1

ANALITIČKA KEMIJA II ANALITIČKA KEMIJA II --SEMINARSEMINAR

UVODUVODSTATISTIKA STATISTIKA –– osnovni pojmoviosnovni pojmoviBOLTZMANNOVA RAZDIOBABOLTZMANNOVA RAZDIOBAATOMSKA SPEKTROSKOPIJA ATOMSKA SPEKTROSKOPIJA –– predavanja i seminarpredavanja i seminarMOLEKULSKA SPEKTROSKOPIJA MOLEKULSKA SPEKTROSKOPIJA –– primjena UV/VISprimjena UV/VISMOLEKULSKA SPEKTROSKOPIJA MOLEKULSKA SPEKTROSKOPIJA –– primjena UV/VIS primjena UV/VIS –– dodatni dodatni zadatcizadatciMOLEKULSKA SPEKTROSKOPIJA MOLEKULSKA SPEKTROSKOPIJA –– IR, IR, RamanRaman i fluorescencijai fluorescencijaMOLEKULSKA SPEKTROSKOPIJA MOLEKULSKA SPEKTROSKOPIJA –– osnove instrumentacijeosnove instrumentacijeNMRNMRMASENA SPEKTROMETRIJAMASENA SPEKTROMETRIJAASIGNACIJA SPEKTARAASIGNACIJA SPEKTARAKROMATOGRAFIJAKROMATOGRAFIJA

AK2; šk.g. 2006/07; sastavila: V. Allegretti Živčić

KROMATOGRAFIJAKROMATOGRAFIJA

Michael Tswett (1872-1919) – ruski botaničar

objasnio načela kromatografije na stupcu

biljni pigmenti na koloni od praškaste glinice – nastale obojene vrpce naziv “kromatografija”

KROMATOGRAFIJA

2

definicija:metode odvajanja, pri čemu se smjese tvari rastavljaju na svojekomponente, razdiobom između dvije faze (koje se međusobno nemiješaju)

faze:stacionarna (nepokretna)mobilna (pokretna, koja struji)

primjena:odjeljivanjeidentifikacijakvantitativna analiza sastojaka prisutnih u složenim smjesama

podjela prema:agregatnom stanju fazafizičko-kemijskim svojstvima i procesima

koji dominiraju pri odvajanjuizvedbenoj tehnici

podjela prema agregatnom stanju faza:

GLCtekućina (liquid, l)plin (gas, g)GSCkrutina (solid, s)plin (gas, g)LLCtekućina (liquid, l)tekućina (liquid, l)LSCkrutina (solid, s)tekućina (liquid, l)

postupakstacionarna fazamobilna faza

plintekućina (tanki film otapala na krutomporoznom nosaču)

tekućinakrutinamobilna faza:stacionarna faza:

3

podjela prema fizičko-kemijskim svojstvima:

kromatografija ionskeizmjeneGLC uz tvorbu kompleksareverzibilna kem.

reakcija

gelna kromatografija,afinitetna kromatografijaGSC s molek. sitimaoblik molekule

LLCGLCtopljivostLSCGSCadsorpcija

-sve vrste GCvrelište

mobilna faza: tekućina(tekućinska krom.)

mobilna faza: plin(plinska krom.)svojstvo

podjela prema izvedbenim tehnikama:

GCplinska kromatografija

PCpapirna kromatografija

TLCtankoslojna kromatografija

kromatografija na stupcu

postupci ⇒ tekućinska: kolonaravna ploha

⇒ plinska: kolona

4

KOLONSKA KROMATOGRAFIJA

osnovni pojmovi:

eluiranje: proces u kojemu mobilna faza ispire analizirane sastojkesa stacionarne faze

eluens: otapalo koje nosi sastojke smjese kroz stacionarnu fazu

kromatogram: ispis bilo koje funkcije analizirane tvari u ovisnostio vremenu eluiranja ili o volumenu eluensa

sastojci uzorka kreću se samo u mobilnoj fazi ⇒ prosječna brzinakojom se sastojak kreće kroz kolonu ovisi o vremenu koje provede u mobilnoj fazi – sastojci se odjeljuju zbog različitih brzina gibanja i dužkolone nastaju vrpce ili zone

tijek kromatografije i izlazni zapis

koncentracijski profil; razlučivanje

kromatografska odjeljivanjatemelje se na različitojrazdiobi sastojaka izmeđumobilne i stacionarne faze:

