analiza widm masowych - uniwersytet wrocławski
TRANSCRIPT
ANALIZA WIDM MASOWYCH
OBSŁUGA PROGRAMU DATA ANALYSIS(Bruker Daltonics)(Bruker Daltonics)
W ramach przedmiotu:
Metody fizykochemiczne (L)
I rok Mgr Chemia biologiczna
Prowadzący mgr Karolina RadziszewskaProwadzący:mgr Karolina Radziszewska
1© 2012 Karolina Radziszewska
DATA ANALYSIS 3.4 (Bruker Daltonics)
Oprogramowanie kompatybilne ze spektrometrami masowymi firmyOprogramowanie kompatybilne ze spektrometrami masowymi firmy
Bruker Daltonics
Wymagana licencja użytkownika
Dostęp z komputerów Laboratorium Spektrometrii Mas Wydziału Chemii UWr
(LW‐07)
Pozwala na analizę widm masowych zapisanych w formacie *.bafPo wala na anali ę widm masowych apisanych w formacie .baf
2© 2012 Karolina Radziszewska
IMPORT DANYCH Z PLIKU *.BAF
Każdy folder zawierający widma masowe oznaczony jest rozszerzeniem *.d
Wewnątrz możemy znaleźć następujące pliki:
Zawiera dane dotyczące
metody pomiaru
Główny plik zawierający
widmo masowe
Pliki pomocnicze
3© 2012 Karolina Radziszewska
IMPORT DANYCH Z PLIKU *.BAF
Aby otworzyć widmo masowe należy dwukrotnie kliknąć LP myszy na ikonie:
lub zaimportować dane bezpośrednio z poziomu programu uruchamiając go
z Paska programów:z Paska programów:
pojawi się okno startowe
4© 2012 Karolina Radziszewska
pojawi się okno startowe…
IMPORT DANYCH Z PLIKU *.BAF
…a następnie główne okno programu
5© 2012 Karolina Radziszewska
IMPORT DANYCH Z PLIKU *.BAF
…lub w wersji 4.0
6© 2012 Karolina Radziszewska
IMPORT DANYCH Z PLIKU *.BAF
Aby zaimportować widmo masowe klikamy FILE na pasku głównym:
Następnie OPEN:
I z odpowiedniego folderu wybieramyInteresujące nas widmo masowe:
7© 2012 Karolina Radziszewska
PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE
Zaimportowane widmo masowe zarejestrowane na aparacie micrOTOF‐Q zapisane jest w formie chromatogramu:
Zależność prądu jonowego TIC (ang total ion current)Zależność prądu jonowego TIC (ang. total ion current) od czasu trwania pomiaru
8© 2012 Karolina Radziszewska
PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE
Aby przekształcić chromatogram na uśrednione widmo masowe należy kursor myszy
ustawić na początku osi czasu w obszarze chromatogramu, a następnie trzymając wciśnięty
PP myszy przeciągnąć kursor do końca linii chromatogramu:
droga kursora myszydroga kursora myszy
Miejsce ustawienia kursora
i wciśnięcia PP myszy
Miejsce zwolnienia PP myszy
9© 2012 Karolina Radziszewska
i wciśnięcia PP myszyy y
PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE
Pojawia się dodatkowe okno, w którym znajduje się uśrednione przez nas widmo masowe:
10© 2012 Karolina Radziszewska
PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE
Aby móc przeprowadzić analizę na danym widmie masowym należy najpierw je skopiować.
