zur reduzierbarkeit der vitamin b -arten durch...

This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

CORRINOIDREDUKTION DURCH CO 1175

This investigation was supported by the Scientific Research Found from the Ministry of Education of Japan.

We want to thank Prof. S. ONO, the University of Osaka Prefecture, and his coworkers for the use of the stopped-flow apparatus. Thanks are also due to Dr. S. NAKAMURA for his stimulating and helpful dis-cussions.

1 K. YANO, N. HIGASHI, and K. ARIMA, Biochem. biophysic. Res. Commun. 34, 1 [1969].

2 N. HIGASHI, H. SHOUN, K. YANO, and K. ARIMA, Agr. Biol. Chem. 36, (6), 1081 [1972].

3 K. YANO, N. HIGASHI, S. NAKAMURA, and K. ARIMA, Bio-chem. biophysic. Res. Commun. 34, 277 [1969] .

4 S. NAKAMURA, Y. OGURA, K. YANO, N. HIGASHI, and K. ARIMA, Biochemistry 9, 3235 [1969].

5 N. HIGASHI, S. NAKAMURA, K. YANO, and K. ARIMA, Agr. Biol. Chem. 3 4 , 9 6 4 [1970].

6 S. NAKAMURA, Y. OGURA, K. YANO, N. HIGASHI, and K. ARIMA, "Flavins and Flavoproteins" (third International Symposium, ed. by H. KAMIN), University Park Press Butterworths.

7 N. HIGASHI, H. SHOUN, K. HIROMI, K. YANO, and K. ARIMA, J. Biochem. 67, 749 [1970].

8 K. HIROMI, S. ONO, S. ITOH, and T. NAGAMURA, J. Bio-chem. 64, 897 [1968] .

9 K. HIROMI, Bunkö Kenkyü (in Japanese) 19, 321 [1970]. 10 M. EIGEN and L. DE MAYER, Techniques of Organic Che-

mistry, ed. by A. WEISSBERGER et al., V o l . I l l , part two, p. 895, Interscience Publishers, New York 1963.

11 K. HIROMI and N. HIGASHI, "Flavoenzymes", ed. by K. YAGI and T. YAMANO, in Japanese, Asakura shoten (To-kyo) , in press.

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Zur Reduzierbarkeit der Vitamin B12-Arten durch Kohlenmonoxid About the Reduction of the B12-vitamins by Carbon Monoxide

MATTHÄUS MOSKOPHIDIS u n d WILHELM FRIEDRICH

unter Mitarbeit von CHRISTA-MARIA POHL

Physiologisch-Chemisches Institut der Universität Hamburg

(Z. Naturforsch. 27 b, 1175—1182 [1972] ; eingegangen am 23. Mai/10. Juli 1972)

Vitamin B1 2 , carbon monoxide, absorption spectra, reduction

The reduction by CO of diaquo-cobinamide, diaquo-cobyric acid and several complete aquo-corrinoids in aqueous solutions was studied. Aquo-cobalamin-lactam and all the other corrinoids under study were reduced to (Coll). At 37 ° C the reaction is about two to three times faster than at 22 °C, and it is inhibited by benzimidazole and (more strongly) by histidine. CO is a better reductans for diaquo-cobinamide and diaquo-cobyric acid than for the complete corrinoids. Cor-rinoids with a purine base are more quickly reduced than those with a benzimidazole base. The experiments show that the reaction of CO with corrinoids is inhibited or delayed by those trans ligands, which are strong electron donors.

Die Reaktion der Vertreter des Vitamins B12 mit CO ist beeinflußbar durch a) Strukturmerkmale des Substrates (Wertigkeit des Kobaltatoms; Struktur der Axialliganden; Beschaffenheit des Corrinringes), b) Lösungsmittel (Alkohole bzw. Wasser; pH; in Wasser gelöste potentielle Ligandmoleküle) und c) Temperatur. Die Reaktion läuft nach dem Schema (1) ab:

(Co)+ + X O " + CO (Co), X = H oder ein Alkyl. (1)

Sonderdrudeanforderungen an Prof. Dr. W . FRIEDRICH, Universitäts-Krankenhaus Eppendorf, Physiolog.-Chem. In-stitut d. Univ., D-2000 Hamburg 20, Martinistr. 52.