Amobilna ⇔ Astacionarna

M

S

ccK =

K (konst. ravn.) = omjer razdiobe ilikoeficijent razdiobe

5

vrijeme zadržavanja (tR): vrijeme od unošenja uzorka u kolonu do pojave sastojka u detektoru smještenome na izlazu iz kromatografskekolone

mrtvo vrijeme (tM): vrijeme potrebno da sastojak koji se ne zadržavana koloni prođe kroz kolonu

faktor kapaciteta, k’: opisuje brzinukretanja analita u koloni(VS i VM = volumeni faza)

M

MR

M

SAA t

ttVVKk' −

==

koeficijent selektivnosti, α: pokazuje moć odjeljivanjasastojaka na koloni(uvijek >1)

A

B

KKα =

djelotvornost kromatografske kolone može se izraziti pomoću dvijesrodne veličine (L = duljina punila kolone):

visina tavana, Hbroj teorijskih tavana, N

N = L / HMartin i Synge (Nobelova nagrada 1920.) kromatografska

kolona sastavljena od niza tavana prevladavaju ravnotežni uvjetite izraze treba promatrati kao oznake za djelotvornost kolone,

zadržane samo iz povijesnih razloga

razlučivanje kolone, RS:mjera kojom se izražavasposobnost odjeljivanjadva analita na koloni

6

7

mobilna faza

komponenta 1 komponenta 2

stacionarna faza

PLINSKA KROMATOGRAFIJA, GC

mobilna faza: plinovita (plin nosač)uzorak smjese se ispari bez raspada (zbog prijenosa plinom)eluiranje: protok inertne plinovite mobilne fazemeđudjelovanje molekula plina nosača i uzorkovih para, kao i plina nosača i

stacionarne tekuće faze je zanemarljivo (zbog niske gustoće plina) ⇒ jedinafunkcija plina nosača je prijenos analita kroz kolonu

dva tipa plinske kromatografije: GSC i GLC

usporedba GC i LC:

GC

mobilna faza

komponenta 1 komponenta 2

stacionarna faza

LC

plinovi nosači:

helij – uz detektore s toplinskom vodljivošću

dušik – uz detektor s plamenom ionizacijom (jeftiniji od He)

vodik – bolje odjeljivanje (osobito uz kapilarne stupce)zbog niske viskoznosti prikladan za dugačke stupce

OPASNOST OD EKSPLOZIJE!

8

GC

primjer:jabučni sok se “onečišćuje” dodatkom tržišno dostupnih sladila koja su po ugljikohidratnom sastavu slična jabučnom soku

analiza čistog jabučnog soka i soka kojemu je dodano 10% fruktoze žitnog

sirupa

http://www.chem.agilent.com/cag/peak/peak2-97/article1.html

GC-MS

primjer: analiza trikloretena i tetrakloretena u uzorcima tla/sedimenta

http://www-esd.lbl.gov/EML/analysis_options.html

9

TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE DJELOTVORNOSTI, HPLCHPLC ⇒ high pressure liquid chromatography

high performance liquid chromatography

HPLC ⇒ mobilna faza: tekućastacionarna faza: punila vrlo finih zrnatlak: nekoliko miljuna Pa (do 4x107 Pa – 400 bara)

⇒ tlačna pumpa (sisaljka)

detektori:za skupna svojstva (mjere promjene fizikalnih veličina)za specifična svojstva (mjere pojedinačna svojstva)

vrste:diferencijalni refraktometarUV-detektorfluorimetarIR-detektorelektrokemijski detektorkonduktometar (vodljivost)maseni spektrometar

HPLC

Column: SepaxBio-C18, 4.6x150mm, 5um, Eluent: 0.10 M Phosphate buffer, pH 3.1Flow rate: 1.0 ml/minDetection: UV 210 nmInjection: 5 µL.Temperature: Ambient (23oC)Compounds: Organic Acids (10 mM)

Column: SepaxBio-C18, 4.6x150mm, 5 mm Eluent: 0.10 M Phosphate buffer, pH 3.1 Flow rate: 0.75 mL/min Detection: UV 254 nm Injection: 5 mLTemperature: Ambient (23?C) Compounds:

1. Theobromine (1 mM) 2. Theophyline (1 mM) 3. Caffeine ( 1 mM) 4. Phenol (7 mM)

http://www.sepax-tech.com/sepaxbioc18.html

organske kiseline purinski alkaloidi

10

TANKOSLOJNA KROMATOGRAFIJA (TLC)(planarna, plošna kromatografija)

pravokutne ploče staklo, plastika, aluminijsloj slikagel (uz moguće dodatke); 100-200 µm = stacionarna faza

uzorak nanosi se oko 1 cm od donjeg ruba ploče

volumen nekoliko nL do nekoliko µLmrlja promjer 1-3 mm

mobilna faza neko otapalo (eluens)

nakon završetka putovanja otapala (nekoliko cm) ploča se suši (otapalo upari)

razvijanje ploče

obojene mrlje (spojevi) izravna detekcijabezbojni spojevi razvijanje ploče

na tržištu postoje ploče s dodanom cinkovom soli obasjavanjem živinom lampom pojavljuju se tamne mrlje na flurescentnoj pozadini

zagrijavanje ploče nakon prskanja sumpornom kiselinom karbonizacijom spojeva mrlje postaju vidljive (nije prikladno za kvantitativnu analizu)

prskanje ploče reagensima – općenitim (fosfomolibdenska kiselina) ili specifičnim (ninhidrin u alkoholu za aminokiseline) –opisane su stotine takvih reagenasa

11

komponente su definirane s vrijednošću Rf

Rf = faktor zadržavanja (retencijski faktor) – veličina migracije u odnosu na otapalo

0otapala fronta prešla je koju udaljenostsastojak prešao je koju udaljenost

xxRf ==

ostali izrazi:

2

2

16wxN =

x = duljina putaw = promjer mrlje

NxH 0=

21

122wwxxR

+−

=

110

00 +====kt

tuu

xxRf

k = retencijski faktoru = migracijske brzinet = migracijsko vrijeme

11−=

fRk

tržišna TLC ploča pod normalnim osvjetljenjem

ista TLC ploča osvijetljena UV-lampom

TLC

12

http://www.uwplatt.edu/chemep/chem/chemscape/labdocs/catofp/chromato/paper/paper.htm

PAPIRNA KROMATOGRAFIJA

čistoća supstancijaidentifikacija supstancija

relativno brzamale količine materijala

isti princip kao tankoslojna kromatografija

stacionarna faza: visokokvalitatni filter papir

mobilna faza: otopina “razvijača”

određuje se vrijednost retencijskogfaktora, Rf(može se naziv pripisati i “omjeru fronti” "ratio of fronts“)

karakteristika svakog spoja – služi za identifikaciju

čistoća uzorka može se odrediti iz kromatograma smjesa pokazuje dvije ili više mrlja, čisti uzorak ima samo jednu mrlju

13

papirna kromatografija – primjer: biljni pigment

http://iws.ccccd.edu/jbeck/Photosynthesisweb/Page.html

201. Neka smjesa spojeva stavljena je u Erlenmayerovu tikvicu u kojoj je bilo 6 mLsilikagela i 40 mL otapala s otopljenih 100 mg nehlapljivog spoja. Nakon miješanja smjesa je ostavljena stajati neko vrijeme, te je iz smjese izvučen alikvot od 10 mLkoji je potom uparen do suhoga. Ostatak je izvagan i masa je iznosila 12 mg.Izračunajte adsorpcijski koeficijent, K = CS/CM, spoja u ovom pokusu.

• u ravnotežnim uvjetima eluens sadrži:

12 x 40 / 10 = 48,0 mg spoja

• u stacionarnoj fazi je stoga:

100 – 48 = 52 mg spoja

• K predstavlja omjer masa u 1 mL svake od faza u ravnoteži, te je:

K = (52 / 6) / (48 / 40) = 7,2

14

202. Izračunajte separacijski faktor (ili faktor selektivnosti) između dva spoja, 1 i 2, čiji retencijski volumeni iznose 6 odnosno 7 mL. Mrtvi volumen kolone je 1 mL.Pokažite da je taj faktor jednak omjeru distribucijskih koeficijenata K2 / K1 tih spojeva (pretpostavka: tR(1) < tR(2)).

• separacijski faktor (ili faktor selektivnosti) se obično računa iz retencijskih vremena.

