análisis de flavonoides en plantas medicinales por

Análisis de Flavonoides en plantas medicinales por electroforesis capilar y determinación de su actividad biológica

I

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN.

Para aspirar al título de

INGENIERO FARMACÉUTICO

Presentado por:

MEZA OLMEDO ANE-JO MARIANA

“Análisis de flavonoides en plantas medicinales por electroforesis capilar y determinación de su actividad bilógica.”

DIRECTOR DEL PROYECTO:

QFB. MARIA ESTHER BAUTISTA RAMIREZ


II


III

Agradecimientos

A mis padres:

Muchas gracias por todo su apoyo y comprensión, por tener confianza y fe en mí, por ser pilar y

modelo a seguir, por alentarme a nunca darme por vencida y seguir mis sueños.

A ti mami muchas gracias por todos esos días de desvelo en los que me hiciste compañía, por

cuidar de mi y simplemente por ser maravillosa.

A ti papá por darme tu apoyo incondicional e impulsarme a siempre terminar lo que inicio, por tu

comprensión en los momentos difíciles.

A mi hermano:

Muchas gracias Andrés por ser mi hermano y mi entrañable amigo, por escucharme y aconsejarme

cuando más lo necesité, por ser mi confidente y cómplice, y nunca dejarme sola.

A mis amigos:

Gracias a mis amigos, estaría de más mencionarlos porque de ante mano saben quiénes son,

muchas gracias por hacer más grato esté viaje, por todas las alegrías y tragos amargos que

pasamos juntos, por su apoyo durante la carrera y por brindarme una amistad sincera.

A mi solecito

Por su gran amor, comprensión y apoyo por ser la luz que me guía, por su ayuda, paciencia y amor

por ser una inspiración, a ser cada día mejor y por el gran cambio que represento para mí, durante

esta etapa. Muchas gracias por todo lo que me das.

Agradecimiento especial.

Le estoy muy agradecido a la Q.F.B. Bautista Ramírez María Esther que me permitió desarrollar este

proyecto y que además me apoyo durante su realización y también Dr, Gustavo Valencia del Toro,

por su apoyo y dedicación por compartir sus conocimientos y dedicarme tiempo.


IV

El presente trabajo se llevo a cabo en el Laboratorio de Farmacología del

Departamento de Bioprocesos en la Unidad Profesional Interdisciplinaria de

Biotecnología (UPIBI), del Instituto Politécnico Nacional ubicada en , Av.

Acueducto s/n Barrio la Laguna Ticomán, México CP 07240; bajo la dirección de la

QFB. María Esther Bautista Ramírez. El trabajo contó con el apoyo de la

Secretaria de Investigación y Postgrado (SIP).


V

INDICE DE CONTENIDO

0. Resumen……………………………………………………………………………….. VIII

1. Antecedentes………………………………………………………………………….. 1

1.1. Introducción ……………………………………….……………………………………..

1.2. Radicales Libres……………………………………………………………………….

1.3. Antioxidantes…………………...………………………………………………………..

1.4. Flavonoides……………………………………………………………………...............

1.5. Síntesis, Absorción y Metabolismo……………………………………………………

1.6. Acción Antioxidante De Los Flavonoides……………………………………………..

1.7. Descripción Jacaranda mimosifolia (jacaranda)…………………………………..

1.8. Descripción Amphiterygium adstringensis Schiede (cuachalalate)………………...

1.9. Descripción Agastache Mexicana Toronjil morado ………….….…………………..

1.10. Descripción Waltheria indica (tapa Cola) ……………………………………….

1.11. Descripción Salvia gilliesii Benth (salvia morada) ……………………………….

1.12. Fundamento Teórico de la Metodología……………………………………...

1.12.1. Extracción por sonicación…….……..……………………………………..

1.12.2. Cuantificación de Fenoles Totales………………………………………..

1.12.3. Cuantificación de Flavonoides Totales…………………………………...

1.12.4. Método ABTS……………………..…………………………………………

1.12.5. Identificación por Electroforesis capilar………………………………......

1.12.5.1. Electroforesis micelar….………………………………………………

1.12.5.2. Principales ventajas de la Electroforesis Capilar……………………

1.11.6 Actividad antimicrobiana……………………………………………………

1.13. 1.11.6.1 Fundamento sensidiscos…………………………………………….

1

1

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18

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3. Justificación………………………………………………………………………… 20

4. Objetivos……………………………………………………………………………….. 20


VI

5.Metodología……………………………………………………………..................

5.1. Materiales y reactivo………………………………………………………….

5.2. Extracción de flavonoides por sonicación…………………………………

5.3. Cuantificación de fenoles totales……………………………………………

5.4. Cuantificación de Flavonoides Totales………………………………………

5.5. Método ABTS……………………………………………………………………

5.6. Actividad Antimicrobiana………………………………………………………

5.6.1Preparación del inoculo………………………………………………………

5.6.2 Método sensidisco en placa…………………………………………………

5.7 Identificación por electroforesis capilar micelar………………………………

21

21

21

22

22

23

24

24

24

25

6 Resultados y discusión…………………………………………………………….… 27

6.1 Cuantificación de fenoles y flavonoides totales…………………………

6.2 Determinación de la capacidad antioxidante utilizando el radical ABTS

6.3 Actividad antimicrobiana ……………………………………………………

6.4 Identificación de flavonoides por electroforesis capilar…………………

31

33

35

35

7 Conclusiones………………………………………………………………………...... 39

8. Recomendaciones para el trabajo futuro………………………………………… 39

9. Referencias…………………………………………………………………………….. 40

10. Anexos………………………………………………………………………………….. 43

Anexo 1 – Cálculos……………………………………………………………………. 43

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Clasificación de los tipos de antioxidantes……….……………….……….. 3

Tabla 2. Estructura básica de los grupos de flavonoides…………………….…… 6

Tabla 3. Plantas utilizadas para realizar los extractos …………………………… 21

Tabla 4. Estándares de flavonoides utilizados en la electroforesis capilar………… 26

Tabla 5. Concentración de fenoles totales ………………………………….………... 27

Tabla 6. Concentración de flavonoides totales………………….…………………… 29

Tabla 7. Capacidad Antioxidante obtenida por el radical ABTS.…………………… 32


VII

Tabla 8. Halos de inhibición para los diferentes microorganismo……………..…… 34

Tabla 9. Concentración de las muestras en equivalentes de cefalosporina……… 34

Tabla 10 Flavonoides identificados en los extractos…………………………………... 38

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Ruta biosintética de los flavonoides y relación con otros productos……………………. 4

Figura 2. Estructura básica y tipos de Flavonoides………………………………………………… 5

Figura 3. Árbol de Jacaranda…………………………………………………………………………. 10

Figura 4. Tronco de cuachalalate……………………………..….……………………………………. 11

Figura 5. Corteza seca del cuachalalate……..…………………………………………………….. 11

Figura 6. Flor toronjil morado…………………………………………………………………. 12

Figura 7. Planta toronjil morado.……………………………………………………………... 12

Figura 8. Flor tapa cola……………..………………………………………………………….. 13

Figura 9. Planta Tapa Cola donde se observa su estructura general………………………….. 13

Figura 10. Planta Salvia morada.…………………………………………………………………. 14

Figura 11. Flor Salvia morada…………………………..………………………………………….. 14

Figura 12. Reacción de formación del Radical ABTS……………………………………... 17

Figura 13. Curva Tipo de Ácido Cafeico para la cuantificación de fenoles totales……… 27

Figura14. Gráfico de la concentración de fenoles totales…………………………………. 28

Figura 15. Curva Tipo de Rutina para la cuantificación de flavonoides totales………….. 29

Figura 16. Gráfico de la concentración de flavonoides totales……………………………. 30

Figura 17. Curva Tipo de Vitamina C utilizando el Radical ABTS………………………… 31

Figura 18. Curva Tipo de Trolox utilizando el Radical ABTS……………………………… 31

Figura 19. Curva Tipo de la inhibición del microorganismo de E. Coli.……………………………... 33

Figura 20. Electroferograma de la mezcla de los estándares de flavonoides………………… 35

Figura 21. Electroferograma de tallo de salvia……………………………………………………… 36

Figura 22. Electroferograma de tallo de toronjil…….………………..……………………………. 36

Figura 23.

Figura 24.

Figura 25.

Electroferograma de flor jacaranda…….……………………………………………..

Electroferograma de hoja salvia……………………………………………………………

Electroferograma de hoja toronjil……………………………………………………………

37

37

38


VIII

“Análisis de flavonoides en plantas medicinales por electroforesis capilar y determinación de su actividad

biológica.”

Meza Olmedo Ane-jo Mariana , Bautista Ramírez María Esther.

Departamento de Bioprocesos. Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología del IPN, Av. Acueducto s/n Barrio

la Laguna Ticomán, México 07240, México.

Palabras clave: Capacidad Antioxidante, Flavonoides, Electroforesis capilar, Actividad antioxidante, de Jacaranda

mimosifolia, Amphiterygium adstringensis Schiede , Agastache mexicana, Waltheria indica, Salvia gilliesii Benth.

Introducción. Las plantas son una de las principales fuentes de compuestos con

actividad farmacológica, entre estos, podemos destacar a los flavonoides, que son

un grupo de metabolitos secundarios que se caracterizan por poseer propiedades

terapéuticas tales como, antisépticas, cardiotónicas, anticancerígenas,

antitrombóticas, antimicrobianas, antiinflamatorias, antioxidantes entre otras, lo

que provoca un interés particular en su estudio. Es importante caracterizar e

identificar los compuestos responsables de cierto efecto terapéutico en las plantas

por lo que se han desarrollado técnicas y métodos que nos facilitan determinar

estas actividades, en el presente trabajo, se determinara la cantidad de fenoles

totales, flavonoides totales y la capacidad antioxidante de los extractos cetónicos

obtenidos de plantas con uso medicinal, así como la identificación de algunos

compuestos de flavonoides por medio de electroforesis capilar.

