. CONCLUSIONES ....................................................................... 77
12. RECOMENDACIONES ............................................................... 79
13. BIBLIOGRAFÍA ........................................................................... 80
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Dendograma de las proteínas Cry. ........................................ 31
Figura 2. Dominio I de la toxina Cry11Aa. ............................................ 33
Figura 3. Dominio II de la toxina Cry11Aa. ........................................... 34
Figura 4 Dominio III de la toxina Cry11Aa. ........................................... 35
Figura 5. El modelo de formación de poros de la toxina Cry11Aa de tres
dominios en las balsas de lípidos de intestino medio………………….. 36
Figura 6. Mecanismo de acción de la toxina Cry, según el modelo de
unión secuencial.. ................................................................................. 38
Figura 7. Mecanismo de acción de la toxina Cry, de acuerdo con el
modelo de vía de señalización .............................................................. 40
Figura 8. Esquema general del procedimiento utilizado en la metodología.
.............................................................................................................. 51
Figura 9. Alineamiento aminoacídico del dominio I de mutantes: 8Cry11,
8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W respecto a la parental
Cry11Aa. ............................................................................................... 58
Figura 10. Alineamiento aminoacídico del dominio II de mutantes:
8Cry11, 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W respecto a la
parental Cry11Aa. ................................................................................. 59
Figura 11. Alineamiento aminoacídico del dominio III de mutantes:
8Cry11, 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W respecto a la
parental Cry11Aa. ................................................................................. 59
Figura 12. Tinción de verde malaquita más safranina.. ........................ 64
Figura 13. SDS-Page 10 %, de las mutantes y el parental Cry11Aa. ... 67
Figura 14. SDS-Page 12 %, de las mutantes y el control negativo
BMB171 activados con proteinasa K.. .................................................. 68
9
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Asociaciones entre los principales tipos de proteínas Cry y su
especificidad de acción. (Sauka & Benintende, 2008). Tabla modificada
por el autor. ........................................................................................... 46
Tabla 2. Composición en g/L de los medios de cultivos evaluados para la
producción de la δ-endotoxina. ............................................................. 53
Tabla 3. Cambios en el dominio de las variantes; DEL (deleción); INS
(Inserción); SUS (Sustitución). Los análisis se realizaron comparando la
secuencia parental Cry11Aa. ................................................................ 61
Tabla 4. Tabla porcentaje de identidad y similitud, de mutantes
empleados en esta investigación. ......................................................... 62
Tabla 5. Cuantificación de proteínas obtenidas de cada medio de cultivo
evaluado. .............................................................................................. 63
Tabla 6. Conteo de células viables de mutantes trabajadas en esta
investigación, expresadas en unidades formadoras de colonia por
mililitro. .................................................................................................. 65
Tabla 7. Promedio de la estimación del peso seco por cada 0,3 ml de
cultivo de mutantes. El peso seco se expresó en mg/mL. .................... 66
Tabla 8. Cuantificación de proteínas de mutantes empleando el método
de Bradford. .......................................................................................... 66
Tabla 9. Resultados obtenidos en el ensayo grueso para las mutantes y
los parentales para determinar la letalidad contra larvas de primer estadio
de A. aegypti. ........................................................................................ 69
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ABREVIATURAS
ALP Fosfatasa Alcalina
ANP Aminopeptidasa
Bt Bacillus thuringiensis
Bti Bacillus thuringiensis subsp Israelensis
Btjeg Bacillus thuringiensis subsp Jegathesan
Btmed Bacillus thuringiensis subsp Medellin
CDN Cadherina
CL50 Concentración letal media
Cry Cristaliferas
Cyt Citolíticas
F Fenilalanina
GPI Glicosilfosfatidilinositol
kDa Kilo-Dalton
L Leucina
W Triptofano
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RESUMEN
TITULO: Análisis estructural y determinación de la actividad tóxica de las
mutantes 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W obtenidas por
mutagénesis sitio dirigida en larvas de primer estadio de Aedes aegypti.
AUTOR: Diego Fernando Herrera Pineda
PALABRAS CLAVES: Bacillus thuringiensis, Proteínas Cry,
Mutagénesis sitio dirigida; SDS-PAGE, Concentración letal media.
Bacillus thuringiensis es un bacilo Gram-positivo productor de δ-
endotoxinas que son tóxicas para diferentes órdenes de insectos y
nematodos. Cry11 es una toxina específica contra el vector A. aegypti, el
cual es el responsable de la trasmisión del dengue, zika y chikungunya;
sin embargo, su modo de acción y características estructura-función aún
no se han elucidado completamente. El grupo de investigación de
Biología Molecular y Biotecnología de la UDES, cuenta con una librería
obtenida por barajado de ADN de genes cry11, resaltando la variante
8Cry11, la cual es 6 veces más toxica que Cry11Aa y 3,8 más que
Cry11Bb. Estudios de Docking molecular demostraron que las posiciones
553 y 556 de esta proteína son relevantes en la interacción con el
receptor cadherina, para corroborar esta información se realizó
mutagénesis sitio dirigida para revertir las mutaciones mencionadas,
obteniendo las variantes 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W.
En este trabajo se determinó la actividad tóxica de las mutantes
8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W así como una aproximación
de análisis de proteínas tanto in silico como in vitro a través de SDS-
PAGE. Para lograrlo se estandarizó las condiciones ideales para la
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producción de la δ-endotoxina (Cry11Aa), encontrándose una relación
entre las concentraciones de glucosa (15g/L) y las fuentes de nitrógeno
orgánico e inorgánico en una proporción de 3:7; se corroboró mediante
SDS page la producción de protoxina (~100 kDa) y toxina (32 y 34 kDa).
Se evaluó la toxicidad de las mutantes frente a larvas en primer estadío
de A. aegypti para determinar la concentración letal media en
comparación con la mutante 8Cry11 y la parental Cry11Aa, los resultados
mostraron pérdida de toxicidad para las variantes en estudio, lo cual
indicó que aminoácidos sustituidos en el dominio III fueron los posibles
involucrados en la perdida de la toxicidad debido a la características
estructurales.
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ABSTRACT
TITLE: Structural analysis and determination of the toxic activity of
mutants 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, and 8Cry11L553F-L556W obtained by site-
directed mutagénesis in first instar larvae of Aedes aegypti.
AUTHOR: Diego Fernando Herrera Pineda
KEYWORDS: Bacillus thuringiensis, Cry proteins, site-directed
mutagénesis, SDS-PAGE, Half- lethal concentration.
Bacillus thuringiensis is a Gram-positive bacterium, δ-endotoxins
producer that are toxic to different orders of insects and nematodes.
Cry11 is a specific toxin against the vector A. aegypti, which is responsible
for the transmission of dengue, zika and chikungunya; however, its mode
of action and structure-function characteristics have not yet been fully
elucidated. The research group of Molecular Biology and Biotechnology
of the UDES, has a library obtained by shuffling the DNA of cry11 genes,
highlighting the variant 8Cry11, which is 6 times more toxic than Cry11Aa
and 3.8 more than Cry11Bb. Molecular Docking studies showed that
positions 553 and 556 of this protein are relevant in the interaction with
the cadherin receptor, to corroborate this information, site-directed
mutagenesis was performed to reverse the aforementioned mutations,
obtaining the variants 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, and 8Cry11L553F-L556W. In
this work, the toxic activity of mutants 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, and
8Cry11L553F-L556W was determined, as well as an approximation of protein
analysis both in silico and in vitro through SDS-PAGE. To achieve this,
the ideal conditions for the production of δ-endotoxin (Cry11Aa) were
standardized, finding a relationship between glucose concentrations (15g
14
/ L) and sources of organic and inorganic nitrogen in a ratio of 3: 7; the
production of protoxin (~ 100 kDa) and toxin (32 and 34 kDa) was
corroborated by SDS page. To determine the mean lethal concentration
in comparison with the mutant 8Cry11 and the parental Cry11Aa, the
toxicity of the mutants was evaluated, against first stage larvae of A.
aegypti. The results showed loss of toxicity for the variants under study,
which indicated that substituted amino acids in domain III were strongly
possible involved in the loss of toxicity due to structural features.
15
1. INTRODUCCIÓN
Bacillus thuringiensis (Bt) comprende un grupo de bacterias aerobias
facultativas, ubicuas, Gram positivas, formadoras de esporas
estrechamente relacionadas con Bacillus cereus (Elleuch, y otros, 2015).
Bt contiene 71 serotipos reconocidos y varios biotipos flagelares (Ujváry,
2010). Dentro de las características más relevantes de Bt se encuentra
la capacidad de producir inclusiones en forma de cristal durante su fase
de esporulación, estas se pueden clasificar en dos familias: toxinas Cry
(cristaliferas) y Cyt (citolíticas), esto en función de su identidad en la
secuencia de aminoácidos (Tuntitippawan, Boonserm, Katzenmeier, &
Angsuthanasombat, 2005). Estos cuerpos parasporales actúan como
controladores biológicos para diversos ordenes de insectos, tales como:
Lepidóptera, díptera y coleóptera (Ujváry, 2010).
Dentro de las subespecies reportadas a la fecha se distingue Bt subsp.
Israelensis (Bti) como la primera descrita con actividad tóxica hacia
dípteros (Soberón & Bravo, 2007) (Suarez-Barrera, 2015). Esta cepa
produce una inclusión parasporal compuesta principalmente por tres
proteínas Cry insecticidas (Cry4Aa, Cry4Ba y Cry11Aa) y proteínas
citolíticas (Cyt1 y Cyt2) (Elleuch, y otros, 2015). Actualmente se ha
descrito que la proteína Cry11Aa es la más tóxica frente el control de
dípteros (Lee, Aimanova, & Gill, 2014) y junto con la acción sinérgica de
las demás proteínas producidas por Bti hacen de esta subespecie el
controlador biológico por excelencia. La proteína Cry11Aa comparte
cierta homología con otras toxinas como Cry11Ba, la cual es expresada
por Bt subsp. Jegathesan (Likitvivatanavong, Aimanova, & Gill, 2009).
16
De igual modo, se encuentra la proteína Cry11Bb que es expresada por
Bt subsp. Medellín (Orduz, Realpe, Arango, & Angel, 1998) y que al igual
que la proteína Cry11Aa, presentan actividad tóxica frente a dípteros,
específicamente Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus y Anopheles
albimanus (Orduz, Realpe, Arango, & Angel, 1998) (Suarez-Barrera,
2015).
Las conformaciones de las proteínas Cry han sido estudiadas mediante
estructuras cristalográficas, generando modelos tridimensionales
(Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Bb1, Cry2Aa, Cry4, Cyt1Aa) (Li, Carroll, & Ellar,
1991) (Derbyshire, Ellar, & Li, 2001) (Galitsky, y otros, 2001) (Morse,
Yamamoto, & Stroud, 2001) (Boonserm, Davis, Ellar, & Li, 2005), siendo
el modelo de la proteína Cry1Aa el de mayor relevancia para el estudio
de los demás, específica para el orden lepidóptero; la proteína Cry3A
para el orden coleóptero y la proteína Cry2Aa para dípteros y
lepidópteros (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, & Bonning, 2014).
De acuerdo a estos estudios se concluyó que las proteínas Cry
comparten tres dominios conservados (Melo, Soccol, & Soccol, 2016). El
dominio I se encuentra conformado por siete hélices-α en el N-terminal y
es el encargado de la formación del poro lítico (Fernández, y otros, 2005).
El dominio II consta de tres hojas-β anti paralelas, los bucles se
encuentran expuestos en la cima de sus laminas y es el encargado de
reconocer los receptores de las membranas del insecto diana (Parra,
2017). El dominio III posee una estructura de β-sándwich conformada por
dos hojas β-anti paralelas y es el encargado de la estabilidad proteica y
al igual que el dominio II favorece la unión del receptor de la membrana
(Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, & Bonning, 2014).
