AN ABSTRACT OF THE DISSERTATION OF 

 

Chelsea  Wolk  for  the  degree  of  Doctor  of  Philosophy  in  Biochemistry  and 

Biophysics presented on December 12, 2016. 

 

Title:    Initial  in vitro and  in vivo Characterization of  the Membrane Trafficking 

Protein Fer1L6. 

 

 

 

Abstract approved: ______________________________________________________ 

          Colin P. Johnson 

 

 

Abstract 

A fundamental difference between prokaryotic and eukaryotic cells is the 

presence of membrane bound organelles in eukaryotes.  The dynamics of 

membrane trafficking within the cell are responsible for everything from 

intercellular communication and cell homeostasis, to mitosis, cell migration, and 

differentiation.  These processes require exocytosis and compensatory 

endocytosis, often working in concert to create vesicle cycling.  While 

constitutive exo‐ and endocytosis occurs independently of extracellular 

stimulus, , regulated membrane trafficking events are quiescent until triggered 

by a messenger, such as calcium.  Exocytosis is primarily carried out by SNARE 

proteins, while endocytosis is carried out by either clatherin‐related proteins or 

clatherin‐independent proteins, such as Eps 15 homology domain proteins 

(EHDs).  However, none of these proteins are directly calcium sensitive.  Thus, 

calcium regulated exocytosis requires an additional calcium‐regulated protein.  

In neuronal exocytosis the synaptotagmin family confers calcium sensitivity to 

the process, and members are typically composed of  a membrane anchor and 

two C2 domains.  Another family of proteins involved in calcium sensitive 

exocytosis is the ferlin family.  Composed of 5 to 7 C2 domains, these membrane 

proteins  have been implicated in various membrane trafficking diseases, ranging 

from muscular dystrophy to non‐syndromic deafness, and have been implicated 

in multiple cancer types. 

The goal of this dissertation is to characterize the sixth mammalian ferlin 

protein, Fer1L6, which has not been previously studied. Currently, Fer1L6 has no 

known disease state links.  Nevertheless, characterization of both tissue 

specificity and functional roles of the Fer1L6 protein will be highly valuable to 

furthering our understanding of the ferlin protein family, and strengthen our 

understanding of membrane dynamics inside eukaryotic cells.   

  To date little is known about the function or expression of Fer1L6, despite 

the fact that it is a predicted protein coding gene in a wide range of vertebrate 

genomes.  Reverse genetic techniques were used to elucidate a possible 

functional role of Fer1L6 in the model organism D. rerio (zebrafish).  A Fer1L6 

morpholino knockdown resulted in abnormal skeletal muscle development, in 

which the sarcoplasmic reticulum and t‐tubules do not form properly.  

Additionally, the myofibrils and myosepta are disorganized and irregularly 

shaped.  Heart  rate quantitation and microscopy of cardiac muscle shows 

underdevelopment of the heart chambers with decreased heart  rate.  However, 

initial studies with a first generation Fer1L6 mutant zebrafish line do not exhibit 

any of the same gross phenotypes that were observed with the morpholino 

knockdown.  Further investigation of the mutant line is required to fully 

characterize the effects of the mutation.   

  The muscle related phenotypes seen in the morpholino studies initiated an 

investigation into Fer1L6 in the C2C12 myoblast cell line.  Using both q‐PCR and 

western blots, no changes in Fer1L6 expression was detected during myoblast 

differentiation into myotubes.  Immunostaining of undifferentiated myoblasts 

showed Fer1L6 localization to the perinuclear region with Fer1L6 puncta also 

emanating outwards towards the plasma membrane.  Additionally, there were 

small levels of accumulation at the plasma membrane.  These results are 

consistent with previously proposed models in which Fer1L6 is involved in 

trans‐Golgi to plasma membrane endocytic recycling events with Rab 11.   

  The results of this dissertation begin the process of determining a 

functional role for Fer1L6, and demonstrate the feasibility for both zebrafish and 

C2C12 cells as a model for future studies on the endogenous protein.  The results 

validate high‐throughput proteomic studies, and lend support to recently 

literature with over expression in cell culture.  Overall, we find that Fer1L6 is a 

widely expressed protein that may be involved in both embryonic development 

and maintaining homeostasis of tissues through endosomal recycling pathways.  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

©Copyright by Chelsea Wolk  

December 12, 2016  

All Rights Reserved

Initial in vitro and in vivo Characterization of the Membrane Trafficking Protein 

Fer1L6 

 

 

by 

Chelsea Wolk 

 

 

 

 

 

 

 

 

A DISSERTATION 

 

 

submitted to 

 

 

Oregon State University 

 

 

 

 

 

 

 

in partial fulfillment of 

the requirements for the  

degree of 

 

Doctor of Philosophy 

 

 

Presented December 12, 2016 

Commencement June 2017 

Doctor of Philosophy dissertation of Chelsea Wolk presented on December 12, 

2016 

 

 

 

 

 

APPROVED: 

 

 

 

 

Major Professor, representing Biochemistry and Biophysics 

 

 

 

 

 

Head of the Department of Biochemistry and Biophysics  

 

 

 

 

 

Dean of the Graduate School 

 

 

 

 

 

I understand that my dissertation will become part of the permanent collection of 

Oregon State University libraries.  My signature below authorizes release of my 

dissertation to any reader upon request. 

 

 

 

Chelsea Wolk, Author 

ACKNOWLEDGEMENTS 

 

This document is a compilation of five years’ worth of thought, research, 

studying, experimentation, struggles, successes, and failures.  It is also the 

product of dedication and hard work from a multitude of people.  I would like to 

take this opportunity to thank everyone who played a role in the success of this 

project and my graduate career as a whole.  First I would like to thank my 

graduate mentor Dr. Colin Johnson, this work was only possible because of your 

willingness to take a chance on me and on a high risk thesis project.  Your 

guidance and encouragement was always steadfast.  To the other Johnson lab 

members, Sara Codding, Dr. Paroma Chatterjee, Dr. Josephine Bonventre, Dr. 

Murugesh Narayanappa, Nicole Hames, Dr. Naomi Marty, Trisha Chau, and 

Jacob Huegel know that much of this work is thanks to your hard work, ideas, 

and input.  Additionally, the zebrafish work was supported by Dr. Robert 

Tanguay, Carrie Barton, and Jane La Du and their involvement and supervision 

has been indispensable. I need to thank everyone who has served on my 

graduate committee for their input and guidance.  Thank you to Dr. Viviana 

Perez, Dr. Barbara Taylor, Dr. Julie Greenwood, Dr. Weihong Qiu, and Dr. David 

Hendrix.   

Also, this type of graduate work would not be possible without the 

support and love from my friends and family.  I would like to thank my parents 

for believing in me every day of my life, and always pushing me to reach for the 

stars and never settle.  I am grateful to my fellow graduate students at OSU, 

particularly Kelsey Kean and Steve Friedman, for all of their support, friendship, 

and coffee outings.  Finally, deepest gratitude goes to my biggest champion, best 

friend and rock my husband Ben Wolk.  Thank you so much for following me 

across the country and helping me make my dreams come true.   

CONTRIBUTION OF AUTHORS 

 

 

Chapter 1: Text was written by Chelsea Wolk with editing by Colin Johnson and 

Josephine Bonventre.    

 

Chapter 2:  Experimental design was developed by Chelsea Wolk and Colin 

Johnson. All data was collected and analyzed by Chelsea Wolk with minor 

exceptions.  Paroma Chatterjee conducted the ISH for 96hpf. Carrie Barton 

maintained wildtype 5D adult zebrafish.  Sara Codding helped with TEM 

imaging. Sean Burrows helped with two‐photon imaging.  Sa16199 fish line was 

raised and maintained by Chelsea Wolk with assistance from Josephine 

Bonventre. All text was written by Chelsea Wolk with editing by Colin Johnson.   

 

Chapter 3: Experimental design was developed by Chelsea Wolk and Colin 

Johnson.  Cell culture and western blotting was performed by Chelsea Wolk and 

Sara Codding.  Q‐PCR was performed and analyzed by Chelsea Wolk.  All text 

was written by Chelsea Wolk with editing by Colin Johnson.  

 

Chapter 4: Text was written by Chelsea Wolk with editing by Colin Johnson.  

   

TABLE OF CONTENTS 

 

                            Page 

Chapter 1 ‐ Literature Review and Introduction ......................................................... 1 

 

1.1 – Introduction .......................................................................................................... 1 

1.2 – The Ferlin Family ................................................................................................. 2 

1.2.1 – Dysferlin ......................................................................................................... 3 

1.2.2 – Otoferlin .......................................................................................................... 4 

1.2.3 ‐ Myoferlin ......................................................................................................... 4 

1.2.4 ‐ Fer1L4 .............................................................................................................. 7 

1.2.5 ‐ Fer1L5 .............................................................................................................. 7 

1.2.6 ‐ Fer1L6 .............................................................................................................. 8 

1.3 – A closer look at available Fer1L6 data .............................................................. 9 

1.4 – Significance ......................................................................................................... 10 

1.5 ‐ Figures .................................................................................................................. 12 

1.6 – References ........................................................................................................... 15 

 

Chapter 2 ‐ Characterization of Fer1L6 in a Zebrafish Model ................................. 20 

 

2.1 – Introduction ........................................................................................................ 20 

2.2 – Methods............................................................................................................... 21 

2.3 – Results ................................................................................................................. 24 

2.3.1 ‐ Expression of Fer1L6 in zebrafish .............................................................. 24 

2.3.2 – Morpholino knock down ............................................................................ 25 

2.3.3 – Fer1L6 mutant fish line ............................................................................... 28 

2.4 – Discrepancies between morpholino and fish line results ............................ 30 

2.5 – Discussion ........................................................................................................... 32 

2.6 – Figures and Tables ............................................................................................. 35 

2.6 – References ........................................................................................................... 48 

 

 

TABLE OF CONTENTS (Continued) 

 

                            Page 

Chapter 3 ‐ Subcellular Localization and Expression of Fer1L6 in the C2C12 cell  

line .................................................................................................................................... 51 

 

3.1 ‐ Introduction ........................................................................................................ 51 

3.2 ‐ Methods ............................................................................................................... 51 

3.3 – Results ................................................................................................................. 53 

3.3.1 ‐ Validation of antibody................................................................................. 53 

3.3.2 ‐ Fer1L6 is expressed in myoblasts and differentiated myotubes ........... 54 

3.3.3 ‐ Fer1L6 is expressed in HEK cells ............................................................... 56 

3.3.4 ‐ Fer1L6 expression in mouse tissue ............................................................ 56 

3.4 ‐ Discussion ............................................................................................................ 57 

3.5 – Figures ................................................................................................................. 59 

3.6 ‐ References ............................................................................................................ 68 

 

Chapter 4 ‐ General Conclusion and Future Directions ........................................... 69 

 

4.1 – Conclusions from study .................................................................................... 69 

4.2 – New Questions Raised and Future Directions .............................................. 70 

4.3 – References ........................................................................................................... 72 

 

Bibliography ................................................................................................................... 74 

 

   

LIST OF FIGURES 

 

 

Figure                                                                                                                           Page 

Figure 1.1 – Ferlin phylogenetic tree ........................................................................... 12 

Figure 1.2 – Ferlin protein structure schematic ......................................................... 13 

Figure 2.1 – Fer1L6 structure ........................................................................................ 35 

Figure 2.2 – Fer1L6 expression during zebrafish development .............................. 36 

Figure 2.3 – ISH of Fer1L6 in zebrafish ....................................................................... 37 

Figure 2.4 – Fer1L6 splice blocking morpholinos ...................................................... 38 

Figure 2.5 – Morpholino phenotype ............................................................................ 39 

Figure 2.6 – Fer1L6 knockdown quantitation ............................................................ 40 

Figure 2.7 – Survival and phenotype rates ................................................................. 41 

Figure 2.8 – Morpholino knockdown results in abnormal skeletal muscle. ......... 42 

Figure 2.9 – Cardiac related phenotype ...................................................................... 43 

Figure 2.10 – Genotype rates of Fer1L6 mutant ......................................................... 44 

Figure 3.1 – Western blot showing specificity of HPA054117 anti‐Fer1L6 

antibody. .......................................................................................................................... 58 

Figure 3.2 – WB showing expression of dysferlin and Fer1L6 in differentiated and 

non‐differentiated C2C12 cells. .................................................................................... 59 

Figure 3.3 – qPCR of myoferlin, dysferlin, and Fer1L6 in C2C12 cells during 

differentiation ................................................................................................................. 60 

Figure 3.4 – Fer1L6 localization in C2C12 cells.......................................................... 61 

Figure 3.5 – Western blot of HEK cell lysate .............................................................. 62 

Figure 3.6 – transcription in cardiac tissue ................................................................. 63 

Figure 3.7 – western blot of mouse tissue ................................................................... 64 

 

 

 

 

LIST OF TABLES 

 

Table                               Page 

 

1.1 – Ferlin function and expression ……………………………..………………..14 

2.1 – q‐PCR primers for zebrafish………………………………………………….45 

2.2 – Fer1L6 sequence of sa16199 mutation……………………………………….47 

3.1 – q‐PCR primers for C2C12 cells……………………………………………….65 

 

 

 

   

1 

 

Chapter 1 ‐ Literature Review and Introduction 

1.1 – Introduction  

Membrane trafficking is an essential factor in maintaining normal function 

and health of a eukaryotic cell.  Endocytosis is responsible for membrane protein 

regulation, cell migration, invagination of extracellular material, membrane 

maintenance, and vesicle reformation [1][2].  Similarly, exocytosis is responsible 

for organelle maintenance, plasma membrane growth during cell division, 

membrane protein organization, neurotransmitter release, extracellular protein 

secretion, and membrane repair [3][4].  Together, endocytosis and exocytosis 

events work together to create the vesicle cycle, whereby small fluid‐filled lipid 

bi‐layer enclosed structures continually fuse with the plasma membrane and 

then re‐enter the cell via membrane invagination.  These vesicle cycling events 

are engaged in functions including synaptic vesicle recycling and membrane 

protein regulation [5][6].  The fusion events are mediated by a family of proteins 

known as SNAREs (soluble NSF attachment protein receptors) which are 

grouped into three classes; syntaxins, SNAPs, and synaptobrevins (or VAMPs).  

One of each class is required to from a four helix bundle, which is responsible for 

driving membrane fusion[7].  While both constitutive and regulated secretion use 

SNARES, regulated secretion is sensitive to changes in intracellular 

Ca2+concentration, though SNAREs are not calcium sensors themselves.  

Therefore, an additional protein, or proteins, is needed to confer calcium 

sensitivity and regulate the fusion event by acting as a Ca2+ switch.  

Synaptotagmins are a well studied family of proteins known to act as Ca2+ 

sensitive regulators in specific SNARE mediated membrane fusion events[8].  C2 

2 

 

domains are the beta sandwich structural domains found in many calcium 

sensitive membrane binding proteins.  However, synaptotagmins are not unique 

in their ability to act as Ca2+ sensors in this fashion.  Other multi C2 domain 

containing proteins have the ability to perform such a role, including the ferlin 

protein family[9].  The following review focuses on the current understanding of 

phenotypes and functional roles of the six mammalian ferlin genes, and 

highlights areas of interest for future studies (Table 1.1).   

 

1.2 – The Ferlin Family 

The first ferlin discovered was Fer1 in C. elegans.  Fer1 is responsible for 

calcium sensitive vesicle fusion during spermatogenesis when organelles fuse 

with the plasma membrane of the sperm [10].  Gene duplication has resulted in 

four ferlin genes in boney fish (myoferlin, otoferlin, dysferlin, and Fer1L6) [11].  

While mammals have six ferlin family member genes (myoferlin, otoferlin, 

dysferlin, Fer1L4, Fer1L5, and Fer1L6), but in humans Fer1L4 is a pseudogene 

expressed only as a functional RNA (Figure 1.1).  The first three of the 

mammalian ferlins have been studied extensively, while Fer1L4, Fer1L5, and 

Fer1L6 are relatively un‐characterized.  Of the three ferlins that have been 

studied, all are believed to be Ca2+ sensors involved in vesicle fusion with the 

plasma membrane[9].   

The ferlins are a family of proteins which share a similar structure of five 

to seven C2 domains followed by a C terminal single pass transmembrane 

domain[12](Figure 1.2). The C2 domains of otoferlin and dysferlin are known to 

bind both Ca2+ and SNAREs, as well as bind lipid bilayers[13][14].  While the 

mechanism of action for ferlins is not yet fully understood, it is generally 

3 

 

accepted that ferlins assist SNARE bundle formation and membrane fusion by 

lowering the activation energy required for fusion [15][16].  Work on 

synaptotagmin suggests that localized membrane puckering at the point of C2 

domain binding is one method by which C2 domains can decrease this energy 

barrier [15].   

1.2.1 – Dysferlin 

  Dysferlin, (Fer1L1), was the first of the mammalian ferlin family members 

to be studied.  Dysferlin was first identified as the mutated gene in human 

patients with limb girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD2B) and Myoshi 

myopathy, two type of muscular dystrophy that result in a wide range of both 

proximal and distal lower limb muscle myopathies[17][18].  Immunofluorescent 

studies have determined that dysferlin resides at the skeletal muscle plasma 

membrane, although multiple studies have concluded that the protein is 

expressed in other tissue types as well [19].  Transcript analysis suggests 

ubiquitous expression, although these results have not been confirmed at the 

protein level[20].  To date, the bulk of dysferlin research has focused on its 

involvement in sarcolemma repair, where it is believe to be the calcium sensor 

for vesicle recruitment and subsequent fusion at skeletal muscle wound sites 

[21].  Loss of this function leads to skeletal muscle myopathy and the muscular 

dystrophy phenotype.  In addition to sarcolemma, dysferlin has also been found 

within the t‐tubules of skeletal muscle, where it is believed to function in 

conjunction with the calcium channel Dihydropyridine receptor (DHPR) to 

maintain structural integrity of the t‐tubules and prevent excessive calcium 

influx [22].   

  Very little research has focused on dysferlin’s role in non‐muscle tissue,  

although it is expressed in, at the minimum, stomach, lung, kidney, brain, liver, 

4 

 

and spleen[19].  In addition to muscular dystrophy, dysferlin‐null mice exhibit 

impaired angiogenesis, and dysferlinopothy patients also present with 

hyperactive monocyte activity, both of which have been linked to dysferlin’s role 

in cell adhesion through a dysferlin‐integrin complex [23][24]. Additional 

diseases associated with altered expression and localization of dysferlin are 

diamond‐blackfan anemia and severe preeclampsia[25][26].  This highlights the 

need for a better understanding of dysferlin’s mechanistic role outside of skeletal 

muscle.   