La cuantificación de fenoles totales y flavonoides totales se realizaron a partir de

extractos cetónicos obtenidos de las hojas de Jacaranda mimosifolia (jacaranda),

Amphiterygium adstringensis Schiede (cuachalalate), Agastache mexicana

(Toronjil morado), Waltheria indica (Tapa cola), Salvia gilliesii Benth (Salvia

morada ), así como determinar la capacidad antioxidante aplicando los métodos

ABTS; determinar su capacidad antimicrobiana y finalmente identificar algunos

compuestos de flavonoides en cada extracto por electroforesis capilar.

Objetivos. Cuantificar la concentración de fenoles totales y flavonoides totales a

partir de los extractos obtenidos de las plantas de Jacaranda mimosifolia

(jacaranda), Amphiterygium adstringensis Schiede (cuachalalate), Agastache

mexicana (Toronjil morado), Waltheria indica (Tapa cola), Salvia gilliesii Benth

(Salvia morada ), así como determinar la capacidad antioxidante aplicando los

métodos ABTS, probar su actividad antimicrobiana; y finalmente identificar

algunos compuestos de flavonoides en cada extracto por electroforesis capilar.

Metodología Se utilizaron como muestra las plantas jacaranda, cuachalalate,

tapa cola, toronjil y salvia morada las cuales se colocaron a secar durante 3 días,

se molieron, posteriormente se pesó 1 g de cada muestra y se mezcló cada una

con una solución de acetona al 70%, se sometió a sonicación durante 30

minutos, se filtró y finalmente se eliminó solvente con un rotavapor para remover

la acetona. Para la determinación de fenoles totales, se tomó 200 µL de cada

muestra diluida 1:100 y se aplicó la técnica de Folin-Ciocalteu utilizando como

estándar ácido cafeico; en cuanto la determinación de flavonoides totales también

se tomó una muestra de 200 µL diluida 1:100 y se aplicó el método con AlCl3

para el cual se aplicó como estándar el flavonoide rutina. La capacidad

antioxidante se determinó utilizando los radicales 2,2-Azinobis-3-Etilbenzotiazolin-

6-Ácido Sulfónico (ABTS) para el método ABTS se preparó el radical al 7 mM

con agua destilada y se mezcló con una solución de persulfato de potasio 2.45

mM, se dejó en reposo en la oscuridad durante 16 horas y posteriormente se

diluyó con etanol hasta obtener una absorbancia 0.7 (+ 0.01) a una longitud de

754 nm , se tomó como estándar la Vitamina C y el Trolox;.i Posteriormente se

realizaron las pruebas de inhibición microbiana por el método de sensidisco en

placa, y se midieron sus halos de inhibición. Finalmente para la identificación de

flavonoides se utilizó la técnica de electroforesis capilar micelar en un equipo

Beckman Coulter P/ACE MDQ, con un detector de arreglo de diodos, utilizando un

capilar de sílica fundida catiónico de 60 cm de longitud y un diámetro interior de

75 mm; con las siguientes condiciones, se inyecto la muestra 0.5 psi por 5

segundos, el voltaje de separación fue de 15 Kv, se detectó a 214 nm y el tiempo

de corrida de la muestra es de 18 minutos. La solución amortiguadora de corrida

utilizada fue de boratos 40 mM con dodecil sulfato de sodio (SDS) 40 mM a pH 9.

Utilizando como estándares rutina, catequina, quercetina, naringenina, miricetina,

luteolina, epigallocatequina, kaempferol y apigenina.

Resultados y Discusión. Para la concentración de fenoles totales los resultados

se presentan en µg/mL de muestra en donde la flor de tonjil morado presentó la

mayor concentración 514.66 µg/mL y la flor de trompetilla la menor concentración

con 57.77 µg/mL. Para el caso de los flavonoides la concentración más alta fue la

hoja de toronjil morado 104.55 µg/g.

La actividad antioxidante fue reportado en VEAC (mg de vitamina C / 100g de

muestra) y en Trolox (mM), el cuchalalate presentó mayor actividad 5623.75

VEAC mientras que el tallo de salvia morada tuvo la menor actividad (3601.10

VEAC).

Conclusiones. Se logró determinar la cantidad de fenoles totales, flavonoides

totales y actividad antimicrobiana en los extractos Jacaranda mimosifolia

(jacaranda), Amphiterygium adstringensis Schiede (cuachalalate), Agastache

mexicana (Toronjil morado), Waltheria indica (Tapa cola), Salvia gilliesii Benth

(Salvia morada ) , así como también se determinó la capacidad antioxidante de

cada muestra; y finalmente se logro identificar algunos compuestos de flavonoides

presentes en las muestras obtenidas.

Referencias. i Kuskok E Marta 2005. Aplicación de diversos métodos químicos

para determinar actividad antioxidante en pulpa de frutos. Cienc. Tecnol. Aliment..

Campinas. V. 25, p. 726-


1

1. Antecedentes 1.1 Introducción

Desde tiempos antiguos el hombre ha recurrido a las plantas en busca de curación para sus afecciones sabiendo que

las especies vegetales poseen las propiedades medicinales necesarias para la sustentar sus males.

Dentro de la flora, las plantas medicinales han formado parte importante de la historia y la cultura de los pueblos

indígenas. Su uso y aplicación para el remedio de enfermedades constituye un conocimiento que aún es transmitido

en forma oral de generación en generación como parte de las tradiciones heredadas.

A partir de 1521, con la colonización de los españoles, la cultura mexicana sufrió una gran transformación, que le

suscitaron un intercambio de especies animales y vegetales entre ambos continentes, este hecho permitió un

enriquecimiento de la herbolaria medicinal de México y de Europa. Los religiosos franciscanos entre otros

colonizadores, preocupados por reunir los conocimientos herbolarios prehispánicos, fundaron el colegio de Santa

Cruz de Tlaltelolco en 1536, donde indígenas de familias ilustres adquirieron conocimientos diversos de la cultura

occidental dominando el español y el latín. Entre los indígenas formados, destacan Martín de la Cruz y Juan Badiano.

El primero escribió en 1552 el manuscrito náhuatl denominado LIBELLUS DE MEDICINALIBUS INDORUM HERBIS,

conocido como CODICE BADIANO por la traducción que hiciera de la misma al latín Juan Badiano. (Viesca 1993).

1.2 Radicales Libres

Desde el punto de vista químico los radicales libres son todas aquellas especies químicas, cargadas o no, que en su

estructura atómica presentan un electrón desapareado o impar en el orbital externo, dándole una configuración

espacial que genera gran inestabilidad. Poseen una estructura birradicálica, son muy reactivos, tienen una vida media

corta, por lo que actúan cercano al sitio en que se forman y son difíciles de dosificar. iiiii Estos radicales recorren

nuestro organismo intentando robar un electrón de las moléculas estables, con el fin de alcanzar su estabilidad

electroquímica. Una vez que el radical libre ha conseguido robar el electrón que necesita para aparear su electrón

libre, la molécula estable que se lo cede se convierte a su vez en un radical libre, por quedar con un electrón

desapareado, iniciándose así una verdadera reacción en cadena que destruye nuestras células. La vida biológica

media del radical libre es de microsegundos; pero tiene la capacidad de reaccionar con todo lo que esté a su

alrededor provocando un gran daño a las moléculas y a las membranas celularesiv

Desde el punto de vista molecular son pequeñas moléculas ubicuitarias (que se encuentran en cualquier habitad) y

difusibles que se producen por diferentes mecanismos entre los que se encuentran la cadena respiratoria

mitocondrial, la cadena de transporte de electrones a nivel microsomal y en los cloroplastos, y las reacciones de

oxidación, por lo que producen daño celular (oxidativo), al interactuar con las principales biomoléculas del organismo.

No obstante lo expresado anteriormente, los radicales libres del oxígeno tienen una función fisiológica en el

organismo como:

Participan en la fagocitosis

Favorecen la síntesis de colágeno

Favorecen la síntesis de prostaglandinas

Activan enzimas de la membrana celular,

Disminuyen la síntesis de catecolaminas por las glándulas suprarrenales

Modifican la biomembrana y favorecen la quimiotaxis.


2

Existe un término que incluye a los radicales libres y a otras especies no radicálicas (que no son radicales libres), pero

que pueden participar en reacciones que llevan a la elevación de los agentes prooxidantes y son las especies

reactivas del oxígeno (EROS).v vi

Las principales especies reactivas del oxígeno o sustancias prooxidantes son:

Radical hidroxilo (HO)+

Peróxido de hidrógeno (H2O2)

Anión superóxido (O2)

Oxígeno singlete (1O2)

Oxígeno nítrico (NO)

Peróxido (ROO)

Semiquinona (Q)

Ozono

Los radicales libres del oxígeno se clasifican de la forma siguiente:

1) Radicales libres inorgánicos o primarios. Se originan por transferencia de electrones sobre el átomo de

oxígeno, representan por tanto distintos estados en la reducción de este y se caracterizan por tener una vida

media muy corta; estos son el anión superóxido, el radical hidróxilo y el óxido nítrico.

2) Radicales libres orgánicos o secundarios. Se pueden originar por la transferencia de un electrón de un

radical primario a un átomo de una molécula orgánica o por la reacción de 2 radicales primarios entre sí,

poseen una vida media un tanto más larga que los primarios; los principales átomos de las biomoléculas son:

carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre.

3) Intermediarios estables relacionados con los radicales libres del oxígeno. Aquí se incluye un grupo de

especies químicas que sin ser radicales libres, son generadoras de estas sustancias o resultan de la

reducción o metabolismo de ellas, entre las que están el oxígeno singlete, el peróxido de hidrógeno, el ácido

hipocloroso, el peroxinitrito, el hidroperóxidos orgánicos.vii

1.3 Antioxidantes

Un antioxidante es aquella sustancia que presenta bajas concentraciones respecto a la de un sustrato oxidable

(biomolécula) que retarda o previene su oxidación.