In Alkoholen (vor allem in Methanol) als Lösungs-mittel bildet sich ein stabiles Produkt, das Alkoxy-carbonyl-corrinoid (Schema 1, X = Alkyl)1,2. (Co) steht hier zumeist für komplette (nucleotidhaltige) Aquo-corrinoide bzw. für inkomplette Diaquo-cor-rinoide, obwohl unter gewissen Bedingungen auch Cyano-corrinoide reagieren können 2.

Die Tatsache, daß B12-Arten in der Lactam-Form 3

unter gewissen Bedingungen schlechter als native B12-Arten mit CO und Methanol reagieren112, dürfte auf sterische Einflüsse (Sperrigkeit der Methoxycarbonyl-Gruppe) zurückzuführen sein. Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, daß in höhermolekularen Alkoholen die Reaktionsausbeute

1 1 7 6 M. MOSKOPHIDIS UND W. FRIEDRICH

(Schema 1) entsprechend geringer ist und daß in sec. Alkoholen praktisch keine Reaktion abläuft1.

In Wasser als Lösungsmittel bildet sich wahr-scheinlich das Carboxy-corrinoid (Schema 1, X = H) als labiles Zwischenprodukt, welches rasch zerfällt unter Bildung von (Co11), C02 und H+ 4. Da aller-dings 2 Mol (Co11) je Mol CO gebildet werden4, dürfte primär — im Sinne einer Heterolyse der Co — C-Bindung — (Co1) entstehen, welches dann nach der Gleichung: (Co1) + (Com) -> 2 (Co11) reagiert.

Gegenstand dieser Mitteilung ist die Reduzierbar-keit einer Anzahl kompletter und inkompletter B12-Arten durch CO in wäßrigem alkoholfreiem Milieu und die Abhängigkeit der Reduzierbarkeit von Li-gandenart und Temperatur.

Ergebnisse und Diskussion

Einfluß des Lactam-Ringes und der Wertigkeit des Kobaltatoms

Die beobachtete Resistenz des nicht-selbstreduzie-renden Aquo-cobalamin-Lactam gegenüber CO in Wasser5'6 führte zu der Annahme5'6, daß nur (Co11) zur Reaktion mit CO bereit ist. Diese An-nahme war nicht konform mit Versuchen *> 2' 4' 7 an anderen B12-Arten, auch in Methanol1' 2, die für (Co111) als Reaktionspartner sprachen. Wir wieder-holten die Versuche 5' 6 mit Aquo-cobalamin-Lactam und CO in Wasser sowie in 0,05 M Phosphatpuffer (pH 5,4) bei ca. 20 °C und fanden, abweichend von 1. c. 5' 6, daß dieses Corrinoid etwa gleich schnell und mit etwa gleicher Ausbeute reduziert wird wie Aquo-cobalamin (Abb. 1 a). Aquo-cobalamin-Lactam ist nicht-selbstreduzierend5'6 und kann somit nur als (Co111) mit CO reagieren.

Abb. 1 a.

Abb. 1 c.

Abb. 1 d.

Einfluß der Axialliganden und der Temperatur

Wir untersuchten den Einfluß folgender Ligand-moleküle bzw. Ligandionen: Wasser, Histidin, Benz-imidazol, 5.6-Dimethylbenzimidazol (im Aquo-cobalamin), 5-Hydroxybenzimidazol (im Aquo-fak-

Cobalamin

_J i 1 350 400 450

Abb. 1 b.

_J I 500 550

X [nm]

CORRINOIDREDUKTION DURCH CO 1177

500 5SO 600 X [nm]

Abb. 1 e.