1.2.2 – Otoferlin 

    Gene Fer1L2, which encodes for the protein otoferlin, is found 

predominantly in the sensory hair cells of the inner ear [27].  Loss of function 

mutations in this gene lead to autosomal recessive non‐syndromic deafness, 

where severely impaired sound encoding is the only presenting phenotype [28].  

In addition, there are unique mutations which cause temperature sensitive loss of 

hearing, in which functional hearing is impaired at elevated body temperatures 

as small as 1°C over normal [29].  Hearing is completely restored after normal 

body temperature returns.   

  Mechanistically, otoferlin is thought to act as the calcium sensor for 

exocytotic neurotransmitter release [30].  The C2 domains of otoferlin have been 

shown to bind membranes in a calcium sensitive manner and this binding is 

enhanced in the presence of liposomes containing plasma membrane specific 

lipids including PI(4,5)P2 [31].  Although otoferlin is thought to regulate vesicle 

fusion, otoferlin’s relationship to SNARE proteins is unclear.     

1.2.3 ‐ Myoferlin 

Gene Fer1L3, encoding myoferlin, was first characterized at the protein 

level in 2000 in relation to dysferlinopathies, because of its expression in skeletal, 

5 

 

cardiac, and smooth muscle [32].  Myoferlin mRNA is also found in kidney, 

pancreas, lung, and at very high levels in placenta [32].  More recent transcript 

analysis shows ubiquitous expression of myoferlin[20].  However, western blot 

analysis indicates protein persistence primarily in muscle, heart, and to a lesser 

extent lung[32].  

Owing to its sequence similarity with dysferlin, myoferlin was originally 

studied primarily in skeletal muscle, although its proposed link to 

dysferlinopothy was later refuted[33].  It was instead implicated in myoblast cell 

fusion during muscle maturation and regeneration[34].  In the C2C12 skeletal 

muscle cell line, myoferlin is expressed in both undifferentiated myoblasts, and 

differentiated myotubes.  Immediately before myogenesis, myoferlin localizes to 

the plasma membrane, particularly near the point of fusion where a massing of 

vesicles occurs immediately before cell‐cell fusion[34].   Additionally, myoferlin 

null mice exhibit decreased total muscle mass, as well as decreased muscle fiber 

size [34].   

The mechanism of myoferlin’s involvement in myogenesis is thought to 

involve vesicle recycling and accumulation at the point of fusion. Large volumes 

of membrane are required for myoblast fusion, and clathrin‐dependent and 

clathrin‐independent endocytotic pathways have both been implicated in this 

large accumulation of membrane and ferlin proteins [35].  Clathrin‐dependent 

endoycytotic vesicles containing myoferlin are thought to be initiated by the 

endocytic recycling protein EH domain containing protein 2 (EHD2) [36]. EHD2 

is a known binding partner of myoferlin, and the loss of either myoferlin or 

EHD2 results in decreased myogenesis and vesicle recycling in the mouse 

myoblast cell line C2C12 [36].  The similarity in myoferlin‐depleted and EHD‐

depleted phenotypes suggests a direct relationship between these proteins and 

6 

 

an exo‐ endocytotic vesicle cycle mechanism. Another vesicle cycling related 

protein shown to colocalize with myoferlin in GRAF1 [37].  GRAF1 is involved in 

tubular recycling endosomes, an organelle which provides much of the 

membrane mass necessary for myogenesis [38].  

More recently, myoferlin has been linked to tumor growth and metastasis 

[39].  Similar to its role in myogenesis, myoferlin has been shown to play a 

similar function in endothelial cell endocytosis[40], which is crucial for receptor 

trafficking at the plasma membrane.  This vesicle recycling functionality 

illustrates a possible mode of action for myoferlin’s involvement in various types 

of cancer.  Myoferlin’s proposed involvement in receptor trafficking has been 

supported by studies done in breast cancer, where myoferlin is found to be 

overexpressed [41].  Through depletion of myoferlin in breast cancer cell lines, it 

was determined that myoferlin is involved in epidermal growth factor receptor 

(EGFR) degradation[41].  Upon activation of EGFR, downstream receptor 

tyrosine kinase (RTK) pathways promote proliferation and metastasis.  To 

control this process, activated EGFR is sequestered to the cytoplasm via clathrin 

dependent endocytosis.  The majority of these endosomes are then targeted for 

lysosomal degradation in an effort to prevent continual activation of the RTK 

pathways.  However, depletion of myoferlin in breast cancer cell lines results in 

limited EGFR degradation, despite the fact that endocytosis is functioning 

properly[41].  Interestingly, myoferlin depletion also leads to inhibition of 

metastasis and proliferation[42],[41]. Myoferlin involvement in plasma 

membrane related processes has been well established, but a better 

understanding of its precise mechanism of action and that relationship to disease 

state needs further investigation.    

 

7 

 

1.2.4 ‐ Fer1L4 

  The Fer1L4 gene is unique among the ferlins, because in humans it is only 

expressed as a long non‐coding RNA (lncRNA)[11].  The gene has been 

determined to have no functional reading frames, and therefore was predicted to 

only function as an RNA transcript, although this has not be verified 

experimentally.  Fer1L4 is expressed primarily in stomach tissue, although low 

levels are found in thymus, kidney, and colon. [20].  Originally found in gastric 

cancers, the Fer1L4 lncRNA is believed to regulate expression of the tensin 

related protein, Phosphotase and tensin homolog (PTEN), through a competing 

endogenous RNA pathway with miR‐106a‐5p[43].  In gastric cancers, the Fer1L4 

gene is underexpressed, leading to an associated underexpression of PTEN, 

while miR‐106a‐5p is overexpressed.  This can be reversed with the 

overexpression of Fer1L4 [44].  It is believed that this regulation accelerates the 

G0/G1 to S phase transition, thus leading to increased cell proliferation [43].  This 

mechanism can explain a similar response to Fer1L4 expression profiles in colon 

cancer.  In colon cancer cell lines, Fer1L4 overexpression decreased cell 

proliferation, migration, and invasion [44].  While this leads to excitement about 

the possibility of Fer1L4 as a tumor suppressor, these two studies are still very 

new and more research is needed.   

 

1.2.5 ‐ Fer1L5 

The Fer1L5 gene, is thought to be involved in endosome recycling through 

EHD1/2 pathways [45][46].  One of these studies in C2C12 cells suggests 

myoferlin, Fer1L5, EHD1/2 and GRAF1 are interconnected, and work together to 

regulate membrane and protein recycling events.  Myoferlin and Fer1L5 are the 

only two mammalian ferlins with an EHD binding NPF motif, suggesting an 

8 

 

even closer connection between myoferlin, Fer1L5, and endocytotic pathways 

[46],[36].  Additionally, loss of EHD1 causes accumulation of Fer1L5 and 

caveolin‐3 to the perinuclear region [45].  One hypothesis for the demonstrated 

protein‐protein interactions between these two groups of proteins is that it 

provides a mechanism of ensuring that the proteins are continually trafficked 

together.  This means that ferlins, while previously implicated in endocytosis, 

may not be directly involved, but rather localized to the membrane so that later 

fusion is possible.  The decreased endocytotic activity, therefore, would be due to 

a loss of exocytosis, which provides the lipid content necessary for successive 

endocytosis.  This is supported by the observation that endocytosis is reduced, 

and not eliminated completely.  While this study is of great value, giving us a 

first look at possible functions of Fer1L5, it is analyzed only through the lens of 

its possible relationship to myoferlin, and further studies differentiating the two 

proteins is warranted.   

 

1.2.6 ‐ Fer1L6 

To date, Fer1L6 is the least characterized member of the ferlin family.  

This gene, whose translated protein will also be called Fer1L6, lacks an N‐

terminal C2A domain.  Excluding sequence analysis and high throughput 

studies, there are only a handful of references ever made to Fer1L6 in the 

literature.  The first, in 2008 Doherty et al. mentioned unpublished data 

suggesting Fer1L6 is expressed in C2C12 myoblasts[36].  In 2010. Ledig et al. 

showed that a single patient, in a study group of 44 women with premature 

ovarian failure, had a deletion in Fer1L6 [47]. This observation may hint to a 

function related to that of Ferlin‐1 in C. elegans, were it plays an essential role in 

spermatogenesis [10].  Finally, the most recent and most thorough investigation 

9 

 

of Fer1L6 was a in HEK cell culture model, where Fer1L6 overexpression 

demonstrated it localized primarily to the Golgi, but was also found at low levels 

on the plasma membrane[20].  Redpath et al. proposed a functional role of 

Fer1L6 in trans‐golgi to plasma membrane recycling, based on its colocalization 

with Rab11[20].   

1.3 – A closer look at available Fer1L6 data 

Further information about Fer1L6 can be ascertained from an analysis of 

its homology to the other ferlin family members and its predicted structural 

domains.  Its closest paralog is otoferlin, sharing a 48% sequence identity in 

humans (Figure 1.1).  Structurally, the most prevalent fold in ferlins is the C2 

domain, which consists of a 7 to 8 stranded beta sandwich.  Loops 1 and 3 are of 

most importance, because they contain the aspartic residues which coordinate 

Ca2+ [48].  In other non‐ferlin C2 domains, these loops are also the ones that insert 

into the lipid bilayer, to confer membrane binding capabilities [49].   Fer1L6 is 

predicted to contain five C2 domains, which have been labeled C2B, C2C, C2D, 

C2E, and C2F due to their similarity to those domains across other ferlins (Figure 

1.2) [50].  The first domain, C2A, is missing from the structure prediction, 

because the N‐terminal sequence before the predicted C2B is only 82 amino acids 

long, much shorter than the classical 130 amino acid length.   

According to the University of Zurich’s “protein abundance across 

organisms database” (PaxDb), Fer1L6 was found in high levels in blood platelets 

[51].  The Human Protein Atlas Project developed a Fer1L6 antibody that 

recognizes the linker region between the C2E and C2F domains [52].  Using this 

antibody they have identified Fer1L6 in bronchus, stomach, and small intestine 

at “high” levels, and a large variety of tissues including lymph node, cardiac 

muscle, skeletal muscle, colon, testis, seminal vesicle, placenta, cerebral cortex, 

10 

 

and thyroid gland at “medium” levels [52].  This wide range of tissue types 

suggests that Fer1L6 may be ubiquitous expressed.   

 

1.4 – Significance  

In the last several years, some of the largest projects in the life science are 

aimed at using high throughput techniques and large data sets to map all 

possible situations or conditions or molecules in a living organism.  For example, 

the Human Protein Atlas has looked at RNA‐seq and microarray 

immunohistochemistry for every protein in the human genome and the SNP 

Control Database has genotype frequency data for over 1 million SNPs in the 

human genome [52][53].  The human genome project was the first of these high 

energy large data set projects to be completed.  Yet a map of the whole genome 

left us, like most major breakthroughs in science, with more questions than 

answers.  We now know that there are roughly 20,000 protein coding genes in 

the human genome.  Additionally, the human protein atlas project can now 

classify 92% of those proteins based on sequence similarity and protein families 

[52].  However, being able to classify Fer1L6 as a regulator of membrane fusion 

based on homology, is not enough.  It is impossible to gain a full understanding 

of the complexity, physiology, and mechanism of human development and 

homeostasis, without gaining a more complete understanding of the role each 

member of the proteome.   

High throughput methods and automated data analysis have allowed for 

major advances in the breadth of knowledge about the human proteome.  

However, our understanding is quite shallow, and these automated methods can 

lead to errors, as evident in the wide range of RNA seq results for Fer1L6 in 

human tissue, based on the Expression Atlas, a meta‐analysis of 6 different high 

11 

 

throughput RNA‐seq studies[54].  Therefore, research focused on manually 

independently verifying these results is important.  The production of research 

tools such as antibodies and mutant zebrafish lines created by high throughput 

methodologies has made this work easier.   

In this dissertation, Fer1L6 was characterized using a multi‐faceted 

approach.  We investigated Fer1L6 function in vertebrate development and 

homeostasis at the organismal, cellular, sub‐cellular, and molecular levels.  Using 

a variety of methodologies and model systems, we aimed to develop and 

validate the most complete characterization of Fer1L6 expression, localization, 

physiological role and molecular function to date.   

 

 

   

12 

 

1.5 ‐ Figures 

 

Figure 1.1 – Ferlin phylogenetic tree 

Phylogenetic tree of human ferlin proteins relative to ancestral C. elegan Fer1 

gene.  Ensemble transcript IDs used for analysis are indicated under gene name.   

The full length pseudogene sequence for Fer1L4 was used, because multiple 

shorter transcribed RNAs exist, but utilize a full range of exons from the original 

pseudogene.  Revised transcript identification may explain divergence of this 

phylogenetic tree from the previously published tree by Lek et al. which showed 

closer homology between Fer1L6 and Fer1L4 than Fer1L6 and otoferlin[50].   

   

13 

 

 

Figure 1.2 – Ferlin protein structure schematic  

Schematic of mammalian and ancestral Fer1 proteins produced from ferlin genes 

based on structure prediction.  Green ovals represent lipid and calcium binding 

C2 domains labeled C2A through C2G from N‐terminal to C‐terminal.  The 

unique to ferlins DYSF domain is represented by a blue pentagon.  The single 

pass C‐terminal transmembrane domain is represented at an orange rectangle.  

Fer1 and Fer1L6 do not have C2A domains, and the type 1 mammalian ferlins 

dysferlin, myoferlin, and Fer1L5 have a predicted seventh C2 domain C2F.   

Fer1L4 is not included, as it is not predicted to produce a functional protein.  

14 

 

Gene   Function   Diseases   Known Expression 

Dysferlin  Calcium sensitive 

plasma membrane 

vesicle fusion [21] 

LGMD2B, Miyoshi 

myopathy[17][18] 

Skeletal muscle, 

cardiac muscle, 

Ubiquitous? 

[19][20] 

Myoferlin  Cell‐cell fusion in 

myoblast fusion [34] 

Cancer [55]  Ubiquitous? [20] 

Otoferlin  Synaptic vesicle 

cycling [30] 

Autosomal recessive 

Non‐syndromic 

deafness, [28] 

Sensory hair cells 

and brain.  [27] 

Fer1L4  Creates lncRNA 

which suppresses 

cancer cell growth 

[44] 

Colon cancer [44]  Stomach, colon, 

lymph node [20] 

Fer1L5  Cell‐cell fusion 

(myotube 

formation) via 

EHD1 and EHD2 

interactions [36][46]  

unknown  Skeletal muscle, 

pancreas [20] 

Fer1L6  unknown  unknown  Heart, kidney, 

lung, stomach, 

colon, myoblasts 

[20] 

Fer1  

(C.elegans) 

Fusion of 

membranous 

organelles with the 

spermatid plasma 

membrane. [10] 

Infertility  Sperm, muscle of 

adult worms. [10] 

Table 1.1 – Ferlin function and expression 

Mammalian ferlin gene family members and ancestral Fer1 from C. elegans with 

known functions, disease phenotypes, and tissue type with known expression at 

either the transcript or protein level.  Known expression tissues only includes 

small scale q‐pcr or western blot results, and excludes large scale RNA‐seq and 

mass spectrometry high throughput studies.      

15 

 

1.6 – References  

 

[1]  T. Yamashita, Ca2+‐dependent regulation of synaptic vesicle endocytosis, 

Neurosci. Res. 73 (2012) 1–7. doi:10.1016/j.neures.2012.02.012. 

[2]  F. Buss, S.D. Arden, M. Lindsay, J.P. Luzio, J. Kendrick‐Jones, Myosin VI 

isoform localized to clathrin‐coated vesicles with a role in clathrin‐

mediated endocytosis, EMBO J. 20 (2001) 3676–3684. 

doi:10.1093/emboj/20.14.3676. 

[3]  Y.A. Chen, R.H. Scheller, SNARE‐mediated membrane fusion., Nat. Rev. 

Mol. Cell Biol. 2 (2001) 98–106. doi:10.1038/35052017. 

[4]  Z.P. Pang, T.C. S??dhof, Cell biology of Ca2+‐triggered exocytosis, Curr. 

Opin. Cell Biol. 22 (2010) 496–505. doi:10.1016/j.ceb.2010.05.001. 

[5]  T.C. Südhof, THE SYNAPTIC VESICLE CYCLE, Annu. Rev. Neurosci. 27 

(2004) 509–547. doi:10.1146/annurev.neuro.26.041002.131412. 

[6]  D. Leto, A.R. Saltiel, Regulation of glucose transport by insulin: traffic 

control of GLUT4., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (2012) 383–96. 

doi:10.1038/nrm3351. 

[7]  T. Sollner, M.K. Bennett, S.W. Whiteheart, R.H. Scheller, J.E. Rothman, A 

Protein Assembly‐Disassembly Pathway In Vitro That May Correspond to 

Sequential Steps of Synaptic Vesicle Docking , Activation , and Fusion, 

Cell. 75 (1993) 409–418. 

[8]  E. Hui, J.D. Gaffaney, Z. Wang, C.P. Johnson, C.S. Evans, E.R. Chapman, 

Mechanism and function of synaptotagmin‐mediated membrane 

apposition., Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (2011) 813–821. 

doi:10.1038/nsmb.2075. 

[9]  A. Lek, F.J. Evesson, R.B. Sutton, K.N. North, S.T. Cooper, Ferlins: 

Regulators of Vesicle Fusion for Auditory Neurotransmission, Receptor 

Trafficking and Membrane Repair, Traffic. 13 (2012) 185–194. 

doi:10.1111/j.1600‐0854.2011.01267.x. 

[10]  N.L. Washington, S. Ward, FER‐1 regulates Ca2+ ‐mediated membrane 

fusion during C. elegans spermatogenesis., J. Cell Sci. 119 (2006) 2552–62. 

doi:10.1242/jcs.02980. 

[11]  P. Flicek, I. Ahmed, M.R. Amode, D. Barrell, K. Beal, S. Brent, et al., 

Ensembl 2013, Nucleic Acids Res. 41 (2013). doi:10.1093/nar/gks1236. 

[12]  J.L. Jimenez, R. Bashir, In silico functional and structural characterisation of 

ferlin proteins by mapping disease‐causing mutations and evolutionary 

information onto three‐dimensional models of their C2 domains, J. Neurol. 

Sci. 260 (2007) 114–123. doi:10.1016/j.jns.2007.04.016. 

16 

 

[13]  C.P. Johnson, E.R. Chapman, Otoferlin is a calcium sensor that directly 

regulates SNARE‐mediated membrane fusion, J. Cell Biol. 191 (2010) 187–

197. doi:10.1083/jcb.201002089. 

[14]  N. Abdullah, M. Padmanarayana, N.J. Marty, C.P. Johnson, Quantitation of 

the calcium and membrane binding properties of the C2 domains of 

dysferlin, Biophys. J. 106 (2014) 382–389. doi:10.1016/j.bpj.2013.11.4492. 

