zellbiologie - philipps-universität marburg · robert hooke (1635‐1703) engl. physiker, erfinder...

Zellbiologie

Zellbiologie

Lehrbücher

Doppel-stunde

ThemaStichworte

11.04.11

Lichtmikroskopie: Präparationsmethoden, Mikroskopaufbau, Durchlichtmikroskopie, (Vergrößerung, Auflösung, Tiefenschärfe), Phasenkontrastmikroskopie, Dunkelfeldmikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, Anwendungsbeispiele (Prof. Jacob)

14.04.11Elektronenmikroskopie: Präparationsmethoden, Mikroskopaufbau, Transmissions-EM, Raster-EM, Anwendungsbeispiele

02.05.11Biologische Membranen: Aufbau, Lipide, Cholesterin, Membranproteine, Fluidität, Membrananker, Detergentien

05.05.11 Membranverbindungen I: Tight junctions, Adhesion junctions, Cadherine, Desmosomen

09.05.11 Membranverbindungen II: Gap junctions, Connexine, Hemidesmosomen, Integrine

12.05.11

Zytoskelett Einführung/Mikrotubuli I: Einteilung der Zytoskelettsysteme; Morphologie der Zytoskelettsysteme; Mikrotubuliaufbau; Dynamische Instabilität in vitro; Dynamische Instabilität in vivo;

16.05.11Mikrotubuli II: intrazelluläre Mikrotubuliorganisation; Centrosom; Mikrotubuli-bindende Proteine; Mikrotubuli-assoziierter Transport; Kinozilien; Mitosespindel

19.05.11

Aktinzytoskelett: G-Aktin/F-Aktin; Polymerisation/Depolimerisation; Aktin-bindende Proteine; Mikrovilli; Aktin-assoziierte Zell-Zell- und Zell-Matrix-Verbindungen; Aktin-assoziierte zelluläre Bewegungen

23.05.11

Intermediärfilamente: Struktur der Intermediärfilamente; Polymerisation/Depolymerisation; Einteilung der Intermediärfilamente; Zelltypspezifische Verteilung und Funktion der Intermediärfilamente; Verbindung zwischen Intermediärfilamenten und Mikrotubuli

26.05.11

Extrazelluläre Matrix: Zell-Matrix Wechselwirkung; Basalmembran; Struktur, Synthese und Sekretion von Kollagen; Störungen im Kollagenstoffwechsel (Ehlers-Danlos Syndrom); Kollagentypen; Elastin und Störungen im Elastinstoffwechsel (Marfan Syndrom); Proteoglykane und Hyaluronsäure; Fibronectin

Nach Absprache Tutorium: Membranen

Nach Absprache Tutorium: Zytoskelett

Vorlesung/ Seminar Zellbiologie (SS 2011)2. SemesterOrt: Histologiesaal der Zellbiologie, Robert-Koch-Str. 6Zeit: Mo 10:15– 12:00 Uhr; Do 9:15 - 11.00 UhrVerantwortlich: Prof. Dr. Roland Lill, Prof. Dr. Ralf Jacob, PD Dr. Christopher Lillig

Institut für Zytobiologie, Robert-Koch-Str. 6 (Tel. 286-6482)

30.05.11 Endoplasmatisches Retikulum I: Morphologie der glatten und rauhen ER, Funktionen des glatten ER, Cytochrome P450. Ribosomen, Rauhes ER, Signalhypothese, Translocon (Prof. Lill)

06.06.11 Endoplasmatisches Retikulum II: Weitere Funktionen des rauhen ER, Proteinfaltung und Modifikationen im ER, Chaperone, Quality control, Disulfidverbrückung, N-Glykosylierung.

09.06.11Proteintransport durch Fission und Fusion von Membranvesikeln: vesikulärer Transport, Fusion und Fission von Membranvesikeln, anterograder/retrograder Proteintransport

16.06.11Golgi-Apparat I: Morphologie, Funktionen der Golgi Stapel, Modifikationen im Golgi-Apparat (z.B. O-Glykosylierung, Proteolyse, Sulfatierung)

20.06.11Golgi-Apparat II: Proteintransport im Golgi-Apparat, Sortierung im Trans-Golgi-Netzwerk; Sortierung lysosomaler Proteine

27.06.11Endosomales Kompartiment, Exocytose, Endozytose: regulierte und konstitutive Sekretion, frühes und spätes Endosom, Rezeptorgekoppelte Endozytose, Pinozytose.

