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ANALISIS DEL PROCESO DE ESTERILIZACION CON CALOR HUMEDO PARA PRODUCTOS DE LA SALUD

LURIO GUSTAVO BEDOYA RIVERA

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE OCCIDENTE FACULTAD DE INGENIERIA

DEPARTAMENTO DE SISTEMAS DE PRODUCCION PROGRAMA DE INGENIERIA INDUSTRIAL

SANTIAGO DE CALI 2008

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ANALISIS DEL PROCESO DE ESTERILIZACION CON CALOR HUMEDO PARA PRODUCTOS DE LA SALUD

LURIO GUSTAVO BEDOYA RIVERA

Trabajo de Grado para optar el titulo de

Ingeniero Industrial

Director JUAN CARLOS OTERO JARAMILLO

Ingeniero Mecánico Especialista en Edumática

Especialista en Procesos de Transformación del Plástico y el Caucho

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE OCCIDENTE FACULTAD DE INGENIERIA

DEPARTAMENTO DE SISTEMAS DE PRODUCCION PROGRAMA DE INGENIERIA INDUSTRIAL

SANTIAGO DE CALI 2008

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Nota de Aceptación:

Aprobado por el Comité de Grado en cumplimiento de los requisitos exigidos por la Universidad Autónoma de Occidente para optar al título de Ingeniero Industrial.

JUAN CARLOS OTERO Director

Santiago de Cali, Julio de 2.008.

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AGRADECIMIENTOS El autor presenta sus agradecimientos a: Profesor Juan Carlos Otero. Director del proyecto por sus valiosas orientaciones y apoyo. Adriana Doza. Jefe de operaciones de calidad Laboratorios BAXTER, por su comprensión y paciencia, sin las cuales no se hubiera alcanzado este logro. Juan Carlos Saavedra. Instructor SENA, por sus invaluables enseñanzas, fundamentales para el desarrollo de este proyecto. El autor también agradece a todos los docentes y estudiantes, compañeros de trasegar académico por sus contribuciones incondicionales.

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A mis padres, quienes despertaron en mí la curiosidad y el gusto por el saber y me proporcionaron el invaluable tesoro del estudio.

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CONTENIDO

Pág.

GLOSARIO 12 RESUMEN 13 INTRODUCCION 14 1. EL PROBLEMA OBJETO DE ESTUDIO 16 1.1 DEFINICION DEL PROBLEMA 16 1.2 JUSTIFICACION 17 2. OBJETIVOS 18 2.1 OBJETIVO GENERAL 18 2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 18 3. METODOLOGIA 19 4. MARCO TEORICO 20 4.1 INTRODUCCION A LA MICROBIOLOGIA 20 4.1.1. Clasificación celular 20 4.1.2. Identificación de los microorganismos 22 4.1.3. Crecimiento de los microorganismos 24 4.1.4. Conteo de microorganismos 27 4.1.5. Efecto de factores externos en el crecimiento 29 4.1.6. Formación de endosporas 31 4.2. CIENCIA DE LA ESTERILIZACION 33

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4.2.1. Cinética de la letalidad microbiana 34 4.2.2. Desarrollo del modelo semilogarítmico 36 4.2.3. Conceptos base de esterilización con vapor 40 4.2.4. Correlación entre letalidad física y biológica 47 5. RESULTADOS 49 5.1. ENTORNO MICROBIANO DE UNA PLANTA FARMACEUTICA 49 5.1.1. Resultados de muestreo en aguas 50 5.1.2. Resultados de muestreo en área de plásticos 51 5.1.3. Resultados de muestreo en área de bombas 51 5.1.4. Resultados de muestreo en área de tanques 52 5.1.5. Resultados de muestreo en área de medicamentos 53 5.1.6. Resultados de muestreo en área de impresión 53 5.1.7. Resultados de muestreo en área de llenado de bolsa 55 5.1.8. Resultados consolidados de muestreos 60 5.1.9. Características de los microorganismos más frecuentes 62 5.1.10. Comentarios a la biocarga típica hallada 62 5.2. VARIABLES CRÍTICAS Y DISEÑO DE UN PROCESO DE 63 ESTERILIZACION 5.2.1. Paradigmas sobre el proceso de esterilización 63 5.2.2. Dos maneras de ver el punto de control microbiano 64 5.2.3. Fases del diseño de un proceso de esterilización 66 5.2.4. Enfoque del diseño 67

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5.2.5. Procesos de esterilización y variables críticas 72 5.2.6. Desarrollo de ciclos de esterilización 77 5.2.7. Calificación del proceso 83 5.3. REQUERIMIENTOS PARA APLICACIÓN DE LIBERACION 92 PARAMETRICA 5.3.1. Principios de la liberación paramétrica 93 5.3.2. Elementos esenciales 93 5.3.3. Requerimientos en el proceso de manufactura 95 5.3.4. Requerimientos en el proceso de esterilización 95 5.3.5. Requerimientos de segregación de producto 97 5.3.6. Requerimientos para la aprobación de lotes 97 5.3.7. Análisis estadístico de la prueba de esterilidad 98 6. CONCLUSIONES 102 7. RECOMENDACIONES 103 BIBLIOGRAFIA 104

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LISTADO DE TABLAS

Pág. Tabla 1. Valores de L para Tref 121,1° C, Z 10° C 46 Tabla 2. Resultados muestreo en aguas 50 Tabla 3. Resultados muestreo en área de plásticos 51 Tabla 4. Resultados muestreo en área de bombas 51 Tabla 5. Resultados muestreo en área de tanques 52 Tabla 6. Resultados muestreo en área de medicamentos 53 Tabla 7. Resultados muestreo en área de impresión 1 54 Tabla 8. Resultados muestreo en área de impresión 2 54 Tabla 9. Resultados muestreo en área de impresión 3 54 Tabla 10. Consolidado de muestreos en área de impresión 1,2 y 3 55 Tabla 11. Resultados muestreo en área de llenado de bolsas 1 55 Tabla 12. Resultados muestreo en área de llenado de bolsas 2 56 Tabla 13. Resultados muestreo en área de llenado de bolsas 3 57 Tabla 14. Resultados muestreo en área de llenado de bolsas 4 58 Tabla 15. Consolidado de muestreos en áreas de llenado 59 Tabla 16. Consolidado total por punto de muestreo 61 Tabla 17. Consolidado total por punto especie de microorganismo 61 Tabla 18. Valores D y Z típicos para microorganismos reconocidos 88 Tabla 19. Probabilidad de encontrar una unidad no estéril 99 Tabla 20. Análisis estadístico para prueba de esterilidad 101

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LISTADO DE FIGURAS

Pág. Figura 1. Clasificación de los organismos 21 Figura 2. Formas celulares de bacterias 22 Figura 3. Pasos de la tinción de Gram 23 Figura 4. Paredes celulares de bacterias 24 Figura 5. Datos de una población que se duplica cada 0,5 horas 25 Figura 6. Datos en escala logarítmica y aritmética 26 Figura 7. Fisión binaria de una célula 27 Figura 8. Métodos para conteo de células viables 28 Figura 9. Conteo mediante diluciones 29 Figura 10. Ciclo de formación de una espora 32 Figura 11. Diferencias entre células vegetativas y endosporas 33 Figura 12. Representación aritmética de sobrevivientes 35 Figura 13. Representación logarítmica de sobrevivientes 36 Figura 14. Curva de sobrevivientes 39 Figura 15. Valor DT en la curva de sobrevivientes 41 Figura 16. Curva Temperatura – Resistencia 42 Figura 17. Curva Tiempo de Letalidad - Temperatura 43 Figura 18. Temperatura de Proceso vs. Temperatura de Producto 44 Figura 19. Distribución de muestreos en áreas de llenado 60

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Figura 20. Curvas de sobrevivientes en escala semilogarítmica 65 Figura 21. Fases de desarrollo de un proceso de esterilización 67 Figura 22. Comparación entre los enfoques de diseño 68 Figura 23. Curva del agua a 1 Atmósfera de presión 72 Figura 24. Curva del agua a 2 Atmósferas de presión 73 Figura 25. Diagrama de Fases 74 Figura 26. Flujo de calor al interior de un contenedor de líquido 75 Figura 27. Ubicación óptima de un probador de temperatura 75 Figura 28. Mapeo de temperatura al interior de un producto 78 Figura 29. Zonas de transferencia y flujo de calor hacia una bolsa 78 Figura 30. Fases de un ciclo de esterilización a vapor 79 Figura 31. Esquema básico de un esterilizador a vapor 82 Figura 32. Colocación ideal de un probador para distribución 85 Figura 33. Reporte típico de estudio de penetración de calor 86 Figura 34. Reporte típico de distribución de calor 87 Figura 35. Diagrama de flujo para liberación paramétrica 94 Figura 36. Sistemas de apoyo a la liberación paramétrica 95

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GLOSARIO Las siguientes definiciones son importantes para la comprensión de la teoría de esterilización•: BIOCARGA : cantidad de microorganismos viables presentes en un material, componente o producto terminado. ESTERIL: condición de estar libre de microorganismos viables, es decir que se puedan reproducir. ESTERILIZACION : proceso validado para eliminar todas las formas de microorganismos viables de un producto.

EMPAQUE PRIMARIO : elemento del sistema de empaque que protege la esterilidad del producto. LETALIDAD DE PROCESO : capacidad del proceso de esterilización para eliminar microorganismos. Esta puede determinarse con base en la curva de muerte bacteriana o mediante la medición de los parámetros físicos requeridos. UFC: unidades formadoras de colonias VALOR D : tiempo de exposición a una temperatura determinada necesario para reducir la población bacteriana en un 90% (1 logaritmo). VALOR F: medida de la capacidad de inactivación microbiológica de un proceso de esterilización. VALOR Z: variación en grados Centígrados necesaria para modificar el valor D en un factor de 10 • Definiciones tomadas principalmente de la norma ISO 11134, 1994.