[15]  E. Hui, C.P. Johnson, J. Yao, F.M. Dunning, E.R. Chapman, Synaptotagmin‐

Mediated Bending of the Target Membrane Is a Critical Step in Ca2+‐

Regulated Fusion, Cell. 138 (2009) 709–721. doi:10.1016/j.cell.2009.05.049. 

[16]  S.J. Codding, N. Marty, N. Abdullah, C.P. Johnson, Dysferlin Binds 

SNAREs and Stimulates Membrane Fusion in a Calcium Sensitive Manner, 

J. Biol. Chem. (2016) jbc.M116.727016. doi:10.1074/jbc.M116.727016. 

[17]  R. Bashir, S. Britton, T. Strachan, S. Keers, E. Vafiadaki, M. Lako, et al., A 

gene related to Caenorhabditis elegans spermatogenesis factor fer‐1 is 

mutated in limb‐girdle muscular dystrophy type 2B., Nat. Genet. 20 (1998) 

37–42. doi:10.1038/1689. 

[18]  J. Liu, M. Aoki, I. Illa, C. Wu, M. Fardeau, C. Angelini, et al., Dysferlin, a 

novel skeletal muscle gene, is mutated in Miyoshi myopathy and limb 

girdle muscular dystrophy., Nat. Genet. 20 (1998) 31–36. doi:10.1038/1682. 

[19]  L. V Anderson, K. Davison, J.A. Moss, C. Young, M.J. Cullen, J. Walsh, et 

al., Dysferlin is a plasma membrane protein and is expressed early in 

human development, Hum. Mol. Genet. 8 (1999) 855–861. 

doi:10.1093/hmg/8.5.855. 

[20]  G.M.I. Redpath, R.A. Sophocleous, L. Turnbull, C.B. Whitchurch, S.T. 

Cooper, Ferlins Show Tissue‐Specific Expression and Segregate as Plasma 

Membrane/Late Endosomal or Trans‐Golgi/Recycling Ferlins, Traffic. 17 

(2016) 245–266. doi:10.1111/tra.12370. 

[21]  P.L.M.& K.P.C. Dimple Bansal, Katsuya Miyake, Steven S. Vogel, Se´verine 

Groh, Chien‐Chang Chen, Roger Williamson, Defective membrane repair 

in dysferlin‐deficient muscular dystrophy, Nature. 423 (2003) 1–5. 

doi:10.1038/nature01604.1. 

[22]  J.P. Kerr, C.W. Ward, R.J. Bloch, Dysferlin at transverse tubules regulates 

Ca2+ homeostasis in skeletal muscle, Front. Physiol. 5 MAR (2014) 1–5. 

doi:10.3389/fphys.2014.00089. 

[23]  A. de Morree, B. Flix, I. Bagaric, J. Wang, M. van den Boogaard, L. Grand 

Moursel, et al., Dysferlin regulates cell adhesion in human monocytes, J. 

Biol. Chem. 288 (2013) 14147–14157. doi:10.1074/jbc.M112.448589. 

[24]  A. Sharma, C. Yu, C. Leung, A. Trane, M. Lau, S. Utokaparch, et al., A new 

role for the muscle repair protein dysferlin in endothelial cell adhesion and 

17 

 

angiogenesis, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30 (2010) 2196–2204. 

doi:10.1161/ATVBAHA.110.208108. 

[25]  E.N. Pesciotta, S. Sriswasdi, H.Y. Tang, D.W. Speicher, P.J. Mason, M. 

Bessler, Dysferlin and other non‐red cell proteins accumulate in the red cell 

membrane of Diamond‐Blackfan anemia patients, PLoS One. 9 (2014) 

e85504. doi:10.1371/journal.pone.0085504. 

[26]  C.T. Lang, K.B. Markham, N.J. Behrendt, A.A. Suarez, P. Samuels, D.D. 

Vandre, et al., Placental dysferlin expression is reduced in severe 

preeclampsia., Placenta. 30 (2009) 711–718. 

doi:10.1016/j.placenta.2009.05.008. 

[27]  R. Varga, M.R. Avenarius, P.M. Kelley, B.J. Keats, C.I. Berlin, L.J. Hood, et 

al., OTOF mutations revealed by genetic analysis of hearing loss families 

including a potential temperature sensitive auditory neuropathy allele., J. 

Med. Genet. 43 (2006) 576–581. doi:10.1136/jmg.2005.038612. 

[28]  R. Varga, P.M. Kelley, B.J. Keats,  a Starr, S.M. Leal, E. Cohn, et al., Non‐

syndromic recessive auditory neuropathy is the result of mutations in the 

otoferlin (OTOF) gene., J. Med. Genet. 40 (2003) 45–50. 

doi:10.1136/jmg.40.1.45. 

[29]  S. Marlin, D. Feldmann, Y. Nguyen, I. Rouillon, N. Loundon, L. Jonard, et 

al., Temperature‐sensitive auditory neuropathy associated with an 

otoferlin mutation: Deafening fever!, Biochem. Biophys. Res. Commun. 394 

(2010) 737–742. doi:10.1016/j.bbrc.2010.03.062. 

[30]  I. Roux, S. Safieddine, R. Nouvian, M. Grati, M.C. Simmler, A. Bahloul, et 

al., Otoferlin, Defective in a Human Deafness Form, Is Essential for 

Exocytosis at the Auditory Ribbon Synapse, Cell. 127 (2006) 277–289. 

doi:10.1016/j.cell.2006.08.040. 

[31]  M. Padmanarayana, N. Hams, L.C. Speight, E.J. Petersson, R.A. Mehl, C.P. 

Johnson, Characterization of the lipid binding properties of otoferlin 

reveals specific interactions between PI(4,5)P2 and the C2C and C2F 

Domains, Biochemistry. 53 (2014) 5023–5033. doi:10.1021/bi5004469. 

[32]  D.B. Davis, A.J. Delmonte, C.T. Ly, E.M. McNally, Myoferlin, a candidate 

gene and potential modifier of muscular dystrophy., Hum. Mol. Genet. 9 

(2000) 217–226. doi:ddd030 [pii]. 

[33]  M. Inoue, Y. Wakayama, H. Kojima, S. Shibuya, T. Jimi, H. Oniki, et al., 

Expression of myoferlin in skeletal muscles of patients with 

dysferlinopathy, Tohoku J. Exp. Med. 209 (2006) 109–116. 

doi:JST.JSTAGE/tjem/209.109 [pii]. 

[34]  K.R. Doherty, A. Cave, D.B. Davis, A.J. Delmonte, A. Posey, J.U. Earley, et 

al., Normal myoblast fusion requires myoferlin., Development. 132 (2005) 

18 

 

5565–75. doi:10.1242/dev.02155. 

[35]  K. Rochlin, S. Yu, S. Roy, M.K. Baylies, Myoblast fusion: When it takes 

more to make one, Dev. Biol. 341 (2010) 66–83. 

doi:10.1016/j.ydbio.2009.10.024. 

[36]  K.R. Doherty, A.R. Demonbreun, G.Q. Wallace, A. Cave, A.D. Posey, K. 

Heretis, et al., The endocytic recycling protein EHD2 interacts with 

myoferlin to regulate myoblast fusion, J. Biol. Chem. 283 (2008) 20252–

20260. doi:10.1074/jbc.M802306200. 

[37]  K.C. Lenhart, A.L. Becherer, J. Li, X. Xiao, E.M. McNally, C.P. Mack, et al., 

GRAF1 promotes ferlin‐dependent myoblast fusion, Dev. Biol. 393 (2014) 

298–311. doi:10.1016/j.ydbio.2014.06.025. 

[38]  B. Cai, S. Xie, S. Caplan, N. Naslavsky, GRAF1 forms a complex with 

MICAL‐L1 and EHD1 to cooperate in tubular recycling endosome 

vesiculation., Front. Cell Dev. Biol. 2 (2014) 22. doi:10.3389/fcell.2014.00022. 

[39]  D. Song, G. Ko, J. Lee, J. Lee, G. Lee, H. Kim, et al., Myoferlin expression in 

non‐small cell lung cancer: Prognostic role and correlation with VEGFR‐2 

expression, Oncol. Lett. (2015) 998–1006. doi:10.3892/ol.2015.3988. 

[40]  P.N. Bernatchez, A. Sharma, P. Kodaman, W.C. Sessa, Myoferlin is critical 

for endocytosis in endothelial cells., Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297 (2009) 

C484–C492. doi:10.1152/ajpcell.00498.2008. 

[41]  A. Turtoi, A. Blomme, A. Bellahce??e, C. Gilles, V. Hennequier??e, P. 

Peixoto, et al., Myoferlin is a key regulator of EGFR activity in breast 

cancer, Cancer Res. 73 (2013) 5438–5448. doi:10.1158/0008‐5472.CAN‐13‐

1142. 

[42]  C. Leung, C. Yu, M.I. Lin, C. Tognon, P. Bernatchez, Expression of 

myoferlin in human and murine carcinoma tumors: Role in membrane 

repair, cell proliferation, and tumorigenesis, Am. J. Pathol. 182 (2013) 1900–

1909. doi:10.1016/j.ajpath.2013.01.041. 

[43]  T. Xia, S. Chen, Z. Jiang, Y. Shao, X. Jiang, P. Li, et al., Long noncoding 

RNA FER1L4 suppresses cancer cell growth by acting as a competing 

endogenous RNA and regulating PTEN expression., Sci. Rep. 5 (2015) 

13445. doi:10.1038/srep13445. 

[44]  B. Yue, B. Sun, C. Liu, S. Zhao, D. Zhang, F. Yu, et al., Long non‐coding 

RNA Fer‐1‐like protein 4 suppresses oncogenesis and exhibits prognostic 

value by associating with miR‐106a‐5p in colon cancer, Cancer Sci. 106 

(2015) 1323–1332. doi:10.1111/cas.12759. 

[45]  A.D. Posey, K.E. Swanson, M.G. Alvarez, S. Krishnan, J.U. Earley, H. Band, 

et al., EHD1 mediates vesicle trafficking required for normal muscle 

growth and transverse tubule development, Dev. Biol. 387 (2014) 179–190. 

19 

 

doi:10.1016/j.ydbio.2014.01.004. 

[46]  A.D. Posey, P. Pytel, K. Gardikiotes, A.R. Demonbreun, M. Rainey, M. 

George, et al., Endocytic recycling proteins EHD1 and EHD2 interact with 

Fer‐1‐like‐5 (Fer1L5) and mediate myoblast fusion, J. Biol. Chem. 286 (2011) 

7379–7388. doi:10.1074/jbc.M110.157222. 

[47]  S. Ledig, A. Röpke, P. Wieacker, Copy number variants in premature 

ovarian failure and ovarian dysgenesis, Sex. Dev. 4 (2010) 225–232. 

doi:10.1159/000314958. 

[48]  S. Helfmann, P. Neumann, K. Tittmann, T. Moser, R. Ficner, E. Reisinger, 

The crystal structure of the C                    2A domain of otoferlin reveals an 

unconventional top loop region, J. Mol. Biol. 406 (2011) 479–490. 

doi:10.1016/j.jmb.2010.12.031. 

[49]  N.J. Marty, C.L. Holman, N. Abdullah, C.P. Johnson, The C2 domains of 

otoferlin, dysferlin, and myoferlin alter the packing of lipid bilayers, 

Biochemistry. 52 (2013) 5585–5592. doi:10.1021/bi400432f. 

[50]  A. Lek, M. Lek, K.N. North, S.T. Cooper, Phylogenetic analysis of ferlin 

genes reveals ancient eukaryotic origins, BMC Evol. Biol. 10 (2010) 231. 

doi:10.1186/1471‐2148‐10‐231. 

[51]  M. Wang, M. Weiss, M. Simonovic, G. Haertinger, S.P. Schrimpf, M.O. 

Hengartner, et al., PaxDb, a Database of Protein Abundance Averages 

Across All Three Domains of Life, Mol. Cell. Proteomics. 11 (2012) 492–500. 

doi:10.1074/mcp.O111.014704. 

[52]  M. Uhlén, L. Fagerberg, B.M. Hallström, C. Lindskog, P. Oksvold, A. 

Mardinoglu, et al., Tissue‐based map of the human proteome, Science (80‐. 

). 347 (2015) 1260419–1260419. doi:10.1126/science.1260419. 

[53]  M.C. Wu, P. Kraft, M.P. Epstein, D.M. Taylor, S.J. Chanock, D.J. Hunter, et 

al., Powerful SNP‐Set Analysis for Case‐Control Genome‐wide Association 

Studies, Am. J. Hum. Genet. 86 (2010) 929–942. 

doi:10.1016/j.ajhg.2010.05.002. 

[54]  R. Petryszak, M. Keays, Y.A. Tang, N.A. Fonseca, E. Barrera, T. Burdett, et 

al., Expression Atlas update‐an integrated database of gene and protein 

expression in humans, animals and plants. TL  ‐ 44, Nucleic Acids Res. 44 

VN‐r (2016) 52. doi:10.1093/nar/gkv1045. 

[55]  L.I. Volakis, R. Li, W.E. Ackerman IV, C. Mihai, M. Bechel, T.L. 

Summerfield, et al., Loss of myoferlin redirects breast cancer cell motility 

towards collective migration, PLoS One. 9 (2014). 

doi:10.1371/journal.pone.0086110. 

 

20 

 

Chapter 2 ‐ Characterization of Fer1L6 in a Zebrafish 

Model 

Contributing Authors: Chelsea Holman, Josephine Bonventre, Sara Codding, 

Paroma Chatterjee, Robert Tanguay, Colin Johnson 

2.1 – Introduction  

Fer1L6 is a predicted protein coding gene found in a wide range of 

vertebrate genomes, with unknown physiological function.  This gene belongs to 

the ferlin gene family, which code for ~200KDa membrane bound proteins 

believed to be involved in calcium sensitive membrane trafficking events[1].  Of 

the six mammalian ferlin genes, four have been extensively studied, and are 

linked to a variety of human diseases, including muscular dystrophy for 

dysferlin, non‐syndromic deafness for otoferlin, cancer metastasis for myoferlin, 

and cancer cell growth and proliferation for Fer1L4[2–5].  The link between 

ferlins and human disease motivates studies to improve our understanding of 

ferlin protein function, and the characterization of unstudied ferlins, including 

Fer1L6 gene.   

One of the most effective ways of determining the physiological function 

of an uncharacterized gene is through reverse genetics.  That is, looking for 

phenotypic consequences upon removal or downregulation of the gene.  

Techniques, including production of mutant or null in vivo models, siRNA, or 

morpholinos, are typically utilized to reduce the expression of a targeted 

gene[6][7].  Danio rerio, the zebrafish, has become an ideal vertebrate model for 

reverse genetics.  The genetic diversity, ovuliparity breeding, transparent 

anatomy during early developmental stages, relatively short maturation time, 

21 

 

and maintenance cost all make zebrafish the ideal model for an exploratory 

reverse genetic analysis of Fer1L6.  

Four ferlin paralogues have been identified in the zebrafish genome.   

They are dysferlin, otoferlin, myoferlin, and the uncharacterized Fer1L6 gene[8].  

No homolog to the mammalian Fer1L4 and Fer1L5 genes can be found.  

However, there are two minimally divergent copies of both the otoferlin and 

myoferlin genes, due to a whole genome duplication event which occurred in a 

common ancestor of zebrafish and pufferfish[9].   Only one predicted Fer1L6 

gene exists in zebrafish, which simplifies the use of zebrafish as a model for this 

study.  Bioinformatics analysis shows significant amino acid sequence similarity 

between Fer1L6 in zebrafish, humans, and mice (Figure 2.1).  While the full 

length protein shares only 59% identity between humans and zebrafish, the 

functional C2 domains are significantly more similar, with between 68 and 87% 

identity.  This suggests that Fer1L6 functions in a similar manner in both 

zebrafish and mammals, further supporting the choice of a zebrafish model.  

Therefore, this study uses two reverse genetic techniques, morpholino 

microinjection and a mutant Fer1L6 zebrafish line to gain identify the 

physiological role of Fer1L6 in the zebrafish model with the aim of elucidating 

function across vertebrates.   

 

2.2 – Methods  

Husbandry  

All gene expression and morpholino work was performed with wild type 

tropical 5D zebrafish (D. rerio).  The Fer1L6 fish line was crossed and compared 

against a wild type AB strain.  All protocols and husbandry were performed at 

the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory, at Oregon State University in 

22 

 

accordance with Institutional Animal Care and Use Committee protocols.  

General fish strain maintenance and breeding were performed as previously 

described [10].  Adult fish were maintained in a 14:10 light:dark schedule on a 

recirculating water system at 28°C.   

 

q‐PCR 

RNAzol (Molecular Research Center, OH) was used to extract total RNA 

from tissue or whole zebrafish embryos according to manufactures’ protocol.  

cDNA was synthesized using iScript DNA synthesis kit (Bio‐Rad, CA) or high‐

capacity cDNA reverse transcriptase kit (ThermoFisher, MA) according to 

manufactures’ protocol.  All q‐PCR was performed using Power Sybr‐green PCR 

master mix (Applied Biosystems, CA) on a 7500 fast Real‐Time PCR System 

(Applied Biosystems, CA).  At least one set of primers (Sigma‐Aldrich, MO) were 

designed for each gene of interest (Table 1).  

 

whole‐mount ISH 

In situ hybridization (ISH) was performed on 5D wt zebrafish embryos 

using a DIG (digoxigenin) labeled RNA probe which hybridized to a unique 

region of the Fer1L6 zebrafish mRNA (NW_001879462.3) as previously described 

[11][12].  The probe was detected with anti‐DIG alkaline phosphatase conjugated 

antibody and developed using either fast red or BCIP stain as previously 

described [11].   

 

Microinjections 

All microinjections were performed as previously described at the 

Sinnhuber Aquatic Research Laboratory, at Oregon State University [12]. All 

23 

 

microinjections were performed at a single cell stage using glass pulled needles.  

Injected solutions were mixed with 3% phenol red dye in order to visualize 

injected volume.  Approximately 3pL of solution was injected.  Fer1L6 splice 

blocking morpholinos, p53 control morpholino, and standard control 

morpholino (GeneTools, OR) were resuspended in RNAse‐free ultrapure water.   

 

Electron microscopy  

Zebrafish were fixed in 2.5% glutaraldehyde.  Osmium staining was 

performed as previously described using 1% osmium tetroxide and 0.8% 

potassium ferricyanide (cite).   Resin imbedding were performed using EMbed‐

812 (Electron Microscopy Sciences, PA) according to manufacturer protocol.  

Ultramicrotomy sectioning was performed at 50nm using a diamond blade 

microtome, and placed on copper PELCO formvar coated grids (TedPella, CA).  