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El mecanismo de acción de las proteínas Cry, no se encuentra bien
definido a la actualidad, por este motivo, se han propuesto diversos
modelos (Soberón, y otros, 2010) que pueden ocurrir simultáneamente
(Melo, Soccol, & Soccol, 2016) uno de ellos describe que mediante la
ingestión por parte del insecto, el cual es denominado modelo de unión
secuencial, en donde las proteínas Cry son solubilizadas en el pH alcalino
del intestino medio (Hoeven, 2014), posterior a esto se lleva a cabo una
activación de estas toxinas mediadas por la acción de las enzimas
proteolíticas (proteinasa K, Tripsina, etc.), que posteriormente se unen a
los receptores específicos en la membrana del insecto (Tallinski, Laporte,
& G Tetreau, 2015), como lo son las fosfatasas alcalinas (ALP), N-
aminopeptidasas (APN) y caderinas (CADRs) (Soberón, y otros, 2012)
(Melo, Soccol, & Soccol, 2016).
Otro Modo de acción denominado “Vía de señalamiento”, el cual ocurre
de dos formas: en primera instancia; una forma lítica, generando
reacciones continuas que alteran el metabolismo celular sin causar
apoptosis, debido a que no siempre las formas activas de la proteína Cry
se unen a los receptores de la membrana (Zhang, Zhao, Yu, & Su, 2005)
y en segunda instancia, generando estímulos. Este proceso procede
después de la unión de las proteínas Cry a los diversos receptores de
membrana, produciendo un estímulo el cual activa la vía de señalización
y estimulación de la proteína G que resulta en la activación de los canales
de magnesio en la membrana plasmática, ocasionando un flujo anormal
de iones, lo que conduce a la destrucción de la membrana y
posteriormente produciendo la muerte celular (Zhuang, Oltean, & Gómez,
2002) (Zhang, Candas, & Griko, 2005) (Melo, Soccol, & Soccol, 2016).
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A pesar de que se conocen las ventajas de la utilización de Bt como
controlador biológico, con el pasar del tiempo diversos estudios in vitro
han encontrado poblaciones de diversas especies de insectos que se
hacen poco susceptibles a las toxinas Cry, han llegado a generar
resistencia a la acción de dichas proteínas y esporas tras varias
generaciones de selección (Ferré, 2002). Estos eventos de resistencia,
pueden deberse a mutaciones en los receptores del intestino medio de
insectos diana, evitando así las uniones de las toxinas a los receptores
(ALP, APR Y CADRs) (Soberón & Bravo, 2008).
Actualmente, mediante el uso de técnicas de biología molecular se ha
incursionado en el mejoramiento genético de proteínas con el fin de
potencializar la actividad tóxica frente a los diferentes órdenes de
insectos que desarrollan resistencia (Araújo, 2015). Dentro de las
estrategias empleadas para el mejoramiento de las proteínas Cry se
encuentran el intercambio de dominios, mutagénesis sitio dirigida, el uso
de péptidos sintéticos y las bibliotecas de fagos (Deist, Rausch,
Fernandez-Luna, Adang, & Bonning, 2014).
En estudios previos desarrollados por el grupo de investigación de
Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad De Santander,
UDES, se ha trabajado con una diversa cantidad de mutantes obtenidos
por recombinación aleatoria de barajado molecular de ADN (DNA
Shuffling). Actualmente se han descrito 5 de estas mutantes, las cuales
poseen una alta homología (64,9 - 98,9% de similitud) con los genes
Cry11Aa (Suarez-Barrera, 2015); se demostró un aumento en la
toxicidad en el control de A. aegypti mediante la mutante 8Cry11 con una
toxicidad 6 veces mayor en comparación con la parental Cry11Aa en el
control de A. aegypti. Posteriormente análisis de docking molecular de
19
esta misma proteína permitió sugerir posiciones de relevancia
involucradas en el mejoramiento de unión de la proteína a los diferentes
receptores de A. aegypti, información con la cual se dispuso a realizar un
modelo in vitro, en donde se pudiese corroborar la información obtenida
mediante simulaciones in silico, y en base a esto se llevó a cabo un
estudio donde se revirtieron las posiciones aminoacídicas 553 y 556 de
8Cry11, obteniéndose como resultado final las mutantes 8Cry11L553F,
8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W (Parra, 2017). En el actual proyecto se
reportan las características moleculares y la actividad toxica frente a
larvas de primer estadio de A. aegypti de las mutantes 8Cry11L553F,
8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W obtenidas mediante mutagénesis sitio
dirigida.
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2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Bacillus thuringiensis (Bt) ha sido motivo de estudio por casi un siglo, ya
que se caracteriza por producir proteínas tipo Cry, que son tóxicas para
diferentes tipos de invertebrados, y posee cualidades que permiten hacer
una competencia a plaguicidas de tipo químico; de este modo Bt presenta
un gran interés como controlador biológico (Parra, 2017). Su alta
actividad insecticida, la falta de toxicidad para organismos no objetivo y
la aparición de poblaciones resistentes de insectos a insecticidas
químicos dieron como resultado una rápida implementación de estos
bioinsecticidas como método de control alternativo de poblaciones de
mosquito y mosca negra (Becker, 2000). A pesar de esto, con todo el
conocimiento que se tiene a la fecha, aún no es claro cuál es su modo de
acción (Melo, Soccol, & Soccol, 2016). Actualmente el estudio de las
toxinas Cry se ha centrado fundamentalmente en las proteínas Cry1Aa,
Cry3Aa, Cry4Ba (Tuntitippawan, Boonserm, Katzenmeier, &
Angsuthanasombat, 2005) que son utilizadas principalmente en el control
biológico de plagas de interés agrícola; poca atención se ha prestado a
Cry11Aa, la cual se ha reportado con considerables efectos insecticidas
frente a vectores de enfermedades como lo es A aegypti, mosquito
trasmisor del Dengue, Zika y Chikungunya (Powell J. , 2013). Diversos
ensayos in vitro han demostrado que poblaciones de múltiples especies
de insectos se hacen menos susceptibles y han generado una resistencia
a la acción de las toxinas y esporas de los insecticidas elaborados a partir
de Bacillus thuringiensis, administrados como insecticidas biológicos,
tras varias generaciones de selección (Ferré, 2002). Es relevante resaltar
que el mecanismo más común de la resistencia a las toxinas Cry son
mutaciones que afectan a los receptores proteínicos de las cadherinas
21
por residuos aminoacídicos que generan interacción con los bucles 8,4
y3 de la proteína Cry, lo que evita así la unión de la toxina a su membrana
blanco (Soberón & Bravo, 2008). Se han adoptado varios enfoques para
modificar la especificidad de unión y la afinidad de las toxinas con el
objetivo final de contrarrestar la resistencia desarrollada por especies
nativas. La alteración de la especificidad y afinidad de unión de toxinas
de Bt se puede dividir en cuatro categorías, las cuales corresponden a
técnicas como: intercambio de dominio o bucle entre toxinas Cry,
mutagénesis sitio dirigida, incorporación de péptidos de unión y la
generación y visualización posterior de bibliotecas mutantes de toxina
Cry en fagos (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, & Bonning, 2014).
En estudios previos llevados a cabo en el laboratorio de Biología
molecular y Biotecnología de la Universidad de Santander, UDES, se ha
trabajado con una serie de variantes obtenidas por recombinación
aleatoria de barajado molecular de ADN, hasta el momento se han
descrito 5 variantes, las cuales presentaron alta homología con genes
Cry11 (Suarez-Barrera, 2015). Se demostró que la variante 8Cry11
presentó un aumento en su toxicidad en larvas de primer estadío de A.
aegypti en comparación con las proteínas parentales, aumento que se
reflejaba con una toxicidad 6 veces mayor a la parental Cry11Aa y 3,8
veces mayor para la proteína parental Cry11Ba (Suarez-Barrera, 2015).
Estudios basados en docking molecular permitieron dilucidar posiciones
de relevancia involucradas en la mejoría de unión de la proteína al
receptor cadherina, y posteriormente se procedió a revertir los residuos
aminoacídicos involucrados a su estado original en las posiciones L553F,
L556W, y L553F-L556W para constatar la información obtenida mediante
el docking molecular. El actual proyecto determinó mediante estudios in
vitro las alteraciones que se puedan generar en función de la longitud de
22
la cadena polipeptídica, masa molecular, modificaciones
postraduccionales de acuerdo a dichos residuos revertidos mediante
patrones electroforéticos en su estado de protoxina y toxina. En paralelo,
también se realizaron pruebas de concentración letal media (CL50) para
determinar si estas posiciones aminoacídicas están involucradas en la
unión al receptor y además si estos residuos son los responsables en
aumentar la actividad toxica del mutante 8Cry11 en larvas de primer
estadio de A. aegypti.
De este modo, se planteó la siguiente pregunta de investigación: ¿Cuál
es el rol de las posiciones L553F y L556W de la muteína 8Cry11 de
Bacillus thuringiensis sobre la toxicidad en larvas de primer estadio de
Aedes aegypti?
23
3. JUSTIFICACIÓN
Las enfermedades transmitidas por los mosquitos se encuentran entre
las principales causas de morbilidad y mortalidad en los seres humanos
(Araújo, 2015). A. aegypti tienen una alta capacidad vectorial (eficacia de
la transmisión del virus en la naturaleza) para DENV (dengue), CHIKV
(chikungunya), ZIKV (zika) y YFV (fiebre amarilla), estas enfermedades
son infecciones transmitidas por mosquitos que se presenta en todas las
regiones tropicales y subtropicales del planeta (Powell J. , 2013). La
incidencia del dengue ha aumentado enormemente en el mundo para las
últimas décadas debido a los diferentes cambios climáticos, que han
proporcionado ambientes más propicios para el desarrollo de los
vectores (OMS, 2017). El número real de casos reportados por dengue
es insuficiente o por lo general muchos de estos eventos están mal
clasificados. Por año, recientemente se ha estimado 390 millones de
infecciones, de las cuales, 67 a 136 millones se manifiestan clínicamente,
por cualquier gravedad que presente la enfermedad (Bhatt, y otros,
2013); estudios realizados por (Brandy, y otros, 2012) calculan la
prevalencia del dengue se encuentra alrededor de 3900 millones de
personas, de 128 países. Según lo reportado por la (OMS, 2017) en
Colombia en el periodo de 2000 y 2016 se han perdido 1152 vidas por
causas del mosquito trasmisor del dengue, para este lapso, en el país se
generaron dos grandes epidemias; en la primera se presentaron
alrededor de 157.000 casos en el año 2010 y la segunda con alrededor
de 127.000 casos en el año del 2013. Para los últimos años se ha
presentado una mortalidad de 215 personas a causa del dengue (OMS,
2017).
24
El control de este vector se ha realizado principalmente con la aplicación
de insecticidas de tipo químico del grupo piretroides (Anadón, 2015), no
obstante, su uso prolongado afecta a otras poblaciones de seres vivos, e
incluso algunos organismos han llegado a adquirir resistencia ante dichos
insecticidas químicos (Sanahuja, Banakar, Twyman, Capell, & Christou,
2011). Conforme se adelantan investigaciones, se plantean soluciones
para controlar este vector, que van desde la mutación directa en los
mosquitos (Araújo, 2015), hasta el uso de bacterias como
biocontroladores (Alzate, Osorio, Florez, & Dean, 2010). Sin embargo,
esta última opción representa una de las alternativas más llamativas, en
donde, se produce la importancia de generar mutantes de las bacterias
nativas de Bt con la capacidad de generar nuevas toxinas Cry con un
mayor potencial tóxico y especificas con respecto a las cepas
comerciales con las cuales se ha venido trabajando en el control de
plagas tanto agrícolas como de vectores de enfermedades (Araújo,
2015). La técnica molecular conocida como mutagénesis sitio dirigida
permite crear proteínas con mejores parámetros de unión que resultan
ser más toxicas (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, & Bonning,
2014), ofreciendo la posibilidad de conocer residuos y dominios que
interactúan directamente con los receptores dianas y que están
involucrados en la estabilidad de la proteína (Parra, 2017). En la
actualidad, poca información se posee de la interacción de la proteína
Cry11Aa con los receptores de membrana de las células epiteliales de A.
aegypti. Estudios realizados por (Fernández, y otros, 2005) es uno de los
pocos realizados en este tipo de proteína, en el cual exponen la
importancia de diferentes secuencias aminoacídicas en la interacción con
células del insecto. Por lo anteriormente expuesto, surge la necesidad de
utilizar herramientas de biología molecular para la verificación de los
resultados obtenidos a través de dichos mejoramientos genéticos,
25
aportando de este modo información que corrobore si los cambios
generados en dichas proteínas son relevantes y generando información
del comportamiento de toxinas modificadas frente al control biológico de
A. aegypti y a su vez, generar información de base para el desarrollo y
optimización de recursos informáticos para el grupo de investigación,
encaminados al desarrollo de un software para el mejoramiento genético
de proteínas.