Abb. 1 f.

Abb. l a — l f . Absorptionsspektren von verschiedenen kom-pletten Aquo-B12-Arten ( l a — l e ) und von Diaquo-cobin-amid (1 f) sowie den durch die Einwirkung von CO während 15 min dargestellten Co^-Formen. 1 a —1 c: Aquo-cobalamin-Lactam, Aquo-cobalamin und Aquo-faktor III in Wasser ( ), nach Durchleiten von CO in Wasser ( ) und nach Durchleiten von CO in 0,05 N HCl (••••)• 1 D UND 1 e :

Aquo-2-methylmercaptoadenyl-cobamid und Aquo-pseudovit-amin B12 in Wasser ( ), nach Durchleiten von CO in Wasser ( —) und nach Durchleiten von CO in 0,01 N HCl. 1 f : Diaquo-cobinamid in Wasser ( ), nach Durch-leiten von CO in Wasser ( ) und nach anschließendem Durchleiten von 0 2 in Gegenwart von KCN (•••*)• Benützte Spektrometer: Spectromic 505, Bausch u. Lomb; Beckman,

DU.

tor III), Adenin (im Aquo-pseudovitamin B12), 2-Methyladenin (im Aquo-faktor A), 2-Methylmer-captoadenin (im Aquo-2-methylmercaptoadenyl-cobamid), ferner CN"" und CH3~. Die meisten der untersuchten B12-Arten lassen sich mit CO zu (Co11) 7a reduzieren. Die Absorptionsspektren der so dargestellten Con-ormen der kompletten B12-Arten in Wasser (pH 6 - 7 ) und in 0,01 N bzw. 0,05 N HCl (Abb. 1 a — 1 e und Tab. 1) unterscheiden sich

praktisch nur im Wellenlängenbereich < 320 nm. Die Unterschiede dürften fast ausschließlich auf die Protonierung der Base zurückzuführen sein7b. Die Spektren ähneln, vor allem im längerwelligen Be-reich, dem Spektrum des Cobinamid,. (Abb. 1 f und Tab. I).

Da die Base im freien a-Ribazol (dem Nucleosid des Vitamins B12) den pK-Wert von 4,7 8 und im B12r den pK-Wert von ca. 3 9 '1 0 hat, ist sie im Bi2r bei pH > 3 an das Kobaltatom koordiniert. Die Koordination ist jedoch — entsprechend der gerin-gen Differenz der pK-Werte von a-Ribazol und Bj2r — relativ schwach und wirkt sich auf das Ab-sorptionsspektrum des (Co11) nur wenig aus: die Lage der langwelligen Bande (hier 472 nm) ist un-abhängig von der Koordination. Bei den Com-B12-Arten ist dagegen die Protonierung der Nucleotid-base, verbunden mit der Spaltung der koordinativen Bindung, stets mit einer markanten kürzerwelligen Bandenverschiebung verknüpft7c' n , weitgehend un-abhängig vom pK-Wert des Gleichgewichtes:

(Col") (Colli)

pK = — 2,4 bis + 3,521 H N + ir - — = - N+

/ x y \ Aquo-pseudovitamin B12 und Aquo-faktor A

haben in ihrer Con-Form erwartungsgemäß fast identische Absorptionsspektren (Tab. I). Ob bei den reduzierten Purin-B12-Arten in irgendwelchem pH-Bereich die Base koordiniert ist, ist aus den Ab-sorptionsspektren nicht ersichtlich. Da die CoTI-B12-Arten in bezug auf die Elektronendichte im Chromo-phor den Com-B12-Arten mit der Co — C-Bindung ähneln9-12, wäre zu erwarten, daß im Pseudovit. B12r die Nucleotidbase nicht koordiniert, ähnlich wie dies beim Adenosyl-pseudovitamin B12 der Fall ist11. Allerdings deuten die ESR-Spektren der Co11-Derivate von Pseudovit. B12, 2-Methylmercapto-adenyl-cobamid und Faktor III (alle durch kataly-tische Hydrierung hergestellt) darauf hin, daß hier die Base koordiniert13. Ferner führt bei den Purin-B12-Arten die Protonierung der Nucleotidbase nicht unbedingt zur Spaltung der koordinativen Bin-dung 14.