30.06.11Lysosomen: Funktion, Hydrolasen, Biogenese von Lysosomen, Proteinimport in Lysosomen; lysosomale Erkrankungen

04.07.11Mitochondrien I Morphologie, Funktionen und Bestandteile der einzelnen Kompartimente, Überblick zur oxidativen Phosphorylierung, Biogenese (Proteinimport und -sortierung)

07.07.11

Mitochondrien II Genexpressionsapparat der Mitochondrien (mtDNA, Nukleoid, Transkription und Translation) , rho-zero Mitochondrien, Vererbung und Segregation, Fusion und Fission (Dynamik des mitochondrialen Retikulums), Endosymbiontentheorie, mitochondriale Erkrankungen (Myopathien etc.)

11.07.11Peroxisomen: Morphologie, Funktionen, Biogenese (Proteinimport, Peroxine), peroxisomale Erkrankungen (Zellweger-Syndrom, Adrenoleukodystrophie)(PD Dr. Lillig)

14.07.11 Ersatztermin

Nach Absprache Tutorium: Sekretorischer Transportweg

Nach Absprache Tutorium: Lysosomen, Peroxisomen, Mitochondrien

25.07.11 Abschlussklausur (9:00-11:00 Uhr)

Zellbiologie

• Lichtmikroskopie

• Elektronenmikroskopie

• Biologische Membranen

• Membranverbindungen

• Lichtmikroskopie

• Elektronenmikroskopie

• Biologische Membranen

• Membranverbindungen

Über 1,5 Millionen verschiedene Spezies sindbis heute von Biologen beschrieben worden !

• ~ 280.000 Pflanzen

• ~ 750.000 Insekten

• ~ 50.000 Vertebraten

• ~ 280.000 Pflanzen

• ~ 750.000 Insekten

• ~ 50.000 Vertebraten

Alle Lebewesen sind aus einer oder mehreren Zellen aufgebaut !

Zeitlicher Ablauf der Zellentwicklung

vor ca. Jahren:

4,7 Milliarden Entstehung der Erde3,9 Milliarden erste membranumschlossene Einzeller3,5 Milliarden Bakterien entstehen3 Milliarden Sauerstoffproduktion durch Blaualgen700 Mio. primitive Vielzeller (Schwämme) bilden sich450 Mio. erste Vertebraten tauchen auf200 Mio. Erscheinen der Säugetiere100.000 homo sapiens

vor ca. Jahren:

4,7 Milliarden Entstehung der Erde3,9 Milliarden erste membranumschlossene Einzeller3,5 Milliarden Bakterien entstehen3 Milliarden Sauerstoffproduktion durch Blaualgen700 Mio. primitive Vielzeller (Schwämme) bilden sich450 Mio. erste Vertebraten tauchen auf200 Mio. Erscheinen der Säugetiere100.000 homo sapiens

Die Zelle: Der kleinste Baustein aller Organismen

VergleichProkaryonten Eukaryonten

OrganismusEubakterien PilzeArchebakterien Pflanzen

Tiere

OrganisationsformEinzellig ein- oder

mehrzellig

Organellen, Cytoskelett, Zellteilungsapparatnicht vorhanden vorhanden,

kompliziert,spezialisiert

VergleichProkaryonten Eukaryonten

DNAklein, circulär, keine Introns groß, im Zellkern, viele Introns

RNA: Synthese und Reifungeinfach, im Cytoplasma kompliziert, im Zellkern

Protein: Synthese und Reifungeinfach, mit RNA- kompliziert, im Cytoplasma undSynthese gekoppelt rauhen Endoplasmat. Reticulum

Stoffwechselanaerob oder aerob meist aerobsehr anpassungsfähig

ZellkernZellkern

Golgi-ApparatGolgi-Apparat RibosomRibosom

MitochondriumMitochondriumLysosomLysosom

rERrER

PlasmamembranPlasmamembran

Zellkompartimente

Zelle als Produktionsstätte

Quelle: Leica Microsystems

Warum Mikroskopie?

