analysis of ten candidate genes in autism by association and linkage

4
American Journal of Medical Genetics Neuropsychiatric Genetics) 114:125±128 2002) Analysis of Ten Candidate Genes in Autism by Association and Linkage Anne Philippe, 1,2,5 Michel Guilloud-Bataille, 4 Maria Martinez, 3 Christopher Gillberg, 6 Maria Ra Ê stam, 6 Eili Sponheim, 7 Mary Coleman, 8 Michele Zappella, 9 Harald Aschauer, 10 Christiane Penet, 2 Josue  Feingold, 4 Alexis Brice, 2 and Marion Leboyer, 1,5 * and the Paris Autism Research International Sibpair Study 1 INSERM U 513, Ho Ãpital Henri Mondor, CreÂteil, France 2 INSERM U 289, Ho Ãpital dela PitieÂ-SalpeÂtrieÁre, Paris, France 3 INSERM U 358, Ho Ãpital Saint-Louis, Paris, France 4 Laboratoire d'Anthropologie Biologique, UniteÂdeRecherche deGeÂneÂtiqueEpideÂmiologique, Paris, France 5 Service de Psychiatrie, Ho Ãpitaux Albert Chenevier et Henri Mondor, AP-HP, CreÂteil, France 6 Department of Child and Adolescent Psychiatry, Go Èteborg University, GoÈteborg, Sweden 7 Centre for Child and Adolescent Psychiatry, University of Oslo, Oslo, Norway 8 Department of Pediatrics, Georgetown University School of Medicine, Washington D.C. 9 Divisione di Neuropsichiatria Infantile, Azienda Ospedaliera Senese, Siena, Italy 10 Department of General Psychiatry, University Hospital, Vienna, Austria We studied the possible involvement of ten candidate genes in autism: proenkephalin, prodynorphin, and proprotein convertase subtilisin/kexin type 2 opioid metabolism); tyrosine hydroxylase, dopamine receptors D2 and D5, monoamine oxidases A and B monoaminergic system); brain-derived neu- rotrophic factor, and neural cell adhesion molecule involved in neurodevelopment). Thirty-eight families with two affected sib- lings and one family with two affected half- siblings, recruited by the Paris Autism Research International Sibpair Study PARIS), were tested using the transmission disequilibrium test and two-point affected sib-pair linkage analysis. We found no evi- dence for association or linkage with intra- genic or linked markers. Our family sample has good power for detecting a linkage disequilibrium of 0.80. Thus, these genes are unlikely to play a major role in the families studied, but further studies in a much larger sample would be needed to highlight weaker genetic effects. ß 2002 Wiley-Liss, Inc. KEY WORDS: autism; linkage disequili- brium; linkage; sib-pair DATABASES: PENK GDB no. 156549); PDYN GDB no. 376650); PCSK2 GDB no. 215822); TH GDB no. 225009); DRD2 GDB no. 270166); BDNF GDB no. 162545); NCAM GDB no. 377827); MAOA GDB no. 156455); MADB GDB no. 155726) Paris Autism Research International Sibpair Study: Sweden. Department of Child and Adolescent Psychiatry, Go Èteborg University, Go Èteborg: Christopher Gillberg, Maria Ra Ê stam, Carina Gillberg, Agneta Nyde Ân. France. Consultation spe Âcialise Âe pour l'autisme infantile, Ho Ãpital Robert Debre Â, Paris: Marion Leboyer, Manuel Bouvard, Anne Philippe, Nadia Chabane and Marie-Christine Mouren-Simeoni; Service universitaire d'Explo- rations Fonctionnelles et Neurophysiologie en Pe Âdopsychiatrie, Ho Ãpital Bretonneau, Tours: Catherine Barthe Âlemy. Norway. National Centre for Child and Adolescent Psychiatry, University of Oslo, Oslo: Eili Sponheim, Ingrid Spurkland; Department of Pediatrics, Rikshospitalet, University of Oslo, Oslo: Ola H. Skjeldal. USA. Department of Pediatrics, Georgetown University School of Medicine, Washington D.C.: Mary Coleman; Children's National Medical Center, George Washington University School of Medicine, Washington, D.C.: Philip L. Pearl; New York State Institute for Basic Research in Developmental Disabilities, Staten Island, New York: Ira L. Cohen, John Tsiouris. Italy. Divisione di Neuropsichiatria Infantile, Azienda Ospedaliera Senese, Siena: Michele Zappella, Grazia Menchetti, Alfonso Pompella. Austria. Department of General Psychiatry, University Hospital, Vienna: Harald Aschauer. Grant sponsor: Assistance Publique-Hopitaux-de-Paris; Grant number: PHRC AOM95076 and CRC Number 932413; Grant sponsor: Association Franc Ëaise Contre les Myopathies; Grant sponsor: France Telecom; Grant sponsor: Fondation Lilly; Grant sponsor: Swedish Medical Research Council; Grant num- ber: K97-21X-11251-03CK. *Correspondence to: Marion Leboyer, INSERM U513, Ho Ãpital Henri Mondor, 8, rue du Ge Âne Âral Sarrail, 94010 Cre Âteil Cedex, France. E-mail: [email protected] Received 14 June 2000; Accepted 2 August 2001 ß 2002 Wiley-Liss, Inc. DOI 10.1002/ajmg.10041

