amplification of `variola virus-specific' sequences in german cowpox virus isolates

3
Institut fuÈr Mikrobiologie, SanitaÈtsakademie der Bundeswehr, MuÈnchen, Germany Ampli®cation of `Variola Virus-Speci®c' Sequences in German Cowpox Virus Isolates H. MEYER 1,3 , H. NEUBAUER 1 and M. PFEFFER 2 1 Institute of Microbiology, German Armed Forces Medical Academy, Neuherbergstrasse 11, 80937 Munich, 2 Institute for Medical Microbiology, Infectious and Epidemic Diseases, Veterinary Faculty, Ludwig Maximilians-University, Veterinaerstrasse 13, 80539 Munich, Germany; 3 Corresponding author: Tel.: 49±89±3168±3910, Fax: 49 89 31683292, e-mail: hermann.meyer @micro.vetmed.uni-muenchen.de With 1 ®gure and 1 table Received for publication October 17, 2001 Summary In 1995 a polymerase chain reaction PCR) protocol describing the speci®c detection of variola virus, the causative agent of smallpox, was published by Knight and others. Virulent variola major strains could be dierentiated from less virulent variola minor strains because of the distinct amplicon sizes. Here, we applied this PCR protocol to DNA from various orthopoxvirus isolates. There was no ampli®cation with the orthopoxvirus species vaccinia, monkeypox, mousepox, or camelpox viruses. However, ampli®cation was observed in six out of 15 cowpox virus strains investigated. The size of the amplicons correspon- ded exactly with the size described for variola minor strains and the nucleotide sequence identity accounted for 97%. Findings are discussed with respect to the evolution of orthopoxvirus species assuming that variola virus most probably stems from a rodent-transmitted cowpox virus-like progenitor. Introduction The genus Orthopoxvirus comprises morphologically and antigenically closely related viruses including several pathogens of human and animal importance Esposito and Massung, 1995). Four orthopoxvirus OPV) species, three of which are zoonotic, may infect humans. The most notorious member is variola virus, the causative agent of smallpox, which is a strictly human pathogen and which was declared eradicated by the World Health Organization WHO) in 1978. The second, monkeypox virus, is reported from the African tropical rainforest and is a zoonotic agent causing a smallpox-like disease in man. Cowpox virus is rodent-borne and endemic in most European and a few west Asian countries, where humans usually acquire localized skin lesions through contact with rodents, or more likely through an intermediate host, such as pet cats or cows. Finally, vaccinia virus, subspecies bualopox virus, is endemic in India and may cause localized skin lesions Esposito and Massung, 1995). With smallpox eradicated in 1978, WHO recommended either the destruction of national stocks or sending them to the two WHO Collaborating Centres in Atlanta and Moscow. The ®nal destruction of these stocks was proposed by WHO. However, in the late 1980s concerns were raised that clandestine stocks of smallpox could potentially be used in bioterrorism. According to a Russian ocial, Kanatjan Alibekov, the Russian military had developed weapons using the virus in a secret oensive biowarfare programme Alibekov, 1999). In 1999, the World Health Assembly postponed the destruction to permit further internationally approved research on antiviral drugs, improved vaccines and full genome sequencing for use in diagnostic assays. Many experts agree that the chance of smallpox appearing is minimal but the consequences of a reappearance would be disastrous for mankind. Therefore, unambigous diagnostic tests are needed to clearly identify variola virus and to dierentiate it from other species of the genus, in particular monkeypox virus, which can cause a smallpox-like disease. To this end, the application of molecular techniques oered many advantages when compared to the labour- and time-consuming phenotypic characterization of pock morphology on the chorioallantoic membrane of embryonated chicken eggs Esposito and Knight, 1985). There is also a high cross-reactivity in serological tests limiting a clear dierentiation of OPV species. Today, polymer- ase chain reaction PCR) technology is regarded as the method of choice and several PCR assays have been developed targeting single genes or parts of genes that exhibit degeneracy in their sequence. By using consensus primers and restriction cleavage of amplicons it is possible to dierentiate species. Assays have been described targeting the A-type inclusion ATI) protein gene Meyer et al., 1997), the haemagglutinin HA) gene Ropp et al., 1995; Meyer et al., 1998) and the cytokine response modi®er B crmB) gene Loparev et al., 2001). In 1995, a variola virus- speci®c PCR protocol was established by Knight and co- workers which targets sequences located in the right terminus Knight et al., 1995). Ampli®cation resulted in a single product for variola virus strains whereas other OPV species failed to amplify. Due to the size of the generated DNA fragment, alastrim variola minor strains, which are associated with a low case-fatality rate, could be dierentiated from the more virulent variola major strains amplicon sizes of 838 bp and 212 bp, respectively). Five years later, a comparison of the genomic sequence of variola minor strain Garcia-1966 with currently available OPV sequence data con®rmed that these sequences were indeed unique for variola viruses Shchelkunov et al., 2000). In this study results are described which were obtained by applying the variola virus-speci®c PCR protocol described above to DNA from various OPV isolates. Materials and Methods Thirty-®ve strains belonging to the OPV species cowpox virus CPXV), monkeypox virus MPXV), vaccinia virus VACV), U. S. Copyright Clearance Center Code Statement: 0931±1793/2002/4901±0017 $15.00/0 www.blackwell.de/synergy J. Vet. Med. B 49, 17±19 2002) Ó 2002 Blackwell Wissenschafts-Verlag, Berlin ISSN 0931±1793