… weil es mehr gibt als man mit dem Auge erfassen kann

Strahlengang des Auges

• Rose in weiter Entfernung• Linse entspannt

• Rose näher am Auge• Strahlen werden stärker gebrochen• Linse wird dicker• vergrößertes Abbild

Strahlengang des Auges

0.2 mm

Auflösungsvermögen des menschlichen Auges

Haare

BlätterInsekten

Tiere

0.2 mmmenschl. Auge

Haare Blätter

Insekten

Tiere

Auflösungsvermögen des menschlichen Auges

0.2 mm0.2 µm0.2 nm

Atome Organische Moleküle

Makromoleküle

Viren

….

0.1 nm

1 nm

10 nm

100µm

100 nm

1 µm

10 µm

Lichtmikroskopie

Atomkraftmikroskopie

Elektronenmikroskopie

Bakterien/ Organellen

Eukarytische Zellen

Haare

Blätter

Insekten

Tiere

Größenbereiche biologischer Präparate

menschl. Auge

Quelle: University of Vienna, cell imaging group

Brechung an einer bikonvexen Linse

Linsenconvex lenses

(collecting lenses)concave lenses

(divergent lenses)

biconcaveplano-convex

concave-convexcvbibiconvex

plano-concave

convex-concave

concave-convexcv

Fokuslänge

Brechung an einer bikonkaven Linse

Fokuslänge

Source: University of Vienna, cell imaging group

extw|Çz áàÉÇx

Erstes Jahrhundert: Lesesteine

objectimage

- ursprünglich aus Beryll (Silicat-Mineral)

Athanasius  Kircher(1601‐1680)

Jesuiten‐Pater, Universalgelehrter

Robert Hooke(1635‐1703)

Engl. Physiker, Erfinder

Antoni van Leeuwenhoek(1632‐1723)

Engl. Physiker, Erfinder

Die ersten Jahre

Athanasius  Kircher(1601‐1680)

Jesuiten‐Pater, Universalgelehrter

Robert Hooke(1635‐1703)

Engl. Physiker, Erfinder

Antoni van Leeuwenhoek(1632‐1723)

Engl. Physiker, Erfinder

Die ersten Jahre

Das Mikroskop

Vergrößerung

einer Lupe eines Mikroskops

Sehwinkel mit Lupe α1Sehwinkel in 25 cm Entfernung α0

γ = =

α1 G s0 s0α0 f G f

γ = = =γObj = =B t

G f1γ = γObj γOk = t s0

f1 f2

Auflösung

Objektiv: 100xOkular: 10xObjektiv: 100xOkular: 10x

Objektiv: 40xOkular: 25xObjektiv: 40xOkular: 25x

Numerische Appertur

2α

2α

2α

A = n sin α (ABBE)

Brechungsindex

Numerische Appertur

A = n sin α (ABBE)

Brechungsindex

Objektträger

Deckglas

Immersionsölα

Luft, n=1Öl, n=1,52Glas, n=1,52

Auflösung

Ernst Abbe 1873

Auflösung

dmin =A = n sin α (ABBE)

Brechungsindex

λAObj + AKond.

rotes blaues Licht

RA8 RA9 RA10

Folie 28

RA8 Wellenlänge des verwendeten Lichts: 400-750 nmmax. Empfindlichkeit des Auges: 555 nmRAD; 19.04.2004

RA9 Für den Kontrast ist es wichtig, dass A(Kondensor) < A(Objektiv) istOptimum: A (Kondensor) = 2/3 A (Objektiv)d= lambda/(2/3 A(Obj.) + A(Obj.)) = lambda/1,66 A(Obj.)Bei 555 nm:d= 555/1,66 1/A(Obj.) = 334 1/A(Obj.)RAD; 19.04.2004

RA10 Beispiele:A (Obj.) d(nm)

0,3 11130,65 5141,3 257Richtwert für Auflösungsgrenze: 200 nmRAD; 19.04.2004

Mikroskop-Strahlengang

Tubusmit Prisma

Feldblende

Lampenhaus

Kollektor

Okular

Objektivrevolver

Objektive

Kreuztisch

Kondensor

Spiegel

Aperturblende

Die Köhlersche Beleuchtung(Prof. August Köhler, 1893)1.

2.

3.

4.

5.