Los antioxidantes que se encuentran naturalmente en el organismo y en ciertos alimentos pueden bloquear parte del

daño que causan los radicales libres debido a que los estabilizan. Estas sustancias tienen la capacidad de inhibir la

oxidación causada por los radicales libres, actuando algunos a nivel intracelular y otros en la membrana de las

células, siempre en conjunto para proteger a los diferentes órganos y sistemas.

Existen diferentes tipos de antioxidantes:


3

• Antioxidantes endógenos: mecanismos enzimáticos del organismo (superóxidodismutasa, catalasa, glutatión

peroxidasa, glutatión y la coenzima Q-). Algunas enzimas necesitan cofactores metálicos como selenio, cobre, zinc y

magnesio para poder realizar el mecanismo de protección celular.

• Antioxidantes exógenos: son introducidos por la dieta y se depositan en las membranas celulares impidiendo la

lipoperoxidación(vitaminas E y C y del caroteno). (Halliwell, 1995).

Tabla 1. Clasificación de los antioxidantes según el sitio donde ejercen su acciónviii

Intracelular Membrana Extracelular

Superóxido dismutasa Vitamina E Ceruloplasmina

Catalasa Betacarotenos Transferinas

Peroxidasa Ubiquinol-10 Lactoferinas

DT-deafarasa

Albúminas

Albúminas

GSH Haptoglobinas

Proteínas que ligan

metales

Vitamina C

Sistemas proteolíticos

Ácido úrico

Vitamina C Vitamina E

Un nutriente tiene propiedades antioxidantes cuando es capaz de neutralizar la acción oxidante de la molécula

inestable de un radical libre sin perder su propia estabilidad electroquímica. El organismo está luchando contra

radicales libres a cada momento del día, pero el problema se produce cuando tiene que tolerar de forma continuada

un exceso de radicales libres. El exceso es producido sobre todo por contaminantes externos que entran a nuestro

cuerpo. La contaminación atmosférica, el humo del tabaco, los herbicidas, pesticidas o ciertas grasas son algunos

ejemplos de elementos que generan radicales libres que ingerimos o inhalamos. Este exceso no puede ser eliminado

por el cuerpo y, en su labor de captación de electrones, los radicales libres dañan las membranas de nuestras células,

llegando finalmente a destruir y mutar su información genética, facilitando así el camino para que se desarrollen

diversos tipos de enfermedades. La acción de los radicales libres está ligada al cáncer así como al daño causado en

las arterias por el colesterol "oxidado", lo que relaciona directamente estas moléculas con las enfermedades

cardiovasculares.ix


4

1.4 Flavonoides

Las plantas mediante el proceso de la fotosíntesis producen las sustancias necesarias para todos los ciclos vitales de

la naturaleza. Las plantas producen sustancias como los carbohidratos, las proteínas y las grasas, a los cuales se les

ha denominado metabolitos primarios, dado que se encuentran en prácticamente todas las formas de vida y cumplen

funciones básicas para la misma, existen otras que no se encuentran tan distribuidas y que se hallan restringidas solo

a ciertas especies, géneros o familias como son los alcaloides, las saponinas esteroides, los aceites esenciales, los

terpenoides, etc., a los cuales se les denomina metabolitos secundarios. dentro de este último grupo están los

flavonoides.

Figura 1. Ruta biosintética de los flavonoides y relación con otros productos.( Packer L.

Flavonoids and other polyphenols. San Diego: Academic Press, 2001.

Los flavonoides son pigmentos naturales presentes en los vegetales y que protegen al organismo del daño producido

por agentes oxidantes, como los rayos ultravioletas, la polución ambiental, sustancias químicas presentes en los

alimentos, etc. El organismo humano no puede producir estas sustancias químicas protectoras, por lo que deben

obtenerse mediante la alimentación o en forma de suplementos. Están ampliamente distribuidos en plantas, frutas,

verduras y en diversas bebidas y representan componentes sustanciales de la parte no energética de la dieta

humanax

Desde que el científico húngaro Albert Szent-Györgyi —ganador del premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1937

los descubriera y les diera el nombre de «vitamina P», se han descrito para los flavonoides propiedades antioxidantes,

antiinflamatorias, antiagregantes, antihemorrágicas, vasodilatadoras, antineoplásicas, antivirales, antibacterianas,

antialérgicas y hepatoprotectorasxi.


5

Los flavonoides son compuestos de bajo peso molecular que comparten un esqueleto común de difenilpiranos (C6-

C3-C6), compuesto por dos anillos de fenilos (A y B) ligados a través de un anillo C de pirano (heterocíclico). Los

átomos de carbono en los anillos C y A se numeran del 2 al 8, y los del anillo B desde el 2' al 6'12 (fig.10). La

actividad de los flavonoides como antioxidantes depende de las propiedades redox de sus grupos hidroxifenólicos y

de la relación estructural entre las diferentes partes de la estructura química. Esta estructura básica permite una

multitud de patrones de sustitución y variaciones en el anillo C.xii

Figura 2. Estructura básica y tipos de Flavonoides

Los flavonoides retiran oxígeno reactivo especialmente en forma de aniones superóxidos, radicales hidroxilos,

peróxidos lipídicos o hidroperóxidos; debido a que en su estructura química puede existir un número variable de

grupos hidroxilo-fenólicos lo que les confiere una gran capacidad antioxidantexiii

Propiedades anticancerosas: muchos han demostrado ser tremendamente eficaces en el tratamiento del

cáncer. Se sabe que muchos inhiben el crecimiento de las células cancerosas. Se ha probado contra el

cáncer de hígado.

Propiedades cardiotónicas: tienen un efecto tónico sobre el corazón, potenciando el músculo cardíaco y

mejorando la circulación. Atribuidas fundamentalmente al flavonoide quercetina aunque aparece en

menor intensidad en otros como la genisteína y la luteolina. Se ha estudiado que los flavonoides reducen

el riesgo de enfermedades cardíacas.

Fragilidad capilar: mejoran la resistencia de los capilares y favorecen el que éstos no se rompan, por lo

que resultan adecuados para prevenir el sangrado. Los flavonoides con mejores resultados en este

campo son la hesperidina, la rutina y la quercetina.


6

Propiedades antitrombóticas: la capacidad de estos componentes para impedir la formación de trombos

en los vasos sanguíneos posibilita una mejor circulación y una prevención de muchas enfermedades

cardiovasculares.

Disminución del colesterol: poseen la capacidad de disminuir la concentración de colesterol y de

triglicéridos.

Protección del hígado: algunos flavonoides han demostrado disminuir la probabilidad de enfermedades en

el hígado. Fue probado en laboratorio que la silimarina protege y regenera el hígado durante la hepatitis.

Junto con la apigenina y la quercetina, son muy útiles para eliminar ciertas dolencias digestivas

relacionadas con el hígado, como la sensación de plenitud o los vómitos.

Protección del estómago: ciertos flavonoides, como la quercetina, la rutina y el kaempferol, tienen

propiedades antiulcéricas al proteger la mucosa gástrica.

Antiinflamatorios y analgésicos: la hesperidina por sus propiedades antiinflamatorias y analgésicas, se ha

utilizado para el tratamiento de ciertas enfermedades como la artritis. Los taninos tienen propiedades

astringentes, vasoconstrictoras y antiinflamatorias, pudiéndose utilizar en el tratamiento de las

hemorroides.

Antimicrobianos: isoflavonoides, furanocumarinas y estilbenos han demostrado tener propiedades

antibacterianas, antivirales y antifúngicas.

Tabla 2. Estructura básica de los grupos de flavonoides. (Pérez G. 2003. Los Flavonoides: Antioxidantes o

prooxidantes)

Grupo Estructura Grupo Estructura

Antocianidinas

Dihidroflavonoles

Auronas

Flavonas


7

Biflavonoides

Flavonoles

Chalconas

Flavandioles

Dihidrochalconas

Isoflavonoides

Flavanonas

Protocianidinas

Flavanol

_ _

1.5 Síntesis, absorción y metabolismo.

Los flavonoides se sintetizan en las plantas y participan en la fase dependiente de luz de la fotosíntesis, durante la

cual catalizan el transporte de electronesxiv

Su formación tiene lugar a partir de los aminoácidos aromáticos fenilalanina y tirosina y también de unidades de

acetato. La fenilalanina y la tirosina dan lugar al ácido cinámico y al ácido parahidroxicinámico, que al condensarse

con unidades de acetato, originan la estructura cinamol de los flavonoides. Posteriormente se forman los derivados

glicosilados o sulfatados.

El metabolismo de los flavonoides es intenso y una parte importante se excretan por la orina. La transformación de los

flavonoides tiene lugar en dos localizaciones: en primer lugar en el hígado, por medio de reacciones de

biotransformación de fase I en las que se introducen o exponen grupos polares; en segundo lugar en el colon

mediante reacciones de biotransformación de fase II, en las que los microorganismos degradan los flavonoides no

absorbidos.xv

La conjugación con el ácido glucurónico, sulfatos, o glicina, parecen tener lugar tanto para los flavonoides como para

sus metabolitos procedentes del colon. Los conjugados, solubles en agua, pueden excretarse por la orinaxvi


8

Para evaluar los efectos biológicos de los flavonoides, así como de cualquier fármaco o componente alimenticio, uno

de los más importantes aspectos es la biodisponibilidad, en la que influyen factores tales como estructura química,

absorción, distribución y eliminación. Por ejemplo, existen diferencias de biodisponibilidad entre la quercitina y la

catequina dependientes del metabolismo, habiéndose demostrado que las concentraciones plasmáticas de los

metabolitos de quercitina presentan una vida media más larga que los metabolitos de la catequina. Esta diferencia es

mayor en ratas adaptadas a una dieta rica en quercetina durante varios días, que en ratas adaptadas de igual forma

con catequinaxvii.