Upload: h-meyer

Post on 06-Jul-2016

217 views

Category:

Documents


2 download

TRANSCRIPT

�������� ��� ��� �������� ������� ���������� �� ���������� �� ������ ������

���������� � ������ �������������� ��������� �� ������ ���� �����������

�� ��� !�"� �� #�$�%$� ! ��� � &'�''� (

!��������� �� ��� ������� ����� %��� '���� ������ %������� #���� �������� !!� )*+", ������ (��������� �������� ��� ������� ���������� ��� �-������ .�������� /������� '������� 0����� �1��������2$��3������ /�������������!"� )*4"+ ������ ������5 "6���-������ �����7 8���7 9+:)+:"!;):"+!*� '�17 9+ )+ "!;)"(+(� �2����7 �����������<�����3���������2�����������

=��� ! >��� ��� ! �� �� ����3�� �� -� �������� ?��� � !,� (**!

�������

�� !++4 � -�������� ����� ������� @&6 A -������ ����� ������ �-���>� ��������� �� 3����� 3���� ��� �������3� ����� ��

�����-�1� ��� -� ������ � B����� ��� ������ /������ 3�������C� ������ ����� � ��D��������� ��� ���� 3������ 3��������� ������ ������ �� ��� �������� ��-����� ��E��� ���� ��

�--���� ���� &6 -������ �� .#% ��� 3����� ����-�13������������ 8��� ��� �� ��-��>������ ���� ��� ����-�13����-����� 3�������� ������-�1� �����-�1� � �����-�1 3����������3�� ��-��>������ ��� � ��3�� �� ��1 ��� �� !4 ���-�1

3��� ������ ��3���������� 8�� ��E� �� ��� ��-������ ����-��2��� �1����� ���� ��� ��E� ����� �� �� 3����� ���� ������ ������ ���������� ��F����� �������� ��������� �� +,G� '�������

�� ��������� ���� ��-��� �� ��� �3������� �� ����-�13����-����� �������� ���� 3����� 3��� ���� -� � �� ����� ��� ������2���������� ���-�1 3���2���� -��������

��������

8�� ����� ����������� ���-���� ��-����������� ���

������������� ������� ������ 3����� ��������� ��3��� -���������� ����� ��� ������ ��-������ @��-����� ��� �������!++4A� '�� ����-�13��� @?&/A �-������ ���� �� ����� ��E�������� ��� ������ ������� 8�� ���� �������� ��� � ��

3����� 3���� ��� �������3� ����� �� �����-�1� ����� �� � ������������ -������� ��� ����� ��� ������� ��������� � ���=��� ������ ?����E����� @=�?A �� !+,)� 8�� �������

������-�1 3���� �� �-���� ��� ��� %����� ��-������������ ��� �� � E������� ����� ������� � �����-�12����������� �� ���� 6��-�1 3��� �� �����2 ��� ��� ������� ��

���� ���-��� ��� � ��� ���� %���� ��������� ���� ������������� ��F��� ������E�� ���� ������� ������ ������� ����������� � ��� ������ ������ �� ����������� ����� ���� ��-�� ���� � ����� '������� 3������� 3���� �� �-����� �D���-�1

3���� �� ������� �� ����� ��� ��� ����� ������E�� ���� �������@��-����� ��� ������� !++4A�=��� �����-�1 ��������� �� !+,)�=�?���������� �����

��� ���������� �� �������� ������ � ������� ���� �� ��� ���=�? 6���� ������ 6����� �� %������ ��������� 8�� >������������� �� ����� ������ ��� -�-���� �=�?�����3�� ��

��� ���� !+)*� ������� ��� ����� ���� ����������� ������ �������-�1 ����� -���������� � ���� �� ��������� %��������� � ������ �H����� B����C�� %�� ���3� ��� ������ �������

��� ��3���-�� ���-��� ����� ��� 3��� �� � ����� �D����3� ������� -������ @%�� ���3� !+++A� �� !+++� ��� =���

������ %���� �� -���-���� ��� ���������� �� -���� �����

�������������� �--�3�� ������ �� ����3��� ����� ��-�3��3������� ��� ���� ������ ��F������� �� ��� �� ���������� ���������� �1-��� ���� ���� ��� ������ �� �����-�1 �--����� ��������� �� ��� �����F������ �� � ��--������ ����� �

��������� ���������� 8������� ���� ����� ���������� ������� ������ �� ������ �������� 3����� 3��� ��� �� ��D�������� ����� ���� �-����� �� ��� ������ �� -������� ������-�1 3����

����� ��� ����� � �����-�12���� �������� 8� ���� ���� ����--�������� �� �������� ������F��� �D��� ���� ��3����������� ���-��� �� ��� �� ��2 ��� ����2��������� -������-��

��������E����� �� -��� ��-������ �� ��� ����������������� ��� �� �� ������� ������� ���� @��-����� ��� B������!+)4A� 8��� �� ���� � ���� ����2�����3��� �� ���������� ������������� � ���� ��D���������� �� ?&/ �-������ 8����� -�����2

��� ����� ������� @&6 A ���������� �� ������ �� ��� �������� ������ ��� ��3��� &6 ������ ��3� ��� ��3���-�� �������������� ����� � -��� �� ����� ���� �1�� �� ��������� �� ����

��F������ ������� ��������� -���� ��� ��������� ����3��� ����-������ �� �� -���� �� �� ��D�������� �-������ %����� ��3� �������� �� �������� ��� %2��-� ��������� @%8�A -����� ����

@��� �� ���� !++,A� ��� �������������� @�%A ���� @ �-- �� ����!++45 ��� �� ���� !++)A ��� ��� �������� ��-���� ����>� �@���A ���� @0�-��3 �� ���� (**!A� �� !++4� � 3����� 3���2

�-���>� &6 -������ ��� ���� ������ � B����� ��� ��2����� ����� ������ ��F������ ������� �� ��� ���� �������@B����� �� ���� !++4A� %�-��>������ ������� �� � ������ -������� 3����� 3��� ������ ������ ���� ?&/ �-����� ������ ��

��-����� .�� �� ��� ��E� �� ��� �������� .#% ��������������� 3����� ���� ������� ����� �� ���������� ���� � �������2�������� ���� ����� � ��D��������� ��� ��� ��� 3������

3����� ��C� ������ @��-����� ��E�� �� )") - ��� (!( -���-����3���A� '�3� ���� ����� � ���-����� �� ��� ���������F����� �� 3����� ���� ����� �����2!+;; ���� �������

�3���� �� ?&/ ��F����� ���� ���>��� ���� ����� ��F��������� ������ ���F�� �� 3����� 3����� @����������3 �� ����(***A��� ���� ����� ������ �� ����� �� ����� ��� � ������ �

�--����� ��� 3����� 3���2�-���>� &6 -������ ����� ��� �3� �� .#% ��� 3����� ?&/ ���������

�������� ��� �����

8����2>3� ������ �������� �� ��� ?&/ �-����� ���-�1 3���@6&I/A� ������-�1 3��� @&I/A� 3������� 3��� @/%6/A�

$� �� 6�-����� 6������� 6���� 6��� ���������7 *+"!:!,+"J(**(J9+*!:**!, K!4�**J* ���� �����������J������

L� /��� ��� � !" !,:!+ @(**(A

� (**( ��������� =������������2/����� �����

���# *+"!:!,+"

