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Universit di Pisa

Dipartimento di Ricerca Traslazionale e delle Nuove Tecnologie in

Medicina e Chirurgia

Scuola di Specializzazione in Patologia Clinica

Tesi di Diploma di Specializzazione

Analisi di metilazione gene specifica in

pazienti affetti da malattia di Alzheimer

Relatore:

Prof.ssa Lucia Migliore

Candidato:

Andrea Stoccoro

________________________________________________________________________

Anno accademico 2014/2015

II

Ad Alessandro

III

Indice

Riassunto ........................................................................................................................................ IV

1. Introduzione .............................................................................................................................. 1

1.2. Diagnosi ............................................................................................................................ 2

1.3. Caratteristiche neuropatologiche ....................................................................................... 5

1.3.1. Peptide beta-amiloide (A) .............................................................................................. 8

1.4. Genetica della MA ............................................................................................................. 9

1.4.1. Forme familiari della MA ................................................................................................ 9

1.4.2. Forme sporadiche della MA .......................................................................................... 10

1.5. Fattori ambientali coinvolti nella MA.............................................................................. 13

1.6. Compromissione dei meccanismi di riparazione al DNA nella MA ................................ 19

1.6.1. Meccanismi di riparazione al DNA ............................................................................... 19

1.6.2. Danno al DNA e meccanismi di riparazione nella MA .................................................. 20

1.7. Epigenetica e MA ............................................................................................................ 25

1.7.1. Studi su modelli cellulari e animali di MA .................................................................... 27

1.7.2. Studi su tessuti umani .................................................................................................... 28

2. Scopo della tesi ....................................................................................................................... 31

3. Materiali e Metodi ................................................................................................................... 32

3.1 Popolazione oggetto dello studio ..................................................................................... 32

3.2. Analisi di metilazione del DNA ...................................................................................... 32

3.3. Methylation-Sensitive High Resolution Melting ............................................................. 33

3.4. Pirosequenziamento ......................................................................................................... 35

3.5. Array di metilazione ........................................................................................................ 35

3.6. Genotipizzazione ............................................................................................................. 36

3.7. Analisi Biochimiche ........................................................................................................ 37

3.8. Mappa di connettivit semantica. .................................................................................... 37

3.9. Analisi statistiche ............................................................................................................ 38

4. Risultati ................................................................................................................................... 39

4.1. Risultati Studio 1 ............................................................................................................. 39

4.2. Risultati Studio 2 ............................................................................................................. 44

5. Discussione ............................................................................................................................. 45

6. Bibliografia ............................................................................................................................. 53

IV

Riassunto

La malattia di Alzheimer (MA) una malattia neurodegenerativa che rappresenta da sola

circa i due terzi di tutte le forme di demenza. La MA caratterizzata clinicamente da un

progressivo deterioramento delle funzioni cognitive e da atrofia cerebrale che si localizza

prevalentemente a livello della neocorteccia. A livello microscopico, il cervello di un

individuo affetto caratterizzato dalla presenza extracellulare di placche senili, costituite

da un eccessivo deposito del peptide -amiloide, che deriva dal taglio proteolitico della

proteina precursore dellamiloide (APP), ad opera degli enzimi -secretasi (BACE1) e -

secretasi. Inoltre si riscontra la presenza di grovigli neurofibrillari intracellulari, dovuti

alliperfosforilazione della proteina tau.

Circa l1-5% dei casi della malattia riconducibile a mutazioni causative a carico dei geni

PSEN1, PSEN2 (codificanti per componenti della -secretasi) e APP (codificante la

proteina APP), mentre nella maggior parte dei casi si manifesta in maniera sporadica,

verosimilmente in seguito allinterazione di fattori di suscettibilit genetici, il pi noto dei

quali lAPO4, e fattori di origine ambientale, come lo stile di vita, lalimentazione e

lesposizione ad inquinanti. In particolare sempre pi studi hanno mostrato come un deficit

di acido folico con compromissione del ciclo dei folati, fondamentale per la sintesi di

importanti composti cellulari e per la metilazione di DNA e altre macromolecole, sia

associato ad un aumentato rischio di sviluppare la MA. I fattori ambientali

promuoverebbero infiammazione e stress ossidativo in grado di indurre danno al DNA e

compromissione dei meccanismi per la sua riparazione. Sempre pi studi hanno inoltre

evidenziato che diversi fattori ambientali sono in grado di indurre alterazioni epigenetiche

in grado di contribuire allo sviluppo della MA; in particolare, alterazioni della metilazione

del DNA sono state osservate sia a livello di tessuto cerebrale post-mortem che in cellule

di sangue periferico di individui con MA.

Nel presente lavoro di tesi sono stati ricercati possibili marcatori epigenetici periferici in

soggetti affetti da MA. A tale scopo sono stati condotti due studi. In un primo studio

(studio 1) sono stati valutati i livelli di metilazione di geni coinvolti nel processamento del

peptide -amiloide (PSEN1 e BACE1), nella metilazione del DNA (DNMT1, DNMT3A e

DNMT3B) e nel metabolismo dei folati (MTHFR) mediante la tecnica Methylation-

Sensitive High Resolution Melting (MS-HRM) e i valori ottenuti sono stati correlati con

fattori di rischio per la MA, come let, il sesso, biomarcatori del ciclo dei folati, quali

lomocisteina, folati e vitamina B12 e presenza del genotipo APOE 4. Inoltre in un

sottogruppo di questi individui sono state analizzate le forze di connessione tra le variabili

V

analizzate mediante lapplicazione di reti neurali artificiali (ANN). Dato che ben noto che

nel cervello e nei tessuti periferici di individui con MA vi sia un aumentato danno al

DNA che una alterazione dei meccanismi della sua riparazione, in un secondo studio

(studio 2) sono stati valutati i livelli di metilazione di 25 geni che codificano per proteine

coinvolte nella riparazione del DNA, mediante la MS-HRM e mediante un array di

metilazione.

Tutti i geni analizzati nello studio 1 sono risultati essere ipometilati, con un livello di

metilazione inferiore al 5%, tranne il gene MTHFR che ha mostrato dei livelli di

metilazione compresi tra il 5 e il 75%. Nessuna differenza significativa nei livelli di

metilazione dei geni analizzati stata osservata tra i pazienti e i controlli. Inoltre,

lelaborazione dei risultati mediante lapplicazione delle ANN ha evidenziato interessanti

correlazioni tra i livelli di metilazione dei geni PSEN1, BACE1, MTHFR e delle DNMT e i

livelli plasmatici di omocisteina, folati e vitamina B12.

Nello studio 2 sia la MS-HRM che larray di metilazione hanno mostrato che tutti i geni

coinvolti nella riparazione del DNA analizzati sono altamente ipometilati sia nei pazienti

con MA che nei controlli, e non stata evidenziata nessuna differenza tra i due gruppi in

esame.

In conclusione, dal momento che non sono state osservate differenze tra i pazienti e i

controlli, lanalisi di metilazione dei geni investigati non sembrerebbe essere un utile

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