1.6 Acción antioxidante de los flavonoides

La capacidad de los polifenoles vegetales para actuar como antioxidantes en los sistemas biológicos fue ya

reconocida en los años treinta; sin embargo, el mecanismo antioxidante fue ignorado en gran medida hasta hace poco

tiempo. El creciente interés en los flavonoides se debe a la apreciación de su amplia actividad farmacológica. Pueden

unirse a los polímeros biológicos, tales como enzimas, transportadores de hormonas, y ADN; quelar iones metálicos

transitorios, tales como Fe2+, Cu2+, Zn2+, catalizar el transporte de electrones, y depurar radicales libresxviii.

Otras actividades que merecen ser destacadas son su acción antiviral y antialérgico, así como sus propiedades

antitrombótica y antiinflamatoria. Los criterios químicos para establecer la capacidad antioxidante de los flavonoides,

son:

Presencia de estructura O-dihidroxi en el anillo B; que confiere una mayor estabilidad a la forma radical y

participa en la deslocalización de los electrones.

Doble ligadura, en conjunción con la función 4-oxo del anillo C.

Grupos 3- y 5-OH con función 4-oxo en los anillos A y C necesarios para ejercer el máximo potencial

antioxidante.

Siguiendo estos criterios, el flavonoide quercetina es el que mejor reúne los requisitos para ejercer una efectiva

función antioxidante. Su capacidad antioxidante medida como Trolox es de 4,7 mM, lo que resulta 5 veces mayor al

demostrado por las vitaminas E y C y tiene una hidrosolubilidad similar a la de la vitamina E.

La función antioxidante de la quercetina muestra efectos sinérgicos con la vitamina C. El ácido ascórbico reduce la

oxidación de la quercetina, de manera tal que combinado con ella permite al flavonoide mantener sus funciones

antioxidantes durante más tiempo.

Por otra parte, la quercetina protege de la oxidación a la vitamina E, con lo cual también presenta efectos

sinergizantes. Así, se ha demostrado que el flavonoide inhibe la fotooxidación de la vitamina E en la membrana

celular de las células sanguíneas en presencia de hematoporfirina como fotosensibilizador.

Los flavonoides retiran oxígeno reactivo especialmente en forma de aniones superóxidos, radicales hidroxilos,

peróxidos lipídicos o hidroperóxidos. De esta manera bloquean la acción deletérea de dichas sustancias sobre las

células. Sus efectos citoprotectores son, por ejemplo, bien patentes en fibroblastos de la piel humana, queratinocitos,

células endoteliales y ganglios sensoriales cultivados en presencia de sulfoxina- butionina, un inhibidor irreversible de

la glutatión sintetasa. Diversos flavonoides han mostrado su eficiencia para eliminar los procesos de peroxidación


9

lipídica del ácido linoleico o de los fosfolípidos de las membranas, la peroxidación de los glóbulos rojos o la

autooxidación de los homogeneizados de cerebro. Así mismo, se ha comprobado su potente capacidad de inhibir in

vitro la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) por los macrófagos y reducir la citotoxicidad de las LDL

oxidadas. De hecho, las poblaciones que consumen productos ricos en flavonoides estadísticamente presentan

menores riesgos de afecciones cardiovasculares.

Además, flavonoides como la quercetina y el kaempferol son importantes para el control de las concentraciones

intracelulares de glutatión. Actuando a nivel del gen de regulación, son capaces de aumentar el nivel en un 50%,

induciendo el sistema antioxidante celular y contribuyendo así a la prevención de enfermedadesxix

Sin lugar a dudas una de áreas en las que las se ha enfocado la investigación es en la acción anticancerígena de los

flavonoides así como sus mecanismos de acción, aunque el campo de investigación aun es muy amplio y hay muchas

cosas por descubrir en la actualidad se tiene registrados mecanismo anticancerígenos de los flavonoides.

Algunos flavonoides inhiben el paso del agente precursor a mutágeno durante la elaboración de los alimentos,

mientras que otros simplemente dificultan la absorción del promotor tumoral en el tubo digestivo.

La genísteina bloquea el desarrollo de tumores al prevenir la formación de nuevos vasos impidiendo con ello la

llegada del oxígeno y nutrientes a las células neotumorales. También modula la reacción de los estrógenos ligándose

a sus receptores con lo que disminuye el riesgo de cáncer de mama.

De hecho, se ha puesto de manifiesto que diversos flavonoides pueden inhibir monooxigenasas dependientes del

citocromo P-450, lo que indicaría un papel potencial en la regulación de la activación de carcinógenos xx y que

chalconas y flavononas en concreto son inductoras de las quinonas reductasas y podrían tener un papel preventivo en

la progresión de los hepatomas.xxi

Las enzimas del citocromo P450 —enzimas metabólicas de fase I— constituyen la primera línea de acción frente a

moléculas exógenas y, en ocasiones, provocan la activación de diferentes agentes carcinógenos. Por tanto, la

inhibición, la activación o la inducción de estas enzimas pueden modificar dramáticamente el metabolismo de algunos

mutágenos.

Las propiedades antioxidantes de un compuesto son consideradas a priori como favorables para la prevención de la

oncogénesis. Las especies reactivas de oxígeno (ERO) están envueltas en las distintas etapas del proceso

cancerígeno, ya que:

Pueden oxidar directamente el ADN o activar mutágenos.

Los promotores tumorales estimulan su producción.

La inflamación, proceso en el que se generan ERO, está muy relacionada con la carcinogénesis.

Sin embargo, debe tenerse en cuenta la dualidad de la cuestión: compuestos con una actividad protectora frente a la

oxidación en unas moléculas como los lípidos pueden provocar un daño oxidante en otras como proteínas o ácidos

nucleícos.


10

1.7 Jacaranda

El género jacarandá, conocido como gualandayes o tarcos se compone de unas cuarenta especies de árboles y

arbustos de la familia de las bignoniáceas, típicos de la América intertropical y subtropical, que prosperan

preferentemente en zonas con un buen régimen de lluvias, aunque pueden implantarse y prosperar en zonas más

templadas. El nombre científico de la especie (jacaranda) deriva de la voz guaraní jacarandá.

Es conocido también en el Paraguay como "Caroa" o "Kaí jepopete" (por sus frutos en forma de castañuela).

Taxonomía xxii

Orden: Lamiales

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase :Magnoliopsida

Familia: biogniacease

Género: Jacaranda

Figura 3. Árbol de Jacaranda

http://es.wikipedia.org/wiki/Especies

http://es.wikipedia.org/wiki/%C3%81rbol

http://es.wikipedia.org/wiki/Arbusto

http://es.wikipedia.org/wiki/Familia_(biolog%C3%ADa)

http://es.wikipedia.org/wiki/Bignoniaceae

http://es.wikipedia.org/wiki/Subtropical

http://es.wikipedia.org/wiki/Idioma_guaran%C3%AD

http://es.wikipedia.org/wiki/Jacarand%C3%A1

http://bp1.blogger.com/_S7it_Cu9W6E/RxE6aIuC1hI/AAAAAAAAA1Y/XCx5m9AqyRs/s1600-h/20040527042800Jacaranda mimosifolia.jp


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1.8 Cuachalalate

Nombre científico: Amphiterygium adstringensis Schiede

Familia: Julianiaceae

Origen: México

Sinónimos:

• Español: Cuachalalate, Coachalalate, Cuachalala, Chicle, cuachquetchalálatl, Maxiterán, Volador, Cuachinala

Descripción

El Cuachalalate es un árbol que crece hasta una altura de 6 metros o más; tiene un tronco torcido (observar figura 4)

y corteza de color gris marrón; al final de cada ramilla hay un manojo de hojas compuestas de cinco hojuelas sésiles,

aserradas, con dientecillos redondeados, casi todas abovedadas, en el anverso son verde opaco y en el reverso

verde grisáceo; el fruto consiste en nueces alongadas, abultadas, aladas de 2.5 a 5 cm de largo y de color verde

pálido.xxiiixxiv

Esta especie es de clima cálido, y templado, se encuentra desde los 100 hasta los 3000 msnm. Crece en zonas

perturbadas de selva baja caducifolia y bosque de pino-encino. Este árbol se puede reproducir por semilla y por

estaca, siendo esta última una mejor manera de multiplicar esta especie.

Se le atribuye virtudes terapéuticas tales como anticancerígeno, antiinflamatorio, astringente. Se ha usado

tradicionalmente la corteza seca como se observa en la figura 5 por sus acciones curativas contra el cáncer,

principalmente de estomago y de intestinos; ulceras pépticas, ulceraciones externas y heridas antiguas de difícil

cicatrización; de pinorrea y encías endurecidas; y de algunas afecciones de la matriz, incluyendo la matriz desviada o

caída.

Para curar la inflamación de los ovarios y las ulceras vaginales, además es recomendado contra las infecciones

respiratorias, tos, la inflamación de las anginas y las enfermedades pulmonares.xxv

El cuachalalate también sirve contra la inflación del riñón, tosferina, pulmón, lavar heridas o granos, cálculos renales,

paño, nervios, corazón, mucosidad en el estómago, disolver tumores y heridas.xxvi

Figura 4. Tronco de cuachalalate Figura 5. Corteza seca del cuachalalate


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1.9 Toronjil Morado

Nombre científico: Agastache mexicana

Familia: Lamiaceae

Origen: México

Sinónimos: Cedronella mexicana

Descripción

Planta herbácea, perenne muy aromática de unos 40 a 60cm, aunque en algunos casos la reportan hasta de 1.5m de

altura. Sus tallos son cuadrados. Sus hojas tienen forma de lanza y en su parte inferior son más anchas que en la

superior, los bordes de las hojas son dentados y con pelos por el envés. Tiene flores en racimos terminales, en

número de 5 hasta 20, con forma tubular, de color rojo vivo o rojo-morado y sus frutos son color café (observar figura

7). Es una planta aromática.

El toronjil es originario de México; está presente en climas cálido, semicálido y templado entre el nivel del mar y los

780 m y desde los 1600 a los 3900msnm. Hierba asociada a bosques tropicales caducifolio, subcaducifolio y

perennifolio y a bosques espinoso, mesófilo de montaña, de encino, de pino y mixto de encino-pino.

