universidade de sÃo paulo faculdade de ciÊncias … · 2013-09-05 · felicidade, por dividir...
Post on 13-Jun-2020
3 Views
Preview:
TRANSCRIPT
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULOFACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Programa de Pós-Graduação em Ciência dos AlimentosÁrea de Bromatologia
Teores de benzilglicosinolato, benzilisotiocianato e expressão da
mirosinase durante o desenvolvimento e amadurecimento do mamão
papaia (Carica papaya L. , var. Sunrise Solo)
Maria Rosecler Miranda Rossetto
Tese para obtenção do grau de
DOUTOR
Orientador.
Prat-'. Drª. Beatriz Rosana Cordenunsi
Co- orientador:
Praf. Dr. João Roberto Oliveira do Nascimento
SÃO PAULO
2005
DEDALUS - Acervo - CQ
1111.11111111130100011116
Ficha CatalográficaElaborada pela Divisão de Biblioteca e
Documentação do Conjunto das Químicas da USP.
1. Enzima : Mamão: Bioquímica dos alimentos 2. Caricapapaya: Ciências dos alimentos 3. Expressão gênica 4. Biologiamolecular I. T. 11. Cordenunsi, Beatriz Rosana, orientador.III. Nascimento, João Roberto Olivei ra do, co-orientador
Rossetto, Maria Rosecler MirandaR829t Teores de benzilglicosinolato, benzilisotiocianato e expressão
da mirosinase durante o desenvolvimento e amadurecimento domamão papaia (Carica papaya L., varo Sunrise solo) / MariaRosecler Miranda Rossetto. São Paulo, 2005.
115p.J} 1-
Tese (doutorado) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas daUniversidade de São Paulo. Departamento de Alimentos e NutriçãoExperimental
Orientador: Cordenunsi, Beatriz RosanaCo-orientador: Nascimento, João Roberto Oliveira do
CDD641.34651
Maria Rosecler Miranda Rossetto
Teores de benzilglicosinolato, benzilisotiocianato e expressão da
mirosinase durante o desenvolvimento e amadurecimento do mamão
papaia (Carica papaya L., varo Sunrise Solo)
Comissão Julgadorada
Tese para obtenção do grau de Doutor
Prafa. Dr<;Í. Beatriz RosaniCOrdenunsi o~entador/presidente
João Roberto Oliveira do Nascimento1°. examinador
Giuseppina Pace Pereira Lima2°. examinador
Ricardo Alfredo Kluge3°. examinador
Marco Aurélio Tiné4°. examinador
São Paulo, junho de 2005.,1.1
t -- ~ -- ------ ------
P,~efênciada caridade:
Ainda que eu falasse as línguas dos homens e dos anjos, se não tiver caridade, sou
como o bronze que soa, ou como o címbalo que retine. Mesmo que eu tivesse o dom da
profecia, e conhecesse todos os mistérios e toda a ciência; mesmo que tivesse toda afé, a
ponto de transportar montanhas, se não tiver caridade não sou nada. Ainda que
distribuísse todos os meus bens em sustento dos pobres, e ainda que entregasse o meu
corpo para ser queimado, se não tiver caridade, de nada valeria!
A caridade é Paciente, Bondosa. Não tem inveja. Não é orgulhosa. Não é
arrogante. Nem escandalosa. Não busca seuspróprios interesses, não se irrita, não guarda
rancor. Não se alegra com a injustiça, mas se rejubila com a verdade. Tudo desculpa, tudo
crê, tudo espera, tudo suporta. A caridade jamais acabará.
As profecias desaparecerão, o dom das línguas cessará, o dom da ciênciafindará.
A nossa ciência é parcial, a nossa profecia imperfeita. Quando chegar o que é perfeito o
imperfeito desaparecerá. Quando éramos crianças falávamos, pensávamos e
raciocinávamos como criança. Desde que nos tornamos homens, eliminamos as coisas de
criança. Hoje vemos como por um espelho, confUsamente, mas então veremosface a face.
Hoje conheço em parte; mas conhecerei totalmente, como eu sou conhecido. Por ora
subsistem a fé, a esperança e a caridade - as três. Porém a maior delas é a caridade.
(I Coríntios 13: 1-13)
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por muitas bênçãos derramadas em minha vida, por ter me conservado e
me dado uma família maravilhosa, e pela oportunidade de mais esta formação acadêmica.
Obrigada Deus pela saúde, pela paz, harmonia e muita perseverança, por me dar essa certeza de
acreditar deque sem o Seu amparo nada somos e como diz o salmista: "eu tudo posso Naquele
que me fortalece".