26
4. HIPOTESIS
4.1 Hipótesis de Investigación.
Las posiciones L553F y L556W son determinantes en el aumento en la
toxicidad de la variante 8Cry11, respecto a la parental Cry11Aa
4.2 Hipótesis alternativa.
Las posiciones L553F o L556W son determinantes en el aumento en la
toxicidad de la variante 8Cry11, respecto a la parental Cry11Aa
4.3 Hipótesis Nula.
Las posiciones L553F y L556W no son determinantes en el aumento en
la toxicidad de la variante 8Cry11, respecto a la parental Cry11Aa
27
5. MARCO TEORICO
5.1 Generalidades de Bt
Bacillus thuringiensis fue identificado por primera vez en el siglo veinte,
en el año de 1901 por Ishiwata, quien reportó que este microorganismo
poseía una capacidad infectiva hacia Bombyx mori, plaga que en aquel
tiempo estaba causando graves daños en la industria de la seda en
Japón (Beegle & Yamamoto, 1992). En ese momento, el autor llamó a
dicha bacteria como Bacillus sotto. Una década más tarde, Berliner aisló
una bacteria Gram-positiva en larvas de Ephesitia kuehniella en el estado
de Turingia (Alemania) e ignorando el nombre dado por Ishiwata, la
nombró Bacillus thuringiensis, nombre con el cual se le conoce hasta la
fecha (Melo, Soccol, & Soccol, 2016). Bt es una bacteria ubicua Gram-
positiva, aerobia, con una alta capacidad resistente a temperaturas
elevadas y condiciones de desecación, es formadora de endosporas
cuyo tamaño se encuentra entre 1 a 1,2 micrómetros de ancho y de 3 a
5 de largo (Portela-dussán, Chaparro-giraldo, & López-pazos, 2013). Bt
ha sido aislada de diversas partes del planeta, pero principalmente en
nichos como suelos, hojas de plantas e insectos muertos (Sanahuja,
Banakar, Twyman, Capell, & Christou, 2011). Bt posee un genoma de
alrededor de 2,4 a 5,7 millones de pares de bases, la mayoría de las
cepas tienen elementos extra cromosómicos, algunos de ellos circulares
y otros lineales , cuyos tamaños varían entre 2 y cientos de kilo bases
(Mireles, 2006). Bt está incluido en el grupo de B. cereus que
corresponde a 5 especies: B cereus, B anthracis, B. mycoides, B
pseudomycoides y B. weihenstephanensi (Didelot, Barker, Falush, &
Priest., 2009). A su vez, se encuentra subdividido en 71 subespecies con
28
base en las propiedades del antígeno flagelar (H) (Lecadet, y otros,
1999)y de este grupo se conocen cuatro como las principales que son Bt
subsp. kurstaki (H3a3b3c), Bt subsp aizawai (H7) que tienen actividad
contra lepidópteros, Bt subsp israelensis (H14) que tiene actividad contra
mosquitos y Bt subsp. morrisoni cepa tenebrionis (H8a8b) que tiene
actividad contra coleópteros (Suarez-Barrera, 2015).
Bt posee la capacidad de proliferar fácilmente cuando las condiciones
ambientales, tales como la temperatura y la disponibilidad de nutrientes
son favorables, mientras que la formación de esporas se genera por
factores internos y externos que incluyen señales de inanición de
nutrientes, densidad celular y progresión del ciclo celular (Hilbert &
Piggot, 2004). El ciclo de vida de Bt está compuesto por diversas fases y
estas están dadas de la siguiente forma: Fase I: crecimiento vegetativo;
Fase II: transición a la esporulación; Fase III: esporulación; y Fase IV:
Maduración de esporas y lisis celular (Hilbert & Piggot, 2004). Durante la
fase III, Bt tiene la capacidad de producir proteínas insecticidas, estas
proteínas son conocidas como δ-endotoxinas, las cuales están
compuestas principalmente por una o más proteínas Crystal (Cry) y
proteínas Cytoliticas (Cyt). Las proteínas Cry son proteínas de inclusión
parasporal que exhiben un efecto tóxico contra diversos tipos de insectos
(Bravo, Gill, & Soberón, 2007).
5.2 Proteínas Cry
Las proteínas Cry son específicamente tóxicas para insectos del orden
Lepidóptera, Coleóptera, Himenóptera y Díptera, e incluso para diversos
nematodos. Por el contrario, las proteínas Cyt poseen una capacidad
29
toxica únicamente para el orden díptera (Bravo, Gill, & Soberón, 2007).
Las proteínas Cry están conformadas por al menos 50 sub grupos con
más de 200 miembros (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, &
Bonning, 2014). Su composición consta de alrededor de 600
aminoácidos de forma globular, conformando una estructura de tres
dimensiones con tres dominios conservados unidos entre sí. Desde la
identificación y clonación del primer gen de proteína Cry insecticida de Bt
en 1981, el número de genes que codifican nuevas proteínas insecticidas
han aumentado continuamente, generando la necesidad de un sistema
de nomenclatura organizado (Palma, Muñoz, Berry, Murillo, & Caballero,
2014). La figura 1 representa el filograma de identidades entre las
secuencias Cry, las líneas verticales denotan los cuatro niveles de la
nomenclatura; y para asignar su nombre, por lo general se realiza de la
siguiente manera: el número arábigo se designa con la primera fila que
corresponde hasta 45% de identidad. La segunda hilera cataloga a las
proteínas con una letra mayúscula y corresponde a identidades de 45 a
78%. La tercera fila asigna una letra minúscula y corresponde a
identidades de 78 a 95%. La última fila incluye un número arábigo al final
de la nomenclatura indicando más de 95% de identidad (Soberón &
Bravo, 2007). Estudios de los alineamientos de los tres dominios de las
toxinas Cry han permitido orientar que la mayoría presenta un mismo
patrón de plegamientos con cinco bloques conservados (Schnepf, y
otros, 1998). El bloque uno está conformado por cinco hélices del dominio
I, que está inmerso en la formación del poro. El bloque dos, incluye siete
hélices del dominio I y la primera lamina β del dominio II, esta es la región
de contacto de estos. Los bloques tres, cuatro y cinco se encuentran
dentro del dominio III; El bloque tres contiene la última lámina β del
dominio II, una estructura involucrada en las interacciones entre los
dominios II y III; el bloque cuatro, contiene dos argininas centrales,
30
envueltas en los puentes salinos, que están implicados en la agregación
oligomérica; posteriormente, la razón biológica del bloque cinco se ubica
se ubica en el extremo del dominio III, pero no es clara su función
actualmente (Portela-Dussán, Chaparro-Giraldo, & López-Pazos, 2013).
31
Figura 1. Dendograma de las proteínas Cry. Autor: (Adang, Crickmore, & Jurat-Fuentes, 2014) Modificado por: (Suarez-Barrera, 2015)
Cry11Ba
Cry11Bb
Cry11Aa
32
El dominio I se encuentra ubicado en el extremo N-terminal, compuesto
por siete α-hélice anti paralelas hidrofóbicas, anfipáticas con residuos
polares y se encuentra implicada en la formación del poro lítico en la
membrana del insecto diana (Figura 2) (Soberón, y otros, 2010). La hélice
número cinco se encuentra en el centro, y a su alrededor están las seis
restantes (Portela-Dussán, Chaparro-Giraldo, & López-Pazos, 2013). Los
grupos polares se encuentran ubicados en el espacio inter helical y
forman puentes salinos o enlaces de hidrogeno. La mayoría de las α-
hélices son más largas de 30 Armstrong y tienen la capacidad de
atravesar una membrana hidrofóbica (Alzate, Osorio, Florez, & Dean,
2010). La forma en que este dominio actúa se ha planteado mediante dos
modelos, el de paraguas y “Pen knife” (Palacios, 2015).
En el modelo “Pen knife”, las hélices fuertemente hidrofóbicas α5 y α6,
se unen en el extremo de la proteína abriendo espacio e insertándose en
la membrana lipídica, mientras el resto de la molécula permanece en la
superficie de la membrana (Hoeven, 2014). Por otro lado, en el modelo
paraguas, se plantea que la estructura de horquilla hidrofóbica de las
hélices α4 y α5, se insertan e inician la formación del poro y el resto del
dominio I se agrupa en la membrana en un estado globular (Li, Carroll, &
Ellar, 1991).
33
El dominio II consiste en un β-prisma de tres hojas β-anti paralelas
empaquetadas alrededor de un núcleo hidrofóbico (Figura 3) (Soberón, y
otros, 2010). Dos de las hojas están compuestas por cuatro cadenas en
forma de llave griega y están expuestas al solvente (Suarez-Barrera,
2015). La tercera hoja involucra tres cadenas y una α-hélice corta dirigida
hacia el dominio I, los bucles se encuentran expuestos en la cima de sus
láminas, los cuales se asemejan a los sitios de unión a una reacción
antígeno-anticuerpo en algunas proteínas y moléculas (Fernández, y
otros, 2005) permitiendo sugerir que este mecanismo es el encargado de
reconocer el receptor de las membranas del intestino del insecto blanco
(Portela-dussán, Chaparro-giraldo, & López-pazos, 2013). Por otro lado,
este dominio posee tres asas que interactúan con las micro vellosidades
del intestino medio del insecto, teniendo un papel funcional en
especificidad de la proteína (Soberón & Bravo, 2007).
Figura 2. Dominio I de la toxina Cry11Aa. Fuente: Autor
34
El dominio III Estructuralmente se asemeja a proteínas de unión a
carbohidratos tales como galactosa oxidasa, sialidasa, β-glucoronidasa,
xilanasa U y β-galactosidasa (Bravo, Gill, & Soberón, 2007). Se
encuentra descrito como un β-sándwich (Figura 4.) (Nair, Liu, & Dean,
2015). En este caso, dos paquetes de hojas β-anti paralelas se
encuentran unidas con una topología; las dos hojas están compuestas
de cinco cadenas con el revestimiento de la cara externa hacia el
solvente y el revestimiento interno contra el dominio II (Li, y otros, 2007).
El dominio I interactúa con el extremo de este dominio a lo largo de dos
bucles extendidos. La menor variabilidad estructural reportada se
encuentra en el dominio III en comparación con el II y esto se debe a
diferencias significativas basadas en las longitudes, orientaciones y
secuencias de los bucles (Suarez-Barrera, 2015). Este dominio aporta en
mantener la estructura integral de la toxina, frente a la proteólisis del
organismo diana, también, se encuentra involucrada en la unión con el
receptor, la inserción a la membrana celular y la formación de canales
Figura 3. Dominio II de la toxina Cry11Aa. (A) Estructura del dominio II de la toxina Cry1Aa; (B) llave griega del Dominio II. Fuente: Autor
35
iónicos (López-Pazos & Cerón, 2010) (Portela-dussán, Chaparro-giraldo,
& López-pazos, 2013).
5.3 Mecanismos de acción de las toxinas Cry de Bt
La actividad insecticida de Bt se caracteriza en al menos cuatro
protoxinas cristalinas de 27, 72, 128 y 134 KDa, codificadas por Cyt1Aa,
Cry11Aa, Cry4Ba y Cry4Aa respectivamente, todas mapeadas en el
plásmido de 128 Kb conocido como pBtoxis (Xu, Nagai, Bagdasarian,
Smith, & Walker, 2001). Las proteínas Cry se han especificado son
toxinas formadoras de poros que inducen la muerte celular en insectos
diana al formar aberturas iónicas en la membrana de las células
epiteliales del intestino medio del insecto (Figura 5). Se han descrito
diversos mecanismos de toxicidad, lo que indica que no existe un único
modelo estándar (Soberón, y otros, 2010); además, estos procesos
complejos pueden ocurrir simultáneamente, y muestran que todavía hay
Figura 4 Dominio III de la toxina Cry11Aa. Esquema de sus hojas β plegadas (β-sándwich). Fuente: Autor
36
vacíos en el conocimiento sobre los receptores de las δ-endotoxinas en
la membrana plasmática y la secuencia de reacciones que culmina en la
muerte de un organismo (Melo, Soccol, & Soccol, 2016). Dentro de los
diversos mecanismos de acción propuestos hasta el momento se hace
hincapié al modelo de enlace secuencial y al modelo de vía de
señalamiento mediante la formación de canales iónicos (Melo, Soccol, &
Soccol, 2016).