Die untersuchten B12-Arten lassen sich in drei Gruppen einteilen, abhängig von der Art der Axial-liganden:

Gruppe I, Cobalamine. Unterer Ligand 14a: stets 5.6-Dimethylbenzimidazol, kovalent (über Ribose und Phosphorsäure) gebunden; oberer Ligand: H20

1178 M. MOSKOPHIDIS UND W. FRIEDRICH

Tab. I. Absorptionsmaxima der untersuchten Aquo-corrinoide und ihrer mittels CO dargestellten CoH-Formen.

B12-Art (CoIH) Amax (nm) B12-Art (Coli) ^max (nm) in H , 0 in H , 0 in 0,05 N HCl *

bzw. in 0,01 N HCl **

Aquo-cobalamin 274 Bl2r 265 267 351 288 274 407 312 285 497 403 315 526 473 472

Aquo-fakt. III 274 Fakt. IIIr 301 (Sch.) 267 351 312 296 407 403 315 497 473 472 521

Aquo-cobalamin- 274 Bi2r-Lactam 288 Lactam 351

407 498 527

313 403 473

Diaquo-cobinamid 270 350 407 (Sch.) 496 520

Cobinamidr 267 315 472

Aquo-pseudo- 273 Pseudo-vit. Bi2r 267 269 vit. B12 351 312 315 vit. B12

406 498 521

403 472

472

Aquo-fakt. A 274 Fakt. A r 269 271 351 312 315 406 403 472 497 472 521

Aquo-2-methyl- 273 (Sch.) 2-Methylmercapto- 263 244 mercaptoadenyl- 351 adenylcobamidr 300 (Sch.) 267 (Sch.) cobamid 406 312 296

498 403 315 (Sch.) 523 472 472

Bei den Benzimidazol-B12-Arten. **Bei den Purin-B1 2-Arten.

bzw. OH-, Benzimidazol, Histidin, CN- oder CH3~ Gruppe II, Aquo-cobamide. Unterer Ligand (ko

valent gebunden) : Adenin (im Aquo-pseudovit B12), 2-Methyladenin (im Aquo-faktor A), 2-Me thylmercaptoadenin (im Aquo-2-methylmercapto adenyl-cobamid), 5.6-Dimethylbenzimidazol (im Aquo-cobalamin) und 5-Hydroxybenzimidazol (im Aquo-faktor III); oberer Ligand: stets H20 bzw. OH".

Gruppe III, Diaquo-cobinamid bzw. Diaquo-cobyrsäure in Gegenwart potentieller Ligandmole-küle bzw. Ligandionen wie Benzimidazol, Histidin oder CN".

Cyano-cobalamin (Gruppe I, oberer Ligand: CN-) reagiert nicht mit CO in Wasser 4 '15 . Dies ist verständlich, da in diesem Corrinoid die beiden

Axialliganden relativ fest gebunden sind. Ähnlich läßt sich die Resistenz des Methyl-cobalamins gegen-über CO begründen; hier wirkt CO nur als Stimula-tor der Isomerisierungsreaktion: Methyl-cobalamin a ^ Methyl-cobalamin b (es wirkt vermutlich in-direkt, über Aquo-cobalamin, welches in Spuren das CH3 — B12 begleitet), zur nachweisbaren Bildung von (Co11) kommt es jedoch nicht16. Aquo-cobalamin reagiert mit CO relativ rasch4-6'15. Die pH-Abhängigkeit dieser Reaktion wurde gründlich untersucht4' 6. Die Reaktionsgeschwindigkeit hat ein Maximum bei pH ca. 6 4' 6, welches wahrscheinlich teilweise auf die Umwandlung des H20-Liganden zum OH--Liganden (H20 ^ OH- + H+, pK = 7,5 17) zurückzuführen ist. Höchstwahrscheinlich reagiert CO nur mit Aquo-cobalamin, nicht jedoch mit Hy-