Agradeço especialmente à minha mãe Marlene, pelo seu imenso amor e dedicação, aqui
não caberiam palavras para explicar a grande mãe guerreira e dedicada que temos. Agradeço à
minha irmã Andréa pelo grande apoio sentimental e moral, pelos seus sábios conselhos,
contagiando-me com sua grande força interior, otimismo e muita garra e também pela imensa
ajuda financeira (obrigada querida irmã). Quero agradecer ao meu marido, Alexandre, por ter me
proporcionada mais alegria na vida, por compartilharmos juntos muitos momentos de alegria e
felicidade, por dividir comigo todos os meus problemas me dando força e coragem. Agradeço-o
especialmente porter me dado um filho, o João Victor, que nos trará muita alegria. Aos meus avós
Pedro e Lourdes que me mostraram o poder de Deus nas nossas vidas, ensinando-nos que a
felicidade anda de mãos dadas com a humildade, e que esse sentimento abstrato, aumenta, a
partir do momento em que temos compaixão de nossos irmãos menos favorecidos, e quando
estamos sempre dispostos a perdoar.
Um agradecimento especial aos meus queridos tios Luís Fernando e Tere que desde o
meu mestrado confiaram plenamente em mim, sendo os fiadores do meu apartamento, peço a
Deus que os cubra de bênçãos. Aos meus outros tios e tias (João e Inês, Edvaldo e Selma, Rita e
Marcos) por tanto carinho, afeto e por estarem sempre presentes no amor e na união. Aos meus
sobrinhos e primos que os amo de paixão como se fossem meus filhos verdadeiros, obrigada por
vocês existirem, e fazerem a minha vida mais feliz, Vinnícius, Rafhaela e Isabela (sobrinhos),
Talita, Caio, Leonardo, Ivanka, Samantha e Xandinho (primos).
Quero agradecer também à minha sogra Adair e a meu sogro Flávio pela grande
dedicação e apoio sentimental, moral e financeiro no nosso casamento e também pelo
companherismo.
Agradeço aos meus primeiros orientadores, Professora 0(' Giuseppina P. P. Lima e
Professor José Pedro S. Valente, por tanta paciência, bondade e dedicação nos primeiros passos
da iniciação científica, e por despertar em mim, o grande desejo de ser pesquisadora.
Ao Professor Dr. Rogério L. Vieites, pela grande amizade, pela orientação, pelas aulas
maravilhosas e grande incentivo na área de Alimentos.
Agradeço especialmente à minha orientadora Professora Dr" Beatriz Rosana Cordenunsi
por tantos anos de amizade, paciência, por sua grande dedicação e ajuda em todos os momentos,
principalmente nas correções de muitos relatórios, trabalhos, qualificação e tese, também por sua
preocupação e delicadeza neste meu momento especial de gravidez.
Agradeço também de modo especial, ao Professor Dr. João Roberto O. Nascimento, por
me aceitar como sua co-orientada, pelo seu ânimo e incentivos contagiantes, por sua grande
amizade em todos estes anos de mestrado e doutorado, pelos vários bons momentos de alegria e
descontração, pela imensa ajuda e participação em todos os resultados produzidos neste trabalho,
desde as análises do laboratório, acompanhando cada análise da biomol (obrigada por sua imensa
disposição e paciência de muitas vezes fazer comigo e me ensinar todas estas análises, e me
ensinar a ler os manuais), até as infindáveis correções de trabalhos, relatórios, tese, etc. Quero
agradecê-lo também pelo imenso carinho que teve comigo na gravidez.
Agradeço, com carinho ao Professor Dr. Eduardo Purgatto que também foi um pouco meu
co-orientador, principalmente na área cromatográfica, agradeço por sua grande amizade nos seis
anos que passei aqui, por sua acessibilidade e dedicação, por sua imensa ajuda na elaboração
dos métodos destas análises, cálculos e ajuda na conferência dos mesmos.
Ao Prof. Dr. Franco Maria Lajôlo também quero anexar os meus agradecimentos não só
pela amizade, mas por seus sábios e preciosos conselhos e por me incluir no seu núcleo de
pesquisa, quero agradecer especialmente pelo senhor e sua equipe terem me favorecido o grande
avanço científico, cheguei aqui sem saber quase nada e hoje posso dizer que aprendi muito de
pesquisa com vocês, obrigada.