Figura 5. El modelo de formación de poros de la toxina Cry11Aa de tres dominios en las balsas de lípidos de intestino medio. (A) Diagrama 3-D de la estructura Cry11Aa. B) Pasos secuenciales del modelo de formación de poros. 1) La proteína Cry11Aa se solubiliza mediante proteasas alcalinas. 2) Cry11Aa se une a los abundantes receptores APN y ALP anclados a GPI en las balsas lipídicas con baja afinidad. Esta unión promueve la localización y concentración de las toxinas activadas. 3) La unión al receptor de cadherina facilita la escisión proteolítica de la hélice α-1 en el extremo N-terminal. 4-5) La escisión N-terminal induce la formación de oligómero pre-poroso y aumenta la afinidad de unión del oligómero a los receptores APN y ALP anclados a GPI. 6) El oligómero se inserta en la membrana, lo que conduce a la formación de poros y lisis celular (Chengchen, Bi-Cheng, Ziniu, & Ming, 2014). Imagen modificada por el Autor.
37
El modelo de enlace secuencial se basa en la acción citotóxica de Bt,
que recae sobre los poros que se forman en la membrana plasmática, lo
que da como resultado una unión en serie y esta afecta el equilibrio
osmótico de la misma (Figura 6) (Bravo, Gill, & Soberón, 2007). Este se
conoce comúnmente como mecanismo clásico, y en los últimos años ha
sido ampliamente detallado por diversos investigadores (Bravo, Gill, &
Soberón, 2007), para dicho modelo se han realizado estudios con
Cry1Ab en Manduca sexta: la δ-endotoxina se ingiere, la proteasa
digestiva activa la protoxina y luego la toxina Cry en su forma activa entra
en contacto con los receptores de N-aminopeptidasa (APN), fosfatasa
alcalina (ALP) y cadherina (CDN), en la membrana de la superficie
(Figura 6.1) (Jiménez-Juárez, Muñoz-Garay, & Gómez, 2008). Las
afinidades moleculares específicas entre las toxinas y ciertos receptores
dan como resultado la activación proteolítica en la molécula de Cry,
generando así, cambios estructurales en la cadena proteica, formando
oligómeros que realizan la función de preporos (Figura 6.2-6.3). Por otra
parte, existe una tercera conexión a la superficie de la membrana: el
receptor de N-aminopeptidasa tiene una afinidad molecular, teniendo
como resultado el anclaje del pre-popo en la bicapa lipídica de la
membrana (Figura 6.4). Las horquillas helicoidales hidrofóbicas de hélice
α-4 y hélice α-5 se insertan a la membrana para iniciar la formación del
poro, mientras que el resto del dominio I se mantiene flotando sobre la
membrana en estado globular asimilando la forma de una sombrilla
(Dean, y otros, 1996). Finalmente, el cambio en la formación de poros
afecta la integridad de la membrana (Figura 6.5) desestabilizándola, la
cual lleva a un desbalance osmótico, causando la muerte celular (Melo,
Soccol, & Soccol, 2016). Las demás interacciones proteína-receptor son
mediadas por bucles expuestos en los ápices de las tres hojas β
38
hidrofóbicas del dominio II (Li, Carroll, & Ellar, 1991). Debido a las
similitudes de los sitios de unión de antígenos de las inmunoglobulinas,
se ha propuesto que los bucles del dominio II están relacionados con
uniones a receptores del intestino medio del insecto (GPI) (Dean, y otros,
1996). El dominio III que corresponde al β-sándwich se encuentra
implicado en funciones de unión al receptor y se ha descrito que está
implicado en la estabilidad e integridad estructural de la molécula
protegiéndola de la proteólisis dentro del intestino del insecto (de-Maagd,
Bravo, & Crickmore, 2001). El modelo de unión secuencial considera los
enlaces entre las toxinas y los receptores, dando como resultado que la
toxina altere molecularmente la proteína y activa los poros en el cuerpo
que es susceptible a la citotoxicidad.
Figura 6. Mecanismo de acción de la toxina Cry, según el modelo de unión secuencial. (1) La proteína Cry (Cry) se une a los receptores de cadherina (Cd) en la membrana plasmática. (2) La proteína Cry conecta los receptores de N-aminopeptidasas (N-a). (3) El clivaje proteolítico se da mediante la oligomerización de la proteína (Ol-Cry). (4) Formación de pre-poro y anclaje a la membrana. (5) Poros que afectan la integridad de la membrana. (Melo, Soccol, & Soccol, 2016). Imagen modificada por el autor.
El modelo de vía de señalamiento mediante la formación de canales
iónicos posee características similares al modelo de enlace secuencial,
39
sin embargo, la muerte celular se asigna a diferentes causas (Melo,
Soccol, & Soccol, 2016). Dentro lo descrito, las proteínas Cry generan
daño celular de dos formas: en primera instancia, de forma lítica,
generando poros en la membrana, como en el modelo de unión
secuencial; en segunda instancia, producen reacciones sucesivas que
alteran el metabolismo celular (Figura 7) (Zhang, Candas, & Griko, 2005).
Si bien es conocido que la formación de poros determina la citotoxicidad
de la proteína, en este modelo, se minimiza la importancia de incorporar
un pre-poro en la membrana y de este modo no se considera suficiente
para causar la muerte celular, debido a que no siempre se une con los
lípidos de la membrana (Zhuang, Oltean, & Gómez, 2002).
Por otro lado, en algunos casos, las toxinas bacterianas simplemente no
se unen a la membrana, pero aun así, generan daño en ella y la toxicidad
ocurre (Melo, Soccol, & Soccol, 2016), Esta hipótesis se basa en que los
receptores de la toxina Cry se unen a las cadherinas y las
aminopeptidasas N (Figura 7A) y por procesos, que aún no se conocen,
transmiten estímulos que resultan en la activación de los canales de Mg2+
en la membrana plasmática (Figura 7B). La apertura de estos canales
causa un movimiento anormal de iones en el citosol (Figura 7C). Este
efecto resulta ser mayor debido a la destrucción de la membrana
plasmática, y las toxinas bacterianas activan los procesos celulares
preexistentes durante la apoptosis (Zhang, Candas, & Griko, 2005).
Según este modelo, puede aparecer una forma lítica cuando los
oligómeros se insertan en la bicapa lipídica, pero esto no resulta ser
toxico para la célula.
40
5.4 Proteínas Cry11
B. thuringiensis israelensis (Bti), Bt subsp Jegathesan (Btjeg) y Bt subsp
Medellín (Btmed) se han caracterizado por producir dentro de sus
cristales las proteínas Cry11Aa, Cry11Ba y Cry11Bb respectivamente
(Sauka, Monella, & Benintende, 2010).
Bti produce una proteína Cry11Aa de aproximadamente 70 KDa y
mediante su activación proteolítica, se remueven alrededor de 28
residuos de aminoácidos del extremo N-terminal y una partición
intermolecular fragmenta la proteína en dos partes, un fragmento de 32
y 34 KDa, que se mantienen asociados y son tóxicos. La proteína activa
se une a los receptores específicos de la membrana diana del insecto,
generando un clivaje en ella y formando un poro lítico (Fernández, y
otros, 2005). Dentro de los cristales producidos por Bti, se encuentra
Cry11Aa, este se ha descrito como la toxina más activa contra A. aegypti,
Figura 7. Mecanismo de acción de la toxina Cry, de acuerdo con el modelo de vía de señalización: (1) La Proteína Cry se une a los receptores de cadherina (Cd) en la membrana plasmática; (2) la apoptosis estimulante (Ap) con la activación de los canales de iones (ci) en la membrana plasmática; (3) Movimiento de iones de magnesio, que culmina en la muerte celular (Melo, Soccol, & Soccol, 2016). Imagen modificada por el autor.
41
sin embargo las regiones involucradas en las interacciones con su
receptor permanecen sin caracterizar (Fernández, y otros, 2005).
Diversos estudios demuestran que el dominio II de Cry11Aa, es relevante
en el reconocimiento del receptor y vinculante, debido a que este
contiene cuatro regiones de bucle putativo α-8, 1,2 y 3 (Emiliano,
Zanicthe, Bravo, & Soberón, 2011). De igual modo, existen diversos
factores que se encuentran involucrados en el modo de acción de la
toxina, entre ellos se encuentra las CDN, APN y ALP, las cuales se han
identificado como moléculas de unión de Cry11Aa en diferentes especies
de mosquitos, que sugieren un modo de acción conservado de las toxinas
Cry en insectos del orden díptero (Emiliano, Zanicthe, Bravo, & Soberón,
2011). Por otra parte, se ha demostrado que una isoforma de
glicosilfosfatidilinositol (GPI) anclado a una fosfatasa alcalina (ALP1)
están relacionadas en la toxicidad contra A. aegypti (Lee, Aimanova, &
Gill, 2014).
Btjeg produce una toxina de alrededor de 80 KDa que genera fragmentos
activos mediante la activación con proteinasa K de 30 y 35 KDa, la cual
es conocida como Cry11Ba (Likitvivatanavong, Aimanova, & Gill, 2009).
Actualmente se conoce que este tipo de proteína es la más toxica en
comparación con las demás Cry11 contra larvas de Aedes, Anopheles y
Culex (Zhang, Hua, Bayyareddy, & Adang, 2013). La toxicidad de
Cry11Ba es dependiente de los receptores que se encuentran en el
intestino medio de los insectos y se ha evidenciado que receptores como
cadherinas APN y ALP, están involucrados en la especificidad de esta
toxina en el control de dípteros (Wirth, Walton, & Federici, 2015). El efecto
tóxico de las proteínas Cry11Ba está relacionado con los receptores en
las células epiteliales del intestino medio de larvas de mosquitos, se ha
encontrado que la cadherina (AgCad2), aminopeptidasa (AgAPN2) y la
42
fosfatasa alcalina (AgALP1) están implicadas en la regulación de la
toxicidad en Anopheles gambiae (Zhang, Hua, Bayyareddy, & Adang,
2013). La mutagénesis en Cry11Ba denota que los bucles α8, 1 y 3 en el
dominio II son muy importantes y determinantes en la toxicidad hacia
algunas especies de mosquitos (Likitvivatanavong, Aimanova, & Gill,
2009).
Btmed se caracteriza por poseer un tipo de cristal que contiene efectos
tóxicos contra diferentes géneros de mosquitos, tales como Culex,
Anopheles y Aedes, la toxina producida se describe como Cry11Bb, la
cual tiene un peso de 94 KDa (Arias, Orduz, & Lemeshko, 2009). El efecto
toxico de Cry11Bb1 se da con la solubilización y el procesamiento
proteolítico en el intestino medio de los insectos diana, en donde sus
fragmentos activos toman un peso de 30 y 35 KDa. Cry11Bb está
compuesta por cinco bloques repetitivos de 16 aminoácidos en el
carboxilo terminal, ubicados entre los aminoácidos 702 y 781 de la
secuencia (Orduz, Realpe, Arango, & Angel, 1998).