Leuchtfeldblende schließen

Über den Kondensorscharf einstellen

zentrieren

Blende öffnenscharf einstellen

zentrieren

Blende öffnenPräparat ausleuchten

schlecht ausgeleuchtetesPräparat

RA4

Folie 30

RA4 Punkteabstand im Präparat: 5 µM10 x Objektiv: Zwischenbild 50 µMaber: d(Auge) ~300 µM > NachvergrößerungRAD; 19.04.2004

Färbetechniken

Quergestreifter Skelettmuskelquer

längs

Azan-Färbung

HE-Färbung

Eisenhämatoxilin-Färbung

Mikroskopiertechniken

Kontrastverfahren

1. Dunkelfeld

2. Phasenkontrast

3. Differenzinterferenzkontrast

Fluoreszenzmikroskopie

4. Fluoreszenz

5. Laser-Scanning

to see, or not to see …

that is the question

Dunkelfeld-Mikroskopie

• Das Präparat wird nicht direkt angestrahlt

• Vom Präparat ausgehendes Streulicht wird gemessen

Refraktion (Brechung)Richtungsänderung einer Welle durch veränderte Geschwindigkeit in verschiedenen Medien

Die Brechung erfolgt zum Lot,wenn ein Lichtstrahl in einMedium mit größerer Brechzahleintritt (zum Beispiel aus Luft inWasser oder Glas)

Eine Spaltbreite kleiner als dieWellenlänge ergibt eine vom Spaltausgehende Kreiswelle, derenIntensität auch in Richtungen, diesich stark von der ursprünglichenAusbreitungsrichtung abweichen,noch groß ist.

Diffraktion (Beugung)Ablenkung an einem Hindernis (Spalt, Gitter, Linsenrand usw)

Wellenwanne

Phasenkontrast(1953 Physik-Nobelpreis an Fritz Zernike)

• Kontraststeigerung durch Veränderung in der Mikroskopoptik

• Kondensor und Objektiv sind mit verschiedenen Ringblenden versehen

• Wechselwirkung (Interferenz) des direkten Mikroskopierlichts mit dem am Präparat gebeugten Licht

• Ergebnis: Objekte mit hohem Brechungsindex (z.B. Zellen) werden dunkler abgebildet als Objekte

mit geringem Brechungsindex (z.B. Wasser)

Phasenkontrast(1953 Physik-Nobelpreis an Fritz Zernike)

Differential Interferenz Kontrast (DIC)

• Linear polarisiertes Licht wird in einem Winkel von

45° auf ein Wollaston-Prisma geleitet

• Aufspaltung in zwei senkrecht zueinander

schwingende Wellenzüge gleicher Amplitude

• Vereinigung mit einem zweiten Wollaston-Prisma

• Interferenz am Analysator gemessen

Differential Interferenz Kontrast (DIC)

Phasenkontrast DIC

Differential Interferenz Kontrast (DIC)

• Der Name „Fluoreszenz“ stammt von dem Fluoreszierenden Mineral „Fluorit“ (CaF2)

• 1824 entdeckt der Mineraloge Friedrich Mohs Fluoreszenz unter UV-Licht

• Der Ausdruck „Fluoreszenz“ wurde in einer Veröffentlichung von G.G. Stokes erstmals 1852 erwähnt

Fluoritkristalle unter UV-Licht

Fluoreszenz

• Energien der Elektronenübergänge, die bei

Absorption und Emission von Photonen

auftreten

• Delokalisierte Elektronen in bindenden -

Orbitalen werden bei Absorption eines

Anregungsphotons auf ein höheres *-

Orbital katapultiert (angeregter Zustand S1

o. S2)

• Beim Übergang in den Grundzustand wird

die freiwerdende Energie als

Fluoreszenzphoton emittiert

Fluoreszenz

Fluoreszenzierende Moleküle

Absorptions- und Emissionsspektrum

Anregungs- und Emissionsfilter

Fluoreszenzmikroskop

Fluoreszenzmikroskop

Konfokales Fluoreszenzmikroskop

Konventionelles Fluoreszenzmikroskop konfokales Fluoreszenzmikroskop

Konfokales Fluoreszenzmikroskop

konventionelles

konfokales

Fluoreszenzmikroskop

Medulla Muskel Getreidekorn

Laser-Scanning Mikroskop

SI-YFP Actin-CFP

Aktin-abhängiger Transport der Saccharase

Scale bars: 10 µm

Gal3-YFPGT-CFP

Transient interference between galectin-3 containing vesicles and the trans Golgi