Os meus agradecimentos aos grandes novos amigos do laboratório, por tornarem a nossa
vida mais agradável e feliz e pelo apoio nas horas difíceis da vida: Andréia (pela sua grande
amizade e companheirismo), Amanda, Malu, Fernanda, Graciele, Janaína, Eliana, Denise, Ana
Cris, Adriana, Milana, Marcinha, Aderuza, aos amigos Adair (por sua imensa ajuda), Renato (por
sua grande ajuda), Maurício, Ricardo, João Paulo, Marcelo, adoro todos vocês, às técnicas Lúcia e
Tania, à querida Marcia que tanto me ajudou a congelar os mamões, junto da professora Beatriz e
do professor João, quero agradecer pela amizade também a professora Inês Genovese.
Às meninas da secretaria, Mônica e Tânia, e ao pessoal da secretaria de pós-graduação
(Jorge, Elaine e Majô) meus agradecimentos pela amizade e pela imensa atenção.
Meus agradecimentos muito além de especial à FAPESP, órgão financiador desta
pesquisa, por custear todos os reagentes, pela ajuda na divulgação dos trabalhos científicos
(principalmente em congressos), pelo auxílio tese, pela bolsa generosa, sem um dia de atraso, por
ter confiado muito em meu trabalho desde a iniciação científica, mestrado e, agora, doutorado,
muito obrigada aos relatores científicos e administrativos e a toda equipe FAPESP.
Dedico
Marlene
Alexandre
este trabalho à minha mãe
e irmã Andréa, ao meu marido
e especialmente ao meu filho
João Victor.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 3 )J
1.1 Classificação botânica do mamão papaia 6 S
1.2 Ponto de colheita 9
1.3 Variedades e cultivares 10
1.4 Metabolismo das plantas 12
1.5 Glicosinolatos 17
1.5.1 Benzilglicosinolatos •••••••••.••••••••••••••••••.••.•••..••.••••••••.••••••..••..•••..••••••••••••••••••....••••••••• 19
1.5.2 Fatores que influem na composição dos glicosinolatos em plantas ••••••••••••••..••••••• 21
1.5.3 Biossíntese dos glicosinolatos em geral•••••••••....•••••••.•.•••••••.••.•.•••••••••••••................. 24
1.5.4 Evolução da biossíntese dos glicosinolatos••••.••••••.••.••••..•••.•••••••••••••••••••••...••.••••••••• 30
1.6 Degradação dos glicosinolatos 32
1.7 Mirosinases 34
1.8 Sistema glicosinolato - mirosinase no mamão 37
2. OBJETiVOS 39
3. MATERIAL E MÉTODOS 40
3.1 Material 40
3.2 Métodos 42
3.2.1 Determinação de Açúcares solúveis•.•••••••••.••••••••.•..•••••.•••••••••.••••••••••••••.••••....••••••••• 42
3.2.2 Determinação de Etileno e CO2 •••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 43
3.2.3 Análise do benzilglicosinolato em mamão por HPLC••.•.•••••••••••••••••.•••••.•••••••••••••...•• 44
3.2.4 Análise do BITC durante o desenvolvimento e amadurecimento do mamão •••••••• 46
3.2.5 Preparo do extrato enzimático e atividade da p-tioglicosidase em mamão papaia 50
3.2.6 Proteínas ••.....•••••••••••••...••••••••••••••.•••••••••••••.•••.....•••••••••.••••••••••••••••••••••..........•••.•••••... 51
3.2.7 Extração de RNA total••••••••••••••••••••••••••••..•.•••.•.••.•••••••••••.•••••••••••••••••••••..•••.....••••••••.• 51
3.2.8 Obtenção do cDNA ........•...••••••••••••••..••••••••••..••••••••••••.•••••••••••••••...•••.••.••••••••••••••.•••••• 53
3.2.9 Síntese de oligonucleotídeos•••••••••••.•••••••.••••..•...;..•.•••............................................. 53
- - _.- --
2
3.2.10 Reação em cadeia da polimerase (PCR) ••••••.••••.•••••••••.••••••.•.••••••••••.•...•••••••••..•.••••. 55
3.2.11 Clonagem e expressão do produto de PeR•••.•.•••••••.••.•••••••••••••••••••.••••••••••••.•••••••••• 55
3.2.12 Mini-preparação de DNA plasmidial e sequenciamento••••••••••••••••••.••••••••••••...••••.• 56
3.2.13 Expressão em sistema heterólogo da mirosinase em Escherichia colí e purificação
da proteína recombinante•.•••••..•••••.••••••••••.•.••••••••••..•••••••••.•••••••.•••••••••••••••••...••••.•••.•..•••••.. 57
3.2.14 Eletroforese de RNA e northem blot •••..••••..•••••••••••••••.••••••••••••••••••••..•.•..•••..•••...•••• 59
4. RESULTADOS 60