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RESUMEN

El presente trabajo ofrece un modelo para aplicar la Liberación Paramétrica a un proceso de esterilización con calor húmedo aplicado a productos para el cuidado de la salud. El modelo se apoya en la ciencia microbiológica y los conceptos base de esterilización para diseñar y validar un proceso de esterilización en el que resulte viable implementar la liberación Paramétrica de lotes de producto. El Capítulo 1 Presenta la descripción del problema objeto de estudio, y la justificación del proyecto. El Capítulo 2 Presenta el objetivo general y los objetivos específicos del proyecto. El Capítulo 3 Presenta los metodología para llevar a cabo el proyecto El Capítulo 4 Contiene el marco teórico con los conceptos fundamentales necesarios para llevar a cabo el proyecto El Capítulo 5 Presenta los resultados El Capítulo 6 Presenta las conclusiones y recomendaciones del proyecto.

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INTRODUCCIÓN

En los últimos años el sector de la salud en Colombia ha sufrido una crisis reflejada principalmente en la situación económica del Instituto de Seguros Sociales. Por otro lado, la situación coyuntural del país en términos de violencia, desempleo e inflación además de una competencia agresiva tanto nacional como extranjera han deteriorado los resultados financieros de varios sectores y diversas empresas que se han vistas forzadas a reducir costos de operación y tomar medidas de emergencia para aliviar su economía entre las que se encuentran el cierre de algunas filiales y el despido de personas, lo que va en detrimento de la calidad de vida de los Colombianos y las compañías farmacéuticas no son ajenas a esta situación. Uno de los elementos que hace complejo el sector farmacéutico es la diversidad de regulaciones y leyes a que deben someterse las empresas de esta naturaleza además de los altos estándares internacionales establecidos para los procesos de manufactura de productos médicos. Esto hace que para una empresa farmacéutica no resulte fácil introducir sus productos en los mercados internacionales lo que sería una alternativa interesante para buscar el mejoramiento de los resultados financieros dadas las difíciles condiciones del mercado nacional. La importancia de las compañías productoras de medicamentos y equipos para el cuidado de la salud es sumamente alta ya que su misión es la de salvar y mejorar la vida de los pacientes de servicios de salud que son los usuarios finales de sus productos, por lo que resulta altamente deseable que estas empresas gocen de una buena situación económica que les permita invertir en el fortalecimiento de su sistema de gestión de la calidad y en los elementos necesarios para garantizar una operación con clase mundial que les permita ofrecer productos y servicios de lata calidad y que puedan ser aceptados en todos los mercados a nivel internacional. Uno de los procesos críticos dentro de la manufactura de productos médicos es el de la esterilización. Este proceso se encarga de garantizar la seguridad de que el producto aplicado a un paciente no generará en él reacciones adversas que puedan poner en riesgo su salud y su vida. Existen diversas regulaciones y normas internacionales que son reconocidas como estándares para el desarrollo y validación de un proceso de esterilización. Mientras las normas como ISO y las

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Europeas se centran en el qué, las regulaciones de los ministerios de salud se ocupan del como. El paso siguiente a la esterilización de un producto es su liberación al mercado y es allí donde las entidades regulatorias encargadas de la vigilancia de las compañías de medicamentos y alimentos son más exigentes. La liberación de productos médicos mediante un ensayo de esterilidad ha sido comúnmente apoyada por los organismos de vigilancia y durante mucho tiempo constituyó la única manera de liberar productos farmacéuticos al mercado. El auge de los sistemas de gestión de calidad, unido al desarrollo de la tecnología dieron lugar a una alternativa de liberación conocida como Liberación Paramétrica, la cual se fundamenta en la implementación de un sistema de calidad fuerte y el cumplimiento de unos requerimientos previamente establecidos y la evidencia de ese cumplimiento. Este trabajo de grado buscará demostrar la conveniencia de la liberación paramétrica como método de liberación y sus ventajas tanto en calidad como en costos, a la vez que será una referencia para implementarlo de manera efectiva cumpliendo con los más altos estándares. Espero que este trabajo contribuya al mejoramiento de la calidad en las compañías farmacéuticas y constituya una herramienta para facilitar sus operaciones en lo relacionado con los procesos de esterilización, porque aunque obliga a las empresas a implementar un sistema de gestión de calidad sumamente robusto y mantener unas excelentes condiciones en su planta, los beneficios asociados compensan con creces los recursos invertidos. Recordemos que la calidad no es un gasto sino una inversión. Con todas las exigencias y no poner en riesgo la vida de los pacientes, los clientes potenciales y por consiguiente el mercado de la empresa.

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1. EL PROBLEMA OBJETO DE ESTUDIO 1.1. DEFINICION DEL PROBLEMA La industria farmacéutica es una de las más controladas tanto por instituciones de vigilancia gubernamentales como por estándares internacionales debido a la naturaleza de sus productos, los cuales están dirigidos a mejorar la salud e inclusive salvar la vida de las personas que los reciben, por lo que su nivel de calidad y confiabilidad debe ser excelente. Cuando se trata de productos parenterales, es decir de aplicación intravenosa, uno de los requerimientos fundamentales es el de esterilidad. Existen diversos métodos para asegurar estas características en una solución intravenosa tales como la radiación gamma, el llenado aséptico y la esterilización con calor húmedo entre los más conocidos. Nuestro objeto de estudio se centrará en el proceso de esterilización con calor húmedo cuyo agente esterilizante es el vapor introducido a una cámara generalmente conocida como autoclave o esterilizador. Para liberar sus productos al mercado, las plantas farmacéuticas realizan una prueba denominada ensayo de esterilidad. Esta prueba implica la toma aleatoria de muestras de un lote de producción y el análisis de unos indicadores biológicos. Este análisis requiere entre una y dos semanas para la obtención de un resultado, lo que significa que el producto esterilizado se convertirá en inventario durante ese tiempo. Además de los costos que acarrea tanto por los insumos necesarios para la prueba como por almacenamiento, esta situación afecta la disponibilidad de producto en el mercado e incide sobre la planeación del área de manufactura que debe tener en cuenta esa variable de cara al cumplimiento de pedidos. La solución de estos inconvenientes subyace en la liberación paramétrica que es la liberación de un lote de producto mediante el soporte documentado del cumplimiento de unos requerimientos especificados, llevados a cabo bajo un proceso debidamente controlado y validado. Para aplicar a esta forma de aprobación, la planta debe contar con un sólido sistema de calidad en el cual cada paso del proceso de manufactura desde el recibo de materias primas hasta la entrega misma debe ser realizado bajo los más altos estándares y cumplir con estrictos criterios de aceptación.

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1.2. JUSTIFICACIÓN Este trabajo se realiza para contribuir al desarrollo de la industria farmacéutica colombiana optimizando la eficiencia y la eficacia de los procesos de esterilización y el mejoramiento en la calidad de vida de los pacientes que reciben tratamientos y terapias que requieren la aplicación de soluciones intravenosas. El proceso de elaboración de productos farmacéuticos abarca todo un conjunto de actividades realizadas bajo unos sistemas de control que garanticen óptimas condiciones de manufactura a fin de minimizar los elementos contaminantes y robustecer la confiabilidad del producto final. Aunque las etapas iniciales son claves para reducir la biocarga asociada al proceso y al producto, es finalmente el proceso de esterilización el encargado de proporcionar un producto viable para utilizar en un tratamiento de la salud, por lo que debe ser totalmente eficaz y confiable. La liberación paramétrica apoyada en un sólido sistema de calidad proporciona una herramienta que satisface tanto los requerimientos regulatorios de las instituciones de vigilancia médica como la necesidad de recibir productos confiables y efectivos, libres de elementos contaminantes.

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2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL Analizar el proceso de esterilización con calor húmedo para productos de la salud con el fin de validar la liberación paramétrica. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Describir el entorno microbiológico de una planta farmacéutica para obtener el perfil de biocarga asociada. • Determinar las variables físicas fundamentales en un proceso de esterilización con calor húmedo para comprender la cinética de la letalidad microbiana y diseñar procesos de esterilización efectivos. • Determinar los requerimientos exigidos en la aplicación de la liberación paramétrica para garantizar su viabilidad.

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3. METODOLOGÍA Para dar cumplimiento al objetivo del trabajo, se utilizarán textos, estándares, monografías técnicas y artículos de diferentes publicaciones que contienen la información adecuada, además de la recopilación de los resultados de pruebas y análisis realizados en una planta farmacéutica con el fin de verificar la efectividad de los criterios de aceptación definidos. A continuación se describen los pasos a realizar: � Lectura de documentos relacionados con los temas a tratar. Se consultarán textos y trabajos de diversos autores reconocidos como eminentes teóricos y científicos en el campo de la esterilización. � Análisis de la información para estructurar los procedimientos adecuados para el desarrollo de un proceso de esterilización. Con base en el material consultado se diseñará un marco teórico sólido y riguroso desde el punto de vista científico pero igualmente claro y coherente de manera que permita su fácil comprensión y aplicación. � Revisión de los resultados de pruebas y análisis realizados en una planta farmacéutica. Estos reportes deben ser la confirmación práctica de los conceptos construidos en el marco teórico. � Síntesis de los pasos anteriores para determinar los elementos clave del sistema de calidad que permitirán aplicar la liberación paramétrica. La combinación de fundamentos teóricos con resultados prácticos conduce a una caracterización adecuada del proceso de esterilización y permitirá diseñar el entorno adecuado para aplicar la liberación paramétrica. Igualmente se incluirá el análisis de ejemplos revisados previamente por diversos autores y se abordará de manera breve el tema de solución de problemas relacionados con los procesos de esterilización.