5.5 Mejoramiento genético de proteínas
La toxicidad de las proteínas Cry producidas por Bt se encuentra dada
principalmente en la activación proteolítica y posteriormente la unión al
epitelio intestinal de los insectos (Adang, Crickmore, & Jurat-Fuentes,
2014). Los cambios que se realizan en algunos de estos dos factores
deberían dar como resultado un cambio en la toxicidad frente a los
insectos diana. Se han adoptado varios enfoques para modificar la
especificidad de unión y la afinidad de las toxinas con el objetivo final de
producir toxinas diseñadas que se dirijan a nuevas especies de plagas y
contrarrestar la resistencia desarrollada por especies nativas (Deist,
Rausch, Fernandez-Luna, Adang, & Bonning, 2014). La alteración de la
43
especificidad y afinidad de unión de toxinas de Bt se puede dividir en
diferentes categorías (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, &
Bonning, 2014). A continuación se presentan tres de ellas:
El intercambio de dominio se encuentra dentro del método más antiguo
utilizado para diseñar toxinas Cry con propiedades novedosas (Deist,
Rausch, Fernandez-Luna, Adang, & Bonning, 2014). Estos grandes
cambios pueden también proporcionar información sobre la función de
los segmentos intercambiados. A modo de ejemplo, los intercambios del
dominio III en las toxinas Cry han implicado a esta región tanto en la unión
de la toxina como en la afinidad hacia la membrana diana (Walters,
deFontes, Hart, Warren, & Chen, 2010). De este modo, el dominio III se
utiliza ampliamente en estos ensayos. El intercambio del dominio III de
las toxinas Cry con otras toxinas Cry se ha utilizado para mejorar la
toxicidad contra plagas de insectos particulares (Karlova, y otros, 2005).
Por lo general ocurre que la sustitución de alguna parte o todo el dominio
III de una toxina de Bt a otra confiere la especificidad de la toxina donante
a la receptora (de-Maag, Weemen-Hendriks, Stiekema, & Bosch, 2000)
(Karlova, y otros, 2005).A modo de ejemplo (Walters, deFontes, Hart,
Warren, & Chen, 2010) realizaron estudios basados en un intercambio
del dominio III, a partir de una toxina activa de Cry1A, de la cual se tomó
su dominio III para intercambiarlo por el de la proteínas Cry3A. Los
resultados arrojaron que alteraba la especificidad de unión de una toxina
Cry3A modificando con coleópteros activos y la toxina hibrida resultante
arrojó una actividad significativa de aproximadamente 94% de mortalidad
contra Diabrotica virgifera (Walters, deFontes, Hart, Warren, & Chen,
2010) según lo descrito hasta la fecha, este es el único caso
documentado de un intercambio exitoso de dominios entre diferentes
toxinas Cry (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, & Bonning, 2014).
44
La mutagénesis sitio-dirigida de las toxinas Cry ha generado
impresionantes resultados frente a la mejora de toxicidad contra de
diferentes insectos (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, & Bonning,
2014). El dominio II ha sido objeto de diferentes modificaciones, puesto
que este dominio es el implicado en reconocer los receptores de la
membrana diana (Schnepf, y otros, 1998). La importancia para estas
modificaciones recae directamente en insectos que poseen una
susceptibilidad frente a este tipo de toxinas, como también a los que no
la poseen (Zhang, Candas, & Griko, 2005). El bucle uno, dos y tres del
dominio II son de particular interés puesto que interactúan con los
receptores en la membrana diana. Estos bucles en específico han sido
objetivos exitosos para la alteración, aunque el éxito de las
modificaciones del bucle parece depender tanto de la toxina como del
insecto diana (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, & Bonning, 2014).
Dentro de los estudios que se han realizado a la fecha, se ha encontrado
que el bucle uno del dominio II de Cry3A se logró alterar, dando como
resultado mutantes que mostraron tres veces mayor toxicidad contra
diferentes tipos de plagas y un aumento en su afinidad a los receptores
de las membranas (Wu, Koller, Miller, Bauer, & Dean, 2000). Estudios
realizados en Cry19Aa resultaron en la modificación del bucle uno y dos
del dominio II, generando de este modo una similitud con Cry4Ba: Las
deleciones del bucle dos del dominio II y la sustitución de los restos del
bucle uno de Cry4Ba en el bucle uno de Cry19Aa dieron como resultado
una toxina mutante, denominada 19AL1L2, esta aumentó 42 veces la
toxicidad frente a A. aegypti (Abdullah & Dean, 2004). Diversos reportes
respaldan la variabilidad de las interacciones de la toxina Cry y las
especies de insectos, un factor importante a considerar cuando se
selecciona una toxina para modificar la actividad contra un insecto en
particular (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, & Bonning, 2014). La
45
mutagénesis sitio-dirigida se ha utilizado con éxito para realizar
modificaciones en células de Bt, siendo una poderosa herramienta para
combatir la resistencia adquirida por diferentes tipos de plagas tales
como Aedes, Anopheles y Culex, haciéndolas más susceptibles a las
diferentes toxinas producidas por Bt. Por otra parte, este enfoque ha
generado información relevante sobre los residuos específicos de la
toxina Cry que interactúan con los receptores de la membrana diana del
insecto, la estabilidad de la proteína en la unión a ella y la formación del
poro lítico (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, & Bonning, 2014).
El uso de péptidos sintéticos y proteínas diferentes a las de Bt es un
enfoque relativamente nuevo, en el que se potencia fácilmente la
toxicidad de las proteínas Cry contra diferentes tipos de vectores que
tienen poca o nula susceptibilidad frente a estas toxinas (Deist, Rausch,
Fernandez-Luna, Adang, & Bonning, 2014). En las primeras
descripciones, se encuentra la fusión de la lectina no tóxica, la cadena β
de ricina, con el C-terminal de Cry1Ac a través de una región enlazadora
de cuatro aminoácidos, todo esto para producir una toxina denominada
BtRB (Mehlo, y otros, 2005). BtRB se expresó en arroz y maíz,
posteriormente se probó contra Chilo suppressalis, S. littoralis y
Cicadulina mbila; estos estudios arrojaron un incremento en la mortalidad
frente Cry1Ac de aproximadamente 17% a 75% en el maíz y de 60% a
90% en el arroz (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, & Bonning,
2014). Este resultado puede reflejar la especificidad de la unión de la
ricina β a los residuos de galactosa y la abundancia de estos residuos en
el intestino del insecto (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, &
Bonning, 2014).
46
6. ESTADO DEL ARTE
El estudio de Bacillus thuringiensis se ha desarrollado por un tiempo
mayor a 100 años desde su descubrimiento en Japón en el año 1901
(Sansinenea, 2012). Diversos autores han logrado establecer a través de
este tiempo de indagación, las asociaciones entre la morfología de los
cristales, secuencias de las proteínas y el peso molecular el efecto
específico frente a su acción insecticida (López-Meza & Ibarra, 1996), las
asociaciones más relevantes entre los principales tipos de proteínas de
Bt y su espectro de actividad insecticida se observan en la tabla 1 (Sauka
& Benintende, 2008).
Tipo de cristal Grupo Peso
Molecular
Toxicidad a
órdenes de
insectos
Cúbico Cry2 65 kDa Lepidópteros y
Dípteros
Bipiramidal Cry1 130 kDa Lepidópteros
Cuadro
aplanado Cry3 72 kDa Coleópteros
Esférico Cry4, Cry4B,
Cry10 y Cry11
135,65,78, 72
kDa Dípteros
Tabla 1. Asociaciones entre los principales tipos de proteínas Cry y su especificidad de acción. (Sauka & Benintende, 2008). Tabla modificada por el autor.
Bti (H14) se ha descrito como la primera subespecie encontrada con
actividad tóxica contra insectos de orden dípteros (Suarez-Barrera,
47
2015). Las proteínas Cry11 varían en pesos alrededor de 67-100 kDa y
son altamente activas frente a diferentes especies de larvas de
mosquitos que son vectores de enfermedades tropicales como la fiebre
amarilla, la malaria y el dengue (Sauka, Monella, & Benintende, 2010).
De acuerdo con la similitud de las secuencias de nucleótidos y el grado
de divergencia filogenética, Cry11 comparte homología entre tres
proteínas (Suarez-Barrera, 2015); Cry11Aa es expresada por Bacillus
thuringiensis subsp. Israelensis (Bti) y fue descrita inicialmente por
(Donovan, Dankocsik, & Pearce, 1988) en un estudio donde se
caracterizaba un gen codificante de una proteína de Bti con un peso
molecular de 72 kDa. Cry11Ba fue reportada por (Delécluse, Rosso, &
Ragni, 1995) como una proteína producida por Bacillus thuringiensis
subsp. Jegathesan (Btjeg), y fue reportada como una proteína de un peso
molecular de 81,293 kDa con alta capacidad toxica frente a larvas de A.
aegypti, C. pipiens y A. stephensi (Likitvivatanavong, Aimanova, & Gill,
2009). Estudios realizados por (Orduz, Realpe, Arango, & Angel, 1998)
reportaron una proteína producida por Bacillus thuringiensis subsp.
Medellin (Btmed) con un peso molecular de 88,2 kDa, esta presentaba
una identidad del 60,9% con Cry11Aa y 83% con Cry11Ba y según su
secuencia aminoacídica, esta fue descrita como Cry11Bb (Sauka,
Monella, & Benintende, 2010).
El dominio II ha sido objeto de grandes modificaciones, debido a que este
participa en la unión a los receptores CDN, ALP Y APN (Schnepf, y otros,
1998). Las modificaciones se han utilizado para mejorar la toxicidad de
toxinas Bt que ya presentan una actividad toxica frente al algún insecto
diana (Wu, Koller, Miller, Bauer, & Dean, 2000), así como contra insectos
no susceptibles (Abdullah, y otros, 2003) (Rajamohan, y otros, 1996). Los
bucles 1,2 y 3 del dominio II resultan de gran interés porque interactúan
48
con los receptores en el intestino medio del insecto. Estos bucles han
sido objeto de modificaciones exitosa en donde, el bucle 1 del dominio II
de Cry3A se alteró, dando como resultado mutantes que mostraron
aumentos significativos en la toxicidad frente L. alamo, así como la
mejoría de unión al receptor de L. decemlineata (Wu, Koller, Miller, Bauer,
& Dean, 2000). Modificaciones en el bucle 1 y bucle 2 del dominio II de
Cry19Aa produjo una mutante similar a Cry4Ba altamente toxica para A.
aegypti (Abdullah & Dean, 2004). Estos resultados reflejaron la
variabilidad de las interacciones de las toxinas Cry con los receptores de
los diferentes insectos diana (Deist, Rausch, Fernandez-Luna, Adang, &
Bonning, 2014).
De acuerdo con las estructuras cristalográficas de las diferentes
proteínas Cry reportadas hasta la fecha (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry2Aa,
Cry3Aa, Cry3Bb, Cry4Aa, Cry4Ba y Cry8E) (Li, Carroll, & Ellar, 1991)
(Suarez-Barrera, 2015) ha sido posible dilucidar que estas proteínas
comparten tres dominios conservados (Hui, y otros, 2012). Estudios
desarrollados con la estructura cristalográfica y las secuencias
aminoacídicas de Cry2Aa en paralelo con Cry11Aa permitió establecer
mediante diversos residuos aminoacídicos las regiones implicadas en
cada una de estas proteínas (Fernández, y otros, 2005); Dando como
resultado que el bucle α-8 de la toxina Cry11Aa, ubicado en el dominio II,
es un epítopo importante implicado en la interacción con el receptor de
las membranas de A. aegypti. El papel del bucle α-8 de Cry11Aa en la
interacción con este receptor se demostró mediante bibliotecas de fagos
y mutagénesis sitio dirigida (Fernández, y otros, 2005).
Posteriormente (Shi, Zeng, Yuan, Sun, & Pang, 2006) realizaron estudios
de la influencia de la proteína accesoria P19 de Bacillus thuringiensis en
49
la proteína cristalina insecticida Cry11Aa, encontrando que esta proteína
accesoria confería una mejor expresión de Cry11Aa en cierta medida y a
su vez generaba una mayor estabilidad de la proteína, lo que se traducía
a un aumento en la toxicidad contra larvas en tercer estadío de A. aegypti
y C. quinquefasciatus.
Estudios de barajado de ADN de los genes de cry11Aa, cry11Ba y
cry11Bb llevados a cabo por el grupo de investigación Biología Molecular
Y Biotecnología de la Universidad De Santander, UDES, generaron una
librería de mutantes, de estas, cinco fueron objeto de estudio para
determinar la toxicidad frente a larvas en primer estadio de A. aegypti
(Suarez-Barrera, 2015). Dentro de los resultados más relevantes de la
investigación, se encuentra la mutante 8Cry11, la cual presentó una
toxicidad 3,8 veces mayor que la parental Cry11Bb y 6 veces mayor que
la parental Cry11Aa. Posteriormente, mediante análisis de docking
molecular se demostró que las posiciones (553F-556W) podrían cumplir
un papel funcional en dominio III, involucrando la estabilidad de la unión
de la toxina al receptor; y en este orden de ideas es como se empleó la
técnica de mutagénesis sitio dirigida para revertir las mutaciones L553F
Y L556W de la variante 8Cry11 (Parra, 2017).