4.1 Perfis de açúcares solúveis 62
4.2 Respiração e Etileno durante o amadurecimento de mamão papaia 63
4.3 Avaliação da atividade das mirosinases em diferentes estádios de maturação e
diferentes regiões da polpa do mamão 64
4.4 Otimização da metodologia de análise de benzilglicosinolato (BG) e do
benzilisotiocianato (BITC) 66
4.5 Teores de benzilglicosinolatos, BITC e atividade das mirosinases na polpa, casca e
semente durante o desenvolvimento e amadurecimento do mamão papaia 70
4.6 Teores de benzilglicosinolato, BITC e atividade da mirosinase em mamões submetidos
a tratamento com etileno e 1-MCP 77
4.7 Determinação e quantificação relativa do BITC na cavidade interna do mamão durante
o amadurecimento 83
4.8 Extração de RNA total 85
4.9 Amplificação por PCR 85
4.10 Clonagem e seqüenciamento 87
4.11 Expressão heteróloga do cDNA da mirosinase de semente de mamão em E.co/i. 94
4.12 Expressão gênica da mirosinase de mamão papaia 96
-5. CONCLUSOES 99
6. BIBIOGRAFIA CITADA 100
-- . -- _ __ ._~ -~_. ~.-,..=.o.~_ -= - "--- _
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Gradiente de eluição utilizado para determinação de benzilglicosinolato
por HPLC com detecção no U.v. (228 nm) .46
Tabela 2: Condições de trabalho do CG/MS para análise de BITC 48
Tabela 3: Relação das sequências de primers utilizados em PCR para
amplificação de fragmentos de mirosinases 54
Tabela 4: Códigos Ambíguos IUPAC 54
Tabela 5: Sequência de bases dos primers usados nos ensaios de expressão...57
-_.- - -.-
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Balança comercial de frutas frescas do Brasil (Informativo Ibraf, 2005).4
Figura 2: Flor de mamoeiro já fecundada 7
(yNNi.botany.hawaii.edulfacu!tylwebb/BOT41 O/AngiosoermlPlacentation-2.htm)
Figura 3: Carta de cores do System Approach. 1O
Figura 4: Vias metabólicas primária e secundária de plantas (VICKERY &
VICKERY, 1981; DEY & HARBORNE, 1977) 16
Figura 5: Exemplos de glicosinolatos indólicos, aromáticos e alifáticos 25
Figura 6: Biossíntese dos glicosinolatos por DEY & HARBORNE (1977) FAHEY
et aI. (2001); CHEN & ANDRÉASSON (2001); WITTSTOCK & HALKIER (2002)28
Figura 7: Biossíntese do benzilglicosinolato WITTSTOCK & HALKIER (2000);
WITTSTOCK & HALKIER (2002); WITTSTOCK & HALKIER (2004) 29
Figura 8: Via metabólica, comum às plantas produtoras de glicosinolatos e
glicosídeos cianogênicos baseados nos derivados da família gência descrita como
CYP79s (KVL-Department of Plant Biology: www.plbio.kvl.dk). Met, Phe, Trp, I1e,
Vai, correspondem aos aminoácidos, metionina, fenilalanina, triptofano, isoleucina
e valina 31
Figura 9: Degradação do glicosinolato pela mirosinase (FAHEY et aI., 2001;
CHEN & ANDRÉASSON, 2001 ) 33
Figura 10: Estádios de desenvolvimento (30, 60, 90 e 120 dpa) e ponto de
colheita (150 dpa) de mamão papaia (Carica papaya L., v. Sunrise soI0) .42
~~----
Figura 11: A. Sistema de captura do BITC volátil na cavidade interna do mamão
papaia. B. Frutos, com as cânulas plásticas e com as ponteiras vedadas, aos 5
dias pós-colheita, utilizados para medida do BITC dentro da cavidade interna do
mamão 50
Figura 12: Subdivisão das regiões do mamão papaia (1 a amostragem) para
análise dos açúcares solúveis na polpa. 61
Figura 13: Teor de açúcares solúveis (%) em três diferentes regiões da polpa do
mamão papaia do "CEASA" (var. Sunrise solo) com 2 dias após a colheita da 1a
amostragem (-D-verde e maduro) 62
Figura 14: Curvas de respiração e etileno (2a amostragem) em frutos de mamão
papaia (var. Sunrise Solo) durante o amadurecimento, colhidos com 150 dias
após a antese (triplicata de injeção ± desvio padrão) 64
Figura 15: Atividade da mirosinase relativa a 1a amostragem em diferentes
regiões da polpa (P1 = apical , P2=mediana e P3 = próxima ao pedúnculo) e nos
tecidos da semente e da sarcotesta (triplicata de extração ± desvio padrão) 65
Figura 16: Análise por HPLC de benzilglicosinolatos (BG) em mamão papaia. A.