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4. MARCO TEORICO 4.1 INRODUCCION A LA MICROBIOLOGIA La microbiología es el estudio de los microorganismos, extenso grupo de organismos microscópicos que existen como células individuales o agrupaciones celulares, también se incluyen los virus aunque no son entidades celulares. Una célula microbiana aislada es en general capaz de llevar cabo todas las funciones vitales de crecimiento, generación de energía y reproducción independientemente de otras células de la misma clase, a diferencia de las células animales y de plantas, las cuales son incapaces de vivir aisladas en la naturaleza. La célula es la unidad fundamental de toda materia viva. Una célula es aislada de otras por una membrana o una pared celular, conteniendo dentro de ella gran variedad de materiales químicos y estructuras subcelulares. Todas las células contienen componentes químicos complejos: proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y polisacáridos. Aunque cada célula tiene un tamaño y una estructura definida, una célula es una entidad dinámica que sufre cambios y modifica sus constituyentes. Las células son capaces de dirigir su propia síntesis. Como consecuencia de los procesos nutricionales, una célula crece y se divide, formando dos células, cada una casi idéntica a la célula original. Muchas células pueden sufrir cambios de forma o función en un proceso denominado diferenciación. Cuando este proceso ocurre se forman sustancias o estructuras que no estaban previamente formadas. En muchos casos, la diferenciación ocurre como respuesta a una condición desfavorable para su supervivencia. 4.1.1 Clasificación celular. Un amplio volumen de estudios relacionados con la estructura interna de las células ha definido la existencia de dos tipos básicos de ellas, procariotas y eucariotas. Estos dos tipos de células tienen diferencias estructurales muy marcadas. Las eucariotas contienen un núcleo rodeado por una membrana nuclear que encierra varias moléculas de ADN. Por el contrario, en las células procarióticas la región nuclear no está rodeada por una membrana, y consta de una sola molécula de ADN. A diferencia de las procarióticas, las células eucarióticas contienen además del núcleo otras estructuras internas rodeadas por membrana, como las mitocondrias y los cloroplastos. Con base en estudios de la genética microbiana, se pueden definir tres dominios celulares evolutivamente diferentes, de los cuales dos presentan una estructura

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procariótica, denominados Bacteria y Archaea, y uno eucariótico denominado Eukarya. Aunque los grupos Bacteria y Archaea son procariotas, difieren tanto entre sí como del grupo Eukarya. Bajo los dominios se pueden considerar seis reinos: Bacterias (en el dominio Bacteria), Archaebacterias (en el domino Archaea) y Protistas, Hongos, Vegetal y Animal (en el dominio Eukarya). Los hongos y protistas pueden existir como organismos unicelulares, las animales y las plantas son organismos multicelulares. Como las células de plantas y animales son eucarióticas, se piensa que los microorganismos eucarióticos son los antecesores de los organismos pluricelulares, mientras que Bacteria y Archaea constituyen ramas evolutivas que no llegaron más allá del nivel microbiano. Las Archaebacterias presentan características filogenéticas únicas y habitan en ambientes considerados como extremos. La siguiente tabla resume la clasificación de los seres vivos con base en los dos tipos de estructura celular. Figura 1. Clasificación de los organismos. Fuente: MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. 8 ed. Bogotá: Prentice Hall, 1999. p. 45.

Además de comprender las características filogenéticas de los microorganismos, resulta muy importante poder identificar y clasificar los organismos celulares por diversos motivos. Por ejemplo, la identificación de una bacteria causante de enfermedades en humanos es fundamental para establecer el tratamiento adecuado del paciente. Tras un estudio profundo de la estructura y función de un microorganismo, incluyendo su genética, metabolismo, comportamiento y otras propiedades distintivas, es posible reconocer características únicas para un microorganismo dado. Después de que el organismo ha sido identificado en función de características propias, recibe un nombre.

En microbiología se usa un sistema binomial de nomenclatura, inicialmente establecido para designar plantas y animales. El género es un nombre aplicado a organismos relacionados; dentro del género, cada tipo de organismo recibe un nombre de especie. Los nombres de género y especia siempre van juntos para describir un organismo específico. Por ejemplo, la bacteria Escherichia Coli pertenece al género Escherichia y tiene nombre de especie Coli. A la forma de la

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célula se le denomina morfología celular. Las diferentes formas bacterianas se le han asignado diferentes nombres. Las bacterias en forma esférica u ovoide se denominan cocos, las de forma cilíndrica se denominan bacillos y a las de forma espiral se les denomina espirilos. Figura 2. Formas celulares de bacterias.

Fuente: MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. 8 ed. Bogotá: Prentice Hall, 1999. p. 57. El tamaño de los procariotas va desde 0,1 – 0,2 micras de ancho más de 50 micras de diámetro. Algunos procariotas excepcionalmente grandes pueden alcanzar 50 micras de diámetro y medir 0,5 milímetros de diámetro. Un procariota de forma bacilar como la Escherichia Coli mide 1 x 3 micras. La mayoría de los procariotas son comparativamente mucho más pequeños que los eucariotas. Las células pequeñas tienen mayor superficie relativa disponible que las células grandes. El tamaño de las células tiene incidencia en su tasa de crecimiento y los ritmos metabólicos. Las células procariotas alcanzan mayores tamaños de población que las eucariotas en la mayoría de los hábitats microbianos lo que les permite modificar en corto tiempo los parámetros químicos en un ecosistema. 4.1.2 Identificación de microorganismos . La concentración de solutos en las células genera presión en su interior. Para resistir esta presión, las bacterias requieren de una pared celular que además caracteriza la forma y rigidez de la célula. Las diferencias que presentan las paredes celulares de las células permite clasificarlas mediante procedimientos denominados tinciones diferenciales. Una

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tinción diferencial es aquella que no tiñe de manera homogénea a todos los tipos de células. La tinción diferencial más utilizada en microbiología es la Tinción de Gram, llamada así en honor a su descubridor. Dependiendo del resultado de esta tinción las bacteria pueden dividirse en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas. Después de aplicar la tinción de Gram, las bacterias Gram positivas se tornan de color púrpura, mientras que las bacterias Gram negativas presentan color rojo. Este comportamiento se basa en las profundas diferencias estructurales de la pared celular entre unas y otras. La tinción de Gram es de gran utilidad en el laboratorio. El proceso de identificación de una bacteria desconocida, inicia generalmente con la tinción de Gram. La figura 3 ilustra los pasos para la identificación de bacterias mediante la tinción de Gram. Figura 3. Pasos de la tinción de Gram.

Fuente: MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. 8 ed. Bogotá: Prentice Hall, 1999. p. 156. La pared celular de las Gram negativas está conformada por varias capas y es bastante compleja, mientras que la pared de las Gram positivas está formada fundamentalmente por un tipo de molécula y es mucho más ancha.

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Figura 4. Paredes celulares de bacterias. Fuente: Fuente: MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. 8 ed. Bogotá: Prentice Hall, 1999. p. 164. La figura 4 muestra las diferencias características de las paredes celulares entre bacteria Gram positivas y Gram negativas. La capa responsable de la rigidez de la célula se denomina peptidoglicano. En las bacterias Gram positivas el peptidoglicano representa hasta el 90% de la pared, en las bacterias Gram negativas el peptidoglicano constituye alrededor del 10% de la pared, estando el resto constituido por una capa compleja. 4.1.3 Crecimiento de los microorganismos. Las células bacterianas son capaces de duplicarse por sí mismas. En la mayoría de los procariotas, una célula individual crece hasta que se divide en dos nuevas células, en un proceso llamado fisión binaria. El tiempo requerido para completar un ciclo de crecimiento es muy variable y dependa de factores nutricionales y genéticos. La velocidad de crecimiento se define como el cambio del número de células por unidad de tiempo. El tiempo requerido para que a partir de una célula se formen dos células se denomina tiempo de generación. Mientras algunos microorganismos presentan tiempos de generación de 1 a 3 horas, los de crecimiento rápido pueden duplicarse en sólo 10 minutos. Otros pueden tardar varios días.

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Figura 5. Datos de una población que se duplica cada 0,5 horas. Fuente: MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. 8 ed. Bogotá: Prentice Hall, 1999. p. 98. La figura 5 muestra un experimento para una célula con un tiempo de generación de 30 minutos. Este comportamiento se conoce como crecimiento exponencial. Los datos sugieren una progresión geométrica del número 2. Al dividirse dos células para dar cuatro, se puede expresar como 21 ----- 22, al dividirse cuatro para dar ocho como 22 ----- 23 y así sucesivamente. Hay una relación directa entre el número inicial de células y el número de generaciones que han ocurrido durante el crecimiento exponencial. La figura 6 muestra las representaciones logarítmica y aritmética del crecimiento exponencial.

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Figura 6. Datos en escala logarítmica y aritmética.

Fuente: MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. 8 ed. Bogotá: Prentice Hall, 1999. p. 123. La escala aritmética muestra curva cuya pendiente se incrementa progresivamente, pero no dice mucho sobre la velocidad de crecimiento. Los datos representados en escala logarítmica muestran una línea recta, lo que es un indicador que la cantidad de células está creciendo exponencialmente. Los gráficos logarítmicos resultan de utilidad para estimar los tiempos de generación a partir de datos experimentales. Una característica del crecimiento exponencial es que la velocidad del incremento en el número de células es lenta inicialmente, para después presentar un crecimiento sumamente acelerado. Esta característica tiene gran importancia en la conservación de productos alimenticios y en la industria farmacéutica.