CORRINOIDREDUKTION DURCH CO 1 1 7 9

droxo-cobalamin, ähnlich wie dies beim Imidazol der Fall ist. Die Reaktionsgeschwindigkeit der Ko-ordination von Imidazol und Aquo-cobalamin zeich-net sich durch ein Maximum bei pH ca. 7,5 aus, welches einerseits durch die Protonierung des Imi-dazols, andererseits durch die Dissoziation des Was-serliganden verursacht wird 18. Benzimidazol beein-flußt die Reaktion des Aquo-cobalamins mit CO auch bei 100-fachem molarem Überschuß nicht, woraus geschlossen werden kann, daß es praktisch nicht koordiniert. Es ist nicht bekannt, ob hier die Nicht-Koordinierbarkeit des Benzimidazols das Er-gebnis des Transeffektes des unteren Liganden (des kovalent und koordinativ gebundenen 5.6-Dimethyl-benzimidazols) ist oder ob Benzimidazol generell nicht als oberer Ligand in Frage kommt. Aus dem Ablauf der Reduktion von Aquo-cobalamin mit CO in Gegenwart von Histidin (Abb. 2 a) ist ersichtlich, daß diese Aminosäre gebunden wird (Bindung als oberer Ligand; bereits 2 Mol Histidin/Mol Aquo-

8 9 [Stdn] —

Abb. 2 a.

Abb. 2 b.

4 5 5 [Stdn]

Abb. 2 e.

Abb. 2 d. i.ooo F 1 1 1 1 r"

7 8 [Stdn]

Abb. 2 f.

0.600

1.000

I I 0,800

Lü

0.600

0.400

0,200

[Stdn] •

Abb. 2 c.

1 1 8 0 M. MOSKOPHIDIS UND W. FRIEDRICH

0.400

0,200

Abb. 2 g.

Abb. 2 a —2 g. Reduktion verschiedener B12-Arten (Konz, stets 7,2 • 10~5 M) durch CO in H 2 0 bzw. in 0,05 M Phosphat-puffer (pH 7) bei 22 °C bzw. 37 °C, meist in Gegenwart von Histidin (His) bzw. Benzimidazol (BIA) ; die Zahlen an den Kurven entsprechen der molaren Konzentration dieser Basen (Mol Base/Mol Corrinoid). Die Extinktionsabnahme bei 351 nm (JE3 5 1) wird als Maß der Reduktion gewertet. Via = Diaquo-cobyrsäure, FB = Diaquo-cobinamid, xp — Aquopseudovit. B 1 2 , FS = Aquo-2-methylmercaptoadenyl-cobamid, B12 = Aquo-cobalamin, F i l l = Aquo-fakt. III. Zur Sättigung mit CO wurde dieses Gas (zur Reinigung s. o.) durch die Corrinoidlösung (stets in einer mit Hahn versehe-nen Quarzküvette) mittels einer Metallnadel während 15 min geleitet; nach Schließen des Hahnes ( = Beginn der Zeitmes-sung) wurde die Extinktion bei 351 nm periodisch gemessen.

cobalamin führen zur meßbaren Verlangsamung der Reaktion mit CO).