Cromatograma do padrão de benzilglicosinolatos cedido por Richard Bennett
(Institute of Food Research-Inglaterra). B. Cromatograma da semente no ponto de
colheita (150 dpa) 67
Figura 17: Análise por CG/MS do padrão de benzilisotiocianato (BITC) (Aldrich)
(pico relativo a 110,69 ng de BITC pela curva de calibração) com respectivo
espectro de massa 68
Figura 18: Análise por CG/MS, cromatograma e espectro de massa da semente
de mamão papaia no ponto de colheita 69
~"*-".-._- -~--- -~-,.. -~- ---~-- -----~ - --- -----
Figura 19: Teores de benzilglicosinolatos (BG), atividade da mirosinase e teores
de BITC, durante o desenvolvimento, ponto de colheita (150 dpa) e
amadurecimento da Polpa (-0-) do mamão papaia relativo a 2a amostragem
(triplicata de extração ± desvio padrão) 70
Figura 20: Teores de benzilglicosinolatos (BG), atividade da mirosinase e teores
de BITC, durante o desenvolvimento, ponto de colheita (150 dpa) e
amadurecimento na Casca ( ) do mamão papaia relativo à 2a amostragem
(triplicata de extração ± desvio padrão) 71
Figura 21: Teores de benzilglicosinolatos (BG), atividade da mirosinase e teores
de BITC, durante o desenvolvimento, ponto de colheita (150 dpa) e
amadurecimento na Semente ( ) do mamão papaia relativo à 2a amostragem
(triplicata de extração ± desvio padrão) 72
Figura 22: Teores de benzilglicosinolatos (-O- Polpa; -Dl-Casca e
___Semente) durante o amadurecimento do mamão papaia na 3a amostragem
(triplicata de extração ± desvio padrão) 78
Figura 23: Teores de BITC (-o-Polpa; -M-Casca e Semente) do mamão
papaia, submetidos aos tratamentos com etileno e 1-MCP, comparados aos frutos
controle, durante o amadurecimento na 3a amostragem (duplicata de extração ±
desvio padrão) 79
Figura 24: Atividade da mirosinase relativa a 4a amostragem em sementes de
mamões submetidos aos tratamentos com 100 ppm de etileno(~), 100 ppb de
1-MCP (-0-) comparados aos frutos controle(-a-) (triplicata de extração ±
desvio padrão) 80
Figura 25: Teores de benzilisotiocianato na cavidade interna do mamão papaia
durante o amadurecimento ( Controle; 100 ppm Etileno e -0- 100 ppb 1-
MCP) (triplicata de injeção ± desvio padrão) : 84
-- -- ;-- -
Figura 26: Eletroforese em gel de agarose 1,5 % corado com brometo de etídeo,
de RNA total de mamão papaia. Padrão Low mass DNA ladder (P), polpa com 30
e 60 dpa ( P1 e P2), casca com 90 e 150 dpa (C1 e C2), sementes com 150 e 156
dpa ( 81 e 82) 85
Figura 27: Eletroforese em gel de agarose 1,5 % corado com brometo de etídeo
das amplificações com os primers 81 e R6 (1), com os primers 81 e R2 (2), e com
os primers 85 e R6 (3). Padrão Low mass DNA Ladder ( P) 86
Figura 28: Alinhamento das sequências parciais de aminoácidos (códigos IUPAC)
obtidas a partir da semente de mamão, comparadas a dezesseis seqüências de
mirosinases depositadas no Genebank. As sequências de mamão estão
representadas como miropep1000 (miro 1), miropep1030 (miro 2) e miropep400
(miro 3) e as demais representam Arabidopsis thaliana: Arab12 (AAK62412),
Arab24 (AAF14024), Arab37 (NP187537), Arab21 (857621), Arab02(P37702),
Arab53 (856653), Arab 91 (BT002458); Brassica napus (canola): BN89
(CAA79989), B50 (839550), BN26 (Q00326); Sinapis alba (mostarda branca):
MB36 (P293736), MB49 (819149), MB92 (P29092), MB38 (P29738) e também
mirosinase de Brevycore brassicae (inseto afídeo de brassicas): BR99
(AAL25999). Os códigos entre parênteses representam o número de acesso da
sequência no Genebank 91
Figura 29: Eletroforese de proteínas de mamão em sistema dissociante 8D8
PAGE, gel a 9%. Padrão de peso molecular (1); polpa com 120dpa (2); casca com
150 dpa (3); semente com 150dpa (4) 94
Figura 30: Eletroforese de extratos protéicos de E. coli em gel de poliacrilamida
9% da expressão piloto de mirosinase. Padrão de peso molecular (P); indução da
colônia 1 (IC1 ); bactérias não-induzidas com IPTG (NI); indução da colônia 2
(IC2) 95
--'" -- ~~
Figura 31: Análise de northem blot em diferentes tecidos do mamão papaia A.