W tym celu klikamy PP myszy w obszarze widma – pojawia się okno, w którym LP myszy
klikamy COPY TO COMPOUND MASS SPECTRA:
11© 2012 Karolina Radziszewska
PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE
Nasze uśrednione widmo masowe zostało skopiowane:
12© 2012 Karolina Radziszewska
PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE
W tej chwili w programie mamy otwarte cztery okna:
Chromatogram
Lista otwartych plików wraz
ze składowymi
Uśrednione widmo masowe
k i idSkopiowane widmo masowe
13© 2012 Karolina Radziszewska
PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE
Do dalszej pracy zamykamy Chromatogram i Uśrednione widmo masowe:
KLIK
14© 2012 Karolina Radziszewska
PRZEKSZTAŁCANIE DANYCH Z CHROMATOGRAMU NA WIDMO MASOWE
Tak powinno prezentować się główne okno programu:
15© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
Widmo masowe przedstawia zależność m/z czyli masy związku do jego ładunku (oś X) wraz
z intensywnością danego sygnału dla odpowiedniej wartości m/z (oś Y):
Intensywność
Wartości m/z
16© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
Na widmie obserwujemy wiele sygnałów (pików) pochodzących od jonów związków
o określonej wartości m/z:
Wartość m/z
17© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
Jednak obserwujemy również sygnały o niskiej intensywności, dla których nie ma
przypisanych wartości m/z. Aby je dokładnie obejrzeć musimy powiększyć obszary widma:
Sygnały o niskich yg yintensywnościach
18© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
W tym celu możemy skorzystać z narzędzia powiększania na dwa sposoby.
Kliknąć LP myszy w ikonę LUPY na pasku narzędzi – zmiana kursora na krzyżyk z lupą:
19© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
Przy pomocy tak zmienionego kursora z wciśniętym LP myszy otaczamy sygnał bądź obszar,
który chcemy powiększyć:
20© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
Po czym puszczamy LP myszy i otrzymujemy widmo powiększone w wybranym przez nas
zakresie:
21© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
Powiększanie możemy powtarzać wielokrotnie do odpowiadającej nam skali, jednak
za każdym razem należy na nowo uruchomić narzędzie LUPY przez jego zaznaczenie:
Wskazówka:Narzędzie lupy uruchomić można również
poprzez przytrzymanie lewego klawisza Shiftpoprzez przytrzymanie lewego klawisza Shift na klawiaturze. W momencie kiedy go trzymamy narzędzie działa i pozwala
na wielokrotne powiększanie.
22© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
Innym sposobem zmiany zakresu na widmie jest przesuwanie osi X.
Gdy będziemy przesuwali skalę z wciśniętym LP myszy przesuwać się będzie cały zakres:
23© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
Gdy będziemy przesuwali skalę z wciśniętym PP myszy będziemy rozszerzać dany zakres:
24© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
Aby powrócić do wcześniejszego widoku całego widma wystarczy w jego obszarze
dwukrotnie kliknąć LP myszy lub po wciśnięciu PP myszy wybrać z listy AUTO‐SCALING:
25© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
Wartości m/z podane są z dokładnością do miejsc dziesiętnych. Na takim sygnale ciężko
jest określić wartość ładunku, dlatego należy zwiększyć dokładność m/z.
W tym celu klikając PP myszy wybieramy DISPLAY PARAMATERS a następnie zwiększamyW tym celu klikając PP myszy wybieramy DISPLAY PARAMATERS…, a następnie zwiększamy
wartość w polu MASS PRECISION.
Wskazówka:Podając 3 miejsca ją j
po przecinku możemy poprawnie określić wartość ładunku w danym sygnale y yg
na widmie.
26© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – FORMATOWANIE WIDMA
Na widmie masowym pojawiają się wartości z dokładnością do 3 miejsc po przecinku:
27© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Wybierzmy jeden sygnał na widmie i przypiszmy mu ładunek:
28© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Po powiększeniu danego piku obserwujemy:
Piki izotopowe
Pierwszy pik:
Piki izotopowe
y pPik monoizotopowy
29© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Taki układ pików izotopowych, z których pierwszy pik monoizotopowy nie jest najbardziej intensywny, wskazuje na dużą cząsteczkę (najczęściej polipeptyd lub białko) bądź na układ zawierający dodatek izotopów pierwiastków, np. deuter.
Pierwszy pik:
Piki izotopowe
Pierwszy pik:Pik monoizotopowy
30© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Na pierwszy rzut oka wydaje się, że kolejne piki izotopowe dzieli różnica 0,2. Aby to dokładnie sprawdzić wykorzystujemy narzędzie ANNOTATION >>> ANNOTATE.Przy kursorze pojawia się litera „A”.
31© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Po ustawieniu kursora – trójkąt poniżej kursora, na odpowiednim piku i trzymając wciśnięty LP myszy przesuwamy go na kolejny pik. Po zwolnieniu LP myszy pojawia się wartość –różnica między kolejnymi pikami izotopowymi na widmie.
32© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Wykonując tę czynność na wszystkich pikach uzyskujemy średnią wartość różnicy między pikami izotopowymi jako 0,200.
33© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Aby wyłączyć narzędzie wchodzimy w ANNOTATION i odznaczamy ANNOTATE.
Innym sposobem na uruchamianie narzędzia ANNOTATEw trakcie analizy widma y p ę ymasowego jest wykorzystanie klawisza Alt na klawiaturze. Wciśnięcie i przytrzymanie powoduje aktywność funkcji ANNOTATE. Gdy puścimy klawisz Alt nadal możemy analizować widmo przy użyciu normalnego kursora.
Aby przypisać ładunek musimy widzieć, że różnica między pikami izotopowymi jest od niego ściśle zależna. I tak dla ładunku:
+1 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 1,000
+2 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0,500
+3 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0,333
+4 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0,250
+5 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0,200
+6 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0,167
+7 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0,143
+8 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0,125
+9 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0,111
34© 2012 Karolina Radziszewska
+10 różnica między kolejnymi pikami izotopowymi wynosi 0,100
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Zatem w naszym przypadku skoro różnica wynosi 0,200 to sygnał odpowiada cząsteczce o ładunku 5+.
35© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Innym sposobem przypisania ładunków sygnałom na widmie masowym jest wykorzystanie odpowiedniego narzędzia, który przypisuje te wartości w sposób automatyczny.W tym calu wchodzimy do zakładki DECONVOLUTE, a następnie PARAMETERS:
36© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Wybieramy zakładkę MASS LIST a w niej typ Peak finder: SNAPNarzędzie to pozwala na przypisanie ładunku dla cząsteczek o naturalnym rozkładzie izotopowym (bez dodatków innych izotopów, np. deuteru).
Pozostawiamy wartości ustawionePozostawiamy wartości ustawione standardowo, jedynie w przypadku
Maximum charge state jeśli spodziewamy się że widmojeśli spodziewamy się, że widmo
masowe przedstawia dużą cząsteczkę wielokrotnie naładowaną, np. białko, warto zwiększyć tę wartość do np. 15.warto zwiększyć tę wartość do np. 15.
Zatwierdzamy parametry klikając OK.y p y ją
37© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Aby wykonać dekonwolucję widma w celu przypisania ładunku w zakładce DECONVOLUTEklikamy w MASS SPECTRA lub wybieramy F4 na klawiaturze.
Po chwili na widmie pojawią się wartości ładunków, jeśli nie wchodzimy w zakładkę MASS LIST klikamy CLEAR a następnie FIND.
38© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
Narzędzie automatycznego przypisania ładunku pozwala na analizę całego widma masowego i oszacowanie ilości i rodzaju związków obecnych na widmie.
39© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – PRZYPISANIE ŁADUNKU
W tym przypadku mamy do czynienia z widmem masowym jednego związku o wysokiej masie cząsteczkowej ok. 4000 Da. Świadczy o tym charakterystyczna obwiednia, tj. seria sygnałów odpowiadających kolejnym ładunkom od 3+ do 7+.
Wskazówka:Taki układ pików na widmie jest j
charakterystyczny dla widm ESI dużych peptydów lub białek.
40© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU
Mając przypisane ładunki do odpowiednich sygnałów na widmie oraz wiedząc, które z nich pochodzą od jednego związku możemy obliczyć średnią masę cząsteczkową.