Es gilt als sicher, daß die Aquo-cobamide (Gruppe II) praktisch nur „oben" mit CO reagieren und daß die beobachteten Unterschiede der Reaktionsge-schwindigkeit (Abb. 2 b) auf den Transeffekt des unteren Liganden (der kovalent und koordinativ gebundenen Base) zurückzuführen sind. Aus Abb. 2 b ist ersichtlich, daß die Reaktionsgeschwindigkeit in der Reihenfolge: Pseudovit. B 1 2 , 2-Methylmer-captoadenyl-cobamid, Cobalamin, Fakt. III ab-nimmt. In etwa gleicher Reihenfolge nimmt erfah-rungsgemäß die Bindungsstärke der unteren Ligan-den zu (es ist allerdings nicht klar, weshalb Fakt. III langsamer als Cobalamin reagiert, da es frag-lich ist, ob 5-Hydroxybenzimidazol besser koordi-niert als 5.6-Dimethylbenzimidazol19). Aus dieser Versuchsreihe ist ersichtlich, daß der Transligand die Reaktion mit CO im allgemeinen hemmt und daß die Hemwirkung mit der Donatorwirkung des Transliganden wächst.

In Gruppe III dürfte das Cobinamid nur ein Mole-kül Benzimidazol bzw. Histidin binden, die beob-achteten Hemmeffekte sind somit hier — ähnlich wie in Gruppe II — auf die Donatorwirkung des Trans-liganden zurückzuführen.

Die inkompletten B12-Arten werden wesentlich rascher durch CO reduziert als die kompletten B12-Arten (Abb. 2 ) . Dies wurde früher am Stoffpaar: Aquo-cobalamin und Diaquo-cobinamid beobach-tet 4 und war hier aufgrund der Ergebnisse in Gruppe II zu erwarten (Diaquo-cobinamid müßte ähnlich mit CO reagieren wie ein Aquo-cobamid mit außerordentlich schwach gebundenem unterem Liganden; vgl. hierzu Abb. 2 b ) ; dies ist ferner kon-form mit der früheren Beobachtung 10, daß in Metha-nol bei Verwendung von Formiat als Reduktans Di-aquo-cobinamid rascher als Aquo-cobalamin (Co11) ergibt.

Aus Abb. 2 c — 2 f ist ersichtlich, daß Diaquo-cobin-amid in Gegenwart von Benzimidazol weitaus rascher durch CO reduziert wird als in Gegenwart von Histi-din. Dieses koordiniert somit viel stärker: bei 10 Mol Histidin/Mol Corrinoid ist die Reduktion des Diaquo-cobinamides durch CO bei 22 °C völlig ver-hindert, bei 37 °C stark gehemmt (Abb. 2 f ) . Die gleiche relative Konzentration an Benzimidazol hemmt die Reduktion durch CO nur wenig (Abbn. 2 c und 2 e). Diaquo-cobyrsäure verhält sich ähnlich.

Histidin wurde wegen seiner guten Koordi-nierbarkeit mit manchen B12-Arten bereits früher untersucht10' 22' 23. Es wird angenommen 23, daß an Serumalbumin gebundenes Histidin an der Bindung von Aquo-cobalamin in vivo beteiligt ist. Histidin ist die einzige natürliche Aminosäure, die im bio-logischen pH-Bereich mit B^r koordiniert10. Die Annahme23a, daß sie über den H20-Liganden mit Aquo-cobalamin verknüpft ist, entspricht nicht der allgemein geltenden Auffassung 23 '23b, daß an der Bin-dung Nimidazoi und Kobaltatom direkt beteiligt sind.

Cyano-aquo-cobinamid4 und Cyano-aquo-cobvr-säure reagieren erwartungsgemäß nicht mit CO in Wasser.