Upload: anne-philippe

Post on 06-Jun-2016

213 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Analysis of ten candidate genes in autism by association and linkage

�������� ����� ������� �������� ���������������� ��������� ����������� �� ��

�������� !�� "�������� ����� �� ������ #���������� ��� $��%�&�

���� '�������(�(�(� ������ �������)*�������(� ����� �������+(, "��������� ����#��&(-

����� .�/����(- 0��� 1������(2 ���� "�����(� ������� 3�������(4 5����� ��������(�

"��������� '����(� ���6 7���&��(� ���8�� *����(� ��� ����� $�#���(�(�9 ��� ��� '���� ������.������� :����������� 1�#���� 1����������� � �� � ������ ����� � �� �� ��������� ������������� � ���� � ������ �� �� ������ ����������!��� ����"� ������������ � �� � ������ ����� # $�"� ����"� ������%#�& ��� ��� �'(��)� � � *�� +� � *�,$�� ������ �� ���)���)� �� -�������,$� ������.� � *�,$�� ����"� ���������/��� �� �"0�)������� � �����$1 (�&��� �)���/��� �� ����� � �� �� (� ��� ��������� ������23�����.��� 4 �)��� ��� (� ��"���� �"0�)����0� - 5��& �* ���/��"��0� - 5��& �*� �6����7������ 4 � �)��� ��� (� ��"���� �"0�)����0� ���/��"��0 4 8"� � 8"� � � �6�0�3�����.��� 4 ���������"� -� �*�� 6� ���/��"��0 ��) � 4 ��������� 9�")��*� � 3:�:�3�/�"� �� �� ��$� �"��)������ ��4������� (;����� 8"��������� ����"�� ������ ����0�<3�����.��� 4 -������ �"0�)����0� ���/��"��0 � "������ =������ ($"����

;� ������� ��� ����#�� ��<�<����� ������������ &���� �� ������� ����%�������(����������( ��� �������� ��<������

��#�������=%�8�� ���� � ����� ����#�����>������� ����8�����( ������� ��������?� ��� ?�( ������� 8������ � ��� *���������&�� �������> #����)����<�����)������� ����( ��� ������ ���� �������������� ���<�<�� �� ������<��������@!�����)��&�� ������� A��� �A � ����� ��#)���&� ��� �� ����� A��� �A � ����� ��� )��#���&�( ��������� #� ��� '���� ������.������� :����������� 1�#���� 1�����'�.:1�( A��� ������ ����& ��� ���������������B����#���� ���� ��� �A)���� � �������#)���� ���%�&� ��������@ ;� ��� � �<�)����� � ��������� � ���%�&� A��� �����)&���� � ���%�� ���%���@ C�� ����� ��������� &� �A�� � ��������& � ���%�&�����B����#���� @� @ !���( ����� &������� ����%��� � ���� � ��D� ��� �� ��� ������� �������( #�� ������ ������� �� ����� ���&�� ������ A��� #� ������ ���&���&�� A��%�� &������ � ����@� � � ;����)$���( :��@