Imaging was performed on a FEI Titan 80‐20 TEM microscope at Oregon State 

University.   

 

Phalloidin Fluorescent microscopy  

Zebrafish larvae were fixed in 4% paraformaldehyde for 12 hours at 4°C, 

and then washed 3x in PBS.  Tissue was permeobolized using 2% Triton X‐100 in 

PBS for 90min, followed by 3x washes in PBS.  Larvae were then incubated in 

1:2,000 Phalloidin in PBS for 1hr at room temperature, followed by 3x washes in 

PBST.  They were then mounted on coverslips using a 1% agarose solution.  

Imaging was performed on a custom made two‐photon dye‐specific offset 

microscope with a 20x objective as previously described [13].    

 

Fer1L6 null fishline development  

24 

 

Zebrafish 24hpf embryos from the sa16199 zebrafish line were obtained 

from Zebrafish International Resource Center (ZIRC, OR).  They were produced 

through in vitro fertilization of wild type AB eggs with sa16199 cryopreserved 

sperm.  Larvae were raised to 120hpf in embryo media in large plastic dishes.  At 

120hpf, there were placed onto the water system described in husbandry.  Adults 

were anesthetized, and section of caudal fin was amputated for genotyping 

purposes at 3 months of age using custom Vic‐Fam genotyping taq‐man q‐PCR 

assay (Applied Biosystems, CA) according to manufacturer’s protocol.  All 

subsequent spawning was performed by placing males and females in a 

spawning basket in the evening with a small amount of mesh to create a shallow 

environment eggs were collected 2 hours into the follow day’s light cycle.  

Adults are given at least two weeks between spawnings.   

2.3 – Results 

2.3.1 ‐ Expression of Fer1L6 in zebrafish  

Before reverse genetic approaches could be utilized as an approach to 

Fer1L6 characterization, we first sought to verify Fer1L6 expression in zebrafish.  

Two important aspects of expression needed to be explored: timing of expression 

and tissue specification.  In order to use morpholinos, it was vital to establish 

that there was expression within the first four days of development, as 

morpholino efficacy decreases dramatically due to a dilution effect through cell 

division during development.  Using whole embryo RNA extraction, we found 

Fer1L6 expression starting at 24hrs post fertilization and continuing through the 

first five days (120 hpf) of development using reverse transcription q‐PCR 

(Figure 2.1).  The expression levels are steady for the first two days (48 hpf), 

followed by a slight increase to a new steady state for days three through five.     

25 

 

Due to the lack of a functional Fer1L6 antibody for zebrafish, whole 

mount in situ hybridization was used to establish localization of the observed 

expression through the first five days of development.   At 24 hpf, there is 

relatively even distribution of Fer1L6 throughout the embryo (Figure 2.2).  At 48 

and 72 hours post fertilization, a distinct increase in expression in the head and 

brain area is observed.  By 96 hours post fertilization the larvae have Fer1L6 

expression localized to the brain, gut, and gonad area with some staining still 

visible at the tips of the elongating fins.  This is more easily distinguishable 

under the florescent development agent fast red (Figure 2.2).  The change in 

expression localization suggests ubiquitous or at least multi tissue type 

expression with may be associated with differentiation of various tissues 

throughout the first five days of development.   

   

2.3.2 – Morpholino knock down  

  Having characterized the expression profile of Fer1L6 in zebrafish, we 

next sought to knockdown Fer1L6 expression by injecting morpholinos at the 

single cell stage.  These splice blocking morpholinos prevent excession of an 

intron during mRNA processessing, resulting in early chain termination  (Figure 

2.3).  Two different morpholinos localizing to different intron exon junctions 

were used to knockdown Fer1L6.   

The level of transcript knockdown (KD) was quantified using q‐PCR.  This 

showed a maximum 80% reduction in Fer1L6 transcription (Figure 2.5).  

Increasing the morpholino concentration any further resulted in increased 

lethality, but not decreased expression (Figure 2.6).  Therefore, 2.25 pmols was 

used for all following experiments.  Both morpholinos showed identical curved 

tail phenotypes, similar to that observed in previous dysferlin morpholino 

26 

 

studies (Figure 2.4)[14].  The lowest concentration of morpholino presented with 

a slight hunch back, but as morpholino concentration increased, the curve in the 

tail region became more pronounced and began curving to the side, similar to the 

positioning of the embryo in the corion.   

Many morpholinos have been shown to have off target effects, many of 

which result in p53 pathway activation and subsequent apoptosis related 

phenotypes.  The knockdown of both p53 and the gene of interest removed any 

of these p53 linked phenotypes, making it easier to differentiate between on 

target and p53 linked off target phenotypes.  To confirm that our phenotype was 

not related to the common p53 pathway mutations, the Fer1L6 morpholino was 

coinjected with standardized p53 morpholino.  The simultaneous knockdown of 

Fer1L6 and p53 showed no change in phenotype under brightfield, suggesting 

that this observed phenotype is not linked to p53 apoptotic effects [15].  The 

presence of similar phenotypes for two different Fer1L6 morpholinos and the p53 

control combined to produce enough confidence in the phenotype to move 

forward with more thorough phenotypic characterization.   

Due to the similarity in phenotype between the Fer1L6 and dysferlin 

morphants, and the suggestion by Doherty et al. that Fer1L6 is found in C2C12 

cells, the anatomy of the tail skeletal muscle was further scrutinized[16][14].  

Using phalloidin staining and two‐photon microscopy, a distinct disorganization 

is seen in the developed skeletal muscles at 96hpf in KD compared to WT (Figure 

2.8).  The KD muscle shows disorganization of the myofibrils within each 

segment of skeletal muscle tissue.  Further, while the control tissue has highly 

regular parallel myofibril bundles, the knock down myofibrils appear less 

distinct and are not parallel with each other (Figure 2.8).  Additionally, the 

myoseptum is irregular, tissue equivalent to the linea alba in mammals.  The 

27 

 

horizontal myoseptum is practically nonexistent, and the vertical myosepta are 

present but malformed.   

Osmium stained transmission electron microscopy (TEM) was used to 

investigate possible causes of this skeletal muscle phenotype (Figure 2.8).  

Analysis of TEM images revealed an increase in vesicle accumulation and miss‐

trafficking of membrane at the sarcoplasmic reticulum in KD larvae.  This is 

similar to dysferlin null skeletal muscle which shows accumulation of unfused 

vesicles at the sarcolemma during wounding [17].    In addition to sarcoplasmic 

reticulum disruption, the t‐tubules are not overtly visible.  Based on the median 

plane microtome sections, the t‐tubule appears as a dark dot at the intersection of 

the Z line and sarcoplasmic reticulum.  This formation is missing from many 

places in the knock down sections.   

  Both morpholinos shows the presence of a cardiac effusion, where fluid 

builds up in the sac around the heart, or generalized pericardial edema, where 

there is less specific fluid buildup in the organ cavity near the heart (Figure 2.9).  

This created an impetus to better characterize heart development.  While the final 

structure of the zebrafish heart contains two chambers compared to the 

mammalian four, the development processes are highly similar.  The heart is the 

first functional organ to develop in zebrafish [18].  This process starts when cell 

progenitors for endocardial, atrial, and ventricular cells are specified.  These 

progenitors then migrate to the anterior lateral plate mesoderm (ALPM), where 

they differentiate and then fuse to form a cone shaped structure.  Next, the 

myocardium envelops the endocardium to form the heart tube.  The heart tube 

then forms a hook like structure, placing the ventricle on the anterior‐right and 

the atrium on the posterior‐left [19]. Over the next few days, the myocardium 

cells lengthen and change shape, to produce a ballooning effect on the chambers.  

28 

 

This process is believed to be controlled both by sarcomere function and blood 

flow through the heart [20].  Finally, as the chambers continue to grow, internal 

structures such as the valves and atrioventricular canal develop [19]. 

We sought to characterize this developmental process in the Fer1L6 

morphants.  First, we measured heart rate, and saw a significant decrease in 

heart rate for the knock down larvae at 96hpf, even when including larvae which 

showed trunk and tail phenotypes, but no edema (Figure 2.9).  Second, using a 

myosin heavy chain antibody (MF20) the hearts were imaged at 96hpf using 

confocal microscopy (Figure 2.9).  Analysis of the images revealed that while the 

knock down larvae participates in myotube formation, the heart has not 

ballooned. Taken together these results indicated that Fer1L6 appears to 

contribute to both skeletal and cardiac muscle (striated muscle). 

 

2.3.3 – Fer1L6 mutant fish line  

  Recent studies have indicated that morpholino off target effects are much 

more prevalent than previously thought [21].  Additionally, there has recently 

been an greatly increased availability of mutant zebrafish lines, due to large scale 

ENU‐mutation and TILLING projects [22].  Therefore, when an uncharacterized 

Fer1L6 mutant zebrafish line became available, we chose to supplement and 

confirm the Fer1L6 morpholino data with a mutant zebrafish line.  This line 

allows for the study of Fer1L6 removal during all stages of development, and is 

vital to studying the possibility of Fer1L6 involvement in fertility.  The Fer1L6 

mutant line used for this study is sa16199 from the Stemple lab at the Wellcome 

Trust Sanger Institute (Cambridge, UK).  Sa16199 carries a nonsense C to T 

mutation which results in a stop codon after 140 amino acids (Table 2.2).  This 

position correlates to the linker region between C2B and C2C.   

29 

 

The G0 male fish was produced by the Stemple lab through high 

throughput chemical mutagenesis using 1‐ethyl‐1‐nitrosourea (ENU) against a 

Tubingen Long Fin (TL) zebrafish background strain[23][22].  Treated males 

were crossed with wild type females, and their progeny were sequenced for 

desired mutations.  Once mutations were identified, sperm was cryopreserved 

for future studies.   Zebrafish International Resource Center (ZIRC, Eugene, OR), 

maintains cryo‐stocks from the ENU treatment that have been outcrossed to an 

AB zebrafish background through in vitro fertilization.     

Zebrafish embryos produced through in vitro fertilization of heterozygous 

sa16199 sperm and wild type AB females were ordered from ZIRC, and 

maintained until fish were at spawning age (~4 months). Fin clip DNA extraction 

followed by genotyping for the C to T mutation show 4 of the 7 remaining adults 

were heterozygous.  They displayed no discernable phenotype at any stage of 

development.  It is not possible to track how many times the line had been 

crossed during maintenance at ZIRC, we chose to call these original fish from 

ZIRC J1 to distinguish them from the F generation series originating from the 

Stemple lab.  The three heterozygous females and one male J1s, were spawned to 

produce the J2 generation, which again presented with no obvious phenotype at 

any stage of development.  J2s were genotyped, and produced 33.7% 

homozygous wild type, 57.9% heterozygous, and 8.4% homozygous mutant 

(Figure 2.10).  This is statistically different from expected Mendelian inheritance 

distributions of 25% homozygous wild type, 50% heterozygous, and 25% 

homozygous mutant.  Errors in founder genotype could results in skewed ratios, 

however a second round of genotyping confirmed the original identification.  All 

8 of our surviving homozygous mutant adults were male.   

30 

 

In an effort to increase our population of homozygous mutants, and 

obtain female homozygous mutants, heterozygous J2 females were crossed with 

the homozygous mutant J2 males to create J3 progeny.  This generation, now at 

two months of age, does not display any discernable abnormal phenotype.  

Additionally, a subset of J3 embryos were sacrificed at 48hpf for genotyping, and 

were 59% heterozygous and 41% wild type mutant, not statistically different 

from Mendelian inheritance rates (Figure 2.10).  Spawning of homozygous 

mutant J3s is necessary to determine if this is a truly null line.   

 

2.4 – Discrepancies between morpholino and fish line results  

With the increased availability of mutant zebrafish line production 

through CRISPR cas‐9 technology and increased use of TILLING, it has recently 

become apparent that morpholino knock down phenotypes and mutant knock 

out zebrafish line phenotypes often do not correlate.  In fact within the last two 

years, that has been a call by the greater zebrafish community to eliminate use of 

morpholinos in favor of mutant fish lines[24].  The primary issues is the 

prevalence of non‐specific off target effects.  While some of these can be 

identified through techniques such as p53 suppression or use of multiple 

morpholinos as done in this work, this does not eliminate all possible issues.  As 

new technologies become available, it is important for the research community to 

adjust their methodologies to reflect the most accurate information and 

techniques of the time.  With this in mind, the production of the mutant zebrafish 

line served as a valid and possibly necessary control for the phenotype 

characterization carried out with the morpholino knock down embryos.  

Discouragingly, the first generation of knock outs showed no curved trunk and 

tail phenotype.  This creates a situation in which further characterization of both 

31 

 

the knock down and knock out is necessary, in order to rule out any artifact 

results.   

In addition to the p53 control experiment, a common method of 

verification is a rescue experiment, in which the gene of interest in co‐injected 

with the morpholino and a recombinant version of the gene either via 

synthesized mRNA or a zebrafish promoter containing plasmid.  Due to the 

200KDa size of the Fer1L6 gene, synthesis of mRNA was too difficult.  Therefore, 

a construct containing the back half of the human Fer1L6 protein, form the C2D 

domain through the C‐terminal transmembrane domain was produced in a 

plasmid containing a muscle specific promoter.  It was predicted that a truncated 

version of the human protein would rescue, as the same truncated form of mouse 

otoferlin is sufficient for rescue experiments of otoferlin morpholino double 

knock down in zebrafish [12]. However, this construct proved to be toxic at even 

extremely low concentrations.  It is possible that the human homolog of Fer1L6 is 

not functional in zebrafish, or that expression levels using this non‐indigenous 

promoter created expression profiles which were detrimental to development of 

the embryo.  Therefore, it was not possible at this stage to carry out a rescue 

control of our Fer1L6 morphants.   

   One of the most comprehensive studies of this poor correlation between 

morphant and mutant phenotypes was from Kok et al. in 2015[21].  The group 

produced mutant zebrafish lines for 24 genes previously identified as necessary 

for development based on morpholino techniques, and also performed a 

comprehensive analysis of phenotypic data available on the ZFIN and Sange 

ZMP databases[21][23].  The results showed even lower than expected 

correlation between morphant and mutant phenotypes.  Of the 24 genes the 

group produced mutants for, only three displayed phenotypes similar to the 

32 

 

previously published morphant.  Through the literature analysis, only 24 genes 

has well characterized morphant and mutant embryos, and only five of these 

showed similar phenotypes between the two methods.  Taking the two datasets 

together, the group also investigated if including specific controls improved the 

correlation.  Addition of titration, p53, or multiple MOs, and rescue did not 

improved correlation rates.  In fact, nearly 80% of the mutants analyzed 

displayed no phenotype at all[21].  Some studies have suggested that this 

missing phenotype can be caused by residual maternal mRNA which is passed to 

the developing embryo[25].  However, after adjusting the data set to analyze 

only embryos produced through crossing of homozygous mutants, the 

correlation improvement was negligible[21].  These findings confirm that MOs 

are not the ideal technology that the zebrafish community hoped they would be, 

and that mutant zebrafish lines will need to be used as the gold standard moving 

forward.   

  

2.5 – Discussion 

  Fer1L6 is expressed at the mRNA level in a wide range of tissues as early 

as 24hpf.  ISH results showing wide ranging expression in many different tissues 

is consistent with human proteomic results from the human protein atlas project 

[26].  The  

expression of Fer1L6 early in development suggests that Fer1L6 may be 

important in development, similar to the role of myoferlin [27].  Based on EM 

imaging it is possible that Fer1L6 is necessary for proper formation or 

maintenance of sarcoplasmic reticulum.  T‐tubule is also missing or 

underdeveloped. As major calcium related organelles, this hypothesis would 

correlate with Fer1L6’s proposed role in calcium sensitive membrane trafficking.   

33 

 

  Fer1L6 mutant zebrafish line did not always have predicted Mendelian 

inheritance or 50/50 sex ratios.  A possible explanation for the discrepancy in 

genotype‐ratios may be the presence of additional lethal mutations, as ENU 

mutagenesis could lead to multiple mutations.   If alternate lethal mutations are 

present on the same chromosome, the eight surviving homozygous mutants may 

have survived as a result of favorable homologous recombination.  The parental 

F1 fish were developed using ENU based mutagenesis, so high prevalence 

undesired mutations is expected for the first few generations.   The genetic 

bottleneck of our founder generation, 3 females and 1 male, may also have 

contributed to poor ratios.  

  In terms of the sex ratios, natural strains of zebrafish, such as WIK and 

EKW, have been shown to have sex linked genes on a region of chromosome 4, 

which can be used to determine sex [28][29].  However, even for these strains, 

genetic females do not always develop into females. The AB and TU strains, from 

which the Fer1L6 mutant line was developed, do not have any known sex linked 

region in their genomes [28].  Sex differentiation of these lines is not fully 

understood, and has been shown to be based on a combination of genetics, 

environmental stimuli, and chemical exposure.  With all strains, development of 

males is due to oocyte death between 19 to 27  days post fertilization, a process 

that can be triggered by either genetic coding or environmental stress, and can 

result in a disproportionate sex ratio[30].  Notably, our J2 heterozygous 

population was also disproportionately male, indicating that there could be some 

common factor driving the population toward males.  However, the water 

conditions and temperature are not to blame, as other tanks on the same system 

were not male dominated.   

34 

 

  Any discrepancies from undesired mutations or population bottleneck 

will be removed as the line moves through the generations.  The J4 generation 

will be produced from large numbers of ‐/‐ males and female, and therefore will 

have more genetic diversity and no maternal mRNA.  At this point, it will be 

important to determine if there is any residual Fer1L6 mRNA.  If none is 

detected, this will be the first Fer1L6 null in vivo model ever produced.   

 

   

35 

 

2.6 – Figures and Tables  

 

 

Figure 2.1 Fer1L6 structure 

Schematic of predicted structure for Human Fer1L6, based on sequence 

alignment to other ferlins.  C2 domains are represented by ovals, and the single 

pass transmembrane domain by a rectangle.  The percent identity to the human 

Fer1L6 amino acid sequence is shown for each C2 domain in the mouse and 

zebrafish sequences.  Overall there is 88% and 59% identity with the mouse and 

zebrafish respectively.  Percent identity was determined using clustalW [31].  

36 

 

 

 

Figure 2.2 – Fer1L6 expression during zebrafish development 

Expression of Fer1L6 in whole embryo zebrafish through the first 5 days of 

development.  For each day, a ratio of Fer1L6 to beta‐actin ratio was determined. 

The ratios were subsequently normalized to 24hpf, which was set to 1 and 

relative expression levels (RQ) were analyzed for each following day.  Based on 

t‐test, 72hpf through 120hpf five are statistically higher than day one.  Error bars 

represent standard deviation with n=3.  (***p < 0.001,  ****p < 0.0001).  