50
7. OBJETIVOS
7.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar la actividad tóxica de las mutantes 8Cry11L553F, 8Cry11L556W,
y 8Cry11L553F-L556W obtenidas por mutagénesis sitio dirigida.
7.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Comparar las secuencias de proteínas de las mutantes
8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W mediante
herramientas computacionales para determinar posibles cambios
estructurales.
2. Establecer las condiciones óptimas para la obtención de cuerpos
parasporales de cepas recombinantes y mutantes de BMB171.
3. Analizar el patrón electroforético de las proteínas obtenidas por
SDS-PAGE y aproximaciones teóricas.
51
8. METODOLOGÍA
8.1 Diseño del estudio:
Estudio de tipo experimental
8.2 Metodología.
Los pasos a seguir en la metodología experimental, se muestran en la
figura 8.
Figura 8. Esquema general del procedimiento utilizado en la metodología.
52
8.2.1 Análisis de secuencias deducidas de las mutantes 8Cry11,
8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W respecto a la parental
Cry11Aa.
Las secuencias deducidas de aminoácidos de las mutantes 8Cry11,
8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W obtenidas a través de la
mutagénesis sitio dirigida por (Parra, 2017) fueron comparadas con las
secuencias de la parental Cry11Aa y la mutante 8Cry11 disponibles en la
laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad de
Santander, a través del software BioEdit 9.0
(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), con el fin de verificar las
posiciones alteradas en cada mutante trabajada e identificar secuencias
de relevancia en la proteína.
8.2.2 Determinación de compoosciones ideales para el medio de
cultivo
El medio de cultivo se determinó a través de tres ensayos realizando
variaciones en las fuentes de nitrógeno de cada medio (Beltrán, y otros,
2008), para establecer cuál de estos presentaba una mayor producción
de la δ-endotoxina. Las composiciones de cada caldo de cultivo se
muestran a continuación:
53
Composición Cantidad (g/L)
Medio 1 Medio 2 Medio 3
C6H12O6 15 15 15
Extracto de levadura 3 1,73 3
Caseína 7 - -
(NH4)2SO4 - 3 7
K2HPO4 1 1 1
KH2PO4 1 1 1
MgSO4 0,3 0,3 0,3
MnSO4 0,01 0,01 0,01
FeSO4 0,01 0,01 0,01
CaCO3 1 - -
CaCl2 - 0,08 0,08
Tabla 2. Composición en g/L de los medios de cultivos evaluados para la producción de la δ-endotoxina.
8.2.3 Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.
Las cepas BMB171 con los constructos (pSV2+: 8Cry11L553F,
8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W) se cultivaron en medio LB
suplementado con cloranfenicol a 6 ppm para realizar su respectiva
activación. Posteriormente se realizó un cultivo de cada una de las cepas
bacterianas en medio glucosa liquida suplementado con cloranfenicol a
6 ppm (50 mL de caldo glucosado en Erlenmeyers de un volumen de 250
mL) en condiciones óptimas para la producción de la δ-endotoxina
(Zouari, Dhouib, Ellouz, & Jaoua, 1998) por un tiempo de 72 horas a
54
temperatura de 30 °C y a una agitación de 200 RPM. Se realizó de los
cultivos finales tinción de verde malaquita para estimar la presencia de
cristales y en paralelo un choque térmico para establecer la cantidad de
esporas producidas por cada mutante, mediante conteo de UFC/mL en
Agar LB suplementado con cloranfenicol a 6 ppm (Elleuch, y otros, 2015).
8.2.4 Obtención de cultivos finales de las cepas bacterianas.
A partir de cada cultivo líquido obtenido, se realizó la obtención de la
biomasa celular mediante centrifugación a 7000 RPM por un tiempo de 7
minutos a temperatura ambiente (Elleuch, y otros, 2015). El
sobrenadante obtenido fue descartado y se recuperó el pellet para su
posterior extracción de proteínas.
8.2.5 Extracción total de proteínas.
Se tomó la biomasa celular de cada mutante por separado y se
solubilizaron en 500 µL de buffer solubilizador que contenía Na2CO3 a
una concentración de 56 mM (pH 11,4) y ditiotreitol 11 mM (DDT) durante
2 horas a 37 °C. El material insoluble se sedimentó mediante
centrifugación a 13200 RPM durante 10 minutos (Brasseur, y otros,
2015). Finalmente, las proteínas solubilizadas y el material insoluble
separados fueron conservados a -80 °C.
8.2.6 Cuantificación de proteínas.
La cuantificación de proteínas se realizó por medio del método de
Bradford (Bradford, 1976), teniendo en cuenta las indicaciones del
55
fabricante (Quick StartTM Bradford Protein Assay, Biorad ®), se utilizó el
protocolo estándar microplato con una curva patrón de gama globulina
con concentraciones de: 0,125; 0,250; 0,500; 0,750; 1; 1,5 y 2 mg/ml.
Para la determinación de proteína total de cada mutante se tomaron 2 µL
de cada muestra y la cuantificación se realizó utilizando el NanoDrop
2000 (Elleuch, y otros, 2015).
8.2.7 Digestión de proteínas Cry con proteasas.
Las proteínas Cry solubilizadas fueron activadas con proteinasa K (20
mg/mL) en una relación 50:1 v/v. La mezcla se incubó bajo una
temperatura de 37 °C y un tiempo controlado de 45 minutos con agitación
constante a 200 RPM (Corrêa, Ardisson-Araújo, Monnerat, & Ribeiro,
2012).
8.2.8 Determinación de los patrones electroforéticos.
La separación de proteínas extraídas y solubilizadas de los cultivos
finales y tratadas con proteinasa K se realizó mediante electroforesis de
proteínas SDS-PAGE siguiendo las recomendaciones publicadas del
libro de protocolos “The Condensed Protocols From molecular Cloning:
A laboratory Manual” (Sambrook & Russell, 2006), en geles de
Acrilamida-Bisacrilamida al 10 y 12%. El revelado del gel se realizó
utilizando azul Coomassie (R-250) (Amresco®), posteriormente la
visualización se realizó mediante el foto documentador Gel Doc (BioRad).
El marcador de peso molecular utilizado fue “Precision plus proteinTM
Standars Dual Color” con un rango proteico de 250 a 10 kDa.
56
8.2.9 Estimación peso seco.
Se realizó tomando 500 µL del cultivo final de cada cepa y se centrifugó
a 14000 RPM a una temperatura de 4 °C por 30 minutos, se descartó el
sobrenadante y se dejó secar por un tiempo de 48 horas a 20°C. Una vez
trascurrido este tiempo se realizó la estimación del peso seco mediante
diferencia de pesos (Suarez-Barrera, 2015).
8.2.10 Ensayos de letalidad.
Los huevos de A. aegypti se eclosionaron en caldo heno al 10% a
temperatura de 25 °C y un tiempo estimado de 24 horas. Los ensayos de
letalidad se realizaron con 10 réplicas, cada replica de dos repeticiones
de 10 larvas en primer estadio de A. aegypti. Para la estimación de
letalidad se realizó recuento de larvas vivas que se tradujo a porcentaje
de larvas muertas (Suarez-Barrera, 2015). Los controles positivos fueron
las parentales Cry11Aa y Cry11Bb; el control negativo fue la cepa de
referencia BMB171.
8.2.11 Consideraciones éticas.
El actual trabajo de investigación no involucró trabajo con seres
humanos, tampoco la manipulación de muestras humanas de ningún tipo
ni pruebas diagnósticas, tratamientos e intervenciones que involucren o
pongan en riesgo la salud y la vida de los seres humanos. Por lo tanto,
no aplican para este trabajo las consideraciones éticas establecidas en
la Declaración de Helsinki, ni el tratado Belmont.
57
De acuerdo a la resolución 8430 de 1993 este trabajo se realizó en
Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad de
Santander, UDES. Este laboratorio cumple los requerimientos
enunciados en el Capítulo I, Artículo 63 respecto a las instalaciones y
sistemas de contención.
Aunque este trabajo implicó la construcción y manejo de ácidos nucleicos
recombinantes, estos se manejaron de acuerdo a las disposiciones del
artículo 74. Su uso es exclusivamente para actividades de investigación
relacionadas con este trabajo o con los proyectos subsecuentes. Todo
material biológico desechado se desnaturalizó, previo a su descarte y
esterilización con el fin de no liberar ningún material biológico al ambiente
58
9. RESULTADOS
Las secuenciaciones aminoacídica deducidas permitieron visualizar los
cambios en las posiciones de interés para cada una de las variantes
estudiadas y la estimación de las posiciones para diversas Hélices- α y
Hojas-β (Figura 9, 10,11).
En ese sentido, para las mutantes 8Cry11L553F y 8Cry11L556W se observa
una sustitución de fenilalanina (F) y triptófano (W) a leucina
respectivamente y para el caso de la mutante 8Cry11L553F-L556W estos
cambios fueron sustituidos en las dos posiciones (Figura 11) (Parra,
2017).
Figura 9. Alineamiento aminoacídico del dominio I de mutantes: 8Cry11, 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W respecto a la parental Cry11Aa.
59
Figura 10. Alineamiento aminoacídico del dominio II de mutantes: 8Cry11, 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W respecto a la parental Cry11Aa.
Figura 11. Alineamiento aminoacídico del dominio III de mutantes: 8Cry11, 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W respecto a la parental Cry11Aa.
Las secuencias de las mutantes 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, 8Cry11L553F-
L556W y 8Cry11 reflejan una deleción de 73 aminoácidos en su extremo
amino y varios cambios en su extremo carboxilo en referencia con la
parental Cry11Aa. Para el caso de las tres mutantes obtenidas por
mutagénesis sitio dirigida con respecto a la mutante 8Cry11 se puede
observar secuencias totalmente conservadas a excepción en las
posiciones mencionadas anteriormente en las alineaciones (Figura 11),
donde esto ocurrió por la reversión (Tabla 3) de citosina a adenina para
60
la mutante 8Cry11L553F, guanina a timina para la mutante 8Cry11L556W y
ambas reversiones para la mutante 8Cry11L553F-L556W.
61
VARIANTE DOMINIO I DOMINIO II DOMINIO III
8Cry11
1-219DEL (ATG…..ACT)
0 DEL 1939 DEL (A)
0 INS 0 INS 0 INS
0 SUS A1192G; A1223C; A1352G; A1361G; C1380G; T1399G.
A1779C; T1887G; T1892G; T1912C; C1917G; G1918T; A1920G; AA1921-1922TT; A1925C; A1935G; C1936T; T1938G.
L553F
1-219DEL (ATG…..ACT)
0 DEL 1939 DEL (A)
0 INS 0 INS 0 INS
0 SUS A1192G; A1223C; A1352G; A1361G; C1380G; T1399G.
A1779C; T1887G; T1892G; T1912C; C1917G; G1918T; A1920G; AA1921-1922TT; A1925C; A1935G; C1936T; T1938G.
L556W
1-219DEL (ATG…..ACT)
0 DEL 1939 DEL (A)
0 INS 0 INS 0 INS
0 SUS A1192G; A1223C; A1352G; A1361G; C1380G; T1399G.
C1659A; A1779C; T1892G; T1912C; C1917G; G1918T; A1920G; AA1921-1922TT; A1925C; A1935G; C1936T; T1938G.
L553F-L556W
1-219DEL (ATG…..ACT)
0 DEL 1939 DEL (A)
0 INS 0 INS 0 INS
0 SUS A1192G; A1223C; A1352G; A1361G; C1380G; T1399G.
A1779C; T1892G; T1912C; C1917G; G1918T; A1920G; AA1921-1922TT; A1925C; A1935G; C1936T; T1938G.