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Figura 7. Fisión binaria de una célula. Fuente: MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. 8 ed. Bogotá: Prentice Hall, 1999. p. 104. La figura 7 ilustra como sucede la fisión binaria en la célula. Durante el crecimiento todos los constituyentes de la célula se incrementan de tal manera que la célula hija recibe un cromosoma completo y copias de todas las demás estructuras que le permitirán vivir como célula independiente. El crecimiento exponencial se expresa como N = N0 2

n, donde N es número final de células, N0 = número inicial de células y n = el número de generaciones que han ocurrido durante la fase exponencial. El tiempo de generación g se calcula como t / n, donde t son las horas o minutos de crecimiento exponencial. Conociendo las poblaciones iniciales y finales es posible calcular el número de generaciones ocurridas, y el tiempo de generación. La ecuación N = N0 2

n donde, puede expresarse en términos de n valiéndose de las propiedades de los logaritmos: N = N0 2

n Log N = Log N0 + n*Log 2 Log N- Log N0 = n*Log 2 n= Log N- Log N0 / Log 2 = Log N - Log N0 / 0,301 4.1.4 Conteo de microorganismos. Existen diversos métodos para contar el número de microorganismos en una población. Una forma es el conteo directo a través del microscopio. Este Es un método rápido de conteo pero tiene

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desventajas como: las células muertas no se distinguen de las vivas, las células pequeñas son difíciles de ver al microscopio y probablemente sean omitidas del conteo, se requiere de tiempo para adquirir habilidad en el manejo de este método, y este método no es bueno con una suspensión de células poco densa. En la mayoría de casos, se requiere contar sólo las células vivas, por lo que se a desarrollado un método llamado conteo de viables. Una célula viable se define como la que es capaz de dividirse y dar origen a descendencia. La forma habitual de realizar este conteo es determinando el numero capaces de formar colonias sobre un medio sólido. Este método también se denomina conteo de placa o conteo de colonias. El razonamiento subyacente es que cada célula viable es capaz de dar origen a una colonia. Hay dos maneras de llevar a cabo un conteo de placa: por siembra en superficie o por vertido en placa. En el método de siembra de superficie un volumen no mayor a 0,1 ml de la suspensión adecuada se extiende por toda la superficie de la placa. Raramente se usan volúmenes mayores a 0,1 ml ya que no se absorben y se dificulta el conteo posterior. En el método de vertido, se pipetea un volumen conocido de suspensión entre 0,1 y 1,0 ml en el medio de cultivo fundido previamente, después de mezclado se vierte en una caja Petri y se incuba. La figura 8 ilustra el procedimiento para los dos métodos. Figura 8. Métodos para conteo de células viables. Fuente: MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. 8 ed. Bogotá: Prentice Hall, 1999. p. 172.

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El número de colonias que se desarrollen en las placas no debe ser muy elevado para que puedan contarse apropiadamente. El conteo de colonias tampoco puede ser muy bajo para poder que tenga significado estadístico. Lo habitual es realizar conteos entre 30 y 300 colonias por placa. Para obtener un número de colonias adecuado, la muestra de suspensión casi siempre debe ser diluida. La práctica general es realizar diluciones seriadas de base 10. Para realizar una dilución de 10 se mezcla 1 ml de muestra con 10 ml de diluyente, o 0,1 ml con 9,9 ml Figura 9. Conteo mediante diluciones. Fuente: MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. 8 ed. Bogotá: Prentice Hall, 1999. p. 173.

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4.1.5 Efecto de factores externos en el crecimiento. Las actividades microbianas se ven afectadas por las condiciones del medio ambiente. No todos los organismos responden igual a factor del ambiente, una condición beneficiosa para uno puede ser dañina para otro. Los factores de mayor importancia son: temperatura, pH, disponibilidad de agua y oxígeno. � Organismos según su respuesta a la temperatura. Se distinguen cuatro grupos de microorganismos en relación con su temperatura óptima: psicrófilos con temperaturas óptimas bajas, mesófilos con temperaturas óptimas medianas, termófilos con temperaturas óptimas más altas e hipertermófilos con temperaturas muy altas. Los mesófilos se encuentran en animales de sangre caliente y ambientes templados y tropicales, los psicrófilos y termófilos se encuentran en condiciones inusualmente fríos y calientes respectivamente, los hipertermófilos se encuentran en hábitats muy específicos como fuentes hidrotermales y géiseres. � Organismos según su respuesta al pH. Cada organismo tiene un rango de pH óptimo para el crecimiento. La mayoría de los ambientes naturales tienen pH de 5,9 y los organismos habituales tienen un pH óptimo equivalente. Los organismos que crecen a pH bajos se denominan acidófilos. Muy pocos organismos pueden crecer a pH inferior a 2. Los organismos que crecen a pH altos se denominan alcalófilos, tienen pH óptimos entre 10 y 11. La mayoría de estos microorganismos pertenece al género Bacillus. Debe aclararse que independiente de las condiciones extremas ambientales, el pH intracelular debe permanecer neutro para evitar la destrucción de las macromoléculas. � Organismos según la disponibilidad de agua. Los microorganismos dependen de la disponibilidad de agua para su crecimiento. La disponibilidad de agua depende no solo del nivel de humedad del ambiente, sino también de la concentración de solutos en ella, ya que el agua asociada a los solutos es inutilizable para los microorganismos. La disolución de agua con azúcar o sal puede considerarse un ambiente seco. La disponibilidad del agua se expresa en términos físico como actividad del agua aw, que es la razón entre la presión de vapor del aire en equilibrio con una sustancia y la presión de vapor, del agua pura a la misma temperatura. Sus valores varían entre 0 y 1. La actividad del agua en suelos agrícolas por ejemplo, oscila entre 0,90 y 1,00. El agua se difunde de un ambiente de alta concentración hacia uno de menor concentración, en un proceso llamado ósmosis. El citoplasma celular usualmente tiene una mayor concentración de solutos que el medio exterior, por lo que el agua tiende a difundirse hacia el interior de la célula. Cuando la célula está en un ambiente con baja actividad del agua, existe una

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tendencia de salida del agua del interior de la célula. La mayoría de los microorganismos no pueden crecer en un ambiente con baja actividad del agua, por lo que mueren o se deshidratan y se pasan a condiciones durmientes durante largo tiempo. Los microorganismos que se aíslan en el mar y crecen óptimamente en el agua de mar que contiene un 3% de sodio se denominan halófilos. Los organismos capaces de crecer en ambientes de muy alta concentración salina se denominan halófilos extremos, los cuales requieren un 15-30% de sodio para su crecimiento óptimo. Los organismos capaces de crecer en ambientes con altas concentraciones de azúcar se denominan osmófilos y los que crecen en ambientes muy secos por falta de agua se llaman xerófilos. � Organismos según la necesidad o tolerancia al oxígeno. Los microorganismos varían su necesidad o tolerancia al oxígeno. Los organismos que pueden crecer en concentraciones altas de oxígeno se denominan aerobios. Los organismos que carecen de sistema respiratorio y no pueden utilizar el oxígeno se denominan anaerobios. Los anaerobios se dividen en dos clases, los anaerobios facultativos que pueden crecer en presencia del oxígeno aunque no puedan utilizarlo y los anaerobios obligados (o estrictos) que mueren en presencia del oxígeno. La razón por la que los anaerobios estrictos mueren en presencia del oxígeno es porque son incapaces de eliminar algún producto tóxico derivado del metabolismo del oxígeno. Loas aerobios por el contrario son ricos en enzimas que descomponen tales productos. Pudiera creerse que los anaerobios son poco frecuentes en la naturaleza. En realidad los ambientes libres de oxígeno abundan en la Tierra por ejemplo en fangos y sedimentos lacustres, ríos y océanos, alimentos envasados, tracto intestinal de animales, cavidad oral de animales, sistemas de aguas residuales y aguas subterráneas. En la mayoría de estos ambientes la ausencia de oxígeno se debe a las actividades de microorganismos que consumen el oxígeno durante la respiración y producen sustancias reductoras. Si no se recambia el oxígeno, el hábitat se torna anóxico. Entre los organismos anaerobios estrictos más comunes se encuentran las especies del género Clostridium, que es un grupo de bacilos esporulados1 Gram positivos. Los clostridios se encuentran en el suelo, sedimentos de lagos, tracto intestinal y son responsables del deterioro de alimentos envasados. 4.1.6 Formación de endosporas. Ciertas especies de bacterias producen en su interior estructuras especiales denominadas endosporas. Las endosporas son células diferenciadas, que presentan una resistencia extraordinaria al calor y son muy difíciles de destruir. Estas bacterias se encuentran principalmente en el suelo. Estas estructuras se forman dentro de la célula por lo que se denominan endosporas. 1 Organismos formadores de endosporas. Ver sección 4.7

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El núcleo de una endospora madura se encuentra parcialmente deshidratado, lo que aumenta su termorresistencia y el pH en el núcleo es aproximadamente una unidad inferior al de la célula vegetativa y contienen niveles elevados de proteínas específicas del núcleo, que se unen al ADN del núcleo y la protegen del daño por radiación ultravioleta, la desecación y el calor seco. Figura 10. Ciclo de formación de una espora. Fuente: MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. 8 ed. Bogotá: Prentice Hall, 1999. p. 238. Madigan y Martinko dicen que “Las endosporas son metabólicamente inertes pero muy resistentes. Una endospora es capaz de permanecer en estado latente durante mucho tiempo. Se han realizado numerosas investigaciones sobre la longevidad de las esporas, encontrando esporas con capacidad de germinar con edades de varios millones de años”2. Las endosporas son muy impermeables a los colorantes por lo que en ocasiones se ven como zonas sin teñir dentro de células que han sido teñidas con colorantes básicos. La estructura de la espora es mucho más compleja que la de la célula vegetativa, ya que posee múltiples capas, siendo la más externa el exosporium,

2 Cuánto tiempo puede sobrevivir una espora. Fuente: MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. 8 ed. Bogotá: Prentice Hall, 1999. p. 240.

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una fina cubierta de naturaleza proteica. Las esporas se diferencian estructuralmente de las células vegetativas en el tipo de estructuras situadas por fuera de la pared del núcleo de la espora. La conversión de la espora a célula vegetativa es relativamente rápida e implica tres pasos: activación, germinación y crecimiento. La activación se realiza mediante calentamiento de endosporas durante varios minutos a una temperatura no letal elevada. Las esporas activadas germinan cuando se encuentran con nutrientes específicos y es un proceso que toma varios minutos, e implica la pérdida de la resistencia al calor y las sustancias químicas. La fase de crecimiento se caracteriza por el aumento de tamaño debido a la aceptación de agua. La célula surge de la capa rota de la espora y continua en crecimiento vegetativo hasta que detecta nuevamente señales en el entorno que desencadenan la esporulación. Figura 11. Diferencias entre células vegetativas y endosporas.