Entre sus virtudes medicinales se utiliza para el insomnio, nervios y regular la presión arterial, la raíz se utiliza como

estomaquico y antiespasmódico. Las flores frescas de la variedad Agastache Mexicana se puede utilizar en infusión

para quitar la tos y calmar los nervios. Sus hojas, contra la picadura de alacrán. Las flores como se observan en la

figura 6 son eficaces contra cólicos, vomito y malestares de digestión. Alivia el catarro, seca ampollas, mata

lombrices intestinales y también reduce tumores en la piel.xxvii

Figura 6. Flor toronjil morado Figura 7. Planta toronjil morado, se puede observar hojas y

tallo


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1.10 Tapa Cola

Nombre científico: Waltheria indica

Familia: Sterculiaceae

Origen: México

Sinónimos: Escobillo blanco, hierba blanca, hierba del ángel, hierba del cáncer, hierba del pasmo

Descripción

Planta herbácea o leñosa en su base, erecta o decumbente; hojas gruesas, pálidas y cubiertas densamente con

pelos; como se observa en la figura 8 tiene flores pequeñitas con pétalos color amarillo brillante y un aroma dulce.

Crece comúnmente como maleza, en matorrales de lugares húmedos o secos y a veces en el bosque de pino donde

se comporta como ruderal.

Virtudes medicinales

Se le atribuye propiedades medicinales contra enfermedades como la diarrea, disentería blanca y la disentería con

moco y acabar con las amibas.

En general, se puede ocupar cualquier parte de la planta administrada por vía oral, excepto en casos de heridas o

úlceras en la piel, en las cuales se aplica en forma de lavados. Es así, que la planta entera (figura 9) se recomienda

para detener la diarrea. La raíz contra la disentería y para tratar el empacho (de comida) que se origina por la

ingestión de alimentos descompuestos, y que provoca dolor de estómago, diarrea muy fuerte y calentura.xxviii

Figura 8. Flor tapa cola donde se observan sus flores y

hojas Figura 9. Planta Tapa Cola donde se

observa su estructura general.

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=disentería

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=empacho

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=dolor%20de%20estómago

http://www.medicinatradicionalmexicana.unam.mx/termino.php?l=1&t=calentura


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1.11 Salvia Morada

Nombre científico: Salvia gilliesii Benth. Familia: lamiáceas Origen: México y Chile Sinónimos: Escobillo blanco, hierba blanca, hierba del ángel, hierba del cáncer, hierba del pasmo Descripción

Sus características son las de una planta aromática de la familia Lamiaceae; si bien su porte varía de herbáceo a

arbustivo, la presencia del labelo superior de la flor bilabiada muy conspicuo y curvado hacia abajo permite su

identificación (observar figura 11).

Presenta hojas gruesas, cubiertas ligeramente con pelos; flores pequeñitas de color azul brillante y un aroma dulce.

Crece comúnmente como maleza, en matorrales de lugares húmedos y no resiste bajas temperaturas y no se sabe

exactamente el número de sus pétalos (observar figura 10).

Virtudes medicinales

Se le atribuye propiedades medicinales contra enfermedades respiratorias en general, por vía externa en

inflamaciones e infecciones de las mucosas bucofaríngeas, y por vía interna en caso de una excesiva sudoración.

Tiene utilidades para el aparato respiratorio (Mucosidades, inflamación), para el aparato genital (actúa como regulador

de los trastornos menstruales, limita sofocos y sudores nocturnos). Así mismo sirve para combatir la diarrea, la

hidropesía, el histerismo y la epilepsia.xxix

Figura 10. Planta Salvia morada Figura 11. Flor Salvia morada

http://es.wikipedia.org/wiki/Hierba

http://es.wikipedia.org/wiki/Arbusto


15

1.12 Fundamento teórico de la metodología

1.12.1 Extracción por sonicación

El ultrasonido se utiliza en proceso de intensificación para incrementar la velocidad de transferencia de masa,

provocando mejores rendimientos, e incluso cambios de reacción. ( Thompson- Doraiswamy, 1999).

El ultrasonido es transmitido a través de un líquido debido a la presión causada por la agitación vibracional inducida

de las moléculas, que contrae y agranda la estructura molecular ( Suslick, 1989), formando cavitación solo si la

presión negativa excede la tensión local de la fuerza líquida. (Grénman, 2007)

En un sistema sólido –líquido, el colapso de una cavitación de burbuja puede tener diferentes impactos en la

superficie del sólido (Riesz-Kondo, 1990), causando erosión, picaduras e incluso agrietamiento de las partículas

(Hagenson- Doriswamy,1998).

La aplicación de ultrasonido se utiliza actualmente para la extracción de algunos compuestos fenólicos de platas que

mejoran significativamente el rendimiento ( Hromaádkova- Ebringerová, 2003), mediante la ruptura de paredes

celulares y el incremento de transferencia de masa, o bien provocando cambios en la permeabilidad de los organelos

internos de la célula e incluso el rompimiento de las estructuras, favoreciendo la actividad de las enzimas.

La sonicación consiste en la aplicación de ultrasonidos a una suspensión celular, dependiendo de la frecuencia,

intensidad y energía aplicada se puede destruir las estructuras subcelulares o solubilizar complejos proteicos; se

suele aplicar en frio para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría causar la desnaturalización de las

proteínas. En la sonicación se presentan efectos mecánicos si la intensidad de la aplicación de las ondas es baja y

efectos químicos si es muy alta, colapsando la cavitación de la burbuja generada, formando radicales libres con otras

substancias (Priego- Capote y Luque de Castro, 2007)

1.12.2 Cuantificación de fenoles totales

La concentración de fenoles totales en alimentos, vegetales y platas comúnmente se puede determinar por dos

métodos o ensayos el de la vainilla y el de Folin-Ciocalteu.

En este caso el método utilizado fue el de Folin-Ciocalteu, este se basa en la capacidad de los fenoles para

reaccionar con agentes oxidantes. El reactivo de Folin-Ciocalteu es una mezcla de molibdato y tungstato sódico, que

reaccionan con cualquier tipo de fenol, formando complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico.xxx

La transferencia de electrones a pH básico reduce los complejos fosfomolíbdico-fosfotúngstico en óxidos, cromógenos

de color azul intenso, de tungsteno (W8O23) y molibdeno (Mo8O23), siendo proporcional este color al número de

grupos hidroxilo de la molécula.xxxi


16

1.12.3 Cuantificación de Flavonoides Totales

La cuantificación de flavonoides se puede determinar por varios métodos entre los cuales se encuentra las

cromatografías de capa fina, cromatografía de gases (Christov y Bankova, 1992), cromatografía de gases acoplada a

masas GC/MS (Bankova et al., 1987) y cromatografía líquida de alta eficiencia (Vennat et al., 1995). Los métodos por

cromatografía de gases y de alta eficiencia aportan información definitiva en la caracterización de las muestras, pero

presentan limitaciones importantes debido a los costos del equipamiento y la participación de personal con formación

específica en el área instrumental. En cambio, los métodos espectrofotométricos permiten cuantificar flavonoides con

estructuras similares y son convenientes y apropiados en las determinaciones de rutina, aunque presenten

limitaciones en la sensibilidad y especificidad. Las flavonas y flavonoles, desde el punto de vista reactivo, forman

complejos estables con el tricloruro de aluminio y son susceptibles de analizar mediante espectrofotometría

ultravioleta-visible (Mabry et al., 1970); entre tanto, las flavanonas y flavanonoles reaccionan mejor con el 2,4-

Dinitrofenilhidrazina (Nagy y Grancai, 1996), situación que ha sido evaluada por Chang et al. (2002) y Kosalec et al.

(2004).

El método utilizado en este trabajo es el método colorimétrico de cloruro de aluminio, ya que es un método

sencillo, económico y confiable (Chang et al., 2002). Para obtener la concentración total de flavonoides es

necesario realizar una curva tipo, la cual se presenta más adelante.

1.12.4 Método ABTS

Alternativamente, diversos compuestos cromógenos (ABTS, DPPH, DMPD, DMPO y FRAP) son utilizados para

determinar la capacidad de los compuestos fenólicos que contienen los frutos para captar los radicales libres

generados, operando así en contra los efectos perjudiciales de los procesos de oxidación, que implican a especies

reactivas de oxígeno (EROS)xxxii.

Los métodos más aplicados son ABTS y DPPH. Ambos presentan una excelente estabilidad en ciertas condiciones,

aunque también muestran diferencias. El DPPH es un radical libre que puede obtenerse directamente sin una

preparación previa, mientras que el ABTS tiene que ser generado tras una reacción que puede ser química (dióxido

de manganeso, persulfato potasio, ABAP), enzimática (peroxidase, mioglobulina), o también eletroquímicaxxxiii. Con el

ABTS se puede medir la actividad de compuestos de naturaleza hidrofílica y lipofílica, mientras que el DPPH solo

puede disolverse en medio orgánico. El radical ABTS•+ tiene, además, la ventaja de que su espectro presenta

máximos de absorbancia a 414, 654, 754 y 815 nm en medio alcohólico, mientras que el DPPH presenta un pico de

absorbancia a 515 nm.


17

Figura 12. Reacción de formación del Radical ABTS.xxxiv

1.12.5 Identificación por electroforesis capilar.

La Electroforesis capilar es una poderosa técnica analítica para la separación, cuantificación y determinación de

moléculas grandes y pequeñas. Su alta eficiencia en la separación, corto tiempo de análisis, sensibilidad

automatización y pequeñas cantidades de muestra que se necesita, ha permitido que sea utilizado en diferentes áreas

tales como: Química, Bioquímica Clínica, Biotecnología, Farmacia, Alimentos etc.