   

37 

 

 

Figure 2.3 – ISH of Fer1L6 in zebrafish  

In situ hybridization of wild type zebrafish embryos at 24 to 96hpf.  At the early 

time point of 24hpf, there is expression at low levels throughout the embryo 

relative to negative control (upper right panel). At 48 and 72hpf, expression 

becomes more pronounced in the head region.  At 96hpf, there is a large amount 

of expression in the head and body cavity where organ systems are developing, 

with additional pronounced expression at the tip of the elongating fins.  This is 

more easily seen using fast red fluorescent developer (shown in bottom panel at 

96hpf).     

38 

 

 

Figure 2.4 – Fer1L6 splice blocking morpholinos.   

The two morpholinos to Fer1L6 are designed to prevent splicing between an 

intron‐exon junction, and thus retain that intron creating an early stop codon, 

either through a stop codon present in the intron or by causing a frame shift in 

the downstream exon.  Morpholino 1 targeted intron 14 with a sequence of 

CTCCCTCTTCCTGACAAACATAAAA and morpholino 2 targeted intron 2 with 

a sequence of AGCCTCTATCGTGTAACGATTAAAC.  Both products resulted in 

mRNA molecules that if translated would be missing the majority of function C2 

domains and the transmembrane domain necessary for localization.  Gene is 

written 5’ to 3’.  Rectangles represent exons and lines represent introns.   

   

39 

 

 

Figure 2.5 – Morpholino phenotype 

Representative brightfield images of morpholino injected embryos at 48 hours 

post fertilization compared to uninjected and control morpholino. Both 

morpholino 1 (MO1) and morpholino 2 (MO2) show increasing severity of 

phenotype with increasing amount of microinjected morpholino.  Phenotype 

includes curved trunk and tail, pericardial effusion, localized edema, and smaller 

eyes at very high concentrations.  P53 co‐injected morphants show the same 

phenotype as MO1 and MO2 injected.     

40 

 

 

Figure 2.6 – Fer1L6 knockdown quantitation 

Quantitation of Fer1L6 morpholino knockdown at 48hpf under increasing 

amounts of Fer1L6 morpholino knockdown.  Fer1L6 was normalized to beta 

actin for each concentration. Samples were then normalized to, the random 

sequence morpholino control (denoted as 0 pmol on graph).  Maximum 

knockdown occurred at 2.25 (80%), with higher concentrations not increasing the 

knockdown.   Error bars represent standard deviation with an n=5.   

   

41 

 

 

Figure 2.7 – Survival and phenotype rates 

Phenotype and survival rates for MO1 titration compared to a control 

morpholino.  N=92‐109 because unfertilized eggs and embryos that died within 

four hours of injection were removed from count.  2.25pmol was sufficient to 

have nearly all surviving embryos display a phenotype.     

Survival and Phenotype Ratios

Injected amount of morpholino (pmol)

contro

l0.

75 1.5

2.25 3.

00

20

40

60

80

100

deathphenotypeno phenotype

42 

 

   

Figure 2.8 ‐ Morpholino knockdown results in abnormal skeletal muscle.  

A.) 96hpf larvae stained with Phalloidin indicates disordered myofibrils and 

segmentation. In addition, the myoseptum (chevron‐shaped tendon structure) is 

Scale bar is 35.8um.  B.) Transmission electron microscopy of osmium staining 

skeletal muscle sections.  A and I band patterning is severely disrupted by 

accumulation of disordered sarcoplasmic reticulum.  Additionally, well defined 

43 

 

t‐tubule structures are missing in the knockdown sections, as indicated by red 

arrow.  Scale bar is 0.5um.   

 

Figure 2.9 ‐ Cardiac related phenotype 

A.) Brightfield image of sever pericardial effusion in Fer1L6 knock down larvae 

at 96hpf.  B.) heart rate comparison of control vs. knock down 96hpf larvae 

shows statistically decreased heartrate (***p<0.001, n=23) Error bars represent 

standard deviation.  C.) Immunostaining of sarcomere myosin in 96hpf zebrafish 

zebrafish hearts.  Knock down animals show delayed development of distinct 

atrium and ventricle compartmentalization.   

   

44 

 

 

 

Figure 2.10 – Genotype rates of Fer1L6 mutant 

Genotyping analysis of generation J1, J2, and J3 zebrafish created from the 

sa16199 line[23].  J1 is founder fish produced from in vitro fertilization of ‐/+ 

sperm and +/+ eggs.  J3 was produced from ‐/+ females spawned with ‐/‐ males.  

Exterior circle depicts observed proportions, and interior circle depicts expected 

proportions based on Mendelian inheritance.  F3 distribution was divergent with 

expected 25/50/25 results based on Mendelian inheritance (P<0.001).  F2 and F4 

had no statistically significant divergence based on binomial tests, (P>0.1).   

   

45 

 

Target 

Gene 

Forward sequence  Reverse sequence  

Fer1L6  CACATTGCCCTCATGTTTG  AGCCTCTTTTTGTCCAGCAA 

Dysferlin  AGAGACCTGCTGGCTATGGA  AGGGCTCCTCTCAGTCACA

A 

Myoferli

n 

ATTGAAGGCTGGCTTGAGAA  CATGCCTGCTCACAGTAGG

A 

B‐actin  AAGCAGGAGTACGATGAGT

C 

TGGAGTCCTCAGATGCATTG 

 

Table 2.1  

Primers used for q‐PCR quantitation.     

46 

 

A. 

>Fer1L6_Zebrafish(ENSDART00000056105.6) ATGGACCAAGATAAAGACAGCTCTGCACCCCATGGTAGCAAGAAGTTTGGAATAAAAGTAAAGAAGAAACATCGGAAAGGACACAAGGGTGTTGTAATCTCAAACAAAGGTGCTCTAGACACGATAGAGGCTGAGGCTGAAACTAATCCTGAAGATCCAGACGTGATAGATGTACCACAGCCCGAGTTTGCAGGACAGTCCACCTCGGCCCACACTTCTTTCAGACAGATTGCCAATACTAAGAGATGTAAAGCTGTATCCAAGATCTTGGAAGGTGAAAGCAAACCACAAAATTTCCAGATTTCCATCAATATAACAGAGATCAGGCAGCTGGTTGGGGACAATATAGACCCTAGTGTTGTGATTGAAATTGGAGATGATAAAAAGCAGACATCGGTGAAAGAAGGAACCAACGCTCCCTTTTACAATGAGTATTTTGTGTTTGACATATATTGCAATCAAGACATCTTTTTTGACAAAGTCATTAAACTATCAGTCATGCACTCAAAGATTATGAAGAGCTACTGTGTGGGAACGTTCAAGATTGATGTTGGGACAGTTTACTCTCAACCTGGGCATCAGTTCATCAATAAGTGGGCCACACTAACAGACCCTGCCGACATCCGTGTTGGGGTGAAAGGTTACCTGAAGTGTGATATCAGTGTGTCTGGAAAGGGAGATGTTGCACCACCATCTCAGAAATTCAGTGATGCCGAGGAA[C/T]AAATTGATAAGCACCTCCTGCTTCCTGAAGGCTTAAACCCGGAGCGGCCGTGGGCTCGGTTTTATGTGATCGTGTACCGAGCAGAAGGTCTTCCCAGAATAAACTCCAGTATTATGGCCAATGTGACCAAAGCTTTTGTTGGAGACACAACAGCCCTCATTGATCCTTATGTTGAGGTGTCATTCTTTGGTCAAGTTGGAAGGACTTCAACCCAAAAGAGCTCAGCAGATCCAGTGTGGAATGAGCAGGTGGTGTTTAAGGAGATGTTTCCTCCACTGTGTCAGAGACTAAAGATTCGGGTTCTGGATGAAGGAAGCATGAATGATGTGGCCATTGGGACTCATTACATTGACCTGCACACCATATCAAATGACACTGATGGAGACAATGGTTTCTTGCCCACATTTGGGCCAGCCTGGATCAACCTCTATGGTTCTCTTCGAAATTCCACACTGGTGGATGACAGCCAGGAACTGAAC GAAGGTGTTGGTGAAGGGGTGTCCTACAGAGGCAGACTCTACATAGAGCTGAGTGTAGAAATCCTGTCTGGAGGAGCTGCTGAATCCAAATCTCTGCTCTCAAAGTTCAGTCCAAAAGATGCCAAGGGTGGGAAAACTGGTACAGGAGCAGGAGGTGAAGAGGAGAAGTCCAAGATGATAGGACCTGAAGTGATCCCAGTGGAGCCCCCGCAGAAGATGAGAGATGAAGACATGGAGACTTTCCTGCTCTTTGGTTGTGTATTTGAGGCATCCATGATCGACAGAAAAATTGGCGATAGACCAGTCACCCTAGAGTTTACGATTGGTAACTTTGGGAACTTAATTGATGGTGCTGCACCACCTCCATCAAAGAAGAAGCTTGAGGATGTGTCAGTGACTGCTCCTCTACTGGACACTACAGCCACAATGCCCTGCAAATCCACTACAACACCAGAAAGGCCTATTTTTGGAGATGCACAGAGGCATTATATGCATTTGCCCATCGCTGCACAGAAGCCCTGTGTGTATGTTTACAGTAGCTGGGAGGATCGAGCGTACCGACTTCATCACGCCAACATGCTAGACACAATTGCCCTCATGTTTGAAGAGGGAGTCGCTAAGGTCACAGAGCTGGATAAAATGTTATCTCCGGAAGCATGGAGTCTCATGCACCACGTTCTTCGGGAATTCAGACGAGATGCCAAGGAGTTTATTGCTTTTGCTGAAAAAAAGGTGAAGGGAAGCAATTTAACCTTGCTGGACAAAAAGAGGCTAACTATGTGCAAACAGGAGCTGGAGAGTATGACTGAAATGGCAGGAGGACTTCTTGAGCCAAAGAGGAGATCTTTGACTGTGAAAGAAATGCTGCTGGAAGCTCAAAAAATTAAAAAGAAGCTGCGATTTCTGGTGGAGGAGCCTCAACACACTTTACCAGATGTGTTTGTGTGTCTGGTCAGTAATAACAAGCGTGTGGCGTATGCCAGAATCCCTGCTCGGGACCTGCTCTTCTCAGAGAGCCCAGAGCAAAGAGGCAGAGACTGTGGGAAGATCAAGACACTGTTCCTCAAGCCTCCAGTGAAGCGTGCACCGGGATGGACTGTCCAGGCTAAACTTGATGTGTTCTTGTGGCTGGGAACTTGCGCAGAGTCATCCCGCATGTTGGACAATCTCCCGTCGGGCTTTGAACTTGTGTCCACCTCTTTTGAGGATAGGACTGGCGCTCCTCCTGAATATTTACTCTACACAGAGCAGCACATGTTCGAGCTGAGGGCTCATATGTACCAGGCTCGTGGACTCATCGCAGCAGACAACACTGGCCTCTCAGACCCGTTTGCCTGGGTGTCTTTTCTGTCTCATAGCCAATGCACTGGTATCATAAAGCAAACATTGACTCCCACGTGGAATCAGGTGATCAAGATGACTAACATGTCTCTATATGGAGGGCTTTACGACATAGCCCAGGAGCCACCGCTGATTGTGATTGAAGTGTATGATGATGATGCAGTGGGTAGCGAGTACCTGGGCTCGACGGTGGCTGTTCCTGTTGTCAAACTATCAGAAGAGCAATACTCTCCTCCTCAGCTGCAGTACAGCCCTCTGTTCTGTGGCAGCCTGTCTGGAGGAGACATACTGGGGGCCTTTGAGCTCATTCAGTCAGGAGAGCACTCACTCCCTGTTTTAGATGAGCCAGATGGAGTTGTTATCCCAGTGCCCTCATACATTCGACCGGTGCTCTGCAAGTACAGGATTGAGGTTTTGTTCTGGGGCCTCAGAGAACTGAAAAAGGTTCAGCTCTTATCTGTCGATCGTCCTCAAGTATTTATCAAGTGCGCAGGATCGGGTGTCAACTCCTCTGTCATACAAAGCTACAAGAAAAACCCGAACTTTACAATAATTGTGGACGCCTTTGATGTGGAGTTGCCTGAAGATGAACATCTCCTCCCTCCCCTCACTCTCACCGTGGTGGACTGGAGGGCCTTTGGGAGAAGCACGCTTGTAGGTAGTCATGTGATCAACAACCTGGCCTTATTCAAACACAATCCTGTACCGGTCCAGCAGCCCCCGCCAGAGCCCAAAAACATAGCAGTGGCTCAGCTCTCTCTGCAGCAGAGTGTTATTCCACCTCCAGATGAAGAGATCGCCATTGAAATAGAGCATGAGGAGATCATTGCCCCCAAAAGCCAAGAGCCTGAATTCCAGGACACAAAGCAAAGGGTGTCAAAAAAGAGCAAACGAAGATCTACAAAAAGGAAGAAACGCACCACGGCTGATGAGTCTGCAGATAATGTCATCGATTGGTGGTCGAAGTACTATGCATCGATGGAGAAAATCAAACAGGCAAAGCAAAAAGAAGACAATCCTTTTCCACTGCTCTTTGAAAATACATCAGGTATGAGGGATAGGAAAAAAGAGGTGAACTACAAGAGTGTGATTGAACAGCCCAGGCTTGCAACATTACAGGTGTACGACAAAGAGCTGGAGGCTGAATTTGGGCCATTTGATGACTGGGTAAAAACCTTTGAACTCTTTCGAGGAAAGGCCAATGAAGAGGACGGCTCTGCATATGAGAGATTTGTTGGG AAGTTCAAGGGCAGGTTCTGTCTTTACAAGCTGCCAGAAGCAGACGGTGAGGCGGAAGAAGGCTATGTGGATTCAGGGCAGTTTAAAATCAATCAGGGAATTCCTCCAAACACTGCTGTGAATGTCCTTATCCGTTCTCTTATGCATTTTAAGGCCTTCAACCTGCACCCTGCAGACCCAGATGGCAAAGCAGACCCTTACATAGTGCTGAAACTTGGGAAAACTGAGATCAAAGACAGAGACAATTACATCCCAAAGCAGCTCAACCCAGTGTTTGGAAGATCTTTTGAATTTCAAGCCACTTTTCCCAAAGAATCCCTACTAACAATCCTAATCTATGACTATGACCTGGTTGGTGGTGATGATTTGATTGGAGAAACACAGATCGATTTGGAGAACCGGTTTTACAGCAGACATCGAGCAACCTGCAGCCTTCCTACTGAATATGCCATTGAGGGTTATAATGCATGGAGGGACTGCATGAAGCCAGTAGACCTGCTGATTAAACTGTGTAAAGAAAACAGACTGGACAACCCTCAGTTTTCTCCAGGCCGTATTACCATCGGAAACAAAGTCTTTATGGGGAAAACGGTATTTCCAGATGAAGATCAAATGGTGGAGTCGTATGAACACTTGGCTCTCAAGGTGCTTCACAGGTGGTCTGAGATGCCCAACGGAGGCTGTAAACTTGTCCCAGAGCATATTGAAACT

47 

 

CGCGCACTTTACCTCAAGGACAAACCAGGAATAGACCAGGGCCATTTGCAGATGTGGGTGGACATTTTTCCACTGGACATGCCTCACCCTGGCCCACCTGTGGACATTTCCCCTCGCAAACCTAAAGGGTATGAACTGAGAATCATTATCTGGAACACTGAAGATGTGATACTGGAGGACACCAACTTCATTACAGGACAGCAGTCAAGCGACATTTATGTTAAAGGGTGGTTAAAGGGTCTTGAAGATGACGGCCAGGAAACTGATGTCCATTACAATTCTTTGACTGGAGAGGGCAACTTCAACTGGCGCTTTGTGTTCCCCTTCAGCTACCTACCAGCTGAGAAAGTGGTAGTGGTACAAAAGCGAGAAAGCATCTACTCTCTGGACAAAACTGAACAGAAGATGCCTGCAGTTCTTGTTATGCAGGTGTGGGACTTTGAGCGGCTTTCCTCCGATGACTTTCTGGGCTCAGTGGAGTTGGATCTGCATGGGTTTCCTCGTGGAGCTAAATCAGCTAAAGCTTGTAAGATGGAAATGCTGACAGAACTCACAGAGAACATCTCTATCTTCCAGCAGAAACGCTCCAAAGGCTGGTGGCCCTTCATCAAAGCTGGAGAACTAACAGGAAAGGTAGAAGCTGAGTTTCACCTGGTCACTGCTGAGGAGGCTGAGAAAAACCCAGTGGGCCGCGCACGCAAAGAGCCAGAGCCTCTGGAGAAACCAAACCGTCCAGACACATCCTTCTCCTGGTTTATGAATCCTTTCAAGTGCTTCTTTCACCTGATCTGGGGAAACTACAAGAAATACATCATAGCTGGACTGGTGCTGTTGATTTTGACCTTGTTCCTGGTTCTGCTCTTTTACACCCTTCCAGGGGCGCTCAGTACTAAGATAGTCAATGGGTAA B. >Fer1L6_protein MDQDKDSSAPHGSKKFGIKVKKKHRKGHKGVVISNKGALDTIEAEAETNPEDPDVIDVPQPEFAGQSTSAHTSFRQIANTKRCKAVSKILEGESKPQNFQISINITEIRQLVGDNIDPSVVIEIGDDKKQTSVKEGTNAPFYNEYFVFDIYCNQDIFFDKVIKLSVMHSKIMKSYCVGTFKIDVGTVYSQPGHQFINKWATLTDPADIRVGVKGYLKCDISVSGKGDVAPPSQKFSDAEEQIDKHLLLPEGLNPERPWARFYVIVYRAEGLPRINSSIMANVTKAFVGDTTALIDPYVEVSFFGQVGRTSTQKSSADPVWNEQVVFKEMFPPLCQRLKIRVLDEGSMNDVAIGTHYIDLHTISNDTDGDNGFLPTFGPAWINLYGSLRNSTLVDDSQELNEGVGEGVSYRGRLYIELSVEILSGGAAESKSLLSKFSPKDAKGGKTGTGAGGEEEKSKMIGPEVIPVEPPQKMRDEDMETFLLFGCVFEASMIDRKIGDRPVTLEFTIGNFGNLIDGAAPPPSKKKLEDVSVTAPLLDTTATMPCKSTTTPERPIFGDAQRHYMHLPIAAQKPCVYVYSSWEDRAYRLHHANMLDTIALMFEEGVAKVTELDKMLSPEAWSLMHHVLREFRRDAKEFIAFAEKKVKGSNLTLLDKKRLTMCKQELESMTEMAGGLLEPKRRSLTVKEMLLEAQKIKKKLRFLVEEPQHTLPDVFVCLVSNNKRVAYARIPARDLLFSESPEQRGRDCGKIKTLFLKPPVKRAPGWTVQAKLDVFLWLGTCAESSRMLDNLPSGFELVSTSFEDRTGAPPEYLLYTEQHMFELRAHMYQARGLIAADNTGLSDPFAWVSFLSHSQCTGIIKQTLTPTWNQVIKMTNMSLYGGLYDIAQEPPLIVIEVYDDDAVGSEYLGSTVAVPVVKLSEEQYSPPQLQYSPLFCGSLSGGDILGAFELIQSGEHSLPVLDEPDGVVIPVPSYIRPVLCKYRIEVLFWGLRELKKVQLLSVDRPQVFIKCAGSGVNSSVIQSYKKNPNFTIIVDAFDVELPEDEHLLPPLTLTVVDWRAFGRSTLVGSHVINNLALFKHNPVPVQQPPPEPKNIAVAQLSLQQSVIPPPDEEIAIEIEHEEIIAPKSQEPEFQDTKQRVSKKSKRRSTKRKKRTTADESADNVIDWWSKYYASMEKIKQAKQKEDNPFPLLFENTSGMRDRKKEVNYKSVIEQPRLATLQVYDKELEAEFGPFDDWVKTFELFRGKANEEDGSAYERFVGKFKGRFCLYKLPEADGEAEEGYVDSGQFKINQGIPPNTAVNVLIRSLMHFKAFNLHPADPDGKADPYIVLKLGKTEIKDRDNYIPKQLNPVFGRSFEFQATFPKESLLTILIYDYDLVGGDDLIGETQIDLENRFYSRHRATCSLPTEYAIEGYNAWRDCMKPVDLLIKLCKENRLDNPQFSPGRITIGNKVFMGKTVFPDEDQMVESYEHLALKVLHRWSEMPNGGCKLVPEHIETRALYLKDKPGIDQGHLQMWVDIFPLDMPHPGPPVDISPRKPKGYELRIIIWNTEDVILEDTNFITGQQSSDIYVKGWLKGLEDDGQETDVHYNSLTGEGNFNWRFVFPFSYLPAEKVVVVQKRESIYSLDKTEQKMPAVLVMQVWDFERLSSDDFLGSVELDLHGFPRGAKSAKACKMEMLTELTENISIFQQKRSKGWWPFIKAGELTGKVEAEFHLVTAEEAEKNPVGRARKEPEPLEKPNRPDTSFSWFMNPFKCFFHLIWGNYKKYIIAGLVLLILTLFLVLLFYTLPGALSTKIVNG-