Fuente: MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J. Biología de los microorganismos. 8 ed. Bogotá: Prentice Hall, 1999. p. 245.

El descubrimiento de las endosporas bacterianas fue de gran importancia para el desarrollo de la ciencia microbiológica. El conocimiento de estas formas altamente resistentes al calor permitió el desarrollo de métodos de esterilización efectivos, para medios de cultivo, alimentos y productos farmacéuticos. Muchos organismos distintos a las bacterias forman esporas, pero la endospora bacteriana es única en términos de su resistencia al calor. El diseño y validación de los procesos de

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esterilización a nivel industrial se basan en la letalidad obtenida sobre una población inicial conocida de esporas con una resistencia específica, a determinada temperatura de proceso. 4.2. CIENCIA DE LA ESTERILIZACIÓN La naturaleza exponencial del crecimiento de bacterias indica que relativamente poco tiempo se pueden originar más de microorganismos que pudieran ocupar todo el espacio terrestre. Esto es factor teórico ya que el crecimiento microbiano está limitado por la disponibilidad de nutrientes. Sin embargo el control del crecimiento microbiano es fundamental en la industria para evitar el deterioro de alimentos y otros productos perecederos. La esterilización puede definirse como un proceso para eliminar los microorganismos viables en un elemento determinado. Existen medidas de control rutinarias para el control microbiano como la desinfección y esterilización de zonas y equipos involucrados en la elaboración de alimentos y medicamentos, pero en las grandes industrias se hace necesario el diseño de procesos de esterilización a gran escala para altos niveles de producción. Un caso particular es la esterilización de productos médicos como las soluciones parenterales• , que al tener contacto con el torrente sanguíneo de un paciente deben ser completamente libres de microorganismos viables. La presencia de bacterias tendría consecuencias fatales para el paciente. Se define que un producto es estéril cuando se encuentra libre de microorganismos viables aunque en la práctica no es posible probar esa afirmación de manera absoluta. Esto será analizado más en detalle en los siguientes capítulos. 4.2.1 Cinética de la letalidad microbiana. Al igual que el crecimiento microbiano, la muerte de las bacterias presenta una naturaleza exponencial. En el año 1930 el científico Otto Ranh estudio de manera profunda la cinética de la muerta bacteriana. Como afirma el Dr. Pflug3, A la luz del conocimiento actual sobre los requerimientos nutricionales y de crecimiento bacteriano, un microorganismo se considera muerto si es incapaz de mostrar crecimiento cuando es colocado bajo las condiciones apropiadas para ello. Recientes avances indican que las esporas muestran incapacidad para crecer y reproducirse por dos causas

• Productos farmacéuticos administrados a un paciente por vía intravenosa. 3 PFLUG, I. J. Microbiology and Engineering of sterilization processes. 13 ed. Indiana: Universidad de Minessota, 2008 p. 2.4

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principales: la inhabilidad para iniciar la germinación o la inhabilidad para duplicar macromoléculas críticas. Para comprender y analizar la letalidad bacteriana se toma como referencia el número de sobrevivientes de una población inicial después de ser sometida a un proceso de destrucción microbiana. Durante el desarrollo de procesos de esterilización no se cuentan los organismos muertos a causa del tratamiento, sino que se determina el número de organismos sobrevivientes después del tratamiento. Incluso es posible que no todos los organismos sobrevivientes sean contados. Hay varias maneras en que se pueden representar gráficamente los datos del número de sobrevivientes de una población bacteriana. Convencionalmente se representa el número de sobrevivientes en el eje y, y el tiempo de proceso en el eje x, pero pueden utilizarse diversas alternativas como: una escala aritmética una escala logarítmica, o incluso como porcentaje o fracción de sobrevivientes. Figura 12. Representación aritmética de sobrevivientes. La figura 12 muestra que cuando el nivel de sobrevivientes se acerca a cero la representación aritmética no dice mucho respecto al número exacto de organismos viables. La causa de este inconveniente es que la escala aritmética

Tiempo

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debe acomodarse a un valor de un millón de organismos correspondientes a la población en tiempo cero. En los procesos de control microbiano es importante conocer con un alto nivel de confiabilidad el número de sobrevivientes en los niveles menores de sobrevivientes. Figura 13. Representación logarítmica de sobrevivientes. En la representación logarítmica el eje y es dividido con base en potencias de diez, lo que facilita la legibilidad del nivel de sobrevivientes incluso cuando el valor en el eje y es menor a un sobreviviente. Esta característica la hace muy útil en el campo del control microbiano. Durante el diseño de procesos de esterilización se utiliza una representación en papel semilogarítmico, donde el eje y corresponde a

Sobrevivientes

Tiempo

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una escala logarítmica correspondiente al número de organismos, y el eje x corresponde a una escala aritmética para representar el tiempo de proceso.

4.2.2 Desarrollo del modelo semilogarítmico. En 1945, Otto Rahn desarrollo su modelo sobre la cinética de la letalidad microbiana. Rahn basó su modelo en la Ley de Acción de la Masa, en la que se asume una reacción molecular que ocasiona la muerte bacteriana, la cual incluye una constante que será el coeficiente de tasa de reacción K. El objetivo es formular las ecuaciones adecuadas para el análisis de datos experimentales, por lo que inicialmente no se le asigna signo, este se determinará mediante los resultados del análisis de los datos. Partimos del siguiente postulado: “la tasa de cambio en el número de moléculas no afectadas por las reacciones dN/dt , es una función del número de moléculas no afectadas N, y una constante apropiada K”. De este modo la ecuación puede enunciarse así:

KNdt

dN = (4.1)

Cuando se aplica la Ley de Acción de la Masa a la inactivación microbiana, No será el número inicial de microorganismos y N será el número de sobrevivientes después de un tiempo de proceso t. En el proceso de tratamiento con calor la constante K será una función de la temperatura. Dado que la tasa de cambio de las moléculas no afectadas dN/dt es función de N y K, y N decrece con el tiempo, el valor numérico de K será un número negativo.

Mediante el método de variables separables, podemos reorganizar la ecuación 4.1 de modo que pueda ser resuelta por integrales:

Después de integrar queda CKtN +=ln (4.2)

Al evaluar la ecuación 4.2 en condiciones de frontera, es decir en tiempo cero la población inicial es No, y como la ecuación está expresada de manera logarítmica, la constante será definida el logaritmo natural de No, obteniendo la siguiente expresión:

0lnln NKtN += (4.3) Se ha desarrollado una ecuación donde K tiene un valor negativo, y el número de sobrevivientes decrecerá de manera exponencial. La ecuación 4.3 tiene la forma de la ecuación de una recta y = mx + b, donde y es ln N, la pendiente m es K, x es el tiempo t, y el intercepto b es No.

∫∫ = dtKNdN

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Cuando se grafica la gráfica de sobrevivientes versus tiempo se obtiene una línea recta a partir de una función logarítmica, el número de sobrevivientes y una función aritmética, el tiempo. Esto es llamado una gráfica semilogarítmica y la ecuación 4.3 define el modelo semilogarítmico de Rahn. El modelo de Rahn ha evolucionado a uno ampliamente utilizado hoy, el cual se obtiene realizando pequeñas modificaciones al modelo original. El primer paso es cambiar la base de los logaritmos de la base natural e, logaritmos en base 10. El segundo paso es cambiar el tiempo medido por reloj t, por el término U, que representa los minutos equivalentes en tiempo a una temperatura de referencia. El tercer paso es definir e incorporar el valor D.

Primero se despeja Kt en la ecuación 4.3 0lnln NNKt −= , por propiedades de

los logaritmos: 0

lnN

NKt = , ahora utilizando la igualdad para la conversión de

logaritmos naturales a base 10: )(log303,2ln xx = , por tanto:

)(log303,20N

NKt = y

0

log303,2

1

N

NKt = = Kt4343,0 .

El convertir el modelo de base e a base 10 ha generado una nueva constante. Es posible mantener la simplicidad y la corrección matemática del modelo, creando un nuevo término k minúscula, definido como la tasa de reacción pero en base 10.

Las dos constantes están relacionadas Kk 4343,0= , finalmente al rescribir en la ecuación 4.3 con la nueva base tenemos:

0loglog NktN += (4.4) En los procesos de control microbiano, la letalidad microbiana está relacionada con un tiempo de calentamiento equivalente U, que no es necesariamente el tiempo medido por el reloj, por lo que se introducirá U en la ecuación 4.4.

0loglog NUkN T += (4.5) El término k se ha modificado con el subíndice T, para mantener la relación del tiempo U con una temperatura de referencia T.

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En un cultivo homogéneo de microorganismos, cuya muerte puede representarse por la ecuación 4.5, la constante k, expresada en – minutos-1, (1/t dado que k representa la cantidad de bacterias afectadas por unidad de tiempo), será una medida de la tasa de letalidad en los microorganismos. Como k tendría valores como –0,5 minutos-1, esto se resuelve con la introducción del valor D. La constante kT representa la pendiente de una línea, por tanto:

x

ykT ∆

∆== θtan

La pendiente de la recta que representa sobrevivientes versus tiempo será la tangente del ángulo formado por:

U

N

∆∆= logθ ,

con la ayuda de la gráfica de sobrevivientes versus tiempo representada en la gráfica semilogarítmica de la figura 13 se determinan los valores de x∆ y y∆ .

Figura 14. Curva de sobrevivientes.

U U2 – U1

Log N 2 – Log N 1

-1

40

El numerador Nlog∆ es la diferencia entre N2 y N1 , que representa la reducción de un logaritmo en la población, será siempre –1. El denominador U∆ es la diferencia entre U2 y U1, que representa el intervalo de tiempo para obtener la reducción de un logaritmo. Por tanto la pendiente kT será U∆− /1 para el cambio de un logaritmo en N. Las unidades serán –1/ minutos.