Bemerkenswert ist die ungleiche Reaktionsge-schwindigkeit von CO mit Aquo-cobalamin und Di-aquo-cobinamid in Gegenwart von Histidin und B e n z i m i d a z o l ( A b b . 2 a und 2 c - 2 f ) . BERNHAUER u. MÜLLER 20 stellten mittels P. shermanii-Fermenta-tion in Gegenwart von 4.5-Dimethylimidazol und Kobalt das Analog des Vitamins B12 dar, enthaltend 4.5-Dimethylimidazol statt 5.6-Dimethylbenzimida-

CORRINOIDREDUKTION DURCH CO 1 1 8 1

zol. Dieses Analog zeichnet sich durch eine wesent-lich schwächere koordinative Bindung aus als das entsprechende Cobalamin (Protonierung der Base im 4.5 - Dimethylimidazolyl - cyano - cobamid bei pH 3 20, im Cyano-cobalamin bei pH 0,1 2 1 ) . Daraus konnte geschlossen werden, daß Imidazole allgemein schlechter koordinieren als Benzimidazole. Diese An-nahme ist nicht vereinbar mit unseren Ergebnissen, die für eine weitaus bessere Koordinierbarkeit der Imidazole sprechen.

Die Reduktion der Corrinoide mittels CO ist bei 37 °C etwa 4-mal schneller (beim Diaquo-cobinamid, Abb. 2 c — 2 f ) bzw. 2-mal schneller (beim Aquo-cobalamin, Abb. 2 g) als bei 22 °C, was ungefähr dem üblichen Temperaturgradienten entspricht.

Experimenteller Teil

Cyano-cobalamin-Lactam3. Ein Erlenmeyerkolben (300 ml) mit 105 ml 0,1 N NaOH taucht in ein sieden-des Wasserbad. Man leitet durch die NaOH-Lösung lebhaften 02-Strom und setzt 500 mg krist CN-Cobal-amin zu. Man läßt während genau 10 min unter star-

itCHit

Abb. 3. Papierchromatographische Reinigung des aus Cyano-cobalamin dargestellten Cyano-cobalamin-Lactam. Vgl. auch

exper. Teil.

kern Rühren reagieren, kühlt den Ansatz rasch in Eis-wasser und setzt 120 ml 0,1 N Essigsäure zu. Nach Phenolextraktion und Einengen bis zur Trockne wer-den die Corrinoide papierchromatographisch (abstei-gend, Papier Schleicher u. Schüll 2043 bMgl, Entwick-ler, in Vol.: sec. Butanol 56, Wasser 15, 25% Ammo-niak 7, 1% Blausäure 4) getrennt; ein Papierbogen faßt 25 mg Corrinoide. Folgende Zonen (Abb. 3) wer-den beobachtet: Cobalamin-Lactam (II, Ausb. 35%), Cobalaminmonocarbonsäure-Lactam (IV), Cobalamin-dicarbonsäure-Lactam (VII) ; diese Zonen sind wäh-rend der Laufzeit rot-violett; die in geringen Mengen gebildeten Nebenprodukte I, III, VI und VIII haben während der Laufzeit charakteristische stahl-violette Farbe und dürften somit 13-epi-Corrinoide 24 sein.

Methyl-cobalamin-Lactam. 12,5 mg Cyano-cobal-amin-Lactam werden nach der Methode von MÜLLER u. MÜLLER 25 methyliert und nach Phenolextraktion mit Hilfe einer CM-Cellulose-Säule (1,3x13,5 cm) chro-matographiert (Entwickler: Wasser). Ausbeute an Me-thyl-cobalamin-Lactam ca. 60%. Sein Absorptionsspek-trum in Wasser und in 0,01 N HCl ist identisch mit dem des Methyl-cobalamins 25.

Aquo-cobalamin-Lactam wurde aus Methyl-cobal-amin-Lactam durch Belichtung dargestellt. Weitere Rei-nigung wie bei den Aquo-corrinoiden (s. w. u.).