k dl ś ł d kI tak dla wcześniej wyznaczonego ładunku 5+:Wartość piku monoizotopowego m/z wynosi 824.043Ładunek czyli z wynosi 5
Dla ogólnego równania: m/z = (Mcz+z)/zMcz = m/z*z – z
Zatem:Zatem:Mcz = 824.043*5 – 5 = 4115.215 Da
Aby wyznaczyć średniąmasę cząsteczkową należy obliczyćmasy dla poszczególnychAby wyznaczyć średnią masę cząsteczkową należy obliczyć masy dla poszczególnych ładunków, a następnie wyznaczyć średnią. I tak:
3+ 4115.229 Da3+ 4115.229 Da4+ 4115.220 Da5+ 4115.215 Da6+ 4115.220 Da
41© 2012 Karolina Radziszewska
7+ 4115.216 Da Mśrednia = 4115.220 Da
ANALIZA WIDM MASOWYCH – OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU
Innym sposobem wyznaczania średnich mas cząsteczkowych, w przypadku widm ESI dla peptydów i białek, jest wykorzystanie wzoru:
p1 = (M + z)/z( )/( )p2 = (M + z‐1)/(z‐1)
gdzie: p – oznacza wartość m/z piku danego związku dla kolejnych ładunków
p1
p2
42© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU
Wyznaczenie średniej masy cząsteczkowej można wykonać automatycznie w programie wybierając metodę dekonwolucji. Powoduje ona przekształcenie widma masowego z zależności od m/z na zależność od masy.
h d kł dkWchodzimy w zakładkę DECONVOLUTE >>> PARAMETERS
Następnie zakładkę CHARGE DECONVOLUTION i bi j MAXIMUM ENTROPYi wybieramy opcję MAXIMUM ENTROPY
Ustalamy zakres mas
Wskazówka:Wcześniejsze oszacowanie masy
na podstawie ładunku pozwoli na wybranie węższego zakresu mas, a co za tym idzie
szybszą dekonwolucję widma.
Z t i d OK
43© 2012 Karolina Radziszewska
Zatwierdzamy OK.
ANALIZA WIDM MASOWYCH – OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU
Aby uruchomić dekonwolucję widma klikamy DECONVOLUTE >>> MASS SPECTRALub z klawiatury F4. Po przeliczeniu pojawia się nowe widmo masowe
d l ść d kprzedstawiające zależność od masy cząsteczkowej:
44© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU
Po powiększeniu najwyższego sygnału możemy odczytać wartość masy cząsteczkowej:
45© 2012 Karolina Radziszewska
Jednak wciąż mamy wiele wartości mas, które należy uśrednić.
ANALIZA WIDM MASOWYCH – OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU
Aby to zrobić wchodzimy w zakładkę PROCESS >>> SMOOTH MASS SPECTRUM
Narzędzie to służy do wygładzania widma tak, b ł d k ś d śaby tworzyło ono jeden pik o uśrednionej wartościmasy cząsteczkowej.Należy zmienić parametr SMOOTHING WIDTHd t ki j t ś i b id i i ć t lk j ddo takiej wartości, aby na widmie mieć tylko jeden poszerzony sygnał.Zwykle wystarczy już wartość 0.5.
Po zatwierdzeniu OKotrzymujemy wygładzone widmo.
46© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – OBLICZANIE MASY CZĄSTECZKOWEJ ZWIĄZKU
Odczytujemy uśrednioną masę cząsteczkową:
47© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – DODATKOWE INFORMACJE
Na widmie masowym oprócz sygnałów pochodzących od głównego związku obserwuje się także piki pochodzące od innych składników mieszaniny. Często są to zanieczyszczenia wynikające z użytych rozpuszczalników, bądź produkty uboczne wcześniejszych reakcji.
kl h k ś łó d h śćZwykle charakteryzują się one niższą intensywnością sygnałów na widmie – ich zawartość w analizowanej próbce jest mniejsza, bądź mają mniejszą zdolność do jonizacji.
48© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – DODATKOWE INFORMACJE
Często obok pików, odpowiadających głównemu produktowi, znajdują się dodatkowe sygnały pochodzące od adduktów jonów sodu lub potasu do cząsteczki.
Na+ 23 DaK+ 39 Da
Należy pamiętać, że dodanie jonu metalu powoduje jonizację związku bez udziału H+.
49© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – INFORMACJE STRUKTURALNE
Typowe widmo ESI‐MS dostarcza informacji o rodzaju, wzorze sumarycznym i masie cząsteczkowej związku. Aby uzyskać informacje na temat jego struktury należy wykonać widma fragmentacyjne MS/MS.
d d ( ll d d d ) fPodstawowym typem są widma CID (ang. collision induced dissociation) – fragmentacji wywołanej zderzeniowo. W wyniku zderzeń obojętnego gazu z cząsteczkami analizowanej substancji, do których dochodzi w komorze kolizyjnej spektrometru mas, otrzymujemy h kt t idcharakterystyczne widmo masowe.
50© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – INFORMACJE STRUKTURALNE
Fragmentacja związków metodą CID prowadzi do powstania jonów fragmentacyjnych z wcześniej wybranego przez nas jonu obserwowanego na widmie masowym.W wyniku fragmentacji dochodzi do rozerwania wiązań w cząsteczce z utworzeniem y g j ą ąodpowiednich jonów potomnych – fragmentów cząsteczki.
W przypadku peptydów i białek otrzymuje się następujące rodzaje fragmentów:
51© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – INFORMACJE STRUKTURALNE
W przypadku peptydów i białek fragmentacja CID prowadzi do powstania jonów fragmentacyjnych określonego typu. W ich skład wchodzą reszty aminokwasowe o następujących masach monoizotopowych:
52© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – WIDMA FRAGMENTACYJNE
Na widmie masowym ESI‐MS zaobserwowaliśmy sygnał pochodzący od głównego produktu. Chcąc określić strukturę związku możemy poddać go fragmentacji typu MS/MS:
Jon prekursorowy
53© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – WIDMA FRAGMENTACYJNE
Na widmie masowym ESI‐MS zaobserwowaliśmy sygnał pochodzący od głównego produktu. Chcąc określić strukturę związku możemy poddać go fragmentacji typu MS/MS:
Jony fragmentacyjne
54© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – WIDMA FRAGMENTACYJNE
Możemy wyznaczyć ładunki dla odpowiednich fragmentów stosując wcześniej opisaną procedurę SNAP:
55© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – WIDMA FRAGMENTACYJNE
Wykorzystując narzędzie ANNOTATIONmożemy wyznaczyć rodzaje reszt aminokwasowych znajdujących się w łańcuchu. Wystarczy zmienić typ na:
Korzystając z wartości różnic odległości między sygnałamimożemy wyciągać wnioski d ś i b d kiodnośnie budowy cząsteczki
poddanej fragmentacji:
Ob t t t lObecne straty neutralne 17 Da oraz 18 Da.
Obecność resztObecność reszt aminokwasowych
Ala oraz Lys.
56© 2012 Karolina Radziszewska
ANALIZA WIDM MASOWYCH – WIDMA FRAGMENTACYJNE
Przeprowadzenie analizy fragmentacyjnej pozwala na wyciągnięcie wielu wniosków
odnośnie budowy cząsteczki. Umożliwia m.in.:
określenie sekwencji aminokwasowej w peptydzie,
wskazanie miejsc modyfikacji,
d k kpotwierdzenie struktury związku,
wykrycie produktów ubocznych reakcji i ich zidentyfikowanie.
W zależności od rodzaju związku poddanego analizie otrzymuje się różnego rodzaju jony
fragmentacyjne często charakterystyczne dla danej grupyfragmentacyjne, często charakterystyczne dla danej grupy.
Analiza fragmentacyjna powinno zatem być indywidualnie dobrana do rodzajuAnaliza fragmentacyjna powinno zatem być indywidualnie dobrana do rodzaju
analizowanego związku.
57© 2012 Karolina Radziszewska
WARUNKI ZALICZENIA
Wykonanie analizy widma masowego dla nieznanej próbki przy pomocyWykonanie analizy widma masowego dla nieznanej próbki przy pomocy programu Data Analysis przedstawione w formie sprawozdania pisemnego.
T i dd i d ń 7 d i d d t j ć l b t j hTermin oddania sprawozdań – 7 dni od daty zajęć laboratoryjnych
POWODZENIAPOWODZENIAPOWODZENIA POWODZENIA ☺☺
58© 2012 Karolina Radziszewska