Tabla 3. Cambios en el dominio de las variantes; DEL (deleción); INS (Inserción); SUS (Sustitución). Los análisis se realizaron comparando la secuencia parental Cry11Aa.
62
Cuatro mutantes (8Cry11, 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W)
fueron seleccionadas para los análisis moléculas. El análisis se encaminó
a establecer los porcentajes de identidad y similitud de cada uno al
compararlos con los parentales Cry11Aa. Estos valores fueron
calculados y representados en la matriz MatGat (Tabla 4).
% Identidad
Proteína Cry11Aa 8Cry11 8Cry11L553F-
L556W 8Cry11L553F 8Cry11L556W
Cry11Aa 86,8 87,1 86,9 86,9
8Cry11 87,7 99,8 99,8 99,8
8Cry11L553F-
L556W 87,9 99,8 99,8 99,8
8Cry11L553F 87,7 100 99,8 99,6
8Cry11L556W 87,9 99,8 100 99,8
% Similitud
Tabla 4. Tabla porcentaje de identidad y similitud, de mutantes empleados en esta investigación.
La mutante 8Cry11 presentó un porcentaje de identidad de 86,8% y un
porcentaje de similitud de 87,7%. En contraste con la parental Cr11Aa, la
mutante 8Cry11L553F presentó un porcentaje de identidad de 86,9% y un
porcentaje de similitud de 87,7%, la mutante 8Cry11L556W presentó un
porcentaje de identidad de 86,9% y un porcentaje de similitud de 87,9%
y finalmente la mutante 8Cry11L553F-L556W presentó un porcentaje de
identidad de 87,1% y un porcentaje de similitud de 87,9%. Las tres
mutantes (8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W) en comparación
con la mutante 8Cry11 presentaron un porcentaje de identidad y similitud
mayor al 99%.
63
La evaluación de los tres medios de cultivos está consignado en la tabla
5, la cual arrojó diferentes concentraciones de proteínas, estos
resultados permiten evidenciar que las relaciones más significativas para
la producción de la δ-endotoxina se encuentran relacionadas con el
medio de cultivo con fuentes de nitrógeno orgánicos e inorgánicos, que
corresponde al medio N° 3 con un promedio de producción de proteína
de 76 mg/mL.
Concentración de proteínas (mg/mL)
Mutante Medio 1 Medio 2 Medio 3
8Cry11L553F 1,56 14,16 103,6
8Cry11L556W 2,13 16,65 89,65
8Cry11L553F-L556W 2,12 15,38 79,24
8Cry11 3,04 50,21 93,23
Cry11Aa 2,05 19,87 37,69
Cry11Bb 1,79 23,36 68,7
BMB171 1,89 29,65 56,65
Tabla 5. Cuantificación de proteínas obtenidas de cada medio de cultivo evaluado.
64
Las esporas se observaron en todas las mutantes, las cuales se ubicaron
en posición subterminal. La presencia de cuerpos parasporales se
presentó en la mayoría de mutantes, a excepción del control negativo
BMB171 (Figura 12) y estas se observaron cómo incrustaciones
circulares rojas.
El conteo de células viables para cada una de las mutantes y controles
fue mayor a 1x109 unidades formadoras de colonia por cada mililitro
(Tabla 6).
Figura 12. Tinción de verde malaquita más safranina. Las esporas se visualizan de color verde, los cristales se observan como inclusiones de color rojo en el medio.
65
Conteo de Viables
Mutante Conteo (UFC/mL)
8Cry11L553F 4,70x1010
8Cry11L556W 3,20x1010
8Cry11L553F-L556W 7,90x109
8Cry11 9,00x1010
Cry11Aa 2,10x1010
Cry11Bb 4,20x1010
BMB171 3,80x1010
Tabla 6. Conteo de células viables de mutantes trabajadas en esta investigación, expresadas en unidades formadoras de colonia por mililitro.
La estimación del peso seco estuvo entre 0.023 y 0.061 g/mL. Los pesos
obtenidos se observan en la tabla 7.
66
Muestra Peso Total
(g) Peso Seco (g/0,3mL)
Peso Sobrenadante(mg/mL)
8Cry11L553F 0,479 0,033 1487
8Cry11L556W 0,460 0,037 1410
8Cry11L553F-
L556W 0,481 0,061 1400
8Cry11 0,490 0,059 1437
Cry11Aa 0,495 0,023 1573
Cry11Bb 0,496 0,041 1517
BMB171 0,465 0,044 1403
Tabla 7. Promedio de la estimación del peso seco por cada 0,3 ml de cultivo de mutantes. El peso seco se expresó en mg/mL.
La cuantificación de proteínas obtenidas mediante el método de
Bradford, arrojó valores de proteínas entre 12.32 y 40.74 mg/mL (Tabla
8), mediante estos resultados y el peso seco estimado anteriormente se
determinó la proporción de proteína usada de cada mutante (8Cry11L553F,
8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W) para el ensayo de toxicidad grueso
(Tabla 8).
Tabla 8. Cuantificación de proteínas de mutantes empleando el método de Bradford.
Cepa Peso
Sobrenadante (mg/mL)
Concentración proteína
solubilizada (mg/mL)
Proporción Peso:
Proteína
8Cry11L553F 1487 40,740 36:1
8Cry11L556W 1410 25,870 55:1
8Cry11L553F-
L556W 1400 12,320 114:1
8Cry11 1437 31,329 46:1
Aa 1573 12,949 121:1
Bb 1517 27,184 56:1
BMB171 1403 34,478 41:1
67
Se verificó el patrón electroforético de las proteínas mediante SDS-PAGE
al 10% (Figura 13). Las muestras teñidas con azul de Coomassie R-250
se logran visualizar en el bandeo cercano a los 100 kDa, como se
observa en el recuadro rojo. Para el caso específico de la mutante
BMB171, no presentó bandeo de la proteína Cry11 debido a que era el
control negativo y esta mutante no posee la capacidad de producir dicha
proteína.
Posteriormente de la verificación del patrón electroforético de las
protoxinas de las mutantes, se verificó su activación mediante proteinasa
K, hallando como resultado un doble bandeo para cada mutante entre 32
y 34 kDa, permitiendo evidenciar la activación de la protoxina a toxina
(Figura 14).
Figura 13. SDS-Page 10 %, de las mutantes y el parental Cry11Aa. Se empleó 15 µg de proteína por pozo. (1) marcador de peso molecular, (2) BMB171, (3) 8Cry11L553F, (4) 8Cry11L556W, (5) 8Cry11L553F-L556W, (6) 8Cry11 (7) Cry11Aa,
68
Para la determinación de toxicidad de cada una de las mutantes contra
larvas de primer estadio de A. aegypti, se realizó un ensayo preliminar
(Tabla 9). Se encontró que la variante 8Cry11 tuvo 100% de letalidad
comparada con las mutantes 8Cry11L553F (1%), 8Cry11L556W (No tóxica),
8Cry11L553F-L556W (2%) (Tabla 13).
Figura 14. SDS-Page 12 %, de las mutantes y el control negativo BMB171 activados con proteinasa K. Se empleó 19 µL de proteína + 1 µL de proteinasa K por pozo. (1) Cry11Aa, (2) 8Cry11 (3), 8Cry11L553F-L556W (4) 8Cry11L556F, (5) 8Cry11L553F (6) BMB171,(7) marcador de peso molecular.
69
Las mutantes 8Cry11, Aa y la cepa de Bt que expresa Cry11Bb (mutante
Bb) fueron las mutantes con mayor actividad tóxica, siendo estas los
controles positivos. Las tres mutantes 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y
8Cry11L553F-L556W presentaron una actividad tóxica despreciable o nula.
La mutante BMB171 se utilizó como control negativo debido a que esta
no posee la capacidad de producción de la proteína Cry11.
Mutante Concentración Proteína (ng/ml)
Larvas Vivas
(0 horas)
Larvas vivas (24
Horas)
Porcentaje de
letalidad
8Cry11L553F 11x105 100 99 1%
8Cry11L556W 47x104 100 100 0%
8Cry11L553F-
L556W 10x104 100 98 2%
8Cry11 69x104 100 0 100%
Aa 11x104 100 2 98%
Bb 48x104 100 5 95%
BMB171 83x104 100 98 2%
Control Medio
- 100 96 -
Tabla 9. Resultados obtenidos en el ensayo grueso para las mutantes y los parentales para determinar la letalidad contra larvas de primer estadio de A. aegypti.
70
10. DISCUSIÓN
Diversas estrategias de mejoramiento genético de proteínas Cry han
demostrado ser de gran interés, debido a que estas representan una
herramienta para generar información que permita entender la estructura,
función y forma de acción de las mismas, métodos de mejoramiento
como el barajado de ADN, el truncamiento de toxinas, la modificación de
sitios de clivaje, el intercambio de dominios, la adición de péptidos y
librerías de fagos son ejemplo de ello (Deist, Rausch, Fernandez-Luna,
Adang, & Bonning, 2014). En el actual estudio se presenta un análisis
molecular y determinación tóxica frente a larvas en primer estadio de A.
aegypti de las mutantes 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W
obtenidas a través de mutagénesis sitio dirigida.
La mutante 8Cry11 fue obtenida mediante mejoramiento genético de
proteínas a través de barajado de ADN, arrojando como resultado una
variante con una tasa de mutación del 13% respecto al dominio I (Tabla
2) generando una deleción de un fragmento al extremo amino de 8,0 kDa
en contraste con la parental Cry11Aa (Suarez-Barrera, 2015); para el
caso del dominio II las sustituciones se realizaron específicamente en el
bucle 3 (T453A, R456G y P462R), las cuales no habían sido descritas
antes en las toxinas Cry11; finalmente para el dominio III se encontraron
nueve sustituciones, indicando la mayor variabilidad respecto a los
demás dominios (Tabla 3) (Suarez-Barrera, 2015). Los ensayos de
letalidad arrojaron un aumento de 6,09 veces respecto a la parental
Cry11Aa y a pesar de esto, no se conoce información de cómo las
sustituciones generadas en el dominio III de Cry11 pueden generar
efectos de toxicidad contra larvas de A. aegypti. Por otro lado, análisis de
71
docking molecular lograron demostrar que los residuos aminoacídicos
ubicados en las posiciones 553 y 556 del dominio III podrían desempeñar
un rol importante respecto a funciones de estabilidad de unión de la
toxina al receptor diana de las membranas del intestino (Parra, 2017).
Las mutantes 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W se obtuvieron
por técnicas de mejoramiento genético de proteínas mediante
mutagénesis sitio dirigida realizando cambios en posiciones
aminoacídicas 553 y 556 (Figura 10) arrojados por el docking molecular
específicamente en el dominio III localizados entre los bucles β-16 y β-
17 (Parra, 2017) sustituyendo una fenilalanina por una leucina para el
caso dela mutante 8Cry11L553F y un triptófano por una leucina para el
caso de la mutante 8Cry11L556W. Los dominios II y III permanecieron
intactos con referencia a la 8Cry11 (Figura 8 y 9).
La comparación de secuencias aminoacídicas arrojó un análisis
molecular de las mutantes 8Cry11, 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y
8Cry11L553F-L556W en donde se logró determinar un alto porcentaje de
identidad con respecto a la parental Cry11Aa (Tabla 4). De igual forma
las variantes obtenidas mediante mutagénesis sitio dirigida presentaron
un alto porcentaje de identidad y similitud con respecto a la mutante
8Cry11 siendo esta mayor al 99% en todos los casos, confirmando de
este modo el trabajo reportado por (Parra, 2017).
En la actual investigación las condiciones óptimas para la obtención de
cultivos finales se establecieron tomando en cuenta las fuentes de
carbono, nitrógeno orgánico e inorgánico. Datos evidenciados por
(Zouari, Dhouib, Ellouz, & Jaoua, 1998) (Elleuch, y otros, 2015) sugieren
que una alta concentración de glucosa (15g/L) como fuente de carbono
72
es esencial para la producción de las δ-endotoxinas producidas por Bti,
de igual modo (Beltrán, y otros, 2008) reportan que el establecimiento del
uso de fuentes de nitrógeno orgánico e inorgánico en diferentes
proporciones es un factor relevante para la producción independiente de
biomasa celular, esporas y/o δ-endotoxinas; las proporciones No/Ni
ideales para la producción de toxinas son recomendadas como 3:7. Es
relevante resaltar que condiciones óptimas para la obtención las δ-
endotoxinas son cruciales, debido a que no cualquier formulación de
medio de cultivo proporciona una concentración adecuada de toxinas
(Beltrán, y otros, 2008), con lo cual posibilita caer en errores en
momentos de pruebas de toxicidad (Corrêa, Ardisson-Araújo, Monnerat,
& Ribeiro, 2012) (Elleuch, y otros, 2015).