Reaktion der Bl2-Arten mit CO in wäßriger Lösung. CO aus Stahlflasche wurde wie früher 15 sowie zusätz-lich mittels alkalischer Pyrogallollösung (15% Pyro-gallol in 50% KOH) gereinigt und durch die Cor-rinoidlösung in einer Hahnküvette aus Quarz geleitet. Messung des Reduktionsverlaufs bei 351 und 526 nm. Zur Aufnahme von Absorptionsspektren dienten 3,6-10 _ 5M Corrinoidlösungen in Wasser, in 0,05 N HCl (bei den Benzimidazol-B12-Arten) bzw. in 0,01 N HCl (bei den Purin-B12-Arten). Durchleiten von CO durch die Lösungen dauerte stets 15 min. Aufnahme der Absorptionsspektren erfolgte nach 10 Stdn. bei 25 °C (in Wasser) bzw. nach 15 Stdn. bei 30 °C (in 0,01 N bzw. 0,05 N HCl). Die Reoxydation der Co11-B12-Arten ergab stets die entsprechenden Aquo-B12-Arten in einer Ausbeute von 80 — 90%. Diese verhielten sich in Gegenwart von Cyanid papierelektrophoretisch, pa-pierchromatographisch und spektrophotometrisch wie die Ausgangssubstanzen in der Cyano-Form.

Diaquo-cobinamid wurde durch Hydrolyse von Aquo-cobalamin mittels Cer (III) -hydroxid 26 dargestellt. In einem 100 ml fassenden Rundkolben mit Rückflußküh-ler werden 100 mg krist. Aquo-cobalamin in 14 ml Wasser gelöst und in gleicher Reihenfolge mit 24 ml 0,333M Ce(N0 3 ) 3 -6H 2 0 und 20ml 1,0M NaOH ver-setzt. Man läßt in siedendem Wasserbad unter star-kem Rühren im N2-Strom während 40 min reagieren. Anschließend rasches Kühlen, Abzentrifugieren des Ce (OH) 3 , Phenolextraktion, Einengen der wäßrigen Lösung bis zur Trockne, Elektrophorese (Papier Nr. 2230 von Schleicher u. Schüll) in 0,04 M Natriumacetat und erneute Phenolextraktion der elektrophoretisch nachgereinigten Substanz.

1 1 8 2 CORRINOIDREDUKTION DURCH CO 1182

Aquo-cobalamin, Aquo-pseudovit. B12 , Aquo-fakt. A, Aquo-methylmercaptoadenyl-cobamid und Diaquo-cobyrsäure wurden aus den entsprechenden Cyano-B1 2 -Arten durch Methylierung mittels Methyl jod id nach M Ü L L E R U. M Ü L L E R 2 5 und durch anschließende Belich-tung, Papierelektrophorese (Pap ier : Schleicher u.

1 W . FRIEDRICH, Z . N a t u r f o r s c h . 2 5 b , 1 4 3 1 [ 1 9 7 0 ] . 2 W . FRIEDRICH U. M . MOSKOPHIDIS, Z . N a t u r f o r s c h . 2 6 b ,

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7a (CoH) steht für Bi2r, Fakt. I I I r , Pseudovit. Bi2r, Cobin-amidr usw.

,B FIRTH et al. , c veröffentlichten folgende Absorptionsmax. für Bi2r (A in nm) : base-ofT, pH 1, 267, (274), 285, 315, (402), 467; base-on, pH 9, 298, 310, 356, 404, 473, (538). Wir konnten im neutralen pH-Bereich keine Banden bzw. Schultern bei 298, 356 und 538 nm beobachten.

7 c R . A . FIRTH, H . A . O . HILL, J. M . P R A T T , R . J . P . W I L -LIAMS u. W . R . JACKSON, Biochemistry 6, 2178 [ 1 9 6 7 ] .

8 M . T . DAVIES, P . MAMALIS, V . PETROW U. B . STURGEON, J. Pharm. Pharmacol. 3, 420 [1951]. Der pK-Wert wurde am /?-Ribazol ermittelt, er dürfte jedoch auch für a-Ribazol gelten.

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Schüll, Nr. 2230 ) in 0,5 N Essigsäure sowie Phenol-extraktion dargestellt.

Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft und dem Fonds der Chemischen Industrie für die Unterstützung dieser Arbeit .

14a „Untere" Molekülseite im Vitamin B12 ist die Nucleotid-seite.

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