La electroforesis es una técnica ahora realizada en tubos capilares, que mejora la modalidad clásica de electroforesis

hasta el punto de convertirla en una técnica de separación comparable a la Cromatografía de Líquidos de Alta

Resolución con diferentes fundamentos fisicoquímicos, ventajas, desventajas y procedimientos distintivos durante la

operación del equipo.xxxv

El uso de capilares como soporte de la separación ha permitido automatización de los equipos y ampliado

increíblemente el campo de aplicación de esta técnica desde iones simples.

La necesidad de optimizar separaciones para gran variedad de compuestos tiene como resultado diferentes

modalidades de trabajo se han desarrollado para expandir el número de aplicaciones de esta técnica con la gran

ventaja que se pueden realizar con el mismo equipo. Las diferentes modalidades que se trabajan hasta el momento

son:

Electroforesis Capilar de Zona (CZE )

Electroforesis Capilar Micelar (MEKC)

Electroforesis Capilar en Gel (CGE)

Electroforesis Isoeléctrica (CIEF)

Isotacoforesis (CITP)

1.12.5.1 Electroforesis Capilar Micelar

La electroforesis capilar micelar (MEKC) es un método de separación altamente eficiente utilizado para el análisis de

pequeñas moléculas neutras, compuestos cargados con idénticas movilidades o mezclas de compuestos con carga o

sin carga.


18

El mecanismo de separación de la EC es el mismo de la electroforesis convencional: las especies cargadas disueltas

o suspendidas en una solución amortiguadora presentan una diferencia en la velocidad de migración bajo la

influencia de un campo eléctrico. Los cationes migran hacia el cátodo (electrodo de carga negativa) mientras que los

aniones migran hacia el ánodo y las especies neutras no migran por si solas. La migración diferencial dentro de las

zonas discretas es debido a diferencias en las movilidades electroforéticas, las cuales a su vez están vinculadas a la

relación masa/ carga y a la conformación de los análitos así como la viscosidad del medio .Las propiedades del

disolvente tales como la fuerza iónica, pH y constante dieléctrica, son importantes ya que influyen en la carga efectiva

del analito.xxxvi

Este método permite la separación de fenoles y nitrocompuestos aromáticos de bajo peso molecular por la adición de

surfactantes o tensoactivos como el Dodecil Sulfato de Sodio (SDS) al electrolito soporte a concentraciones tales que

se forma micelas, las cuales ayudan a la separación de especies neutras y aún especies cargadas.

El dodecil sulfato de sodio (SDS), es un surfactante tipo aniónico que permite la formación de micelas con carga

negativa, lo que les confiere una movilidad electroforética hacia el electrodo positivo. Cuanto se introduce una

muestra en el sistema los componentes se distribuyen entre la fase acuosa y el interior hidrófobo de las micelas. La

distribución de los analitos y los equilibrios que resultan dependen de la polaridad de los analitos. Con los analitos

polares se favorece la permanencia en la disolución acuosa mientras que los compuestos no polares prefieren el

medio constituido por la cadena hidrofóbicas de las micelas.xxxvii

1.12.5.2 Principales ventajas de la Electroforesis Capilar

1. La dispersión de calor en el tubo capilar es buena y por lo tanto, los cambios de calor son muy pequeños y

los resultados presentan mayor reproducibilidad.

2. Dada la alta disipación de calor es posible utilizar altos voltajes (hasta de 30 kv), lo cual disminuye los tiempos

de análisis y aumenta la resolución entre los picos.

3. El gasto en disolventes, aditivos y demás reactivos es mínimo, de ahí sus bajos costos, además de no

contaminar al ambienta ya que casi ni hay residuos tóxicos

4. La cantidad de muestra es muy pequeña tan solo se necesitan microlitros.

5. El valor del capilar es mucho menos en comparación de una columna de cromatografíca o alguna otra.

6. Se cuenta con equipos automatizados que pueden leer hasta 100 muestras sin necesidad de atención del

equipo.

1.12.6 Actividad antimicrobiana

El antibiograma define la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo determinado y refleja su

capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o población bacteriana

La resistencia bacteriana es un tema de importancia en la salud pública. Su extensión a nivel mundial, desarrollo de

resistencia a nuevos agentes antimicrobianos, así como su presencia en patógenos relacionados con enfermedades


19

prevalentes, como son la enfermedad diarreica aguda, las infecciones respiratorias agudas y las infecciones

intrahospitalarias, le dan el carácter de problema prioritario. Por ello, el conocimiento de los perfiles de susceptibilidad

antimicrobiana debe orientar a la elaboración de esquemas de tratamiento más eficaces y además, la información

proporcionada por la vigilancia debe servir de insumo para la elaboración de un programa de uso racional de

antibióticos.

1.12.6.1 Fundamento

El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno de los métodos que el

National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) recomienda para la determinación de la sensibilidad

bacteriana a los antimicrobianos. El antibiograma disco-placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una

placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes

antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el

filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar. El antibiótico difunde radialmente a través del espesor del agar a

partir del disco formándose un gradiente de concentración. Transcurridas 18-24 horas de incubación los discos

aparecen rodeados por una zona de inhibición. La concentración de antibiótico en la interfase entre bacterias en

crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentración crítica y se aproxima a la concentración mínima

inhibitoria (CMI) obtenida por métodos de dilución. Sin embargo, los métodos disco-placa no permiten una lectura

directa del valor de la CMI. Para cuantificarla, basta con haber contrastado previamente el sistema disco-placa con un

gran número de cepas de CMI conocidas que han estado previamente determinadas por otros métodos de

determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos (ej.: método de dilución). Esta determinación se realiza con

cientos de bacterias para minimizar errores. Se mide el diámetro de la zona de inhibición obtenida por cada una de

tales cepas y se grafica dicha medida frente a la CMI, obteniéndose la línea de regresión o "recta de concordancia"

que proporciona la correspondencia entre las CMI y los diámetros de inhibición. Para determinar la CMI de una cepa

se procede a medir el diámetro de la zona de inhibición y luego extrapolarlo en el gráfico para obtener la CMI. Existen,

por tanto, unos diámetros de inhibición, expresados en mm, estandarizados para cada antimicrobiano. La lectura de

los halos de inhibición debe interpretarse como sensible (S), intermedia (I) o resistente (R) según las categorías

establecidas por el NCCLS.xxxviii

Sensible, si existe una buena probabilidad de éxito terapéutico en el caso de un tratamiento a

la dosìs habitual.

Resistente, si la probabilidad de éxito terapéutico es nula o muy reducida. No es de esperar

ningún efecto terapéutico sea cual fuere el tipo de tratamiento. Intermedia, cuando el éxito

terapéutico es imprevisible. Se puede conseguir efecto terapéutico en ciertas condiciones

(fuertes concentraciones locales o aumento de la posología).


20

2. Justificación

Considerando la información ya documentada de nuestros antepasados y que México es un país con una gran

diversidad de flora, ahora en nuestros días podemos desarrollar conocimiento ―moderno‖ sobre las propiedades

curativas de estas plantas así como de sus componentes.

Considerando que las plantas analizadas en el siguiente trabajo tienen propiedades medicinales importantes, asi

como tomando en cuenta que aun en nuestros días estas plantas siguen siendo utilizadas como una alternativa de

curación.

Teniendo en consideración lo anterior es de gran interés conocer las sustancias que le confieren estas propiedades

medicinales así como de su propiedad antibacteriana el espectro que puede cubrir.

En nuestros días los productos naturales, de uso terapéutico o suplementos alimenticios han tenido un gran auge en

las últimas décadas, y presentan una oportunidad de mercado emergente y promisorio.

En México no se realiza mucha investigación e innovación de nuevos productos, aunque como se menciona

anteriormente es un mercado promisorio para los productos naturales, aunque nuestro país posee una gran

diversidad de flora, en su mayoría los productos naturales consumidos en el país son importados de otros países,

principalmente de china.

3. Objetivos

Determinar la cuantificación de fenoles y flavonoides de los extractos cetónicos obtenidos a partir Jacaranda

mimosifolia (jacaranda), Amphiterygium adstringensis Schiede (cuachalalate), Agastache mexicana (Toronjil

morado), Waltheria indica (Tapa cola), Salvia gilliesii Benth (Salvia morada ),

Determinar la capacidad antioxidante de los extractos cetónicos por el método ABTS obtenidos a partir de

las hojas Jacaranda mimosifolia (jacaranda), Amphiterygium adstringensis Schiede (cuachalalate), Agastache

mexicana (Toronjil morado), Waltheria indica (Tapa cola), Salvia gilliesii Benth (Salvia morada ),

Identificar los flavonoides que contienen los extractos cetónicos obtenidos a partir Jacaranda mimosifolia

(jacaranda), Amphiterygium adstringensis Schiede (cuachalalate), Agastache mexicana (Toronjil morado),

Waltheria indica (Tapa cola), Salvia gilliesii Benth (Salvia morada ), utilizando como método la electroforesis

capilar micelar.

Determinar la actividad antimicrobiana de los extractos obtenidos a partir Jacaranda mimosifolia (jacaranda),

Amphiterygium adstringensis Schiede (cuachalalate), Agastache mexicana (Toronjil morado), Waltheria indica

(Tapa cola), Salvia gilliesii Benth (Salvia morada), con 100µL de muestra.


21

4. Metodología

4.1 Materiales y reactivos

Equipos.

Equipo de Electroforesis Capilar Beckman Coulter P/ACE MDQ, Espectrofotómetro GBC UV/Vis.

Disolventes.

Agua destilada, Acetona, Alcohol Etílico y Metanol

Reactivos.

Reactivo Folin-Ciocalteu, Reactivo Cloruro de Aluminio (AlCl3), Radical 2,2-Azinobis-3-Etilbenzotiazolin-6-

Acido Sulfónico (ABTS), Persulfato de Potasio (K2S2O8), Carbonato de sodio (NaCO3), Nitrito de Sodio (NaNO2),

Dodecil Sulfato de Sodios (SDS) y Acido Bórico (H3BO3).

Estándares.

Acido Caféico, Trolox, Rutina, Quercetina, Catequina, Naringenina, Miricetina, Luteolina, Epigallocatequina y

Apigenina.