 

Table 2.2 – Fer1L6 sequence of sa16199 mutation 

A.) zebrafish Fer1L6 cDNA sequence.  C to T mutation location is highlighted in 

blue.  B.) Translated amino acid sequence for zebrafish Fer1L6.  Location of stop 

codon insertion is highlighted in blue.    

   

48 

 

 

2.6 – References  

[1]  A. Lek, F.J. Evesson, R.B. Sutton, K.N. North, S.T. Cooper, Ferlins: 

Regulators of Vesicle Fusion for Auditory Neurotransmission, Receptor 

Trafficking and Membrane Repair, Traffic. 13 (2012) 185–194. 

doi:10.1111/j.1600‐0854.2011.01267.x. 

[2]  L. V Anderson, K. Davison, J.A. Moss, C. Young, M.J. Cullen, J. Walsh, et 

al., Dysferlin is a plasma membrane protein and is expressed early in 

human development, Hum. Mol. Genet. 8 (1999) 855–861. 

doi:10.1093/hmg/8.5.855. 

[3]  R. Varga, P.M. Kelley, B.J. Keats,  a Starr, S.M. Leal, E. Cohn, et al., Non‐

syndromic recessive auditory neuropathy is the result of mutations in the 

otoferlin (OTOF) gene., J. Med. Genet. 40 (2003) 45–50. 

doi:10.1136/jmg.40.1.45. 

[4]  M.C. Eisenberg, Y. Kim, R. Li, W.E. Ackerman, D.A. Kniss, A. Friedman, 

Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on tumor cell invasion, 

Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (2011) 20078–20083. 

doi:10.1073/pnas.1116327108. 

[5]  T. Xia, S. Chen, Z. Jiang, Y. Shao, X. Jiang, P. Li, et al., Long noncoding 

RNA FER1L4 suppresses cancer cell growth by acting as a competing 

endogenous RNA and regulating PTEN expression., Sci. Rep. 5 (2015) 

13445. doi:10.1038/srep13445. 

[6]  C.B. Moens, T.M. Donn, E.R. Wolf‐Saxon, T.P. Ma, Reverse genetics in 

zebrafish by TILLING, Briefings Funct. Genomics Proteomics. 7 (2008) 454–

459. doi:10.1093/bfgp/eln046. 

[7]  B.R. Bill, A.M. Petzold, K.J. Clark, L. a Schimmenti, S.C. Ekker, A primer 

for morpholino use in zebrafish., Zebrafish. 6 (2009) 69–77. 

doi:10.1089/zeb.2008.0555. 

[8]  P. Flicek, I. Ahmed, M.R. Amode, D. Barrell, K. Beal, S. Brent, et al., 

Ensembl 2013, Nucleic Acids Res. 41 (2013). doi:10.1093/nar/gks1236. 

[9]  J.S. Taylor, I. Braasch, T. Frickey, A. Meyer, Y. Van De Peer, Genome 

Duplication , a Trait Shared by 22 , 000 Species of Ray‐Finned Fish, 

Genome Res. (2003) 382–390. doi:10.1101/gr.640303.1. 

[10]  C.L. Barton, E.W. Johnson, R.L. Tanguay, Facility Design and Health 

Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory, 

Zebrafish. 0 (2016) zeb.2015.1232. doi:10.1089/zeb.2015.1232. 

[11]  C. Thisse, B. Thisse, High‐resolution in situ hybridization to whole‐mount 

49 

 

zebrafish embryos, Nat. Protoc. 3 (2008) 59–69. 

[12]  P. Chatterjee, M. Padmanarayana, N. Abdullah, C.L. Holman, J. LaDu, R.L. 

Tanguay, et al., Otoferlin deficiency in zebrafish results in defects in 

balance and hearing: rescue of the balance and hearing phenotype with 

full‐length and truncated forms of mouse otoferlin., Mol. Cell. Biol. 35 

(2015) 1043–54. doi:10.1128/MCB.01439‐14. 

[13]  C.K. Almlie, A. Hsiao, S.M. Burrows, Dye‐Specific Wavelength Offsets to 

Resolve Spectrally Overlapping and Co‐Localized Two‐Photon Induced 

Fluorescence, Anal. Chem. 88 (2016) 1462–1467. 

doi:10.1021/acs.analchem.5b04476. 

[14]  G. Kawahara, P.R. Serafini, J.A. Myers, M.S. Alexander, L.M. Kunkel, 

Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown, 

Biochem. Biophys. Res. Commun. 413 (2011) 358–363. 

doi:10.1016/j.bbrc.2011.08.105. 

[15]  M.E. Robu, J.D. Larson, A. Nasevicius, S. Beiraghi, C. Brenner, S.A. Farber, 

et al., P53 Activation By Knockdown Technologies, PLoS Genet. 3 (2007) 

787–801. doi:10.1371/journal.pgen.0030078. 

[16]  K.R. Doherty, A.R. Demonbreun, G.Q. Wallace, A. Cave, A.D. Posey, K. 

Heretis, et al., The endocytic recycling protein EHD2 interacts with 

myoferlin to regulate myoblast fusion, J. Biol. Chem. 283 (2008) 20252–

20260. doi:10.1074/jbc.M802306200. 

[17]  P.L.M.& K.P.C. Dimple Bansal, Katsuya Miyake, Steven S. Vogel, Se´verine 

Groh, Chien‐Chang Chen, Roger Williamson, Defective membrane repair 

in dysferlin‐deficient muscular dystrophy, Nature. 423 (2003) 1–5. 

doi:10.1038/nature01604.1. 

[18]  J. Bakkers, Zebrafish as a model to study cardiac development and human 

cardiac disease, Cardiovasc Res. 91 (2011) 279–288. doi:10.1093/cvr/cvr098. 

[19]  D. Staudt, D. Stainier, Uncovering the Molecular and Cellular Mechanisms 

of Heart Development Using the Zebrafish, Annu. Rev. Genet. 46 (2011) 

120913144909001. doi:10.1146/annurev‐genet‐110711‐155646. 

[20]  H.J. Auman, H. Coleman, H.E. Riley, F. Olale, H.J. Tsai, D. Yelon, 

Functional modulation of cardiac form through regionally confined cell 

shape changes, PLoS Biol. 5 (2007) 0604–0615. 

doi:10.1371/journal.pbio.0050053. 

[21]  F.O. Kok, M. Shin, C.W. Ni, A. Gupta, A.S. Grosse, A. vanImpel, et al., 

Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino‐

induced and mutant phenotypes in zebrafish, Dev. Cell. 32 (2015) 97–108. 

doi:10.1016/j.devcel.2014.11.018. 

[22]  R.N.W. Kettleborough, E. de Bruijn, F. van Eeden, E. Cuppen, D.L. 

50 

 

Stemple, High‐throughput target‐selected gene inactivation in zebrafish, 

Methods Cell Biol. 104 (2011) 121–127. doi:10.1016/B978‐0‐12‐374814‐

0.00006‐9. 

[23]  R.N. Kettleborough, E.M. Busch‐Nentwich, S.A. Harvey, C.M. Dooley, E. 

de Bruijn, F. van Eeden, et al., A systematic genome‐wide analysis of 

zebrafish protein‐coding gene function, Nature. 496 (2013) 494–497. 

doi:10.1038/nature11992. 

[24]  S. Schulte‐Merker, D.Y.R. Stainier, Out with the old, in with the new: 

reassessing morpholino knockdowns in light of genome editing 

technology, Development. 141 (2014) 3103–3104. doi:10.1242/dev.112003. 

[25]  E.W. Abrams, M.C. Mullins, Early zebrafish development: It’s in the 

maternal genes, Curr. Opin. Genet. Dev. 19 (2009) 396–403. 

doi:10.1016/j.gde.2009.06.002. 

[26]  R. Petryszak, M. Keays, Y.A. Tang, N.A. Fonseca, E. Barrera, T. Burdett, et 

al., Expression Atlas update‐an integrated database of gene and protein 

expression in humans, animals and plants. TL  ‐ 44, Nucleic Acids Res. 44 

VN‐r (2016) 52. doi:10.1093/nar/gkv1045. 

[27]  K.R. Doherty, A. Cave, D.B. Davis, A.J. Delmonte, A. Posey, J.U. Earley, et 

al., Normal myoblast fusion requires myoferlin., Development. 132 (2005) 

5565–75. doi:10.1242/dev.02155. 

[28]  C.A. Wilson, S.K. High, B.M. McCluskey, A. Amores, Y.L. Yan, T.A. Titus, 

et al., Wild sex in zebrafish: Loss of the natural sex determinant in 

domesticated strains, 2014. doi:10.1534/genetics.114.169284. 

[29]  J.L. Anderson, A. Marí, I. Braasch, A. Amores, P. Hohenlohe, P. Batzel, et 

al., Multiple sex‐associated regions and a putative sex chromosome in 

zebrafish revealed by RAD mapping and population genomics, PLoS One. 

7 (2012). doi:10.1371/journal.pone.0040701. 

[30]  X.G. Wang, R. Bartfai, I. Sleptsova‐Freidrich, L. Orban, The timing and 

extent of “juvenile ovary” phase are highly variable during zebrafish testis 

differentiation, J. Fish Biol. 70 (2007) 33–44. doi:10.1111/j.1095‐

8649.2007.01363.x. 

[31]  M. Larkin, G. Blackshields, N. Brown, R. Chenna, P. McGettigan, H. 

McWilliam, et al., ClustalW and ClustalX version 2, Bioinformatics. 23 

(2007) 2947–2948. doi:doi:10.1093/bioinformatics/btm404. 

 

51

Chapter 3 ‐ Subcellular Localization and Expression of 

Fer1L6 in the C2C12 cell line 

3.1 ‐ Introduction  

In order to gain an understanding of Fer1L6 function at the molecular 

level it is crucial to study Fer1L6 in in vitro systems, where subcellular 

localization, protein‐protein interactions, and biophysical mechanisms can we 

directly studied.  To date the references to Fer1L6 in cell culture are in C2C12 and 

HEK cells.  Doherty et al. 2008, mentions unpublished data in which they found 

Fer1L6 expression in mouse myoblast C2C12 cells[1].  Redpath et al. showed 

subcellular localization of transfected Fer1L6 in C2C12 cells, fibroblast Cos‐7 

cells, and HEK cells, but does not look at endogenous Fer1L6[2].  Previous work 

showed in situ hybridization results in zebrafish identified expression of Fer1L6 

in skeletal muscle, as well as many other tissue types.  Morpholino Fer1L6 knock 

down in zebrafish shows a distinct phenotype of disorganization in skeletal 

muscle and under development of the heart.  The primary issue with exclusively 

studying Fer1L6 in zebrafish, is that there is no commercially available antibody 

which recognizes the zebrafish homolog.  However, an anti‐Fer1L6 antibody 

exists for the human epitope, which will cross react with mouse Fer1L6 [3].  All 

of these preliminary findings and circumstances lead to the decision to 

investigate Fer1L6 function in the mouse leg skeletal myoblast C2C12 line.   

 

3.2 ‐ Methods 

Immunostaining and confocal microscopy 

  C2C12 cells were cultured in DMEM with 10%FBS (Thermo Fischer, CA) 

on class coverslips.  Coverslips were fixed in 4% paraformaldehyde in PBS for 30 

52

minutes and then washed in PBS.  Cells were permeabilized in 0.2% Triton X‐100 

for 20 minutes and then washed in PBS.  Cells were blocked in 2.5% BSA in PBST 

for 1 hr followed by addition of primary Fer1L6 antibody (abcam, UK) at 1:500 

and incubated overnight at 4°C.  Cells were washed in PBS and then secondary 

antibody was added at 1:1,000 + DAPI at 1:2,000 and incubated for 1hr at room 

temperature.  After washing, coverslips were mounted in fluoromount (Sigma 

Aldrich, MO) for imaging.  Images were collected on a Zeiss LSM 78 NLO 

confocal microscope using a 64x oil objective.  Post imaging processing was done 

using Zen black.   

 

WB  

Western blot was carried out as previously described [4].  Samples were 

run on 8% gel, blotted onto PVDF membrane, and blocked with 2% milk in PBST.  

Proteins were ditected with primary antibodies at 1:500 and secondary 

antibodies at 1:1,000.  Hamlet anti‐dysferlin, anti‐Fer1L6, and anti‐actin were 

purchased from Abcam.   

 

q‐PCR 

RNAeasy kit (Quiagen, Germany) was used to extract total RNA from 

cells according to manufactures’ protocol.  cDNA was synthesized using iScript 

DNA synthesis kit (Bio‐Rad, CA) according to manufactures’ protocol.  All q‐

PCR was performed using Power Sybr‐green PCR master mix (Applied 

Biosystems, CA) on a 7500 fast Real‐Time PCR System (Applied Biosystems, CA).  

At least one set of primers (Sigma‐Aldrich, MO) were designed for each gene of 

interest (Table 3.1).  

 

53

3.3 – Results 

3.3.1 ‐ Validation of antibody  

The study of Fer1L6 was critically improved with the availability of an 

anti‐human Fer1L6 antibody produced as part of the human protein atlas project 

[3].  This project aims to produce antibodies for immunostaining of human tissue 

in an effort to produce a full proteomic analysis of protein localization within all 

tissue types.  The results from their immunostaining analysis shows high levels 

of expression in stomach and small intestine with the majority of other tissue 

showing either moderate or low expression levels.  However, the specificity of 

the antibody had not been independently verified.  The epitope for production of 

this polyclonal antibody is found in the endogenous linker region between the 

C2 domains C2E and C2F [5].  In order to verify the specificity of the antibody, 

we expressed a recombinant Fer1L6 C2E‐C2F construct with a maltose binding 

protein (MBP) tag on the N‐terminus in BL21 cells.  The total lysate from 

expression of this construct was used in a western blot with the Fer1L6 antibody.  

The resulting blot shows a single band at the expected 96 KDa molecular weight 

in induced but not unindicted lysate, verifying no cross reactivity with any other 

E. coli proteins (Figure 3.1).  Sequence alignment shows 79% identity between the 

linkers of C2E and C2F between human and mouse [6], thus the polyclonal 

Fer1L6 antibody is expected to work across species.  While we cannot confirm 

any cross reactivity in other species, these results support specificity of the 

antibody in E. coli lysate.  The is of particular importance moving forward, as 

splice variants and post translational truncation products have not been 

independently verified for Fer1L6 in any species.  The only information we have 

about splice variants relies on high throughput RNA‐seq analysis which can 

artificially show shortened variant due to RNA degradation, library prep, and 

54

low coverage at 5’ and 3’ ends.  Thus it is important to have both RNA and 

protein data to confirm any non‐predicted molecular weight products.   

3.3.2 ‐ Fer1L6 is expressed in myoblasts and differentiated myotubes  

Doherty et al. 2008, report they found Fer1L6 expression in mouse 

myoblast C2C12 cells, although they included no data to support the claim. To 

determine whether Fer1L6 is expressed in C2C12 cells, we tested 

undifferentiated C2C12 myoblasts and differentiated C2C12 myotubes for 

Fer1L6.    

C2C12 cells can be induced to differentiate from myoblasts to myotubes 

through starvation conditions by reducing the FBS in the cell culture media from 

10% to 2%.  Indeed we observed that reduction in FBS resulted in nearly full 

differentiation of all cells after 10 days under low FBS conditions (Figure 3.2).  

Western blot analysis showed virtually no dysferlin in the undifferentiated 

myoblast lysate, and clear expression in differentiated myotubes, as previously 

observed [7].  This confirms sufficient differentiation for comparison, as dysferlin 

is a marker for differentiation.  The Fer1L6 western blot showed multiple 

different molecular weight bands.  Interestingly, the primary band is found at 

about 130KDa, significantly lower than the 1862amino acid (209KDa) predicted 

for the only Fer1L6 mouse protein coding transcript (Figure 3.2).  There are 

fainter bands at 36KDa, 80KDa, and 260KDa for the undifferentiated lysate, and 

34, 36, 50, and 80KDa for the differentiated lysate.  No predicted protein coding 

transcripts exist for these molecular weights.  The expression level between 

differentiated and undifferentiated seems unchanged at the protein level based 

on band intensity.  Additionally, the presence of the epitope towards the C‐

terminal of the protein, suggests that if post translational modifications are 

happening, they are most likely being removed from the N‐terminal, leaving the 

55

localizing transmembrane domain intact.   Proteolysis of the Fer1L6 during lysis 

prep is unlikely, because a wide spectrum mammalian protease inhibitor cocktail 

was added to the lysis buffer.  Further investigation into the reason for the 

unexpected molecular weight needs to be further investigated.    