Por tanto: UUUU

NkT ∆

−=−

−=∆

∆== 11logtan12

θ y Tk

U1−=∆

El valor U∆ es el tiempo para un cambio de un logaritmo base 10 en el número de microorganismos representado en la gráfica de sobrevivientes. Como este tiempo corresponde a U2 – U1, tendrá un valor positivo. Este será el nuevo término a introducir en la ecuación 4.5 como valor D, por ende:

DT = U∆ = U2 – U1 = Tk

1−

Entonces:T

T Dk

1−= Finalmente el término valor D ha sido relacionado con kT,

Ahora la nueva ecuación del modelo semilogarítmico es:

0loglog ND

UN

T

+−= (4.6)

El nuevo modelo es matemáticamente correcto dado que la constante inicial K tenía un valor negativo y el nuevo término U / D tiene signo negativo. El valor D es función de la temperatura. Este es el modelo actual que sirve de base para el diseño de procesos de esterilización. 4.2.3 Conceptos base de esterilización. Los siguientes son los conceptos básicos para diseñar y calificar un proceso de esterilización.

• Valor DT. En la sección 4.2.2 se introdujo el valor DT a partir de la constante de reacción KT (KT = 2,303kT = -1 / DT), para desarrollar un modelo apropiado para la curva de sobrevivientes, en la que el valor DT es el intervalo de tiempo necesario

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para que la población disminuya en un logaritmo, es decir en un 90%. Si el valor DT es igual a 10 minutos entonces a partir de una población inicial se requieren 10 minutos de proceso para que la población disminuya en un 90%, Pero dado que el valor DT es función de la temperatura, se requiere conocer la temperatura de proceso para que tenga significado práctico. En la figura 15 se ilustra el significado del valor DT.

Figura 15. Valor DT en la curva de sobrevivientes.

Cada 2,5 minutos la población disminuye un 90%. Cada intervalo de tiempo igual a 2,5 minutos se elimina el 90% de la población anterior. En instante en que la población es 100, el porcentaje acumulado de destrucción microbiana es de 99,9999 %. A menor valor DT, más rápida es la reducción de la población, por tanto es correcto decir que el valor DT es una medida de la resistencia de una población microbiana, a determinadas condiciones de temperatura. • Valor Z. En la sección 4.2.2 se definió que el valor DT y la letalidad en términos de tiempo equivalente son dependientes de la temperatura del proceso, por tanto debe haber un parámetro en unidades de temperatura que determine la variación en la resistencia y la letalidad en una población de microorganismos. Ese

42

parámetro es el valor Z. Hay dos maneras de determinar el valor Z para una población de microorganismos: la primera es realizar experimentos a diversas temperaturas para hallar los valores DT correspondientes a esas temperaturas. La segunda es realizar experimentos para determinar el tiempo necesario para reducir la población en un 90% (un logaritmo) a diferentes temperaturas. Estos experimentos pueden ser representados de manera gráfica en una escala semilogarítmica similar a la curva de sobrevivientes. Figura 16. Curva Temperatura – Resistencia.

Fuente: PFLUG, I. J. Microbiology and Engineering of sterilization processes. 13 ed. Indiana: Universidad de Minessota, 2008. p. 5.3.

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La figura 16 muestra la curva Resistencia – Temperatura, en la que se observa el cambio en el valor DT con respecto a la temperatura. El valor Z resulta ser una diferencia de temperaturas. Figura 17. Curva Tiempo de Letalidad – Temperatura. Fuente: PFLUG, I. J. Microbiology and Engineering of sterilization processes. 13 ed. Indiana: Universidad de Minessota, 2008. p. 5.3. La figura 17 muestra la curva Tiempo de Letalidad – Temperatura, en la que se observa el cambio en el valor FT (equivalente al término U de la ecuación 4.6) con respecto a la temperatura. En este caso el valor Z es también una diferencia de temperaturas. Se define el valor z como la diferencia de temperatura necesaria para cambiar el valor DT y el valor FT en un factor de 10 (un logaritmo). El valor z es una medida del cambio en la tasa de muerte de microorganismos ocasionado

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por un cambio en la temperatura de proceso. Las ecuaciones de ambas curvas deben ser similares: Curva Resistencia -Temperatura: log DT = -1 / z (T – Tref) + log DTref (4.7) Curva Letalidad -Temperatura: log FT = -1 / z (T – Tref) + log FTref (4.8) La ecuación 4.8 será la base para desarrollar una ecuación para FT k. • Valor FT. En el modelo semilogarítmico

0loglog ND

UN

T

+−=

en el que U era el tiempo equivalente a la temperatura de proceso, debido a que el esterilizador alcanza primero la temperatura de referencia, mientras el producto gana temperatura lentamente. Figura 18. Temperatura de Proceso vs. Temperatura de Producto.

El producto no alcanza la temperatura de referencia, pero la temperatura que gana durante el proceso igualmente proporciona letalidad aunque a una tasa menor. Resulta entonces conveniente calcular cuanto tiempo a una temperatura determinada es necesario para lograr una letalidad igual a la que entrega la temperatura de referencia.

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Partiendo de la ecuación log FT = -1 / z (T – Tref) + log FTref es necesario suprimir los logaritmos:

log FT - log FTref = -1 / z (T – Tref) = log FTref - log FT = 1 / z (T – Tref)

log (FTref / FT) = 1 / z (T – Tref) = FTref / FT = 10(T - Tref) / z

La razón FTref / FT se interpreta como: minutos equivalentes a la temperatura de referencia FTref por minuto a una temperatura T, o letalidad equivalente L.

L = 10(T - Tref) / z (4,9)

Si T < Tref entonces L < 1, si T = Tref entonces L = 1, si T > Tref entonces L > 1

Como L, es la letalidad equivalente a Tref para un minuto a una temperatura T, el tiempo equivalente total a temperatura de proceso sería:

∑=

=t

nT LrefF

1

,

pero dado que la de temperatura de producto no es una función lineal, para hallar el área bajo la curva de temperatura se debe recurrir a una integral:

FTref = ∫ Ldt

que se conoce como F0 cuando se trabaja con los valores universalmente utilizados para procesos de esterilización con calor húmedo, la ecuación final es:

Para TRef = 121,1° C y valor Z = 10° C, 10

121

10CT

L°−

= (4.9)

Las unidades de L son minutos (o fracción de minuto). Mediante la ecuación 4,9 es posible calcular la letalidad minuto a minuto para un ciclo de esterilización. La tabla 1 muestra los valores para L 121° C.

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Tabla 1. Valores de L para Tref 121,1° C, Z 10° C

Fuente: PFLUG, I. J. Microbiology and Engineering of sterilization processes. 13 ed. Indiana: Universidad de Minessota. 2008. p. 7.8.

Leta lidad = 10 (T ref - 121,1) / 10

°C LET °C LET °C LET °C LET °C LET100,0 0 ,008 105,0 0,025 110,0 0,078 115,0 0,245 120,0 0,776100,1 0 ,008 105,1 0,025 110,1 0,079 115,1 0,251 120,1 0,794100,2 0 ,008 105,2 0,026 110,2 0,081 115,2 0,257 120,2 0,813100,3 0 ,008 105,3 0,026 110,3 0,083 115,3 0,263 120,3 0,832100,4 0 ,009 105,4 0,027 110,4 0,085 115,4 0,269 120,4 0,851100,5 0 ,009 105,5 0,028 110,5 0,087 115,5 0,275 120,5 0,871100,6 0 ,009 105,6 0,028 110,6 0,089 115,6 0,282 120,6 0,891100,7 0 ,009 105,7 0,029 110,7 0,091 115,7 0,288 120,7 0,912100,8 0 ,009 105,8 0,030 110,8 0,093 115,8 0,295 120,8 0,933100,9 0 ,010 105,9 0,030 110,9 0,095 115,9 0,302 120,9 0,955101,0 0 ,010 106,0 0,031 111,0 0,098 116,0 0,309 121,0 0,977101,1 0 ,010 106,1 0,032 111,1 0,100 116,1 0,316 121,1 1,000101,2 0 ,010 106,2 0,032 111,2 0,102 116,2 0,324 121,2 1,023101,3 0 ,010 106,3 0,033 111,3 0,105 116,3 0,331 121,3 1,047101,4 0 ,011 106,4 0,034 111,4 0,107 116,4 0,339 121,4 1,072101,5 0 ,011 106,5 0,035 111,5 0,110 116,5 0,347 121,5 1,096101,6 0 ,011 106,6 0,035 111,6 0,112 116,6 0,355 121,6 1,122101,7 0 ,011 106,7 0,036 111,7 0,115 116,7 0,363 121,7 1,148101,8 0 ,012 106,8 0,037 111,8 0,117 116,8 0,372 121,8 1,175101,9 0 ,012 106,9 0,038 111,9 0,120 116,9 0,380 121,9 1,202102,0 0 ,012 107,0 0,039 112,0 0,123 117,0 0,389 122,0 1,230102,1 0 ,013 107,1 0,040 112,1 0,126 117,1 0,398 122,1 1,259102,2 0 ,013 107,2 0,041 112,2 0,129 117,2 0,407 122,2 1,288102,3 0 ,013 107,3 0,042 112,3 0,132 117,3 0,417 122,3 1,318102,4 0 ,013 107,4 0,043 112,4 0,135 117,4 0,427 122,4 1,349102,5 0 ,014 107,5 0,044 112,5 0,138 117,5 0,437 122,5 1,380102,6 0 ,014 107,6 0,045 112,6 0,141 117,6 0,447 122,6 1,413102,7 0 ,014 107,7 0,046 112,7 0,145 117,7 0,457 122,7 1,445102,8 0 ,015 107,8 0,047 112,8 0,148 117,8 0,468 122,8 1,479102,9 0 ,015 107,9 0,048 112,9 0,151 117,9 0,479 122,9 1,514103,0 0 ,015 108,0 0,049 113,0 0,155 118,0 0,490 123,0 1,549103,1 0 ,016 108,1 0,050 113,1 0,158 118,1 0,501 123,1 1,585103,2 0 ,016 108,2 0,051 113,2 0,162 118,2 0,513 123,2 1,622103,3 0 ,017 108,3 0,052 113,3 0,166 118,3 0,525 123,3 1,660103,4 0 ,017 108,4 0,054 113,4 0,170 118,4 0,537 123,4 1,698103,5 0 ,017 108,5 0,055 113,5 0,174 118,5 0,550 123,5 1,738103,6 0 ,018 108,6 0,056 113,6 0,178 118,6 0,562 123,6 1,778103,7 0 ,018 108,7 0,058 113,7 0,182 118,7 0,575 123,7 1,820103,8 0 ,019 108,8 0,059 113,8 0,186 118,8 0,589 123,8 1,862103,9 0 ,019 108,9 0,060 113,9 0,191 118,9 0,603 123,9 1,905104,0 0 ,019 109,0 0,062 114,0 0,195 119,0 0,617 124,0 1,950104,1 0 ,020 109,1 0,063 114,1 0,200 119,1 0,631 124,1 1,995104,2 0 ,020 109,2 0,065 114,2 0,204 119,2 0,646 124,2 2,042104,3 0 ,021 109,3 0,066 114,3 0,209 119,3 0,661 124,3 2,089104,4 0 ,021 109,4 0,068 114,4 0,214 119,4 0,676 124,4 2,138104,5 0 ,022 109,5 0,069 114,5 0,219 119,5 0,692 124,5 2,188104,6 0 ,022 109,6 0,071 114,6 0,224 119,6 0,708 124,6 2,239104,7 0 ,023 109,7 0,072 114,7 0,229 119,7 0,724 124,7 2,291104,8 0 ,023 109,8 0,074 114,8 0,234 119,8 0,741 124,8 2,344104,9 0 ,024 109,9 0,076 114,9 0,240 119,9 0,759 124,9 2,399