Eletroforese de RNA total em gel de agarose (1,2%). POLPA com 30 dpa (1), 60
dpa (2),90 dpa (3), 120 dpa (4), 150 dpa (5); CASCA com 30 dpa (6), 60 dpa (7),
90 dpa (8), 120 dpa (9), 150 dpa (10) e SEMENTE com 60 dpa (11), 90 dpa (12),
120 dpa (13), 150 dpa (14), 153 dpa (15), 155 dpa (16), 156 dpa (17), 157 dpa
(18); L Autoradiografia de RNA hibridizado com a sonda específica para
mirosinase do mamão. B. Eletroforese de RNA total em gel de agarose (1,2%).
CASCA com 30 dpa (1), 60 dpa (2), 90 dpa (3), 120 dpa(4), 150 dpa (5) e
SEMENTE com 30 dpa(6), 60 dpa(7), 90 dpa(8), 120 dpa (9), 150 dpa(10), 153
dpa(11), 155 dpa (12), 156 dpa (13), 157 dpa(14); iL Autoradiografia de RNA
hibridizado com a sonda específica para mirosinase 97
3
TEORES DE BENZILGLlCOSINOLATO, BENZILlSOTIOCIANATO E
EXPRESSÃO DA MIROSINASE DURANTE O DESENVOLVIMENTO E
AMADURECIMENTO DO MAMÃO PAPAIA (Carica papaya L., varo Sunrise
Solo)
-1. INTRODUÇAO
o mamoeiro (Carica papaya, L.) é uma planta frutífera típica de regiões tropicais
e seus frutos tem grande aceitação no mercado internacional. O Brasil destaca-se como
um dos maiores produtores de mamão em escala internacional, concentrando 29% da
oferta mundial, seguido da índia (24%), Tailândia (8,8%), México (7,4%) e Indonésia
(5,9%). No Brasil, o mamão é cultivado em praticamente todo o território nacional à
exceção de algumas regiões com invernos rigorosos. As regiões Sudeste e Nordeste
somam em média 87,5% da produção nacional com destaque para os estados do
Espírito Santo e Bahia (Barretto et a!., 2002).
A exportação de frutas no Brasil vem crescendo muito nos últimos anos. Pelo
sexto ano consecutivo, a fruticultura brasileira se mantém superavitária e a balança
comercial de frutas frescas (Figura 1) fechou o ano de 2003 com um saldo de US$ 267
milhões (US$ 335 milhões de exportações e US$ 68 milhões de importações), 39% a
mais que em 2002 (Informativo IBRAF n. 19, fevereiro 2003). O incremento aconteceu,
basicamente, devido a significativos aumentos nas exportações de uva (77%), limão
(71%), abacaxi (59%), melão (54%), manga (44%) e mamão (35%). De janeiro a junho
de 2004 o aumento das vendas externas bateu em 23% o mesmo período de 2003. Até
o final de 2004, a meta de exportação do projeto Brazilían Fruit era de US$ 357,2
C I :. ~;' '~ ,~
Faculdade de Ciências F3r:nacêu\lCa~universidade de São Paulo
~._-=--
4
milhões (Informativo IBRAF n. 32, Junho 2004). Superando as expectativas, o Brasil
fechou o ano de 2004 com um superávit de US$ 369 milhões (Figura 1).
---.- Saldo
241
99 2000 2001 2002 2003 2004
.-J Importações
~ 'cial de Frutas Frescas
_ Exportações
400 1 Balanca Comel 337 3300
200
100
o
-100
-200
-300 ~!f~~~~~~~======~=:=;===~=========================:=ll
Figura 1: Balança comercial de frutas frescas do Brasil
(Informativo Ibraf, 2005)
Os números não são maiores porque vários países da Europa, o Japão e os
Estados Unidos continuam a dificultar as exportações de frutas frescas do Brasil,
através de imposições de barreiras conhecidas como "não - alfandegárias", alegando a
presença de fonte de inóculos patogênicos e a falta de um tratamento fitossanitário
adequado e efetivo para os frutos.