Materiales.

Para realizar los extractos se utilizaron las plantas como se muestra en la tabla 3:

Tabla 3. Plantas utilizadas para realizar los extractos

Planta Parte utilizada para realizar el extracto

Jacaranda Flor seca

Cuachalalate Corteza seca

Tapa cola Flor , hojas y tallo

Salvia Morada Flor, Hojas y Tallo

Toronjil Modaro Flor, Hojas y Tallo

Trompetilla Flor y Hojas

Nota: Una vez realizada la separación de las partes de las plantas, se dejaron secar durante 3 dias a temperatura

ambiente, para el caso de la salvia y el toronjil morado se secaron en un horno a 50 °C.

Para realiza las pruebas antimicrobianas se utilizaron los siguientes microorganismos.

Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus, Escherichia coli , Bacillus cereus, Candida albicans.


22

5. Métodos

5.1 Extracción de flavonoides por sonicación.

5.2 Cuantificación de fenoles totales.

5.3 Cuantificación de flavonoides totales.


23

5.4 Determinación de la capacidad antioxidante con el radical ABTS.


24

5.5 Actividad antimicrobiana

5.6.1 Preparación del inoculo.

5.6.2 Método disco-placa


25

5.7 Identificación por Electroforesis capilar micelar.


26

Tabla 4. Estándares de flavonoides utilizados en la electroforesis capilar asi como su clasificación (Romero D, . Radicales libres del oxígeno y antioxidantes en medicina, Review, 2001) Flavonoide Grupo Estructura

Rutina Flavonol

Catequina Flavanol

Quercetina Flavonol

Naringenina Flavanona

Miricetina Flavonol

Luteolina Flavona

Epigallocatequina Flavanol

Kaempferol Flavonol

Apigenina Flavona


27

6. Resultados y Discusión.

6.1 Cuantificación de fenoles y flavonoides totales.

Para la cuantificación de fenoles totales se obtuvo una curva tipo de calibración (ver figura 13 ), utilizando como

estándar el compuesto fenólico, Ácido Caféico ; cuya ecuación es y cuya R= 0.9991

Figura 13. Curva Tipo de Ácido Caféico para la cuantificación de fenoles totales.

En la tabla 5 se muestran los resultados obtenidos de la cuantificación de fenoles totales en µg/ml, la forma en la que

se realizaron los cálculos están representados en el anexo.

Tabla 5. Concentración de fenoles totales en µg/mL.

Muestra Absorbancia 765 nm Concentracion

µg/ml

Cuachalalate 0.578 455

Jacaranda 0.532 301.11

Flor Tapa Cola 0.7125 401.38

Hoja Tapa Cola 0.2015 117.50

Tallo Tapa Cola 0.1745 102.50

Flor Salvia morada 0.3345 191.388

Hoja Salvia morada 0.4465 253.611

Tallo Salvia morada 0.5855 330.83

Flor toronjil morado 0.9164 514.66

Hoja toronjil morado 1.149 643.88

Tallo toronjil morado 0.4035 229.72


28

Flor trompetilla 0.047 57.77

Hoja Trompetilla 0.3225 184.722

Figura 14. Concentración de fenoles totales en µg/ml de ácido caféico, de las muestras.

En la Figura 14 se puede visualizar la concentración general de compuestos fenólicos donde las muestras de toronjil

morado para el caso de la flor y hoja presentan la mayor concentración de compuestos fenólicos, en el caso de la

trompetilla obtuvo menor concentración de fenoles. En general se observa que la planta de Toronjil presenta mayor

concentración de fenoles con respecto de las demás plantas.

Para el caso de los flavonoides, se obtuvo la curva tipo utilizando como estándar el flavonoide Rutina, cuya ecuación

es con una R= 0.9915, la curva se muestra en la figura 14; como en el caso de

los fenoles totales esta curva tipo fue realizada para calcular la cuantificación de flavonoides.


29

Figura 15 Curva tipo de concentración de rutina cuya ecuación es con una R=

0.9915.

En la tabla 6 se observan los datos obtenidos de la cuantificación de flavonoides de las muestras utilizadas; estos

se expresan como µg de rutina por 100 g de muestra, y nos permite conocer la concentración general de flavonoides

con una estructura similar a los flavonoles, ya que la rutina pertenece a este subgrupo.

Tabla 6 presenta la concentración de flavonoides totales de extractos expresados en µg de rutina por 100 g de

muestra.

Muestra Absorbancia 510 nm Concentracion µg/ml Concentracion

µg/g

Cuachalate 0.283 6845.23 102.67

Jacaranda 0.190 4622.02 69.33

Flor Tapa Cola 0.192 4676.19 70.14

Hoja Tapa Cola 0.163 3989.88 59.84

Tallo Tapa Cola 0.143 3496.42 52.44

Flor Salvia morada 0.261 6311.90 94.67

Hoja Salvia morada 0.104 2573.21 38.59

Tallo Salvia morada 0.108 2673.80 40.10

Flor toronjil morado 0.176 4289.28 64.33


30

Hoja toronjil morado 0.288 6970.23 104.55

Tallo toronjil morado 0.150 3667.26 55.00

Flor trompetilla 0.111 2746.42 41.19

Hoja Trompetilla 0.104 2566.66 38.5

Para el caso de los flavonoides se puede observar de color amarillo la concentración más alta para el caso de la hoja

de toronjil morado, en el caso de la flor de salvia morada y el cuchalalate obtuvieron una concentración alta en

comparación de las demás muestras. En color morado se observa las que obtuvieron menor concentración.

Figura 16. Concentración de flavonoides totales en µg/g de rutina , de las muestras.

En la figura 16 se puede visualizar de mejor manera las diferencias en las concentraciones de flavonoides de las

diferentes muestras, las muestras de cuachalalate y hoja de toronjil morado son las que obtuvieron mayor

concentración, estos datos eran de esperarse ya que en la prueba de fenoles totales obtuvieron concentraciones

altas. Esto es debido a que la estructura básica de los flavonoides es de difenilpiranos, es decir dos grupos fenilos

unidos a un pirano, por lo tanto era de esperarse que al obtener una concentración alta de fenoles, lo más probable

es que se tratara de alguna molécula de flavonoide.


31

6.2 Determinación de la Capacidad Antioxidante utilizando el radical ABTS.

Para determinar la capacidad antioxidante utilizando el radical ABTS, se realizaron dos curvas tipo distintas ya que

se usaron dos estándares diferentes para así poder expresar los datos como equivalentes de Vitamina C (VEAC) y

como equivalentes de Trolox (TEAC), las cuales que se muestran en la figuras 10 y 11 respectivamente, en los

cálculos de la determinación de la capacidad antioxidante se encuentran en el Anexo.

Figura 17. Curva Tipo de Vitamina C utilizando el Radical ABTS, cuya ecuación es y

tiene una R=0.9980

Figura 18. Curva Tipo de Trolox utilizando el Radical ABTS, cuya ecuación es y una

R= 0.992


32

Los cálculos realizados se muestran en el Anexo 1, los datos obtenidos se muestran en la tabla

siguiente,

Tabla 7. Datos obtenidos de la actividad antioxidante por medio del método ABTS, reportados en VEAC y Trolox.

Muestra Absorbancia %inhibicion Concentración µg/ml VEAC Trolox mM

Cuachalate 0.0355 94.92 2.24 5623.75 12.56

Jacaranda 0.1235 82.35 1.94 4857.36 10.70

Flor Tapa Cola 0.1792 74.39 1.74 4371.84 9.53

Hoja Tapa Cola 0.1755 74.93 1.76 4404.50 9.61

Tallo Tapa Cola 0.1995 71.50 1.67 4195.49 9.11

Flor Salvia morada 0.1595 77.21 1.81 4543.84 9.95

Hoja Salvia morada 0.1422 79.68 1.87 4694.07 10.31

Tallo Salvia morada 0.2677 61.75 1.44 3601.10 7.67

Flor toronjil morado 0.1875 73.21 1.71 4299.99 9.36

Hoja toronjil morado 0.1325 81.07 1.91 4778.98 10.52

Tallo toronjil morado 0.1752 74.96 1.76 4406.68 9.62

Flor trompetilla 0.192 72.57 1.70 4260.80 9.26

Hoja Trompetilla 0.163 76.61 1.80 4506.83 9.86

Para el caso de la actividad antioxidante los datos reportados fueron en VEAC (mg de vitamina C / 100g de muestra)

y en Trolox mM , en color amarillo se observa la planta que presento mayor concentración el cuchalalate , seguido en

color verde la hoja de toronjil morado y la jacaranda , mientras que en color naranja se observa que la de menor

concentración fue el tallo de salvia morada.

Es interesante que el cuachalalate haya sido el que presentaba mayor actividad antioxidante ya que se ha estudiado

sus propiedades terapéuticas en enfermedades asociadas a los radicales libres, como es el cáncer de estomago y a

obtenido resultados satisfactorios, como se observa en la tabla su actividad antioxidante es bastante considerable, lo


33

que abre una alternativa de estudio para uso terapéutico en un producto que cumpla con todos los requerimientos

normativos, además de ser dosificado, y no solo de uso empirico.

En cuanto a las demás plantas que de igual forma presentan una actividad antioxidante considerable y es interesante

que en trabajos futuros se probaran estas plantas frente a enfermedades asociadas a los radicales libres.

6.3 Actividad Antimicrobiana

Para el caso de la actividad antimicrobiana se realizaron curvas de calibración para los diferentes microorganismos.

Figura 19. Curva Tipo de la inhibición del microorganismo de E. Coli cuya ecuación es cuya

R= 0.9978

Por medio de la ecuación obtenida de la curva tipo se puede calcular la concentración en µg como se observa en el

anexo.

Tabla 8 . Halos de inhibición para los diferentes microorganismos en milímetros.