To confirm that there is no expression differences between myoblast and 

myotubes, q‐PCR was performed on cDNA from total lysate samples throughout 

the 10 days of differentiation (Figure 3.3).  Myoferlin results show some 

statistically significant changes compared to day 0, but this increase does not 

follow a specific trend.  Dysferlin expression is drastically increased within the 

first two days of differentiation, and slight increases are present through the next 

8 days.  This is consistent with previously published results showing minimal to 

no dysferlin in mononucleated myoblasts, but measurable expression by day two 

of differentiation [7].  Fer1L6 expression however, shows no time points with 

statistically different expression levels when compared to day 0.  These results 

are consistent with the western blot data (Figure 3.2), indicating no changes in 

Fer1L6 at either the mRNA or protein level through myoblast differentiation.  

To investigate subcellular localization of Fer1L6, immunostaining and 

fluorescent confocal microscopy were performed on undifferentiated C2C12 

cells.  Previous work from Redpath et al. in 2015 showed recombinant 

overexpressed Fer1L6 localized primarily to the trans‐Golgi of HEK and C2C12 

cells, and could be found at lower levels on recycling endosomes and the plasma 

membrane.  Our immunostaining of undifferentiated C2C12 cells shows 

dispersed localization both perinuclear and cytosolic with some accumulation on 

the plasma membrane (Figure 3.4).  The cytosolic signal shows both punctate and 

striated patterning, with the striations radiating out from the nuclear region 

towards the plasma membrane.  This may be Fer1L6 being trafficked on vesicles 

56

bound for fusion at the plasma membrane, consistent with localization of other 

ferlin proteins [2].  

3.3.3 ‐ Fer1L6 is expressed in HEK cells 

The Redpath et al. recombinant overexpression studies used HEK cells for 

the majority of their studies, because they had detected RNA expression in an 

adult human kidney cDNA library.  However, the presence of endogenous 

Fer1L6 in HEK cells at the protein level has not been established.  To verify 

Fer1L6 in HEK cells, we performed a WB on HEK cell lysate.  Analysis of the 

whole lysate revealed a Fer1L6 positive band at the same 130KDa molecular 

weight as was detected in the C2C12 cell lysate (Figure 3.5).  However there are 

also faint bands at 250KDa and 36KDa.  The 250KDa band was not observed in 

the C2C12 lysate. The dysferlin blot shows a faint band around 250KDa as 

expected. 

3.3.4 ‐ Fer1L6 expression in mouse tissue 

To date the human protein atlas project is the only study which looked at 

Fer1L6 expression in multiple tissue types at the protein level.  In an effort to 

confirm and solidify those high throughput results, we performed western blot 

analysis on whole tissue lysate from necropsied mouse organs.  Fer1L6 was 

detected at 130KDa in liver, stomach wall, testes, skeletal muscle, heart, kidney, 

spleen, forebrain, and hindbrain but not in intestine (Figure 3.7).  The liver band 

is the most intense, but this could be due to differences in amount of lysate 

loaded, since the total amount of protein lysate loaded for each tissue could not 

be normalized, due to a combination of inefficient extraction and inaccuracy in 

quantitation.  The insolubility of Fer1L6 requires use of 2% triton X‐100 detergent 

to keep the protein in the soluble fraction.  This raises the amount of lipid that is 

not remove from the sample during certification, causing quantitation methods, 

57

including Bradford assays to be highly inaccurate.  Therefore, we chose to load as 

much total protein lysate as possible, looking for a presence or non‐presence of 

Fer1L6.  These results should therefore not be in any way quantitative.   

  The human protein atlas shows high expression in stomach and small 

intestine, moderate expression in brain, testes, skeletal muscle, heart muscle, 

kidney, and low expression in liver and spleen.  All but one of these were 

detected in the mouse western blot, with intestine being the exception.  Western 

blot detection showed no Fer1L6 in the intestine sample, which according to the 

atlas should be high expression.  This could be due to our methodologies of 

western blot vs. immunohistochemistry, or because no a sufficient amount of 

protein was loaded onto the western blot.  Alternatively, the human protein atlas 

may have the error, and we know many errors exist because of the high 

throughput nature of the project.  For example, the myoferlin protein analysis 

reports no detectable myoferlin in skeletal muscle, although myoferlin 

expression and function in skeletal muscle has been well established by multiple 

groups.   

 

 

3.4 ‐ Discussion 

Western blot analysis and q‐PCR analysis show that Fer1L6 is expressed 

in both C2C12 and HEK cells.  In terms of differentiation, Fer1L6 shows no 

appreciable change in expression similar to the expression profile of myoferlin.  

The expression of Fer1L6 in early undifferentiated myoblasts suggests that it has 

a role either related to differentiation like myoferlin, or independent of 

myogenesis but necessary for both myoblasts and myotubes.  The presence of 

58

Fer1L6 in HEK cells indicates that Fer1L6 functions outside of muscle tissue, 

similar to myoferlin and dysferlin.   

The C2C12 subcellular localization is not visually consistent with the 

Redpath et al. data, but is consistent with their proposed mechanism of Fer1L6 

being involved in recycling pathways between the plasma membrane and trans‐

Golgi [2].  The disagreements between our C2C12 localization results and the 

Redpath et al. results are most likely due to the difference between endogenous 

and overexpression results.  Redpath et al. used a plasmid containing a CMV 

promoter for expression of Fer1L6, which produces excessive amounts of 

protein.  With this level of overexpression, the cell cannot transport the protein 

efficiently, and excess protein accumulates in the protein sorting organelle.  The 

endogenous Fer1L6 is more evenly distributed.  This in vitro analysis of Fer1L6 

corroborates the hypothesis that Fer1L6 functions in a wide range of cell types 

and is responsible for membrane trafficking events between the perinuclear 

region and the plasma membrane.   

 

 

   

59

3.5 – Figures 

 Figure 3.1  

Western blot showing specificity of HPA054117 anti‐Fer1L6 antibody.  E. coli 

containing MBP‐C2EF plasmid was lysed and total lysate of uninduced and 

induced samples were blotted using the Fer1L6 antibody.  There is no 

nonspecific signal in either sample, and only the predicted 96KDa band of MBP‐

Fer6C2EF is visible in the induced E.coli.  .   

   

60

 Figure 3.2  

WB showing expression of dysferlin and Fer1L6 in differentiated and non‐

differentiated C2C12 cells.  Protein levels of dysferlin are  increased in 

differentiated myotubes (day 0 vs. day10, middle panel), while Fer1L6 is 

unchanged *day 0 vs. day 10, left panel).  Fer1L6 is also seen at a lower molecular 

weight than thee 209KDa predicted size, while dysferlin is close to the predicted 

240KDa size.  Actin was run as a loading control.   

   

61

 Figure 3.3  

qPCR of myoferlin, dysferlin, and Fer1L6 in C2C12 cells from 0 to 10 days under 

low FBS conditions.  All samples were n=6 with two biological replicates and 

three technical replicates of each.  A 2 way ANOVA test was used to compare 

each ΔΔCt value to the 0 day time point.  Myoferlin expression was statistically 

increased at 2, 6, and 10 days of differentiation.  As expected dysferlin expression 

is rapidly increased within the first two days and then gradually increased as 

days progress. No statistically different expression is seen in Fer1L6 compared to 

day zero. **p<0.01, ***p<0.001. 

   

62

 

 Figure 3.4 ‐ Fer1L6 localization in C2C12 cells 

Immunostaining of Fer1L6 in undifferentiated C2C12 cells.  Red is anti‐Fer1L6 

and blue is DAPI nuclear staining.  Fer1L6 staining appears punctated and has 

striated structures radiating away from the perinuclear region towards the 

plasma membrane.  Small accumulation of Fer1L6 is visible on the plasma 

membrane, particularly in filapodia structures.   

 

 

 

63

   

64

 Figure 3.5  

Western blot of HEK‐293 cell lysate shows expression of Fer1L6 at about 120KDa, 

with minor bands at 40KDa and 250KDa.  The predicted size of Fer1L6 is 

209KDa.  Dysferlin is also visible at the predicted molecular weight of 240KDa.  

Actin was also run as a positive control.    

   

65

 

 

  

Figure 3.6 – transcription in cardiac tissue 

Reverse transcription PCR of mouse cardiac tissue shows expression of both 

dysferlin and Fer1L6 with an actin positive control.  Size of all bands are correct 

based on primer design. Representative image based on two biological replicates.   

   

66

 Figure 3.7  

Western blot of various mouse tissue types, shows presence of Fer1L6 in a wide 

range of tissues.  Fer1L6 expression around 130KDa is detectable in liver, 

stomach wall, testes, skeletal muscle, heart, kidney, spleen, forebrain, and 

hindbrain.  Not detected in intestine. 

   

67

Target 

Gene 

Forward primer  Reverse primer 

Fer1L6  CCAGAGAAGCCTCTGGTGA

C 

TGGGAAACCTTGACCAGTTC 

Dysferlin  CCAGCTCTCCAACGTACTGC  GCCAAACTGGCGATTATCAA 

Myoferli

n 

CCAGAAGACACCAGCTCAG

G 

ATGTCCTCGGCTCGGTAGAT 

Actin  AAATCGTGCGTGACATCAA

A 

AAGGAAGGCTGGAAAAGAG

C 

 

Table 3.1 – q‐PCR primers for C2C12 expression analysis 

   

68

 

3.6 ‐ References  

 

[1]  K.R. Doherty, A.R. Demonbreun, G.Q. Wallace, A. Cave, A.D. Posey, K. 

Heretis, et al., The endocytic recycling protein EHD2 interacts with 

myoferlin to regulate myoblast fusion, J. Biol. Chem. 283 (2008) 20252–

20260. doi:10.1074/jbc.M802306200. 

[2]  G.M.I. Redpath, R.A. Sophocleous, L. Turnbull, C.B. Whitchurch, S.T. 

Cooper, Ferlins Show Tissue‐Specific Expression and Segregate as Plasma 

Membrane/Late Endosomal or Trans‐Golgi/Recycling Ferlins, Traffic. 17 

(2016) 245–266. doi:10.1111/tra.12370. 

[3]  R. Petryszak, M. Keays, Y.A. Tang, N.A. Fonseca, E. Barrera, T. Burdett, et 

al., Expression Atlas update‐an integrated database of gene and protein 

expression in humans, animals and plants. TL  ‐ 44, Nucleic Acids Res. 44 

VN‐r (2016) 52. doi:10.1093/nar/gkv1045. 

[4]  S.J. Codding, N. Marty, N. Abdullah, C.P. Johnson, Dysferlin Binds 

SNAREs and Stimulates Membrane Fusion in a Calcium Sensitive Manner, 

J. Biol. Chem. (2016) jbc.M116.727016. doi:10.1074/jbc.M116.727016. 

[5]  R.D. Finn, A. Bateman, J. Clements, P. Coggill, R.Y. Eberhardt, S.R. Eddy, 

et al., Pfam: The protein families database, Nucleic Acids Res. 42 (2014). 

doi:10.1093/nar/gkt1223. 

[6]  M. Larkin, G. Blackshields, N. Brown, R. Chenna, P. McGettigan, H. 

McWilliam, et al., ClustalW and ClustalX version 2, Bioinformatics. 23 

(2007) 2947–2948. doi:doi:10.1093/bioinformatics/btm404. 

[7]  K.R. Doherty, A. Cave, D.B. Davis, A.J. Delmonte, A. Posey, J.U. Earley, et 

al., Normal myoblast fusion requires myoferlin., Development. 132 (2005) 

5565–75. doi:10.1242/dev.02155. 

69 

 

Chapter 4 ‐ General Conclusion and Future Directions  

Contributing Authors: Chelsea Holman, Colin Johnson 

 

4.1 – Conclusions from study   

  Fer1L6 is a poorly characterized member of the ferlin gene family.  To date 

four of the six mammalian ferlins have been associated with human disease, thus 

producing great interest in understanding the physiological role of all ferlins, 

including Fer1L6 [1].   Using a heterologous system, one study looked at the 

subcellular localization of recombinant Fer1L6 and found the majority of the 

protein accumulated at the trans‐Golgi [2]. All other known information about 

Fer1L6 comes from high throughput expression profiles using RNA‐seq or 

microarray immunohistochemistry [3].  These results show Fer1L6 is widely 

expressed, although the often conflicting results of these studies makes it difficult 

to determine which specific tissues Fer1L6 is definitively expressed in.   

  Our results from ISH in zebrafish embryos and  western blot of various 

mouse tissue show widely distributed expression, with the only tissue not testing 

positive for Fer1L6 being mouse intestine.  These results for the most part 

corroborates the findings in large scale transcript and proteomic studies, with the 

exception of the missing intestine [3].  The presence of both mRNA and protein 

in such a wide range of tissues definitively illustrates that Fer1L6 is a functional 

protein coding gene in vertebrates and not a pseudogene. The wide distribution 

of Fer1L6 matches reports for other ferlins, including myoferlin, which is thought 

to be ubiquitously expressed [4]. Thus, we conclude that the expression profile of 

Fer1L6 is not unlike other ferlins. 

70 

 

  Fer1L6 morpholino studies in zebrafish show abnormalities in both 

skeletal and cardiac muscle.   Closer examination of the skeletal muscle indicates 

misslocalization of sarcoplasmic reticulum membrane and under‐developed T‐

tubules.  The impaired heart rate and underdevelopment of the atrium and 

ventricle structures further support the conclusion that depletion of Fer1L6 

results in developmental differences in striated muscle. This phenotype differs 

from the reported phenotype associated with loss of dysferlin and myoferlin 

expression, and suggest that Fer1L6 may have a no redundant function [5][6].  

  Immunostaining of Fer1L6 in the mouse myoblast C2C12 cell line shows 

Fer1L6 localized to the perinuclear region with punctate striations leading 

outwards towards the plasma membrane, with small amounts of Fer1L6 signal at 

the plasma membrane.  This patterning is consistent with previously described 

rab11 associated trans‐Golgi‐to‐plasma membrane vesicle recycling [2].  Analysis 

of western blot and q‐PCR analysis shows no changes in C2C12 expression 

through differentiation. Based upon these results, it is attractive to envision 

Fer1L6 as a membrane trafficking protein involved in post‐Golgi trafficking 

event(s) that is not sensitive to the myoblast‐to‐myotube transition.  

  With this information, including previously published results, and large 

scale proteomics work, we propose a functional role for Fer1L6 in development 

of muscle and other tissues through plasma membrane and membrane bound 

proteins via calcium regulated movement of vesicles from the trans‐Golgi to the 

plasma membrane and back again.  

   

4.2 – New Questions Raised and Future Directions  

The sa16199 zebrafish line does not yet have ‐/‐ males crossing with ‐/‐ 

females, until the J3s reach reproductive maturity.  Once ‐/‐ J4s can be produced 

71 

 

from ‐/‐ parents, three major experiments will be run.  First, The J4 embryos will 

also need to be analyzed for the presence of Fer1L6 mRNA.  A mutation in the 

gene will not necessarily result in null expression of the gene.  The sa16199 

mutation could results in production of a fully functional C2B domain, although 

preliminary studies of otoferlin recovery assays using otoferlin genes with no 

transmembrane domain are not able to recover the otoferlin phenotype.  In order 

to classify this mutant line as a Fer1L6 null line, we must demonstrate that even 

transcription is turned off completely.    

If sa16199 is confirmed as a null Fer1L6 zebrafish line, J4 embryos can be 

used to look for phenotypic differences.  The lack of an obvious phenotype in the 

first ‐/‐ sa16199 mutant zebrafish raises questions about the validity of the muscle 

phenotype.  However, the J3 generation is not sufficient to definitively say there 

is no phenotype.  Some developmental phenotypes do not appear until no 

maternal mRNA is available at fertilization.  Because all of the J2 ‐/‐ were males, 

the J3 will all have maternal Fer1L6 mRNA from their +/‐ mothers.  This is why it 

is crucial to carry out experiments looking for phenotypic differences in the J4 

embryos and adults.  If there are still no obvious phenotypes once the J4 embryos 

are available, then re‐running the EM imaging of skeletal muscle will be crucial 

to determining if there are subcellular structural differences that do not result in 

full trunk curving.   

Finally, RNA‐seq analysis of the ‐/‐ vs +/+ embryos may give valuable 

information about pathways that are being effected by the removal of Fer1L6 

protein.  It is possible that transcriptional differences between a mutant fish line 

and a morpholino knock down effect regulation of other genes differently.  It 

may be possible that changes in other gene expression are able to compensate for 

72 

 

mutant Fer1L6, but these changes do not occur when there is only an 80% knock 

down.   

More thorough characterization of Fer1L6 localization and interacting 

partners in C2C12 and other cell lines will be important moving forward.  

Identification of the cytoskeletal and motor proteins responsible for the striation 

patterns seen in the C2C12 immunostaining could give insight into what 

membrane cycling pathway Fer1L6 is participating in.  This could be done 

through immunofluorescence colocalization, or though the inhibition of specific 

motors followed by visualization of changes in Fer1L6 distribution.   

Overall, this work establishes the foundation for future studies by 

validating zebrafish and the C2C12 and HEK cell lines as model systems for the 

study of Fer1L6. This work also highlights the need for a better understanding of 

Fer1L6’s function, and the degree of functional redundancy with dysferlin and 

myoferlin in tissues.  Dysferlin’s association with muscular dystrophy has 

created a tunnel vision effect in the research community, in which ferlins 

expressed in muscle are studied nearly exclusively in terms of mechanisms 

unique to muscle, although myoferlin and dysferlin are expressed widely 

throughout different tissue types.  RNA‐seq analysis may open up new areas or 

cell types of interest.   

 

4.3 – References  

[1]  A. Lek, F.J. Evesson, R.B. Sutton, K.N. North, S.T. Cooper, Ferlins: 

Regulators of Vesicle Fusion for Auditory Neurotransmission, Receptor 

Trafficking and Membrane Repair, Traffic. 13 (2012) 185–194. 

doi:10.1111/j.1600‐0854.2011.01267.x. 

[2]  G.M.I. Redpath, R.A. Sophocleous, L. Turnbull, C.B. Whitchurch, S.T. 

Cooper, Ferlins Show Tissue‐Specific Expression and Segregate as Plasma 

Membrane/Late Endosomal or Trans‐Golgi/Recycling Ferlins, Traffic. 17 

73 

 

(2016) 245–266. doi:10.1111/tra.12370. 