47

Si revisamos L para 110° C la tabla 1, indica 0,02 5. Esto significa que un minuto a 110° C es equivalente a 0,025 minutos a 121,1° C, c on un valor Z =10° C. Es decir que si con un minuto a 121° C, eliminamos el 90% de una población de bacterias, si se somete la misma población a una temperatura de 110° C se requieren 40 minutos (0,025 x 40 = 1) para obtener la misma letalidad que con 121,1° C. 4.2.4 Correlación entre letalidad física y biológica. La ecuación para la reducción de la población bacteriana desarrollada en la sección 4.2.2,

0loglog ND

UN

T

+−= , despajando TDNNU )log(log 0 −=

Indica que el tiempo equivalente de proceso es función de la población inicial y la resistencia del microorganismo. La ecuación para la letalidad equivalente desarrollada en la sección 4.2.3, se expresan de la siguiente manera:

10

121

10CT

L°−

= y ∫= LdtF0 ,

en las que el tiempo equivalente de proceso es función de la temperatura de producto y el cambio de temperatura que modifica la resistencia del microorganismo (valor Z = 10° C). En el primer caso, el tiempo U se relaciona con la letalidad biológica, y esta solo puede ser verificada mediante indicadores biológicos. Un indicador biológico es un elemento que contiene una población de microorganismos en el que la especie, la cantidad y la resistencia son conocidas. Como medio para inocular se puede utilizar un papel especial, o suspensión líquida. Para validar procesos de esterilización con calor húmedo siempre se utilizan indicadores con microorganismos que presenten gran resistencia a las altas temperaturas y que sean formadores de esporas, entre los más utilizados se encuentran el Geobacilus Stearothermophilus y el Bacilus Subtillis. En el segundo caso, el tiempo F0 se refiere a un tiempo equivalente a una temperatura de referencia, cuando la temperatura del producto es diferente a la de referencia. La temperatura puede medirse directamente mediante termómetros, o

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sensores como termocuplas, por lo que este valor se relaciona con una letalidad física. La ecuación:

0loglog NDU

NT

+−=

sugiere que si se conoce el tiempo U (el cual puede calcularse con base en la temperatura medida directamente y la ecuación para L, y se conoce la población inicial y la resistencia de los microorganismos, se puede hallar la población final. Se pudiera pensar que la letalidad biológica puede asegurarse mediante la medición directa de la temperatura en el producto que se somete al proceso de esterilización y el cálculo del valor F0 sin que sea necesario utilizar indicadores biológicos, pero en la práctica esto no se permite. Todo proceso de esterilización debe ser validado biológica y físicamente.

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5. RESULTADOS En este capítulo se desarrollan los resultados obtenidos a partir de los tres objetivos específicos. En la sección 5.1 se revisarán los perfiles de biocarga obtenidos en los muestreos realizados en una planta farmacéutica en la ciudad de Cali. En la sección 5.2 se estudian las variables involucradas en un proceso de esterilización y los lineamientos para su validación. En la sección 5.3 se establecen los requerimientos para aplicar la Liberación Paramétrica como alternativa de aprobación de productos farmacéuticos esterilizados con calor húmedo. 5.1. ENTORNO MICROBIANO DE UNA PLANTA FARMACEUTICA Las plantas industriales que manufacturan productos farmacéuticos deben operar bajo condiciones estrictas de limpieza y sanidad. Los ministerios de salud exigen que estas empresas cumplan con los lineamientos establecidos en la normatividad conocida como Buenas Prácticas de manufactura, la cual describe los requerimientos mínimos de operación para una planta de manufactura. Uno de los principales factores a controlar en una planta del sector farmacéutico es su entorno microbiológico. Los niveles de carga bacteriana en las áreas y equipos involucrados en el proceso de manufactura del producto deben ser controlados y monitoreados con el fin de mantener conteos bajos de biocarga en el producto antes de ser sometido al proceso de esterilización. Para llevar a cabo un control efectivo, es necesario realizar muestreos microbiológicos en las áreas productivas e identificar las especies de microorganismos presentes. También es importante realizar muestreos en manos al personal que tiene contacto directo con el producto durante el proceso de producción. Para obtener el perfil microbiológico de una planta farmacéutica en la ciudad de Cali, se realizaron muestreos en áreas productivas, al producto antes de esterilizar y al personal en contacto con el producto. Cuando la muestra excedió los criterios de aceptación establecidos, se procedió a la identificación de cada bacteria, inicialmente con la Tinción de Gram para la caracterización inicial, y luego mediante el método BBL Cristal para determinar la especie. Se realizó siembra por vertido en placa y se incubaron las muestras por un período de siete días a 35-45° C.

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La toma de muestras se realizó en agua destilada utilizada como materia prima para la preparación del producto, en los tanques de mezclado donde se prepara la formulación y se realiza la mezcla de componentes, en el cuarto de bombas que llevan el producto desde los tanque hasta la línea de llenado de soluciones, en el área donde se realiza la impresión de la información del producto a las bolsas en que se llenan las soluciones , en las líneas de llenado de soluciones, y al producto tanto en la fase de mezcla inicial, como después de llenado antes de esterilizar. También se realizaron muestreos en manos al personal de estas áreas. Los productos que fueron muestreados son soluciones intravenosas. El muestreo se realizó mediante filtración de un volumen de 100 ml solución. La frecuencia de muestreo fue diaria cada lote de producción durante Junio-Diciembre de 2007 y Enero-Junio 2008. Los límites de alerta para fueron de 30 unidades formadoras de colonias por muestra. A continuación se muestran los resultados de identificación de bacterias cuando la muestra estuvo por fuera de límites de alerta. La columna frecuencia indica las veces que fue necesaria la identificación de la bacteria por condición fuera de límites. Esto permitirá establecer el perfil microbiológico de la planta farmacéutica. 5.1.1 Resultados de muestreo en aguas. Se realizó el muestreo en el suministro de agua para torres de enfriamiento (no destilada) y a la salida de los destiladores para las aguas a utilizar en la mezcla de productos. Tabla 2. Resultados muestreo en aguas.

Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador

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Estos microorganismos son típicos de ambientes húmedos. No se observa presencia de organismos formadores de esporas. Siete conteos fuera de límites. 5.1.2 Resultados de muestreo en área de plásticos. En esta área se realizan procesos de extrusión, inyección y sellado de plásticos. La materia prima es PVC• grado médico. El personal tiene contacto directo con las bolsas. Tabla 3. Resultados muestreo en área de plásticos. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador En el área de plásticos se tienen diversos controles como presión positiva, ingreso controlado de materiales, indumentaria especial para el personal y lavado de manos previo al ingreso. Los monitoreos ambientales en esta área son estrictos para el controlar el nivel de partículas. Esto contribuye a que los conteos de biocarga en esta área sean muy bajos. No hay presencia de esporas. Solamente dos conteos fuera de límites en superficies de no contacto directo con el producto como suelos y paredes. 5.1.3 Resultados de muestreo en área bombas. En el área de bombas se realiza el armado de las bombas que llevan la solución hacia las líneas de llenado. Tabla 4. Resultados muestreo en área de bombas. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador

• PVC. Sigla para Cloruro de Polivinilo.

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La presencia del género Enterobacter sugiere contaminación en los componentes mezclados debida a lavado inadecuado de manos del personal. El ambiente de esta área es sumamente húmedo. Igualmente se realizan monitoreos ambientales para partículas. No se observa presencia de formadores de esporas. 5.1.4 Resultados de muestreo en área de tanques. En el área de tanque se realiza la mezcla de los componentes de cada formulación de producto. Se toman muestras en la mezcla, el suministro de agua destilada, superficies de no contacto y manos del personal. Tabla 5. Resultados muestreo en área de tanques. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador .

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El área de tanques es un ambiente de alta humedad, lo que contribuye a la presencia de microorganismos. Alto índice de fuera de límites, 33 conteos por fuera del límite máximo. Sobresale la presencia de la especie Acinetobacter Baumanii. No se observa presencia de organismos formadores de esporas. 5.1.5 Resultados de muestreo en área de medicamentos. Para la mezcla de medicamentos con componentes con características especiales como foto-sensibilidad, requerimientos especiales de pH entre otros, se tiene una zona especial de tanques y mezclado. Tabla 6. Resultados muestreo en área de medicamentos. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador Al igual que en la zona de tanques, el ambiente de esta área es muy húmedo. El acceso a esta área es altamente restringido y controlado, debido las características de los productos que allí se mezclan.