Los patrones electroforéticos obtenidos de las mutantes 8Cry11L553F,
8Cry11L556W y 8Cry11L553F-L556W arrojaron bandeos proteicos con pesos
moleculares aproximados a 100 kDa (figura 13), sugiriendo de este modo
la presencia de Cry11 en cada una de estas variantes; información que
es contrastada con estudios realizados por (Suarez-Barrera, 2015) en
donde el peso molecular para la protoxina Cry11 producida por la variante
8Cry11 también arrojó un bandeo proteico de este peso. Por otra parte
los bandeos electroforéticos obtenidos de las toxinas activas con
proteinasa K arrojaron bandeos de pesos moleculares de 32 y 34 kDa,
confirmando de este modo la presencia de Cry11 (figura 14);
experimentos realizados por (Fernández, y otros, 2005) (Xu, Nagai,
Bagdasarian, Smith, & Walker, 2001) (Shi, Zeng, Yuan, Sun, & Pang,
2006) sugieren que la toxina Cry11Aa en su forma activa presenta pesos
moleculares iguales a los reportados anteriormente.
73
Los análisis de toxicidad para determinar si los residuos aminoacídicos
reversados en el dominio III eran de relevancia fueron realizados
mediante un ensayo grueso de toxicidad (Lacey, 1997) en comparación
con la mutante 8Cry11 y la parental Cry11Aa (Tabla 9). Las mutantes
8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W no presentaron toxicidad
frente a las larvas de A. aegypti en el presente estudio después de 24
horas; 8Cry11 presentó una mortalidad del 100% de las larvas al igual
que la parental Cry11Aa con una concentración de inoculo exponencial
similar en todo el experimento, indicando que las mutantes con las
reversiones en los residuos aminoacídicos 553 y 556 poseen una menor
actividad tóxica a las mutantes utilizadas como punto de referencia.
Estudios realizados por (Suarez-Barrera, 2015) demostraron que la
concentración letal media para la mutante 8Cry11 corresponde a 6,05
ng/mL y para la parental Cry11Aa fue de 36,90 ng/mL con una
confiabilidad del 95%. Este aumento en la toxicidad fue atribuida y
relacionada mediante reportes realizados por (Mandal, y otros, 2007) en
donde proteínas relacionadas con Cry11 como Cry2A, gracias a la
ausencia de aminoácidos en el extremo animo terminal de la proteína,
aumenta la toxicidad de 4,1 a 6,6 veces contra insectos del orden
lepidóptero; también se relacionó este aumento de toxicidad por las
modificaciones realizadas en el dominio II, donde el bucle 3 sufrió una
sustitución en 3 residuos aminoacídicos, información que fue comparada
con estudios realizados por (Abdullah, y otros, 2003) donde al realizar
cambios en el bucle 3 de la proteína Cry4Ba la toxicidad aumenta 1,38
frente insectos del orden díptero. A pesar de que se tiene esta
información de ante mano, no existe evidencia del comportamiento de las
proteínas Cry11 en el momento de realizar sustituciones en el dominio III
con efectos en la toxicidad frente A. aegypti. Las sustituciones realizadas
en 8Cry11 (Tabla 3) sugieren que el aumento de toxicidad es debido al
74
dominio III puesto que es donde más variación se presenta con la
parental Cry11Aa en conjunto con el dominio II (Suarez-Barrera, 2015).
Las mutantes de interés presentaron una concentración letal media de la
siguiente manera: 8Cry11L553F >110000 ng/mL, 8Cry11L556W >47000
ng/mL y 8Cry11L553F-L556W >10000 ng/mL. Estos resultados en contraste
con la mutante 8Cry11 permiten inferir que los residuos aminoacídicos
sustituidos en las regiones β-16 y β-17 del dominio III presentan
relevancia en el aumento de la toxicidad de 8Cry11 en comparación con
la parental Cry11Aa.
Aminoácidos como la fenilalanina y el triptófano presentan características
químicas diferentes a la leucina. Para el caso de esta última, su
conformación está dada mediante cadenas laterales alifáticas (Baynes &
Dominiczak, 2011); por el contrario la fenilalanina y el triptófano, son
aminoácidos que están conformados con anillos aromáticos (Devlin,
2004), se encuentran involucrados en las interacciones hidrofóbicas y
tienden a estar posicionados en el centro de una proteína, excluidos del
solvente permitiendo una mayor estabilidad y función de la misma (Sosa-
Peinado, 2014).
Estudios realizados por (Fernández, y otros, 2005) demostraron que la
toxicidad de Cry11Aa se vio afectada al realizar sustituciones
aminoacídicas mediante mutagénesis sitio dirigida de residuos
hidrofóbicos (Alanina) por residuos hidrofílicos como el ácido glutámico.
Por otra parte, describe que los bucles encargados de unión a los
receptores de la membrana presentan mayor afinidad de unión al tratarse
de regiones hidrofóbicas, puesto que al estar expuestas al solvente, sus
propiedades químicas se continúan conservando. De igual modo,
75
estudios basados en el bucle 3 de la proteína Cry1Ab realizaron una
sustitución de fenilalanina por una Alanina, generando una reducción
significativa de la actividad toxica (3,5 veces) hacia insectos del orden
lepidóptero, debido a que las uniones a los receptores presentes en la
membrana del insecto no se presentaban debido a que la Alanina al
poseer dentro de sus características químicas una cadena alifática,
dificulta la generación de puentes de hidrogeno entre la proteína y el
receptor; caso diferente al tratarse de un aminoácido con características
químicas aromáticas como lo es la fenilalanina (Rajamohan, y otros,
1996). Por otra parte, (Tiewsiri & Angsuthanasombat, 2007) informó una
disminución alta de la toxicidad frente A. aegypti al realizar sustituciones
de Alanina en las posiciones donde se encontraban aminoácidos
aromáticos (tripsina, tirosina y fenilalanina) en los residuos 243, 249 y
264 respectivamente, ubicados en la hélice α-7, lo cual sirvió para
confirmar que los residuos aromáticos se encuentran involucrados en los
aumentos o disminuciones de toxicidad.
La capacidad de unión del receptor de las toxinas Cry se atribuye
principalmente al dominio II en lugar del dominio III, aunque este último
puede estar involucrado en la unión (Likitvivatanavong, Aimanova, & Gill,
2009). Diversos reportes han demostrado que el dominio III de varias
toxinas Cry también se encuentra involucrado en la unión al receptor
(Lee, You, Gould, & Dean, 1999) (de-Maag, Weemen-Hendriks,
Stiekema, & Bosch, 2000). A modo de ejemplo, la sustitución del dominio
III en Cry1Ab y Cry1Ac con el dominio III de Cry1Ca, dio como resultado
un aumento aproximado de 10 veces en la toxicidad hacia S. exigua y el
reconocimiento de las proteínas receptoras presentes en las membranas
del insecto (de-Maagd, y otros, 1996). Por otra parte (Mushtaq, Shakoori,
& Jurat-Fuentes, 2018) diseñaron una toxina hibrida que compartía los
76
dominios I y II de Cry1Ac (sitios activos para A. gemmatalis y C.
includens), y el dominio III de Cry2Ac7 con el fin de generar una nueva
proteína con una toxicidad aumentada contra ambas especies; los
resultados indicaron que la toxicidad contra A. gemmatalis y la unión a
sus receptores de membrana se mantenían, caso diferente ocurrió con
C. includens en donde se encontró que la mortalidad era nula frente a
este tipo de plaga y la unión a los receptores de la membrana no se
presentaba, sugiriendo que el dominio III de Cry1Ac se encontraba
involucrada en la unión a los receptores de la membrana del insecto.
En base a los datos recopilados en esta investigación puede encontrarse
una relación en la disminución de la actividad toxica de las mutantes
8Cry11L553F, 8Cry11L556W y 8Cry11L553F-L556W frente al control de larvas de
primer estadio de A. aegypti; al igual del motivo por el cual el aumento de
la toxicidad de la mutante 8Cry11 en comparación con la parental
Cry11Aa, puesto que la sustitución de residuos aminoacídicos de
naturaleza aromática por otros de naturaleza alifática tienden a presentar
problemas en los procesos de unión de la toxina al receptor de la
membrana de los insectos diana (Rajamohan, y otros, 1996) (Tiewsiri &
Angsuthanasombat, 2007); de igual modo, diversos estudios sugieren
que modificaciones realizadas en el dominio III, afectan directamente la
toxicidad frente a diferentes tipos de insectos (Mushtaq, Shakoori, &
Jurat-Fuentes, 2018).
77
11. CONCLUSIONES
Las condiciones de cultivo establecidas para obtención de las mutantes
descritas en este trabajo fueron exitosas y se logró concluir que es de
relevancia una concentración específica de nutrientes para la obtención
del material de estudio en cuestión; es decir, una alta producción de
biomasa celular no garantiza la producción de toxinas en igual
proporción. Las variaciones realizadas en las fuentes de carbono y de
nitrógeno orgánico e inorgánico (3:7) permitieron establecer una
formulación óptima para el medio de cultivo y la producción de la δ-
endotoxina en mayor proporción. De igual manera, los patrones
electroforéticos arrojaron bandeos de proteínas entre 70 y 100 kDa
confirmando la presencia de las proteínas Cry11, lográndose concluir que
cada mutante ensayado en el actual estudio presentaba la capacidad de
expresar la proteína de interés.
Los ensayos de toxicidad demostraron que las mutantes 8Cry11L553F,
8Cry11L556W Y 8Cry11L553F-L556W obtenidas a través de mutagénesis sitio
dirigida presentaron una actividad tóxica menor frente la mutante 8Cry11
y la parental Cry11Aa para con el control de larvas de primer estadio de
A. aegypti. Esta información es relevante, debido a que aporta
conocimiento frente al comportamiento de las mutantes con las
sustituciones en el dominio III; cambios específicos de aminoácidos con
características aromáticas por otros con características alifáticas en las
posiciones 553 y 556 de la mutante 8Cry11.
Finalmente, la información recolectada en esta investigación permitió
dilucidar la importancia de la modificación de proteínas Cry11 mediante
78
el uso de herramientas moleculares (barajado molecular y mutagénesis
sitio dirigida), en posiciones aminoacídicas específicas que actúan en la
interacción de los receptores CDN, APL Y APN de los insectos. Las
mutantes 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, 8Cry11L553F-L556W permitieron reportar
que los cambios realizados en los residuos aminoacídicos en la mutante
8Cry11 respecto a la parental Cry11Aa se encuentran implicados en la
ganancia de toxicidad de esta proteína modificada.
79
12. RECOMENDACIONES
Las mutantes 8Cry11L553F, 8Cry11L556W, y 8Cry11L553F-L556W estudiadas en
el actual proyecto representan relevancia para la recolección de
información del comportamiento de las proteínas Cry11 frente al
comportamiento de su toxicidad en A. aegypti. Estas mutantes pueden
ser candidatas para ensayos futuros de toxicidad frente a diferentes tipos
de insectos del orden díptera para conocer su efecto tóxico frente a otro
géneros de insectos tales como Culex quinquefasciatus y Anopheles
albimanus que sirven de referencia para otros estudios con proteínas
Cry11. Por otro lado, se sugiere estudiar dichas mutantes a través de
ensayos de Western Blot para identificar la expresión de la proteína
Cry11 mediante una técnica más afín para la identificación de proteínas.
En último lugar, se recomienda el uso de herramientas moleculares para
el cambio de posiciones aminoacídicas en bucles específicos del dominio
II y dominio III, puesto que estos son los encargados de la interacción
con los receptores de membrana; generando una mayor letalidad frente
a los diferentes insectos dianas.
80
13. BIBLIOGRAFÍA
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