'��� !� ������ �� � 3����� 3���2�-���>� &6 ����� �--���� �� 3�2���� ����-�13��� ��������� @�A0��� !� !2� - ����� ��E� ����@�� ��2� 0� ����������� ��2����A5 ���� (:;� ���-�1 3���?&/ )+J!� ?&/ +*J!� ?&/ +!J!��������� ?&/ )+J"5 ����� , ��� )�3������� 3��� ������ ��� /%�@ A 0���� ! ��� (� �����-�1 3���&2! ��� &2(5 ����� " ��� 9������-�1 3��� 6&2! ��� 6&2!95����� 4 ��� ;� ������-�1 3���6�-������� ��� M���5 ���� ,�������3� ������ @�� .#% ���2-���� �� ��� ������� ��1A5 ���� )�!2� -2����� ��E� ���� @�� ��2� 0� ����������� ������A�

8� �� !� ?���-�1 3����� ���� �� ���� ����� ��� ������ �� ��-��>������ �� � 3����� 3���2�-���>� -�������� ����� ������� �����

?���-�13��� �-�������� ����������� �������� ��� ��� ?���� ������N ������ %�-��>������N

6&I/ ������� ��� !+"+ $����� B������ ((( � - ������3�6&I/ �&2( ���-���� !+," %�� ���� �� (() � - )9* -6&I/ ?&/ )+J! ��� !+)+ �������� �� ((+ � - )9* -6&I/ ?&/ )+J" ��� !+)+ 6���� �� ((" � - ������3�6&I/ ?&/ )+J9 ��� !+)+ #�������� �� (!) � - ������3�6&I/ ?&/ )+J4 ��� !+)+ $��� �� (() � - )9* -6&I/ �&24 ���-���� !+)+ ����� �� ((* � - ������3�6&I/ ?&/ +*J! ��� !++* .����������� �� ((+ � - )9* -6&I/ ?&/ +!J! ��� !++! 0���� ��� �� ((+ � - )9* -6&I/ ?&/ +!J" ��� !++! ������ �� (() - )9* -6&I/ ?&/ +)J! ��� !++) 0�������� �� #. ������3�6&I/ ?&/ +)J( ��� !++) ��������� �� #. ������3�6&I/ ?&/ +)J" ��� !++) ������������ �� #. ������3�6&I/ ?&/ +)J9 ��� !++) ��� �������� �� #. ������3�6&I/ ?&/ +)J4 ���� !++) �� ����� �� #. ������3�/%6/ ������ ������� $������ (** � - ������3�/%6/ /% ������� $������ !,) � - ������3�/%6/ = ������� $������ (** � - ������3�/%6/ � ��-�1 � �� !+9! $����� #. ������3�/%6/ �&2! �D��� !+,! ����� #. ������3�&I/ 6�-������� ������ !+4) 6�-�������� .B #. ������3�&I/ M��� ��� !++, . 6 #. ������3�&I/ �' O( ��� (**! . 6 #. ������3�&I/ �' O; ��� (**! . 6 #. ������3�&I/ %&24 ������ !+4+ $�% #. ������3��68/ &2! ����� !+)" ������ �� #. ������3��68/ &2( ����� ������ �� #. ������3��68/ &2" ����� .�� �������� �� #. ������3��68/ �����1 ��1 !++( 6E��� �-� ��� #. ������3��68/ ""((! ����� !++4 $�% #. ������3�60/ 6&2! ����� !+,( ��� (*( � - ������3�60/ �������� ����� �������� #. ������3�60/ (+)J( ����� .� ��� $%� #. ������3�60/ 6&2!9 ����� !++" .� ��� $%� #. ������3�60/ 6&2!4 ����� !++" .� ��� $%� #. ������3�

6&I/� ���-�1 3���5 /%6/� 3������� 3���5 &I/� ������-�1 3���5 �68/� ��������� 3���5 60/� �����-�1 3����N��������� ������� �5 �� ��� ���������5 ��� ������� .B� .�����5 . 6� .�������� �-� ��� �� 6����5 $%�� $����� %� ��������

!) �� ��� �� ���

�����-�1 3��� @60/A � ��������� 3��� @�68/A �����3��������� @#�� ��� �� ���� !++)5 ��� �� ���� !+++5 &��D��� ���� !++;� !+++A� 8� �� ! ������E�� ���� ������������

����� ��� ��� �� ���������� /��� .#% ��� -�-��� ���-��>�� 3����� �� -�3������ ����� �� @��� �� ���� !++)A�&6 ��� -������ �������� �� B����� �� ��� @!++4A ����

���� ���� ����>�������� ���P�� &6 -������ ��� ��-��2>�� �� � ����� ������� 3����� �� 4* �� ���������� ! �� ��.#%� (** � �� ���� �#8&� !�* � �� ��� -����

/% 2 @4�2��%868%%88�8�%6�8�%�2"�A ��� /% 20 @4�26�886�888%68866�862"�A� (�4 $ �� -��������@ ����� �������� ������A ��� !� ������� �D�@!4* � B6�� !* � 8��:�6�� -� )�"� ��� (�(4 �

�6�(A� ������� ��1�� ��� �� C����� �� "* ������ ����-��>������� ���� ����� �������� �� +9�6 �� ! ���� 4"�6�� ! ���� ��� ,(�6 �� ! ��� @��� ��������� ���-����� ������ ��� ������� -������ ��� 44�6A� %�-��>�� �������� ���3������E�� � ��� ������-������ @'��� !A� 8�� ������������F����� �� �������� ��-������ ��� ��������� ��� ���-���

����� �������� �3���� �� ��F����� ���� �� ��������

#����� ��� $��������

=� �-�� �� ���� � ������ ���� � &6 -������ ����������������� �� ��� �-���>� ��������� ��� ��D���������� �� 3�����3��� ���������� @B����� �� ���� !++4A� %������� �� ��� ���������-��>������ ������� �� � ������ &6 -����� �� ��������� ��

� ����� �� !( 3����� 3��� ������� '�������� ��� ��-����� ��E���� ��D���� ����� ������� 3����� ���� 3��� ��������@)") -A ��� 3����� ��C� �������� @(!( -A� �� ��� ��

�������� ��� �-���>���� �� ��� ����� �� ���� ��� �� �� ��������?&/ ���� ������ �� /%6/������ ����� ���� ���������� ��� ?&/ �-����� &I/� �68/� � 6&I/ ��� ���������

����3�� �� ��-��>������ -����� ��� ����� �� �� ��3������2���� �� �������� ��� ��� � �� ������ ������ ��� ���>������� �� ��-��>������ ��� ���� ���� >3� ������ �������� �� ���

�-����� /%6/� �68/� 60/� � &I/� ����3�� �� ��1 ����� !4 6&I/ ������ ��� Q3����� 3���2�-���>�R &6 ������� ���� ��-����� � ��� )9* - �� ��E�� �������� �� ��� ��-������ ������������ � ��F������� ��� ���-����� ���� �3���� ��

��F����� ���� @���� ��� �����A� %�� ��1 ��-������ ��� ����������� ��F����� �������� �� +,G �� �� )**2 - ������� �������-��� �� ��� ����-������ ��F����� �� 3����� ���� 3���

����� �����2!+;;� 8��� ��� �� �������� �� ��� ���� ?&/��F����� ���� ��-������ �� ������� ��� �� �������� ��� �� �� ��� �������� �� ��� ������� @����������3 �� ���� (***A� ��

������ � ������� ���� ����� ��1 ������ �� ������ ���-�13����� ���� �� ����� -������-�� @���������� -�����-������ �� � !;*2�.� %8� -�����A � ������-�� �����@������ ��E�� -������� ��-�A� =��� ���-��� �� ���� 6&I/

����� ������ ��3� � �����>������ ���� 3��� ������ �� ������@� ��� ((, � - �� ���-��� �� ((* � - �� ��� ������� ������������A ��� ��� ���� � ���F�� 92� -������ �������� �����

������ �� �� ���E� ���� ���� 6&I/ �������� @��� �� ����!+++A� '�������� ��� ������ ��� ��� �������� �� ����������������6��������� ���� !4������6&I/��� ��������� ����

!" ��-���� ���-� ���� �� ��������� ��E��� ������� ������-�����-���� @#����� �� ���� !++(A� ��� ������ ������� ������� ?&/ �-����� 6&I/ �������� �� � ���� 3����� �� ������

����� ����-�������� ��� �3��3�� ���� ���� ����� ����� �������-������� ��>��� ���3���� ?� >����� ���� ������6&I/ �������� ������� ��F������ ��������� �� � 3�����

3���2�-���>� ����� -���� �� � ������ ������� �� ��� 3����-������ '���� �3������ �� ���� �� ��� ���� ���� 6&I/ ��3� �������� ��E� �� � ��� ((* � -� �����>������ ���� ���� �����2