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5.1.6 Resultados de muestreo en área de impresión de bolsa. Es área se divide en tres zonas. Tabla 7. Resultados muestreo en área de impresión 1. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador Tabla 8. Resultados muestreo en área de impresión 2. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador Tabla 9. Resultados muestreo en área de impresión 3. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador

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Tabla 10. Consolidado de muestreos en área de impresión 1,2 y 3. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador El consolidado es de 49 muestreos fuera de límites todos en manos del personal. 5.1.7 Resultados de muestreo en área de llenado de bolsas. Esta área se divide en cuatro zonas de acuerdo con el tipo de productos que se llenan en ellas. Tabla 11. Resultados muestreo en área de llenado de bolsas 1. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador

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Tabla 12. Resultados muestreo en área de llenado de bolsas 2. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador En esta área se llenan los productos de mayor volumen de solución. Esta es la línea con menor nivel de humedad.

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Tabla 13. Resultados muestreo en área de llenado de bolsas 3. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador En llenado 3 llenan los volúmenes menores. En el área de llenado 4 se realiza el llenado de productos especiales para máquinas de diversas terapias.

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Tabla 14. Resultados muestreo en área de llenado de bolsas 4. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador Las líneas de llenado son las mayores áreas de muestreo, son zonas muy húmedas. Se realizan muestreos en el agua destilada para sanitización,

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superficies de no contacto, la solución antes de esterilizar, y manos del personal. Los muestreos de biocarga en parte seca se realizan en los accesorios especiales que lleven las bolsas y que no estén en contacto con la solución y se consolidan con los conteos en soluciones para contabilizar la biocarga total de una unidad de producto antes de ser esterilizada. Tabla 15. Consolidado de muestreos en áreas de llenado. Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador La especie Enterobacter Cloacae sugiere lavado de manos deficiente. El índice de conteos fuera de límites es alto, 136 muestreos fuera de límites. No se observa presencia de organismos formadores de esporas.

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Figura 19. Distribución de muestreos en áreas de llenado.

Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador La mayoría de muestreos fuera de límites se encuentran en la solución, mientras la mezcla de solución antes de llenar presenta un índice bajo gracias al sistema de filtración previo a las líneas de llenado. Esto sugiere que en el momento de llenar la solución en la bolsa ocurre contaminación, posiblemente transmitida por el personal operativo del área. 5.1.8 Resultados consolidados de muestreos. Los resultados consolidados indican que los puntos de muestreo con mayor índice de fuera de límites son las soluciones antes de esterilización y las manos del personal. Existe una relación entre estos dos puntos críticos ya que los muestreos de mezclas previos al llenado de la solución presentan índices bajos de fuera de límites gracias al sistema de filtración previo al llenado.

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La tabla 16 muestra que el consolidado total de muestreos fuera de límites es de 267 muestreos. Tabla 16. Consolidado total por punto de muestreo.

Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador La tabla 17 muestra el consolidado total por especie de microorganismos para todas las áreas muestreadas. Tabla 17. Consolidado total por especie de microorganismo.

Fuente: Informe Biocarga 2008. Planta Farmacéutica Cali. Santiago de Cali, 2008. 1 archivo de computador

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5.1.9 Características de los microorganismos más frecuentes. � Enterobacter Cloacae. Es una bacteria Gram negativa, anaeróbico facultativa, con una temperatura óptima de crecimiento de aproximadamente 30° C, asociado a infecciones del tracto digestivo y respiratorio. Su presencia se debe principalmente al lavado de manos deficiente después de hacer uso del baño. � Klebsiella Oxytoca. Es una bacteria Gram negativa, con características muy parecidas a las de la Klebsiella Pneumoniae. Se detecta en suelos, plantas y agua, además del tracto gastrointestinal. � Acinetobacter Baumanii. Es una bacteria Gram negativa, aerobia estricta, típica del medio ambiente, resistente a los antibióticos, relacionada con heridas abiertas, asociada a diversas enfermedades infecciosas. � Klebsiella Pneumoniae. Es una bacteria Gram negativa, anaeróbico facultativa que hace parte de la flora bacteriana de la boca, la piel e intestinos. Es clínicamente la especie más importante del género Klebsiella, causante de la neumonía y asociada a infecciones en heridas y el tracto urinario. � Stenotrophomonas Maltophlia. Es una bacteria Gram negativa, aeróbica, no fermentativa. Es común ambientes acuosos, suelos, plantas, secreciones urinarias y del tracto respiratorio. � Enterobacter Sakazakii. Es una bacteria Gram negativa, curiosamente no es típica del tracto intestinal como todos los Enterobacter. No crece bien en temperaturas superiores a 40° C. � Burkholderia cepacia. Es una bacteria Gram negativa causante de neumonía. Es típica de aguas y suelos y puede sobrevivir por tiempo prolongado en ambientes húmedos. 5.1.10 Comentarios sobre la biocarga típica hallada”. Las características de los microorganismos hallados en la “Planta Farmacéutica Cali” indican que no hay presencia de organismos formadores de esporas, lo cual permite concluir que la resistencia de la biocarga típica para los productos de la “Planta Farmacéutica Cali” es muy baja. Si no se identifican esporas, se puede considerar un valor DT del orden de 0,001 minutos a 121° C. Entre Junio de 2007 y Junio de 2008 se realizaron aproximadamente 4000 muestreos, teniendo 267 fuera de límites, lo que significa un porcentaje del 6,67%.El límite de alerta para muestreos fue de 30 microorganismos por muestra, y el conteo máximo de microorganismos en una muestra en ensayos fuera de límites fue de 65, con un promedio de 49

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microorganismos por muestra, lo que significa una biocarga inicial aproximada de 0,5 x 102. Teniendo en cuenta que las condiciones de operación de una planta certificada en Buenas Prácticas de Manufactura son lo suficientemente adecuadas para mantener conteos típicos de biocarga bajos, es muy difícil que una unidad de producto no estéril tenga conteo mayor a 100 organismos antes de ser sometida al ciclo de esterilización. Es importante fortalecer las campañas para un lavado de manos adecuado y el control de la humedad en las áreas para mantener conteos de biocarga bajos y mejorar los indicadores de muestreo. 5.2 VARIABLES CRÍTICAS Y DISEÑO DE UN PROCESO DE ESTERILIZACION El diseño de un proceso de esterilización implica la interacción de la ciencia microbiológica y al ingeniería. Para diseñar un proceso de esterilización efectivo se deben conocer tanto las características de los microorganismos y su resistencia al tratamiento que se quiere aplicar, como las características del producto y el agente esterilizante y sus efectos posibles sobre el producto. Solo es posible eliminar de manera efectiva una carga bacteriana si se conocen a fondo sus características en relación con el entorno del proceso, lo cual requiere conocimientos de microbiología. De igual manera se requieren conocimientos de ingeniería para diseñar un proceso óptimo que garantice el cumplimiento de los requerimientos establecidos para la eliminación de una biocarga conocida. 5.2.1. Paradigmas sobre el proceso de esterilización. Para diseñar un proceso confiable de esterilización es necesario liberarse ciertos paradigmas mentales4 y aceptar los siguientes hechos: • Los sistemas en biología son muy diferentes a los sistemas físicos. En las ciencias físicas hay estándares, pero en la biología no hay organismos estándares, lo que implica que cada preparación de microorganismos debe ser evaluada para establecer sus características. • Los microorganismos son variables, pero pueden presentar reproducibilidad si un cultivo específico es evaluado de una manera reproducible. La contaminación en un producto es variable, habrá diferentes especies, cantidades y resistencias. Para determinar la cinética de letalidad de los microorganismos se debe tener una suspensión homogénea de los mismos. • Cada grupo de organismos unicelulares tienen una única cinética de letalidad. No hay condición o tratamiento que elimine toda contaminación microbiana. 4 Ibíd., p. 8.4.

64

• Se define estéril como una condición absoluta, pero teniendo en cuenta que la muerte microbiana es una función exponencial, la pertinencia de un proceso de esterilización se expresa mejor como un extremo o punto de control de tipo probabilístico. • Mientras el nivel de aseguramiento buscado puede ser 1x10-6, no es posible medir directamente niveles mayores a un microorganismo en 10 o 100 unidades (1x10-1 a x10-2), de modo que cuando se diseñe o se valida un proceso de esterilización se utilizan métodos indirectos para medir el nivel de aseguramiento equivalente a 1x10-6. • El objetivo de un proceso de control microbiano es eliminar microorganismos. Las mediciones de temperatura son útiles durante la calificación y el monitoreo de un proceso de control microbiano. Por lo tanto todo proceso de esterilización debe incluir una fase de diseño y calificación con indicadores biológicos. • En todo proceso, los indicadores biológicos siempre dicen la verdad, de modo que cualquiera que sea la indicación de temperatura o de otras variables, si los microorganismos en indicador sobreviven al tratamiento, es obvio que el proceso de esterilización ha fallado. • La variabilidad en los resultados de las pruebas con réplicas de una suspensión de microorganismos se debe a nuestra propia variabilidad, ya sea ocasionada por la manipulación o por las condiciones ambientales, no a una variación de los microorganismos. 5.2.2 Dos maneras de ver el punto de control microbiano. Como se mencionó en la sección 5.1.1, ciertos niveles de aseguramiento de esterilidad no pueden medirse directamente. La naturaleza logarítmica de la letalidad en los microorganismos no permite comprobar matemáticamente que un producto es estéril absolutamente, o que el número de sobrevivientes es cero, ya que el logaritmo de cero no existe. Las gráficas de sobrevivientes sugieren que el nivel de aseguramiento se relaciona con un punto de control en la curva.