• VR i tR su povezani protokom mobilne faze D:VR = D x tR

• zato je:

α = (tR(2) – tM) / (tR(1) – tM) = (VR(2) – VM) / (VR(1) – VM)

α = 1,2

203. Sljedeći podatci odgovaraju koloni za tekućinsku kromatografiju:

0,164 mLVS

1,37 mLVM

0,313 mL/minbrzina protoka

24,7 cmduljina punila

Na kromatogramu smjese sa sastojcima A, B, C i D mogu se odčitati sljedeći podatci:

1,071,0713,313,3BB

1,161,1614,114,1CC

1,721,7221,621,6DD

0,410,415,45,4AA

--3,13,1nezadržavaninezadržavani

šširina irina osnovice osnovice pika, pika, minmin

vrijeme vrijeme zadržavanja, zadržavanja,

minmin

Izračunajte:(a) broj tavana za svaki

pik(b) srednju vrijednost

standardnog odstupanja za N

(c) visinu tavana za kolonu.

15

a)NA = 2775NB = 2472NC = 2364ND = 2523

b) N = 2534 ± 174 = 2,5(±0,2) x 103 tavana

c) H = 0,0097 cm

204. Pomoću podataka iz prethodnog zadatka izračunajte za A, B, C i D:a) faktor kapaciteta,b) koeficijent razdiobe.

16

205. Iz kromatograma smjese butilnih alkohola (korekcije osjetljivosti detektoradobivene su u odvojenim pokusima s poznatim količinama čistih alkohola) dobivenisu sljedeći podatci o površinama.

Σ = 26.12

2.440.6811.66t-butil4.780.6673.19s-butil14.360.5307.61i-butil4.540.6032.74n-butil

reduciranapovršina, cm2

faktor odzivadetektora

površina pika, cm2

alkohol

% n-Bu = (4.54 / 26.12) x 100 = 17.4 %% i-Bu = (14.36 / 26.12) x 100 = 55.0 %% s-Bu = (4.78 / 26.12) x 100 = 18.0 %% t-Bu = (2.44 / 26.12) x 100 = 9.0 %

Σ = 100.0 %

Odredite sastav analizirane smjese.

rješenje:

(reducirana površina = površina pika / faktor odziva detektora)

206. Relativne površine pikova dobivenih iz plinskog kromatograma smjese metilacetata, metil propionata i metil n-butirata iznosile su 17.6, 44.7, odnosno 31.1. Izračunajte postotni sastav smjese navedena tri spoja, ako su relativni odzivi detektora iznosili 0.65, 0.83, odnosno 0.92.

33.800.9231.153.860.8344.727.080.6517.6

red. površinaodziv det.rel. površine

Σ = 114.74

metil acetat = 27.08 / 114.74 = 23.60 %metil propionat = 53.86 / 114.74 = 46.94 %metil n-butirat = 33.81 / 114.74 = 29.46 %

Σ = 100.00 %

17

207. Za određivanje metanola plinskom kromatografijom u uzorcima metanol-voda, učinjeni su kromatogrami četiri standardne smjese koje su sadržavale 20.0, 40.0, 60.0 i 80.0 % v/v metanola. Odgovarajući metanolni i vodeni pikovi na filter papiru škarama su izrezani, te su im određene mase mm i mv. Pomoću sljedećih podataka izračunajte postotni sadržaj metanola u otopini A.

0.11240.1124A

0.07000.110780.0

0.11900.109860.0

0.14850.069240.0

0.19550.043020.0

mv, gmm, gc (CH3OH), % v/v

rezultat:w = 64 % CH3OH

208. Plinsko-tekućinskom kromatografijom (GLC) analizirana je smjesa n-pentana, n-heksana, n-heptana i n-oktana, uz primjenu detektora termičke vodljivosti. Analiza se temelji na oksidaciji eluiranih ugljikovodika u CO2 i H2O, te propuštanju CO2 kroz detektor nakon uklanjanja H2O. Dobiveni su sljedeći podatci:

64.0n-oktan

42.0n-heptan

24.0n-heksan

10.0n-pentan

površina, relativne jedinicespoj

molni % maseni %n-pentan 7.1 10n-heksan 17.1 20n-hepan 30.1 30n-oktan 45.7 40

rješenje:

18

209. Čisto maslinovo ulje A podvrgnuto je metanolizi, sa ciljem pretvorbe nehlapljivih glicerinskih estera organskih kiselina u hlapijive metilne estere.Smjesa tako dobivenih metilnih estera uštrcana je u plinski kromatograf, te su kao rezultat analize dobiveni pikovi površina 2.10, 5.86 i 1.21 cm2, za metilne esterepalmitinske, oleinske, odnosno stearinske kiseline.Maslinovo ulje B lošije kakvoće podvrgnuto je istom postupku, te su se za iste estere dobili pikovi površina 1.82, 6.90, odnosno 1.05 cm2. Maslinovo ulje C, dobiveno miješanjem dva ulja A i B, podvrgnuto je istom postupku, te su se za iste estere dobili pikovi površina 1.97, 5.90, odnosno 1.10 cm2.Izračunajte postotni sadržaj (w/w) maslinovog ulja B u maslinovom ulju C, uz pretpostavku da su uvijek jednaki votumeni podvrgnuti analizi, te da je masenifaktor (masa/jed. površ.) jednak za sve estere.

rješenje:w = 31.0 % B

A (2,20/1,21) : (%,86/1,21) : 1 = 1,818 : 4,843 : 1B (1,82/1,05) : (6,90/1,05) : 1 = 1,733 : 6,571 : 1C (1,97/1,1) : (5,90/1,10) : 1 = 1.791 : 5,364 : 1

C y % B + (100 – y)% A

15303645100

57161008434

76317911100

73311008181

,y,y,)y(,

,y,y,)y(,

=⇒=+−

=⇒=+−

210. Definirajte pojmove:• eluiranje;• stacionarna faza;• vrijeme zadržavanja.

211. Objasntte pojmove: • kromatogram; • eluat; • eluens; • stacionarna faza; • koeficijent raspodjele.

212. Navedite tekućinske kolonske kromatografske metode, vrste pripadnihstacionarnih faza i ravnoteža.

213. Na kojim se parametrima temelji kvalitativna, a na kojima kvantitativna kromatografska analiza?

214. Koeficijenti raspodjele dvije tvari A i B u kromatografskoj koloni iznose 180, odnosno 225. Koja od dvije tvari će se prva eluirati iz kolone?

19

215. Smjesa spojeva A i B putuje od ishodišta i ostavlja mrlje sljedećih karakteristika:

wB = 2,5 mmxB = 33 mm

wA = 2,0 mmxA = 27 mmx = duljina putaw = promjer mrlje

Fronta mobilne faze iznosi 60 mm od ishodišne linije.

a) Izračunajte faktor zadržavanja Rf, djelotvornost N i visinu tavana H za svaki od spojeva.b) Izračunajte faktor razlučivanja između dva spoja A i B.c) Utvrdite odnos između faktora selektivnosti i Rf za dva spoja. Izračunajte njegovu numeričku vrijednost.

0xxRf =

2

2

16wxN =

NxH 0=

21

122wwxxR

+−

=

a) Rf(A) = 27 / 60 = 0,45; Rf(B) = 33 / 60 = 0,55

NA = 16 x 272 / 22 = 2916; NB = 16 x 332 / 2,52 = 2788

HA = xA / NA = 9,26 x 10-4 cm; HB = xB / NB = 1,18 x 10-3 cm

b) R = 2 (33 – 27) / (2 + 2,5) = 2,67

c) α = (Rf(B) / Rf(A)) x (1 – Rf(A)) / (1 – Rf(B)) = 1,491

2

kk

=α

216. Koji je redoslijed eluiranja smjese sljedećih kiselina iz HPLC kolone čija je stacionarna faza tipa C18 dok je mobilna faza formijatni pufer c = 200 mM, pH 9.

Smjesa:1. linoleinska kiselina CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7CO2H2. arahidna kiselina CH3(CH2)18CO2H3. oleinska kiselina CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7CO2H

Rješenje:

• pri pH 9 kiseline su u obliku svog odgovarajućeg karboksilatnog iona• polarna vodena faza snažno ih privlači• hidrofobni dijelovi (ugljikovodični lanac) određuje kontakt sa stacionarnom fazom

• polarnost tog lanca opada u nizu: 1 > 3 > 2

• redoslijed eluiranja spojeva je stoga: 1, 3, 2