E0F ;C.?1� ������> ���%�&� ����B����)#����> ���%�&�> ��#)����

?�!�*�101� '0�E ��?* �@ ��-��4�>'?F� ��?* �@ ,2--� �>'"1E� ��?* �@ �������>!5 ��?* �@ ��� 4�> ?.?���?* �@ �2 �--�> *?�7��?* �@ �-�����> �"����?* �@ ,22��2�> ��C���?* �@ ��-����> ��?*��?* �@ ���2�-�

����� ����� ������ ������������� ������� ������ �6�������������� �� � ��� ��� ���������� ���� ������ ��������� ��!������� ���������� � ������ �� ��������� "���� �#���������� ��������� ������ $���%�� ������� ������������ ���%�������%����� �&������ ���������� '�(����� ����� �����%� ������ "�����)������� "����� *��!���� ���� � ������� $���� � ����� ���"����+� ������� "�����+������, ���!��� ���!��������� �&-.���+������� /������������� �� $����� ��������� �� ��%������ �������'�(����� *���������� 0����� ��� ����� *��� �%���� � �6�0�$������� ������ ��� � ��� ��� ���������� ���� ������ ��!�������� 1���� 1���� -��� ���� ��� ������ ����2����, ��������� ������������� �2� ���������� ��!������ �� 1���� 1���� 1�� '��23������ ��(� ��������� �� ����������� ��������4� ��!�������� ��� �� "�������� 5�� ������ ����� "��� ������, � ������&�$������� "������ ������� ������ 5�� ������ ��!������ �� ����� "�������� 5�� ������� ����� � ���� )� �����, $�4 6��2 �������������� ��� *���� ������ �� ��!��������� ������������� ������������� $�4 6��2� ��� )� �� ��� 7� � 0�������� ����0� ��!������ ��$�������� ������ ���������� �8����� 1���������� ������� ������"�� ��� 9�������� ���8�� "��� ����� ������� �������� ($"�������������� �� ������� ���� ������ ��!������ '�������� :������'����� ��� �����

����� �������� ���������� �����;��+'������.+��+�����, ����������� �'� �1"<=>?@ ��� �� $���� <ABCDA,����� �������� ����������� /����E���� ������ ��� "����� ���,����� �������� /����� 0�����, ����� �������� /�������� )����,����� �������� �4���� "������ ������ �������, ����� ��+���� F<?+BDG+DDB=D+>A�F�

H�������������� ��� "����� )������� �$�-" =DA� '�(�����'���� "������ I� ��� �� ��%��%��� �������� <C>D> ���%���� ����.�/������ -+���� "������)������J�A���������

����!�� DC 7��� B>>>, �������� B ������ B>>D

� � � ;����)$���( :��@?C: � @� �=�D�&@� ��

Page 2: Analysis of ten candidate genes in autism by association and linkage

:�!.C?G"!:C�

������� ���������� ���2 ��� �4�� ������� �!������������ � � �.������� �� � ������� �������� ��� � �������� �� ����� K"�" $�� B><I=>L� � � ��� ���� �������� �� 4 �� �� ��2��4� M������� D<<?N� "��� ���� ���� �!� ���� �������� �� ������� ��� � ������� �� ������ 1�� �� � �� ����� ������� ����.�����!� ����� ������ ����!��� ������ � � �������������� M���2����� D<?<N� 5� �!� ����������� � ��� ��� ��� ����� ����������� ���4��� ����� �+ ��� $+��������� �������� �+������ �� ����������!����� ���������� � ������ M)������ �� ���� D<<CN�5� �.������ � �� ���� �� �� �������� � ��� ���������

����� ��!��!�� �� ������ ��������� �����2�� ����K�-$FL� ��������� �� K��6$L� ��� ���������� ���+!������ ����������O2�.�� ���� B K���FBL� ����!������4�� ����� ������� ���� ����� ������������ ����������� 0 �� ��� �� �� ���� ����� ��!��!�� ������������� �������� �� 4��� M"�������� �� ����D<<BN� � ������!� ����������� ���4��� � � >�, � )/�������� �� �� � � ������� �B �������� ��� ����� �� ���� �������� M������ �� ���� D<<DN� 0 � �����+���������� ������ ������� �� �� ������ D ��� � � +*��� ������� �� �� � � �������� ����.����� ���� �!���� ���� � �4� �� �� ���������� 4�� ����� M�������� ���� D<<D, '�%����� �� ���� D<<AN� ��� � ��� ������� ����� ����+������� ������� 5� �������� � � �����4������������ ����� ��!��!�� �� ����������� �������+����� ������� ��������� �B K��BL ��� �= K��=L��������� ����.����� K0'L� ��� ������� �.������ �K"�1�L ��� * K"�1*L�/������� �������� �������� ������� ��� ��������

� ����� �� � � ����� ��� ��4 ���� ��!��� �� ���������� �� ����� ������� K$��"L M�������� �� ���� D<<>N�5� � ������� ������� �4� ����� ��!��!�� �� ���!�������� ��!�������� � ��� �������� �����+����!����������� �� ������ K*�$/L ��� $��"� 5� ��!����+����� �������� ����������� ���O�� ���2��� ���4��� � ������������ ����� ��� ����� ����� � � ���������������;�������� ���� ��� �4�+����� �������� ���+�������������

��!0.:�$1 ��? �0!5C?1

7�������

/������ 4�� �� ����� �4� �������� �� ���+�����������P����� � � ��" �: �������� ��� �������� ��������M������� ���� ������ ������������ D<<CN ��� � ������ ���������� �����!��4 ������� ��� ���+D>� ��� ��� ����� M)��� �� ���� D<<CN 4��� ��������� ���� �����������!� ����� ���+���� ���3��� K����L� 0 �������� �������� �� � �� ����� 4��� ��������� ������D<<@� �� ���� �� � �� ���3���� � �����+4��� ���� ��� ��� ������� K���� ���������� ������� ��������� ��D<<?L 4�� ������� ��� ��� �� ���� �������� M� �������� ���� D<<<N� ���3���� 4��� �������� ����� � ������ ��������������� �.��������� ��������� �������� ���������������� 2���������� ��� �������+G �������� ������������ ��� ����� ��� ����� ��������� ���3���� 4�� 2��4� ������ ���������� ���������� 4�� ����� 4����.������� 0 � ����� 4�� �����!�� �� � � �� ����

�������� �� � � ������������� ������8������� �����+�� ������� ���� 4��� �������� �� � � ��������

��������&

*���� ������ 4��� ��������� ��� � ������ ��� � ���������� ��� �$� 4�� �.������� ��� ��� ������ ���������� ����������� ��� ������� ��� ��� �������;������ ��� �!������� ��+���� ��� � � ������������� K��*� ����OO���444��������O���OL� 0 ����������� �������������� ��� �-$F K��* ������������ D=@=C<L� ��6$ K��* ��������� ��� A?@@=>L� ���FBK��* ��������� ��� BD=IBBL� 0' K��* ��������� ���BB=>><L� ��B K��* ��������� ��� D=@D?<L� ��=K��* ��������� ��� B?>D@@L� *�$/ K��* ��������� ���D@B=C=L� $��" K��* ��������� ��� A??IB?L� "�1�K��* ��������� ��� D=@C==L� ��� "�1* K��* �����+���� ��� D==?B@L 4��� ����P�� �� �� ����� ������������������� ������� ���������� 4��� !����� ����������� � � ������ ����� �� �������� 4��� ��������� ���������� ������ �� ���������� @Q ������������� ��������������+������� ���� � ����� ����� �������������� 4�� � ����� =�+������� 4�� K�AB�L+��0� ����������� �� ������������� �� /�� ��� ��������� �����4� ��������� ���� ������ ������������� ��2�����C�CDB� �C�C>A ��� ��=, �I�=AB� �I�BI=��I�D@@� �I�D?@A ��� �-$F, �DD�<<B ��� 0',�DD�<>C� �DD�<A= ��� *�$/, �DD�I<I� �DD�CDCB��� ��B ��� $��", �B>�DDA ��� ��6$, �B>�DI<��B>�D>D ��� ��F�B, �G�DB>B� �G�D>@I� �G�D>>A ���"�1�� ��� "�1*� 0 �� 4��� ����P�� ����� R���+������ ���+������� ������ ��� �����8�� �� ���!��������������� M� ������ �� ���� D<<<N�

1���������� ������

���� 4��� �����8�� �� ���2��� ����;�������� ������2��� ������ ��� � ����� �� AI ������� 4�� �4� ���������������� ��� �������� ��2��� ��� �� A< ������� ��� G� ������ ��2����0� ���� ��� ���2��� ����;��������� 4� ���� � �

��2��� ���+����� ������� �� � � ����������� �������+����O����;�������� ���� K"0�0L� ��!������ �� 0��4��+����� M0��4�������� D<<=N� �� ��������� �� � �0�0��2� ������ �� � � �����8� ���2��� M���������� -4���� D<<@N� �� ��� ������ �� � � �� ������������ ��� ���+���������� ������� 4�� ���� � ��P!�� � ��� ������� 4��� ���������� "0�0 �����P������� ����� �� � ������ ���� �� ��� �������� �� �������.�������� � � "0�0 �� !���� �� � ���� �� ����������� ������ ������������ �� � ������ �������� ����!����� �������� ��� ������� M������� ��� -4���� D<<@N������� �� � � ���2 �� ������������ ���4��� ���������0 �������� ����������� �������� 4�� ���������� ����+��� ��� ��� � � ��������� ����� ������ 4�� ���+������ �� ���������� �� ������ ��� �������� � ��� ��������� 1��� ������� �� 4 �� ��� ������� �� ������������� 4��� �������� �� � � ����������� ����� ����������� ��2����04�+����� �������� ���+���� ���2��� �������� 4��

�������� ��� ������� ��� ���������� ��� ��3������� ��������� ����� ����� � � ��*��� ������M0��4�������� D<<@N� 4 �� ���!���� � ��2��� ���+�����

��- '������� �� ��@

Page 3: Analysis of ten candidate genes in autism by association and linkage

���� ��������� ��� ���2���� 0 � ��2��� ��� �!�� ��� ��������� �.��8�� �� � �������� �� � � ���;����� �� ��2��������� ��������� �� ������� K�L ���� �������� ����� 0 ���2��� ��� ����� ���� ���������� 0� �� ����������� ��� ������ ���� � � ���� ���� ���� �� �� >�= K0� B)�M)K�LO)K��>�=LNL� 0 �� ��������� �����4� � � �+�;���� ��������+���� 4�� ��� ������ �� ������ ��� ��� � �� ���.������� �� � ��� ������ ")��0OB��KD>L�

.01G$!1

0 ����+��� � ������� 4�� �4� �������� �������� ������ ����� 4�� �4� �������� ���+�������� 4��� ���+��8��� /��� �������� ���������� 4�� �!������� ��� ���������� �.���� � ��� ��� ���� ��� ������� 4��� �����+����, DA ��� ��� /������ DB ��� �4����� P!� ���$��4��� ���� ��� � � ��� � ��� ��� ������ ��� �4���� �������� 0 � ��� ��� �� � � �������� 4�� D@�=����� K������ P!� �� C@L ��� � � ��. ����� 4�� A�D K=<���� ��� D< ������L� $��� �� � � ��������� ������2��� 4�� �����P������ ���������� 4�� ��������������� �� "0�0 K0���� �L� 04�+����� �������� ���+���� �������� ���!���� �� �!������ ��� ���2��� ���4�������� �����2��� ������� 4�� �� �� ����� �� � � ����������� K0���� ��L� /�� "�1� ��� "�1*� � ��� 4�� ������������ �� � � ������������ �� ������� ��������� ��������� ���4��� ���+���� �����+���� ��� �����+����� ���+����� K���� ��� � �4�L�

?:1"G11:C�

5� ��!��������� � � �������� ��!��!���� �� ������������ ����� �� ����� �� ����������� �������+����O����;�������� ����� ��� �4�+����� �������� ���+���� �������� �� A< ������� ��������� ?I ������������!������� $��� �� � � ��2��� �� ��������� �����4� �.����� � �4�� ����������� �����P����� ��� ����+������� �� ���2��� �� � �� ������1�� ������� ���P� � � ������� �� �� �����������

���4��� � � ��������������� ������ ������� �� �������� D �� � � 0' ���� ��� ������ �� ���!�������������� �� � ����+������� ����� M'�%����� �� ���� D<<AN� ���2� ������ �� ��� MD<<=N� 4� ����� �� �!������ ������������� ���4��� ��B ��� ������ '�4�!��� ���������� ��� ��� �������� ��������� 4�� � ��� �������� �� ��: MD<<=N ������� � � ������� ������� +��� ������ ������ ���4��� � � �4� �������� �� ���������

� � ����� �� ������ �� ��� MD<<=N �� � ��������� ����+������� ����� 4�� � �� ���2 �� �����+������!� �������+���� ��� �� ���������� ������P������, 4� ���������� � �����2 �� ����� ��������� �������� K0�0L�5� ���� ����� ���!������ �� ���2��� 4�� ���������� ��2��� �� ��B��� � �� �� ��� ������������ 4�� � � ������������������� �� ������ �� ��� MD<<=N�1�� ����� �� ���� ����������� ��4�� ��� ��������� �

���2��� ����;�������� �� >�I� ���������� � �� � �������� ��� �� � � ��������� ����� ������ ��� ������������� 4�� � ������ ��������� ���� �� ������$�!��� ������ ��� ��4�� �� ������ ������������ ��4��2�� ������ 4�� ������ �� � � �!������� ����� ��8���� ���������� �����+����� ������� ��� ��;����� �� ������� � � ��!��!���� �� � ��� ����� �� ������

�"E�C;$0?��0�!1

5� � ��2 � � ���3���� ��� � ��� ������� ��� � ��������������� 5� � ��2 ������ /���� ��� $�� ����� �%��� ��� ��� ����� ��� �� � � ��%��%� �� ��� ���7��2� *��� 6������ ��� ��� ��� ����S� ���8�� ������ ����� ���������� �� � � �$�-" BI< ���� 0 �4��2 ���P��� �� � ����� ��� � � /�������� ���� ���� ��� � "�%������ K����L�

0�*)- �� "����������� 0��������� ����;�������� 0��� ��� � �"��2��� )������ 5�� �� � � ��������� �����

)���� )�������

0����������� �������

$������ ������������� � !����

��= C�D=+�D=�A D> ? >�CI?�-$F I;DD�BA+;DB C B >�A<A0' DD�D=�=+�D= = = >�C>=*�$/ DD�DD�B+�DA C C >�D=B��B DD;BA�D C C >�=>>$��" DD;BA�D D> ? >�BC=��6$ B>������DB = A >�D@I��F�B B>�DD�D+DD�B @ = >�=>>"�1� G�DD�BA ? @ >�C@C"�1* G�DD�BA @ = >�C=<

0�*)- ��� "�.�� )�� ����� K")�L :����� ��� 04�+������������� ���+���� ��������

)������������������������

04�+����� ��������

")� � !����

�C�CDB A<�?Q > >�=>>��= ?�CQ > >�=>>�C�C>A > >�=>>

�I�=AB B>�CQ > >�=>>�I�BI= D>�IQ > >�=>>�-$F A�BQ >�DB> >�BBC�I�D@@ B�=Q > >�=>>�I�D?@A >�>D> >�C@>

0' C�AQ >�BD> >�D@C�DD�<BB >�D<> >�D?>

�DD�<>C I�>Q*�$/ <�>Q >�><> >�CB>�DD�<A= > >�=>>

�DD�I<I D<�DQ >�>B> >�A?>��B A�AQ > >�=>>$��" @�?Q >�>>< >�CB>�DD�CDCB > >�C=>

��6$ >�>DQ >�>C> >�AA>�B>�DDA >�BB> >�D@>

�B>�DI< I�@Q > >�=>>��F�B DD�DQ > >�=>>�B>�D>D > >�=>>

�GDB>B D?�@Q >�CD> >�>IC"�1 * =�=Q >�=>> >�>@C"�1 � >Q > >�=>>�G�D>@I DC�<Q >�><> >�B@>�G�D>>A >�>>D >�C?>

������������ ��������� 4��� �������� 4�� ������� �� � � ��.� ��2��������� ���;������� 4��� �������� ��� � � ���� ����� � � �)�$F ��������� � � )��2��� ����4��� ���2��� M)�� ��� ��� )������� D<ICN�

�������� !�� "�������� ����� �� ������ ��2

Page 4: Analysis of ten candidate genes in autism by association and linkage

.070.0�"01

������� ���� ������ ������������ D<<C� ���������� ��� ����������� ������� ����� ���������� C� ��� 5�� ������� ���

������ �-� ������ *�� "� ���� �� ����8 �� � � �� ��� *� 0��� ��F���� -� *�������� � F�!��� *� )�!� �)� ��� "� *������ � -!������ F���� �� "��"����� 7� 0��2 7"� �!��� 7� ����� � /������� ��D<<D� 0 � ������� �B �������� ����� �� � �������� ���� ����������� ������ ���������� 7�"� B@@�D?<ATDI>>�

������ �-� ���� � "� ���� �� �!��� 7� D<<=� $� ����������� �� ��������� ����.����� ���� ��������������� ������ ������� �� �������� 0������� �������� �� ��'�� *��� ���� ����� A?�CICTCI@�

'�%����� 7� ������ �� *��� �%��%� �� *��� ��� "� � ���� �� )������ "����!��� �� )�����"� "����� 7� "�� 7�� D<<A� �������� ����������� �� �+ ��!��+���+D K'��+DL ��2�� 4�� ������ ���� ����� �� C@�B@DTB@?�

)�� ��� �"� )������ 7"� D<IC� -��� ������������ �� )1� ������ ���������� ���2� �� ���� ��������� � 7 '� ����� A@�C@>TC@=�

)������ "� *��!��� "�� ������� �� � ������ �� ��������+*������� "�*�����. �� 0������� /� ����� "� ���2���� 7� )����� 7"� D<<C����������� ���4��� ����� $+ ��� �+��������� �������� �+������ ������������!��� �� ��������� ������ � 7 ���� ����� D=D�D?<?TDI>D�

)��� �� ����� "� )� ������� �� D<<C� ����� ���������� �����!��4+��!����� � ��!���� !������ �� � ���������� �����!��4 ��� ������!��� ������!������ 4�� �������� ���!���!� ��!��������� ���������� 7 �������! ������ BC�@=<T@I=�

"�������� 7� *��� �%��%� �� 7��!� 7� "� 7�� )����� �� D<<B� "��������K��������� ��� ����� �������L ��� � ��� ����!���!�� �� ��������������� ���+������� � ����� ��� ���� �������� ��! "�� � ��� $�����AC�=<AT@>A�

���2���� 7� D<?<� � ������ ����� � ���� �� ������ 0����� $�������B�D?CTD??�

� ������ �� "������8 "� ��������+*������� "� �������� �� �#��� "����� �� -� ������ "� 9������� "� ��� ���� '� !�� "�������� )������ �� /������� 7� *���� �� )������ "� ����� ����� ������ ������������� ������� ������ D<<<� �����+4��� ���� ��� ������������������� ������ '� "�� ����� I�I>=TIDB�

�������� �:� '���� �-� ���� �"� D<<>� -.�������� �� � ������ ������ ����� ������� ���� ������� �� ��������� �� ������ 7 $�����+��� ����� ���� $������� B�CDATCD?�

������ �)� D<<?� *� �!����� �������� &<?� ������� ��R������ �� � ��� ���+����� ���� ������ ���������� ����� ��� ���������+��P���O ��������!������������ � 7 '� ����� @>�DB?@TDBIB�

������� �� -4��� 57� D<<@� 0 � 0�0 ��� �� �� �����+����� �������� ���2��� ����;�������� ��� ������������ � 7 '� ����� =<�<IAT<I<�

0��4������� 7� D<<=� � ��4����� ��2��� ��� �� �� ��� � � �������� �����2��� ����;�������� ���4��� ����� ���� ��� ��� �� ��� ������� ����2�� ����� � 7 '� ����� =@�???T?I?�

0��4������� 7� D<<@� ������ ��*���� ������� �������� �� ��������������� ����OO���2��������������������

��� '������� �� ��@