Um dos principais problemas fitossanitário da fruticultura brasileira é a infestação
por mosca-das-frutas (SAUL e SEIFERT, 1990) e os gêneros de maior relevância são:
Ceratitis capitata Wild e Anastrepha spp. Os frutos podem ser infestados por outros
5
gêneros igualmente importantes, porém estes dois são os de maior disseminação. Por
muitos anos foi usada a fumigação com brometo de metila, para ovos, larvas e insetos
adultos, mas por ter efeito deletério para os seres humanos, o seu uso foi proibido pelo
ministério da agricultura do Brasil e pelo USDA (ministério da agricultura dos Estados
Unidos), o que levou à busca de novas alternativas para substituir, com eficiência, os
métodos de desinfestação destes dípteros. Uma das tecnologias viáveis foi o
tratamento quarentenário, que consiste no tratamento hidrotérmico dos frutos,
mantendo-os em água a 46,1 cC por 70 a 90 minutos.
Um dos problemas do tratamento térmico, é que o aquecimento prolongado pode
provocar alterações na textura e no sabor dos frutos. Afeta também o equilíbrio entre a
relação interna de oxigênio e gás carbônico, o que provoca um estresse adicional nos
frutos que foram submetidos a este tipo de tratamento. Devido aos fatores citados, o
tempo de armazenamento e conservação também são prejudicados, diminuindo a vida
de prateleira destes frutos (WILLS et aI., 1995; SHELLlE et ai, 2000).
Para amenizar estes problemas, estudos vêm sendo realizados desde a década
de 1940, com plantas que produzem substâncias tóxicas denominadas fitoalexinas, as
quais são responsáveis por sua própria defesa. Desde 1970, já se sabe que o mamão
produz um composto tóxico, o benzilisotiocianato, capaz de combater alguns tipos de
fungos e diminuir a infestação por ovos e larvas de mosca das frutas (PATIL & TANG,
1970). Atualmente, o mecanismo de defesa das plantas tem sido melhor abordado e já
se sabe que um deles é o sistema glicosinolato-mirosinase, que está presente
principalmente nas brássicas. O mamão parece ser o único fruto portador deste
sistema. Estudos realizados na Itália mostraram que plantas produtoras de
6
glicosinolatos, que foram submetidas à secagem e incorporadas ao solo, foram eficazes
no combate a dois importantes patógenos: Pythium spp. e Rhizoctonia so/ani, que
substituiu a fumigação deste solo com brometo de metila (LAZZERI et aI., 2004). Estes
estudos mostraram que estas plantas podem seNir como biocidas naturais para o
controle de certos tipos de pragas, principalmente do solo (LAZZERI et aI., 2004).
A literatura relata que o sistema-glicosinolato-mirosinase pode ser de grande
importância para as plantas, para o ambiente, na nutrição dos seres humanos e
animais. A manipulação deste sistema de defesa pode ser uma das alternativas para
melhorar as qualidades organolépticas e a fitossanidade de frutos e hortaliças.
1.1 Classificação botânica do mamão papaia
Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
Superdivisão: Spermatofita
Divisão: Magnoliofita
Classe: Magnoliopsida
Subclasse: Dilleniidae
Ordem: Violales
Família: Caricaceae
Gênero: Canca
Espécie: Carica papaya
li
O mamoeiro é uma planta herbácea com altura entre 2 e 10m, que pode viver até
20 anos. Tem um sistema radicular superficial com raízes brancas e pouco abundantes,
8
Nas plantas femininas, as flores são amarelas, isoladas ou em grupo de 2 a 3
que se inserem diretamente no caule. Os frutos decorrentes são arredondados a
ligeiramente ovais. Um pomar com plantas femininas necessita de 10-12% de
mamoeiros masculinos, uniformemente distribuídos para assegurar a produção.
As plantas hermafroditas apresentam flores com órgãos masculinos e femininos
na mesma flor e não dependem de outras para a fecundação. Tem forma alongada
(elongata) ou arredondada (pentandrica) e seus frutos podem ser cilíndricos (preferidos
comercialmente) ou arredondados.
Vários fatores genéticos induzem a variabilidade nas flores ao longo do ciclo da
planta; em decorrência disso, os frutos podem apresentar-se em formas diversas
(BARRETO et aI., 2002). Assim, flores hermafroditas podem tomar-se femininas, e
masculinas tomarem-se hermafroditas, produzindo o mamão-macho, sendo as flores
femininas as mais estáveis. O sexo da planta é identificado após a emissão das flores.