Muestra S. thyphi S. aureus E. coli B. cereus C. albicans

Cuachalate 9 0 10 9 11

Jacaranda 9 6.5 13.5 7.5 -

Flor Tapa Cola 17 7 - 8.5 -

Hoja Tapa Cola 9.5 7 - 8 -

Tallo Tapa Cola 9.5 11 - 8 -

Flor Salvia morada 8 10.5 - 6.5 -

Hoja Salvia morada 8 9.5 - 6 -

Tallo Salvia morada 6 8.5 - 7 -


34

Flor toronjil morado 6 15 - 6.5 -

Hoja toronjil morado 6 12 - 7 -

Tallo toronjil morado 7 12 - 7 -

Flor trompetilla 0 16 - - -

Hoja Trompetilla 0 13.5 - - -

Nota: (-) son para las muestras que no presentaron inhibición.

Tabla 9. Concentraciones obtenidas en µg equivalentes de cefalosporina para las diferentes muestras de extractos,

los datos obtenidos fueron a partir de la curva estándar obtenida con E. coli.

Muestra S thyphi S. aureus E coli B. cereus C. albicans

Cuachalate 5.675 negativo 5.902 5.675 6.129

Jacaranda 5.675 5.108 6.697 5.335 -

Flor Tapa Cola 7.491 5.221 - 5.562 -

Hoja Tapa Cola 5.789 5.221 - 5.448 -

Tallo Tapa Cola 5.789 6.129 - 5.448 -

Flor Salvia morada 5.448 6.016 - 5.108 -

Hoja Salvia

morada

5.448 5.789 - 4.994 -

Tallo Salvia

morada

4.994 5.562 - 5.221 -

Flor toronjil

morado

4.994 7.037 - 5.108 -

Hoja toronjil

morado

4.99 6.356 - 5.221 -

Tallo toronjil

morado

5.221 6.356 - 5.221 -

Flor trompetilla 3.632 7.264 - - -

Hoja Trompetilla 3.632 6.697 - - -

Como se observa en la tabla 9 en general para los diferentes microorganismos presentaron actividad antimicrobiana

para el caso de S. thyphi la flor de tapa cola fue la que presento mayor concentración 7.491µg de cefalosporina, para

el caso de S. aureus la flor de toronjil morado fue la que presento mayor concentración 7.037 µg de cefalosporina, en

el caso de E coli solo dos plantas presentaron actividad el cuachalate y jacaranda de los cuales la jacaranda presenta

mayor concentración 6.697 µg de cefalosporina, para el microorganismo B. cereus la flor de jacaranda fue la obtuvo

mayor concentración, en el caso del microorganismo C. albicans solo presenta inhibicion con la muestra de

cuachalate.


35

En general la muestra de cuchalalate presento mayor actividad antimicrobiana aunque no con todos los

microorganismos obtuvo la mayor concentración sin embargo fue la única muestra que presento inhibición para

todos los microorganismos y no todas las plantas la presentaron, esto es de gran importancia ya que una de la

problemática en nuestro país es el uso indebido de los antibióticos y la resistencia que presentan los microorganismos a

estos. Las plantas presentan una oportunidad de tratamiento frente a cepas resistentes.

6.4 Identificación de flavonoides por electroforesis capilar.

El electroferograma obtenido a partir de la solución con los estándares de flavonoides se observa en la figura 14, este

se utilizo para comparar con los electroferogramas obtenidos de los extractos de las muestras. El orden de aparición

de los picos, fue de Rutina en el minuto 7.8 + 0.2, Catequina en el minuto 8.7 + 0.2, Quercetina en el minuto 9.5 + 0.3,

Naringenina en el minuto 10.2 + 0.2, Miricetina en el minuto 10.9 + 0.2, Luteolina en el minuto 11.2 + 0.2,

Epigallocatequina en el minuto 11.6 + 0.2, Kaempferol en el minuto 15.4 + 0.2 y Apigenina en el minuto 16 + 0.1.

Figura 20. Electroferograma de la mezcla de los estándares de flavonoides


36

Para la identificación de los flavonoides en los electroferogramas se traslapo el electroferograma de

la mezcla de los estándares con los electroferogramas de cada muestra.

Figura 21 Electroferograma de tallo de salvia donde el electroferograma de color azul es el de la

muestra de tallo de salvia y el de color negro es el de los estándares, se identificaron lo flavonoides

miricetina y apigenina.

Figura 22. Electroferograma de tallo de toronjil, el electroferograma de color rojo es el de la muestra

de tallo de toronjil y el de color negro es el de los estándares, se identificaron lo flavonoides

Miricetina , Luteína y Epigallocatequina.


37

Figura 23. Electroferograma de flor jacaranda el electroferograma de color morado es el de la

muestra de jacaranda y el de color azul es el de los estándares, se identificaron lo flavonoides

Quercetina, Epigallocatequina, Kaempferol y Apigenina.

Figura 24. Electroferograma de hoja salvia el electroferograma de color verde es el de la muestra

de hoja salvia y el de color negro es el de los estándares, se identificaron lo flavonoides

Quercetina, Catequina y Naringenina.


38

Figura 25. Electroferograma de hoja toronjil el electroferograma de color verde es el de la muestra

de hoja toronjil y el de color negro es el de los estándares, se identificaron lo flavonoides

Quercetina, y Naringenina.

En resumen se identificaron lo siguientes flavonoides

Tabla 10. Flavonoides identificados en los extractos.

Muestra Flavonoide Grupo

Tallo salvia

Miricetina

Apigenina

Flavonol

Flavolona

Tallo toronjil Miricetina

Luteolina

Epigallocatequina

Flavonol

Flavonas

Flavanol

Jacaranda Quercetina

Epigallocatequina

Kaempferol

Apigenina

Flavonol

Flavanol

Flavonol

Flavolona

Hoja salvia Catequina

Quercetina

Naringenina

Flavanol

Flavanol

Flavonona


39

Hoja toronjil Quercetina

Naringenina

Flavanol

Flavonona

Para el caso de la hoja de toronjil morado, hoja de salvia morada y la jacaranda es de gran

importancia haber identificado al falvonoide Quercitina ya que según repostes es el que mejor reúne

los requisitos para ejercer una efectiva función antioxidante. Su capacidad antioxidante medida como

Trolox es de 4,7 mM, lo que resulta 5 veces mayor al demostrado por las vitaminas E y C y tiene una

hidrosolubilidad similar a la de la vitamina E.

7. Conclusiones

Se logro cuantificar la concentración de fenoles totales en µg de acido caféico por ml de

muestra, en los extractos obtenidos donde la hoja de toronjil presento una mayor

concentración, mientras que la de Flor de la trompetilla presento la más baja.

Se cuantifico la concentración de flavonoides en µg de rutina por ml de muestra, en

los extractos obtenidos donde la hoja de toronjil presento una mayor concentración,

mientras que la de Flor de la trompetilla presento la más baja.

Se comprobó la actividad antimicrobiana para diferentes microorganismos.

Se identificaron por medio de electroforesis capilar micelar, algunos compuestos de

flavonoides de los extractos cetónicos de las muestras de las plantas.

8. Recomendaciones para trabajo futuro

Determinar otras propiedades farmacológicas de los flavonoides.

Probar el efecto de la actividad antioxidante en animales.

Cuantificar la cantidad de flavoides identificados en cada planta.

Determinar la concentración mínima inhibitoria.


40

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42

Anexo 1 - Cálculos

a) Cálculo para la cuantificación de fenoles totales.

Una vez obtenida la ecuación de la regresión lineal de la curva tipo de ácido caféico (ecuación 1);

despejamos la concentración para poder determinar la concentración equivalente en las muestras

(ecuación 2), se debe multiplicar por el factor de dilución utilizado en este caso fue de 100:

…………….. (1)

…………… (2)

b) Cálculo para la cuantificación de flavonoides totales.

De la ecuación obtenida de la regresión lineal de la curva tipo de Rutina (ecuación 4); despejamos

la concentración para poder determinar la concentración equivalente de las muestras (ecuación 5) y

también se multiplica por el factor de dilución que fue de 100:

y = 0.0042x - 0.0038…………….. (4)

Donde;

y= Absorbancia;

Despeje;


43

……………… (5)

Poster

muestra;

……………… (6)

Donde;

CRutina

V = Volumen del extracto obtenido [ml],

W = Peso de las hojas utilizadas para el extracto [g];

Cflavonoides

c) Cálculo para la determinación de la capacidad antioxidante con el radical ABTS.

Primero se calcula el % inhibición de cada muestra utilizando la ecuación (7);

%

…… (7)

Para determinar la capacidad antioxidante en equivalentes de vitamina C (VEAC) en las

muestras obtenidas, se despeja la concentración de la ecuación de la curva tipo de Vitamina C

(ecuaciones 8 y 9) y se multiplica por el factor de dilución que fue de 10.


44

y = 410.03x + 2.693…………….. (8)

Donde;

y= %inhibición;

x= Concentración de Vitamina C [mg/ml];

Despeje;

10*03.410

693.2min

yCx aCVita

……………… (9)

Posteriormente se utiliza la ecuación 9 para calcular los equivalentes;

WVCVEAC aCVita

100**min

……………… (10)

Donde;

CVitaminaC = Concentración de vitamina C a la absorbancia obtenida [µg/ml];

V = Volumen del extracto obtenido [ml],

W = Peso de las hojas utilizadas [g];

VEAC = Capacidad Antioxidante en VEAC [mg eq. de Vitamina C /100 g de muestra];

Para la determinación de la concentración equivalente de Trolox (TEAC), simplemente se

despejo la concentración de Trolox de la ecuación de la regresión lineal de la curva tipo de Trolox

(ecuaciones 11 y 12); y se sustituyo con las absorbancias obtenidas para cada muestra

multiplicándose por el factor de dilución que fue de 10.

y = 67.896x + 9.6459…………….. (11)


45

Despeje;

10*896.67

6459.9yTEACx ……………… (12)

Donde;

y = %inhibición;

x = TEAC = Concentración de Trolox [mM];

análisis de flavonoides en plantas medicinales por

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