-�1 @!); � -A� 3������� @� ��� (** � -A� �����-�1 @(*( � -A �������-�1 3��� @!+( � -5 ����������3� -������ �������2������A @��-����� ���B������ !+)4A� �� �� ������� ���� �����-�1

������ � ��� 4*** ���� ���� -���� �� � �����23����������������� �� � ���-�12���� 3��� �� � ���� ��������� �����-�-�������� ����3�� �������� ���-����3� ������� �� ���

������� �������� �� ��D���� ?&/� �� ������ �� � ���������������� �� ��� -����������� �������� �� ��� ���������-�13����

��%�����&�����

8�� ������ ����� � =���� ��� �� M����� �� �1������� ������������ �� ����� ��--���

#���������

%�� ���3� B�� !+++7 �����E��� ����� ����� ��� #�� ���5 !:"!+�

��-������ L� L�� ��� L� 6� B������ !+)47 ?���-�13��� .#%7

6��-����� �� ��������� -�>��� ��� ��-�� /������ ' (" ("*:(4!�

��-������ L� L�� ��� � '�������� !++47 &�13��� ���������� �� �������

��7 @����� ��6���������� ����������� &� �� '�8���3���� L�

������%� &������ ��� ��� ������� ���A� ;�� ���� --� !!"!:!!")�

%������ ������� �� ��� ������� =���������� .� 6�

B������ L� 6�� � '� ������� ��� L� L� ��-������ !++47 &��������

����� ������� ������>������ ��� ��D���������� �� 3����� 3���

��C� ��� ���� ������� ��7 @.�������� �� ����� /����� �

&�������� 6���� ������� 8���������� ������ ��� ��� �� .����

���A� (�� ���� --� (+,:"*(� �-����2/����� ������

0�-��3� /� #�� � '� ������� L� L� ��-������ ��� �� ���� (**!7

.�������� ��� ��D���������� �� ��� ���� ����-�13�����7 �����2

���� ������� ������ -�����-���� �� ��� ��� ���� ������ L� 6����

��� ���� (!" +9:!**�

���� ��� �� 0� �--� ��� L� L� ��-������ !++,7 ���� �� %2��-�

��������� ��� -����� �� ������ �� � -�������� ����� ������� �����

�� ��D�������� ����-�13������ L� /���� ������ ) " (!,:((!�

���� ��� �� 0� �--� ��� L� L� ��-������ !++)7 &�13������ ��7

���-������� L� �� ��� %� =����� @���A� ������ �� �������

�������� /��� !(7 .��������� /������ &�������� --� !++:(!!�

������ &��� ����� 8������ #L�

���� ��� 6� ������ �� ������ ��� � &��D�� !+++7 6�������2

E����� �� ����-�13����� �������� ��� ��� ��� ������� ��

������� %��� /���� ' " 9+!:4*!�

#������ L�� .� ��1 �� � �������� � � �������� ��� 6� L� ��������

!++(7 6�������E����� �� ����-�13����� �������� ��� ������

���������� �� ������� %��� /���� '*+" (;!:(,(�

#�� ���� ��� $� ������� �� �--� L� L� ��-������ �� =���� ��� ��

���� !++)7 �-���>� ��������� �� ������-�1 3��� � -��������

����� �������� L� /���� ������ , " (*!:(*,�

&��D�� �� �� ���� $� =����� ��� ?�2 � B������ !++;7

6��-����� �� �����-�1 3����� �������� �� .� ��� /��� ��� ����

!" !"4:!9;�

&��D�� �� �� ����� ��� �� ���� !+++7 B��-�����3��� ��

.����������7 ���� %������ 3�� 4 '�� ���� ��� ��� L�� !++)� ������

�� ����� 8���� E������ =����������� ''*" ""9:"")�

�--� �� 0�� S� L��� L� 6� B������ � '� ������� ��� L� L� ��-������

!++47 &�������� ����� ������� ������� �� ������>������ ���

��D���������� �� �����-�1 ��� ���� ����-�13������ L� 6����

��� ���� (*" (*;+:(*,;�

����������3� �� #�� %� /� 8�������� /� #� 0�-��3� &� '� ������3�

/� /� �����3� /� �� 6��E����3� L� 6� B������ L� � &������ � '�

������� ��� L� L� ��-������ (***7 %������ �����-�1 3����� ����

3��� ������ .#% ��F������� /������ *))" ";!:");�

/����� /���2�-���>� ��F������ �� 6��-�1 /��� �������� !+