[3]  R. Petryszak, M. Keays, Y.A. Tang, N.A. Fonseca, E. Barrera, T. Burdett, et 

al., Expression Atlas update‐an integrated database of gene and protein 

expression in humans, animals and plants. TL  ‐ 44, Nucleic Acids Res. 44 

VN‐r (2016) 52. doi:10.1093/nar/gkv1045. 

[4]  W.S. Wang, X.H. Liu, L.X. Liu, W.H. Lou, D.Y. Jin, P.Y. Yang, et al., 

ITRAQ‐based quantitative proteomics reveals myoferlin as a novel 

prognostic predictor in pancreatic adenocarcinoma, J. Proteomics. 91 (2013) 

453–465. doi:10.1016/j.jprot.2013.06.032. 

[5]  G. Kawahara, P.R. Serafini, J.A. Myers, M.S. Alexander, L.M. Kunkel, 

Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown, 

Biochem. Biophys. Res. Commun. 413 (2011) 358–363. 

doi:10.1016/j.bbrc.2011.08.105. 

[6]  C. Yu, A. Sharma, A. Trane, S. Utokaparch, C. Leung, P. Bernatchez, 

Myoferlin gene silencing decreases Tie‐2 expression in vitro and 

angiogenesis in vivo, Vascul. Pharmacol. 55 (2011) 26–33. 

doi:10.1016/j.vph.2011.04.001. 

 

74 

 

Bibliography   

Abdullah, N. et al., 2014. Quantitation of the calcium and membrane binding 

properties of the C2 domains of dysferlin. Biophysical Journal, 106(2), pp.382–

389. 

Abrams, E.W. & Mullins, M.C., 2009. Early zebrafish development: It’s in the 

maternal genes. Current Opinion in Genetics and Development, 19(4), pp.396–

403. 

Almlie, C.K., Hsiao, A. & Burrows, S.M., 2016. Dye‐Specific Wavelength Offsets 

to Resolve Spectrally Overlapping and Co‐Localized Two‐Photon Induced 

Fluorescence. Analytical Chemistry, 88(2), pp.1462–1467. 

Anderson, J.L. et al., 2012. Multiple sex‐associated regions and a putative sex 

chromosome in zebrafish revealed by RAD mapping and population 

genomics. PLoS ONE, 7(7). 

Anderson, L. V et al., 1999. Dysferlin is a plasma membrane protein and is 

expressed early in human development. Human Molecular Genetics, 8(5), 

pp.855–861. Available at: 

http://hmg.oxfordjournals.org/content/8/5/855.full.pdf. 

Auman, H.J. et al., 2007. Functional modulation of cardiac form through 

regionally confined cell shape changes. PLoS Biology, 5(3), pp.0604–0615. 

Bakkers, J., 2011. Zebrafish as a model to study cardiac development and human 

cardiac disease. Cardiovasc Res, 91(2), pp.279–288. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21602174. 

Barton, C.L., Johnson, E.W. & Tanguay, R.L., 2016. Facility Design and Health 

Management Program at the Sinnhuber Aquatic Research Laboratory. 

Zebrafish, 0(0), p.zeb.2015.1232. Available at: 

http://online.liebertpub.com/doi/10.1089/zeb.2015.1232. 

Bashir, R. et al., 1998. A gene related to Caenorhabditis elegans spermatogenesis 

75 

 

factor fer‐1 is mutated in limb‐girdle muscular dystrophy type 2B. Nature 

genetics, 20(1), pp.37–42. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9731527. 

Bernatchez, P.N. et al., 2009. Myoferlin is critical for endocytosis in endothelial 

cells. American journal of physiology. Cell physiology, 297(3), pp.C484–C492. 

Bill, B.R. et al., 2009. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish, 6(1), 

pp.69–77. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=2776066&tool=p

mcentrez&rendertype=abstract. 

Buss, F. et al., 2001. Myosin VI isoform localized to clathrin‐coated vesicles with a 

role in clathrin‐mediated endocytosis. EMBO Journal, 20(14), pp.3676–3684. 

Cai, B. et al., 2014. GRAF1 forms a complex with MICAL‐L1 and EHD1 to 

cooperate in tubular recycling endosome vesiculation. Frontiers in cell and 

developmental biology, 2(May), p.22. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25364729%5Cnhttp://www.pubmedc

entral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=PMC4214196. 

Chatterjee, P. et al., 2015. Otoferlin deficiency in zebrafish results in defects in 

balance and hearing: rescue of the balance and hearing phenotype with full‐

length and truncated forms of mouse otoferlin. Molecular and cellular biology, 

35(6), pp.1043–54. Available at: 

http://mcb.asm.org/lookup/doi/10.1128/MCB.01439‐

14%5Cnhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25582200%5Cnhttp://www.p

ubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=PMC4333087. 

Chen, Y.A. & Scheller, R.H., 2001. SNARE‐mediated membrane fusion. Nature 

Reviews Molecular Cell Biology, 2(2), pp.98–106. Available at: 

http://dx.doi.org/10.1038/35052017. 

Codding, S.J. et al., 2016. Dysferlin Binds SNAREs and Stimulates Membrane 

Fusion in a Calcium Sensitive Manner. Journal of Biological Chemistry, 

p.jbc.M116.727016. Available at: 

76 

 

http://www.jbc.org/lookup/doi/10.1074/jbc.M116.727016. 

Davis, D.B. et al., 2000. Myoferlin, a candidate gene and potential modifier of 

muscular dystrophy. Human molecular genetics, 9(2), pp.217–226. 

Dimple Bansal, Katsuya Miyake, Steven S. Vogel, Se´verine Groh, Chien‐Chang 

Chen, Roger Williamson, P.L.M.& K.P.C., 2003. Defective membrane repair 

in dysferlin‐deficient muscular dystrophy. Nature, 423(May), pp.1–5. 

Doherty, K.R. et al., 2005. Normal myoblast fusion requires myoferlin. 

Development (Cambridge, England), 132(24), pp.5565–75. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=4066872&tool=p

mcentrez&rendertype=abstract. 

Doherty, K.R. et al., 2008. The endocytic recycling protein EHD2 interacts with 

myoferlin to regulate myoblast fusion. Journal of Biological Chemistry, 283(29), 

pp.20252–20260. 

Eisenberg, M.C. et al., 2011. Mechanistic modeling of the effects of myoferlin on 

tumor cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the 

United States of America, 108(50), pp.20078–20083. Available at: 

http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=3250187&tool=p

mcentrez&rendertype=abstract%5Cn%3CGo to ISI%3E://000298034800051. 

Finn, R.D. et al., 2014. Pfam: The protein families database. Nucleic Acids Research, 

42(D1). 

Flicek, P. et al., 2013. Ensembl 2013. Nucleic Acids Research, 41(D1). 

Helfmann, S. et al., 2011. The crystal structure of the C                    2A domain of 

otoferlin reveals an unconventional top loop region. Journal of Molecular 

Biology, 406(3), pp.479–490. Available at: 

http://dx.doi.org/10.1016/j.jmb.2010.12.031. 

Hui, E. et al., 2011. Mechanism and function of synaptotagmin‐mediated 

membrane apposition. Nat. Struct. Mol. Biol., 18(7), pp.813–821. Available at: 

http://dx.doi.org/10.1038/nsmb.2075. 

77 

 

Hui, E. et al., 2009. Synaptotagmin‐Mediated Bending of the Target Membrane Is 

a Critical Step in Ca2+‐Regulated Fusion. Cell, 138(4), pp.709–721. 

Inoue, M. et al., 2006. Expression of myoferlin in skeletal muscles of patients with 

dysferlinopathy. Tohoku Journal of Experimental Medicine, 209(2), pp.109–116. 

Jimenez, J.L. & Bashir, R., 2007. In silico functional and structural characterisation 

of ferlin proteins by mapping disease‐causing mutations and evolutionary 

information onto three‐dimensional models of their C2 domains. Journal of 

the Neurological Sciences, 260(1–2), pp.114–123. 

Johnson, C.P. & Chapman, E.R., 2010. Otoferlin is a calcium sensor that directly 

regulates SNARE‐mediated membrane fusion. Journal of Cell Biology, 191(1), 

pp.187–197. 

Kawahara, G. et al., 2011. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino 

knockdown. Biochemical and Biophysical Research Communications, 413(2), 

pp.358–363. 

Kerr, J.P., Ward, C.W. & Bloch, R.J., 2014. Dysferlin at transverse tubules 

regulates Ca2+ homeostasis in skeletal muscle. Frontiers in Physiology, 5 

MAR(March), pp.1–5. 

Kettleborough, R.N. et al., 2013. A systematic genome‐wide analysis of zebrafish 

protein‐coding gene function. Nature, 496(7446), pp.494–497. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23594742. 

Kettleborough, R.N.W. et al., 2011. High‐throughput target‐selected gene 

inactivation in zebrafish. Methods in Cell Biology, 104, pp.121–127. 

Kok, F.O. et al., 2015. Reverse genetic screening reveals poor correlation between 

morpholino‐induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental 

Cell, 32(1), pp.97–108. 

Lang, C.T. et al., 2009. Placental dysferlin expression is reduced in severe 

preeclampsia. Placenta, 30(8), pp.711–718. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19545895. 

78 

 

Larkin, M. et al., 2007. ClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics, 23(21), 

pp.2947–2948. 

Ledig, S., Röpke, A. & Wieacker, P., 2010. Copy number variants in premature 

ovarian failure and ovarian dysgenesis. Sexual Development, 4(4–5), pp.225–

232. 

Lek, A. et al., 2012. Ferlins: Regulators of Vesicle Fusion for Auditory 

Neurotransmission, Receptor Trafficking and Membrane Repair. Traffic, 

13(2), pp.185–194. 

Lek, A. et al., 2010. Phylogenetic analysis of ferlin genes reveals ancient 

eukaryotic origins. BMC Evolutionary Biology, 10, p.231. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2923515/pdf/1471‐2148‐10‐

231.pdf. 

Lenhart, K.C. et al., 2014. GRAF1 promotes ferlin‐dependent myoblast fusion. 

Developmental Biology, 393(2), pp.298–311. 

Leto, D. & Saltiel, A.R., 2012. Regulation of glucose transport by insulin: traffic 

control of GLUT4. Nature reviews. Molecular cell biology, 13(6), pp.383–96. 

Available at: 

http://www.nature.com.ep.fjernadgang.kb.dk/nrm/journal/v13/n6/full/nrm3

351.html. 

Leung, C. et al., 2013. Expression of myoferlin in human and murine carcinoma 

tumors: Role in membrane repair, cell proliferation, and tumorigenesis. 

American Journal of Pathology, 182(5), pp.1900–1909. 

Liu, J. et al., 1998. Dysferlin, a novel skeletal muscle gene, is mutated in Miyoshi 

myopathy and limb girdle muscular dystrophy. Nature genetics, 20(1), pp.31–

36. 

Marlin, S. et al., 2010. Temperature‐sensitive auditory neuropathy associated 

with an otoferlin mutation: Deafening fever! Biochemical and Biophysical 

Research Communications, 394(3), pp.737–742. Available at: 

http://dx.doi.org/10.1016/j.bbrc.2010.03.062. 

79 

 

Marty, N.J. et al., 2013. The C2 domains of otoferlin, dysferlin, and myoferlin 

alter the packing of lipid bilayers. Biochemistry, 52(33), pp.5585–5592. 

Moens, C.B. et al., 2008. Reverse genetics in zebrafish by TILLING. Briefings in 

Functional Genomics and Proteomics, 7(6), pp.454–459. 

de Morree, A. et al., 2013. Dysferlin regulates cell adhesion in human monocytes. 

Journal of Biological Chemistry, 288(20), pp.14147–14157. 

Padmanarayana, M. et al., 2014. Characterization of the lipid binding properties 

of otoferlin reveals specific interactions between PI(4,5)P2 and the C2C and 

C2F Domains. Biochemistry, 53(30), pp.5023–5033. 

Pang, Z.P. & S??dhof, T.C., 2010. Cell biology of Ca2+‐triggered exocytosis. 

Current Opinion in Cell Biology, 22(4), pp.496–505. 

Pesciotta, E.N. et al., 2014. Dysferlin and other non‐red cell proteins accumulate 

in the red cell membrane of Diamond‐Blackfan anemia patients. PLoS ONE, 

9(1), p.e85504. 

Petryszak, R. et al., 2016. Expression Atlas update‐an integrated database of gene 

and protein expression in humans, animals and plants. TL  ‐ 44. Nucleic acids 

research, 44 VN‐r(D1), p.52. Available at: 

http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkv1045. 

Posey, A.D. et al., 2014. EHD1 mediates vesicle trafficking required for normal 

muscle growth and transverse tubule development. Developmental Biology, 

387(2), pp.179–190. 

Posey, A.D. et al., 2011. Endocytic recycling proteins EHD1 and EHD2 interact 

with Fer‐1‐like‐5 (Fer1L5) and mediate myoblast fusion. Journal of Biological 

Chemistry, 286(9), pp.7379–7388. 

Redpath, G.M.I. et al., 2016. Ferlins Show Tissue‐Specific Expression and 

Segregate as Plasma Membrane/Late Endosomal or Trans‐Golgi/Recycling 

Ferlins. Traffic, 17(3), pp.245–266. Available at: 

http://doi.wiley.com/10.1111/tra.12370. 

80 

 

Robu, M.E. et al., 2007. P53 Activation By Knockdown Technologies. PLoS 

Genetics, 3(5), pp.787–801. 

Rochlin, K. et al., 2010. Myoblast fusion: When it takes more to make one. 

Developmental Biology, 341(1), pp.66–83. Available at: 

http://dx.doi.org/10.1016/j.ydbio.2009.10.024. 

Roux, I. et al., 2006. Otoferlin, Defective in a Human Deafness Form, Is Essential 

for Exocytosis at the Auditory Ribbon Synapse. Cell, 127(2), pp.277–289. 

Schulte‐Merker, S. & Stainier, D.Y.R., 2014. Out with the old, in with the new: 

reassessing morpholino knockdowns in light of genome editing technology. 

Development, 141, pp.3103–3104. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25100652. 

Sharma, A. et al., 2010. A new role for the muscle repair protein dysferlin in 

endothelial cell adhesion and angiogenesis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and 

Vascular Biology, 30(11), pp.2196–2204. 

Sollner, T. et al., 1993. A Protein Assembly‐Disassembly Pathway In Vitro That 

May Correspond to Sequential Steps of Synaptic Vesicle Docking , 

Activation , and Fusion. Cell, 75, pp.409–418. 

Song, D. et al., 2015. Myoferlin expression in non‐small cell lung cancer: 

Prognostic role and correlation with VEGFR‐2 expression. Oncology Letters, 

pp.998–1006. Available at: http://www.spandidos‐

publications.com/10.3892/ol.2015.3988. 

Staudt, D. & Stainier, D., 2011. Uncovering the Molecular and Cellular 

Mechanisms of Heart Development Using the Zebrafish. Annual Review of 

Genetics, 46(1), p.120913144909001. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22974299. 

Südhof, T.C., 2004. THE SYNAPTIC VESICLE CYCLE. Annual Review of 

Neuroscience, 27(1), pp.509–547. Available at: 

http://www.annualreviews.org/doi/10.1146/annurev.neuro.26.041002.131412. 

81 

 

Taylor, J.S. et al., 2003. Genome Duplication , a Trait Shared by 22 , 000 Species of 

Ray‐Finned Fish. Genome Research, (13), pp.382–390. 

Thisse, C. & Thisse, B., 2008. High‐resolution in situ hybridization to whole‐

mount zebrafish embryos. Nature Protocols, 3(1), pp.59–69. 

Turtoi, A. et al., 2013. Myoferlin is a key regulator of EGFR activity in breast 

cancer. Cancer Research, 73(17), pp.5438–5448. 

Uhlén, M. et al., 2015. Tissue‐based map of the human proteome. Science, 

347(6220), pp.1260419–1260419. Available at: 

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25613900. 

Varga, R. et al., 2003. Non‐syndromic recessive auditory neuropathy is the result 

of mutations in the otoferlin (OTOF) gene. Journal of medical genetics, 40(1), 

pp.45–50. 

Varga, R. et al., 2006. OTOF mutations revealed by genetic analysis of hearing 

loss families including a potential temperature sensitive auditory 

neuropathy allele. Journal of medical genetics, 43(August), pp.576–581. 

Volakis, L.I. et al., 2014. Loss of myoferlin redirects breast cancer cell motility 

towards collective migration. PLoS ONE, 9(2). 

Wang, M. et al., 2012. PaxDb, a Database of Protein Abundance Averages Across 

All Three Domains of Life. Molecular & Cellular Proteomics, 11(8), pp.492–500. 

Available at: http://www.mcponline.org/cgi/doi/10.1074/mcp.O111.014704. 

Wang, W.S. et al., 2013. ITRAQ‐based quantitative proteomics reveals myoferlin 

as a novel prognostic predictor in pancreatic adenocarcinoma. Journal of 

Proteomics, 91, pp.453–465. 

Wang, X.G. et al., 2007. The timing and extent of “juvenile ovary” phase are 

highly variable during zebrafish testis differentiation. Journal of Fish Biology, 

70(SUPPL. A), pp.33–44. 

Washington, N.L. & Ward, S., 2006. FER‐1 regulates Ca2+ ‐mediated membrane 

82 

 

fusion during C. elegans spermatogenesis. Journal of cell science, 119(Pt 12), 

pp.2552–62. Available at: http://jcs.biologists.org/content/119/12/2552.short. 

Wilson, C.A. et al., 2014. Wild sex in zebrafish: Loss of the natural sex determinant in 

domesticated strains, 

Wu, M.C. et al., 2010. Powerful SNP‐Set Analysis for Case‐Control Genome‐wide 

Association Studies. American Journal of Human Genetics, 86(6), pp.929–942. 

Xia, T. et al., 2015. Long noncoding RNA FER1L4 suppresses cancer cell growth 

by acting as a competing endogenous RNA and regulating PTEN 

expression. Scientific reports, 5(4), p.13445. Available at: 

/pmc/articles/PMC4549704/?report=abstract. 

Yamashita, T., 2012. Ca2+‐dependent regulation of synaptic vesicle endocytosis. 

Neuroscience Research, 73(1), pp.1–7. Available at: 

http://dx.doi.org/10.1016/j.neures.2012.02.012. 

Yu, C. et al., 2011. Myoferlin gene silencing decreases Tie‐2 expression in vitro 

and angiogenesis in vivo. Vascular Pharmacology, 55(1–3), pp.26–33. 

Yue, B. et al., 2015. Long non‐coding RNA Fer‐1‐like protein 4 suppresses 

oncogenesis and exhibits prognostic value by associating with miR‐106a‐5p 

in colon cancer. Cancer Science, 106(10), pp.1323–1332.