andré f. de camargo guilherme m. g. filho leonardo lima
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Métodos de Análise de Expressão Gênica
André F. de CamargoGuilherme M. G. Filho
Leonardo Lima
Os avanços na genética molecular têm aberto novas perspectivas para elucidar a relação entre os genes e seus fenótipos.
Essas tecnologias podem ser utilizadas para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos em processos biológicos importantes.
Introdução
A expressão deve ser medida sob condições experimentais e ambientais
Abordagens
Estresse vs. basal
(Laboratório ou natureza)
In vitro vs. in vivo
Estudo funcional X Análise global
Gene único vs. Múltiplos genes
• Os genes são expressos através da transcrição do DNA em um mRNA simples fita;
O mRNA é posteriormente traduzido em uma proteína;
A expressão do mRNA representa o aspecto dinâmico de uma célula.
Dados importantes
Histórico da Análise da Expressão Gênica
Ano Acontecimento
1965 Sequenciamento da primeira molécula de RNA;
1977 Desenvolvimento da técnica “Northern blotting” e o Método de Sequenciamento de Sanger;
1989 Relatos de experiências de RT-PCR para análise do transcriptoma;
1991 Primeiro estudo de sequenciamento “EST de alto rendimento”;
1992 Introdução da Exibição Diferencial, para a descoberta de genes expressos deferentemente;
1995 Relatos de MICROARRAY e dos Métodos de análise serial da expressão gênica (SAGE);
2001 Projeto do genoma humano concluído;
2005 Tecnologia de sequenciamento de primeira geração introduzido no mercado;
2006 Os primeiros estudos de sequenciamento de Transcriptona usando uma tecnologia de próxima geração (454/ROCHE).
Dentro deste contexto podemos citar as seguintes técnicas:
Northern Blotting; RT (reverse transcriptase) PCR; Microarranjo e Macroarranjo de DNA; Differential Display of RNA; Análise de ESTs; Real Time PCR; SAGE; RNAseq;
Métodos para análise da Expressão Gênica
Northern blotting é uma técnica para detecção de sequências de RNA específicas.
Desenvolvido por James Alwine e George Stark na Universidade de Stanford em
1979.
Northern Blotting
O RNA é isolado a partir de
várias amostras biológicas (por
exemplo, vários tecidos,
diferentes fases de
desenvolvimento do mesmo
tecido, etc)? * RNA é mais
susceptível à degradação do que
o DNA.
Passos envolvidos com Northern blotting
membrana é lavada para remover a sonda não ligada
Agora, os padrões da sequência de
interesse nas diferentes amostras de
expressão podem ser comparados.
A sonda marcada é detectada através de autorradiografia ou através de uma reação de quimioluminescência (se quimicamente uma
sonda marcada é utilizada)
Em ambos os casos, isto resulta na
formação de uma banda escura sobre uma
película de raios-X.
Um padrão para o estudo da expressão de genes ao
nível de RANm (transcrição de RNA mensageiro)
Estudar a degradação do RNA
Estudar o splicing do RNA
Estudar a meia vida do RNA
Aplicações
O método de Northern Blot padrão é relativamente
menos sensível do que outros ensaios
Detecção com sondas múltiplas é um problema
Se as amostras de RNA são ligeiramente degradada por
ARNases, a qualidade dos dados e quantificação de
expressão será afetada negativamente.
Desvantagem do Northern blotting
RT-PCR é uma de muitas variantes de reação em cadeia da polimerase (PCR);
É o método mais sensível para a detecção e quantificação de mRNA disponível no momento, podendo ser utilizada para quantificar os níveis de mRNA a partir de amostras muito pequenas.
O objetivo dessa técnica é analisar se o gene está ou não sendo expresso.
RT-PCR
Trasncriptase Reversa
Sequenciamento
biologia12c.wordpress.com/2010/01/14/dna-complementar-cdna/
Benefícios:
Maior reprodutibilidade Sensibilidade Análise quantitativa
Acompanhamento da reação de forma mais rápida e precisa
PCR em Tempo Real
Quantificar o número de cópias de um gene (templete/molde)
Amplificação e detecção em um único passo + componentes fluorescentes:
◦ o produto da PCR + a intensidade de fluorescência
Maior a quantidade de DNA alvo inicial = mais rápido mento da fluorescência;
Requer muito menos RNA
PCR em Tempo Real
Fluoróforos
TaqMan®,
Sybr®Green
Baixo custoSensibilidadeFacilidade de
trabalho Inespecificidade
Alta especificidade Caro
Curva de amplificação
Fase Geométric
a
Fase Linear
PCR em Tempo Real
Equipamento e reagentes caros;
É necessário um profundo conhecimento do equipamento e das técnicas de normalização.
Contras...
Essa técnica determina, simultaneamente, os níveis de expressão de milhares de genes (SCHENA et al., 1995)
São utilizados em experimentos de análise de expressão gênica em larga escala
Necessidade de se analisar a grande quantidade de informação gerada pelo sequenciamento genomico
Microarranjos de DNA (Chips de DNA)
Microarranjos de DNA (Chips de DNA)
Arranjo pré-definido de moléculas de DNA
(fragmentos de DNA genômico, cDNAs ou oligonucleotídeos)
quimicamente ligadas à uma superfície sólida
Passos relacionados Células cujo DNA possui os genes
de interesse são cultivadas em duas soluções
distintas: uma correspondendo à situação biológica normal (padrão),
outra correspondendo à situação a ser
estudada;
Recolhe-se o mRNA das duas soluções,
“marcando” os mRNA de cada solução
com uma substância fluorescente. Normalmente são utilizados corantes cy3 (verde) e cy5 (vermelho);
Passos relacionados
Passos relacionados 3. Os mRNA marcados são
misturados e aplicados nos microarranjos de DNA;
4. Ocorre a hibridização dos microarranjos com a
mistura de mRNA.
4. Ocorre a hibridização dos microarranjos com a mistura
de mRNA.
A base de um experimento envolvendo microarranjos de DNA é
o processo de hibridização. Somente os genes que
possuírem seqüências complementares aos mRNA
marcados deverão apresentar algum nível de expressão.
Os spots que contêm amostras marcadas com o fluoróforo cy3 devem aparecer na imagem como círculos verdes intensos, aqueles com amostras marcadas com o fluoróforo cy5 aparecem como círculos vermelhos, no caso de quantidades iguais dos dois corantes os círculos devem aparecer amarelos.
RNAseq Recentemente desenvolvida
◦ perfil de transcriptoma, utilizando tecnologias de deep-sequencing.
TRANSCRIPTOMA: o conjunto completo de transcritos (RNAs) em uma célula, e sua quantidade, para um estágio de desenvolvimento específico ou condição fisiológica.
RNAseq
RNA seq
RNAseq
Obrigado!