O mamoeiro pode ser propagado por sementes, estaquia e enxertia, sendo que
comercialmente é multiplicado por sementes. As plantas fornecedoras de sementes
devem ter bom estado sanitário com baixa altura de inserção das primeiras flores,
precocidade e alta produtividade e serem hermafroditas em plantações distantes das
de outras variedades.
Quanto à classificação do fruto: o mamão é um fruto simples (os carpelos são
unidos entre si no início do desenvolvimento) do tipo baga, nasce do caule ou do
pedúnculo longo (macho), são arredondados, cilíndricos ou periformes, apresentam cor
amarela ou alaranjada quando maduros; possuem polpa de consistência suave e
sucosa, cor salmão, avermelhada e também amarela, contendo até 1.000 sementes
que se inserem na cavidade interna do fruto.
11
9
1.2 Ponto de colheita
o ponto de colheita do mamão depende muito do genótipo utilizado. A colheita é
realizada com base na idade da planta quando da ocorrência da primeira flor aberta
(pelo menos 5 plantas floradas), na primeira frutificação (pelo menos 5 plantas com
frutos seguros), que pode ser aos 90, 150, 180, 270 e 360 dias após o plantio das
mudas (BARRETO et aI., 2002) .
A colheita pode ser realizada o ano todo, mas para que o fruto tenha o padrão de
qualidade desejado, se faz necessário o conhecimento da maturação e
amadurecimento. O mamão faz parte da classe de frutos climatéricos, ou seja, continua
o processo de amadurecimento após a colheita. Nos frutos climatéricos, o
amadurecimento é sinalizado através de uma produção máxima de etileno (hormônio
do amadurecimento), diferente dos frutos não climatérios, que mantem um nível basal
deste hormônio. No mamão, o pico de etileno parece ocorrer antes do pico respiratório
(GOMEZ et aI., 2002).
Além do climatério, outro parâmetro importante para identificar o estádio de
maturação é a cor da casca, que pode ser medida por escalas visuais subjetivas, assim
como a descrita no System Approach (VIEIRA et aI. 2000), o mais utilizado (Figura 3),
ou por colorímetro de Hunter (OLIVEIRA et aI., 2002).
11'
10
Estádio O- fruto crescido e desenvolvido
Estádio 1 - fruto com até 15% da superfície amarela
Estádio 2 - fruto com até 25% da superfície amarela (1/4 madura)
Estádio 3 - fruto com até 50% da superfície amarela
Estádio 4 - fruto com 50 a 75% da superfície amarela
Estádio 5 - fruto com 100% da superfície amarela
o 2 3 4 5
Figura 3: Carta de cores do System Approach
Os frutos destinados à exportação são colhidos no estádio 2, principalmente os
destinados aos EUA, enquanto para a Europa, considera-se até o estádio 4. Para o
mercado interno, varia conforme a distância do mercado consumidor e o tempo de
comercialização da fruta (FRUTISERIES, 2000)
1.3 Variedades e cultivares
A cultura dt> mamoeiro está difundida em regiões que apresentam clima tropical,
pluviosidade elevada, solos férteis e bem drenados. A cultura retomou sua importância
econômica no Brasil, devido à introdução de cultivares havaianas do grupo Solo e dos
híbridos chineses do grupo Formosa, nos Estados da Bahia, Pará e Espírito Santo.
------ -- - --" - "'-- - -~ ~._-_.-
11
Desde 1995, o Brasil, se tomou um dos maiores produtores mundiais de mamão
papaia, sendo as cultivares Sunrise Solo, Improved Sunrise Solo Line 72/12 e Tainung
n01" as mais difundidas no país (MENDES et aI., 1996).
A variedade comercial é caracterizada por haste vigorosa com pequena distância
entrenós, que entra em floração de 3 a 6 meses após o plantio. São precoces, de porte
baixo e a maturação do fruto ocorre entre 5 e 6 meses após a floração, com ausência
de ramificação lateral. As variedades de maior interesse comercial estão descritas
abaixo.
O Sunrise Solo é procedente do Hawaí. São plantas precoces que fornecem
frutos periformes ou arredondados, pesando entre 400 e 600 g. Tem polpa laranja
avermelhada de excelente sabor, indicada para consumo in natura. A produção média é
de até 37 toneladas por hectare por ano (Uha/ano).
O Tainung nO 1 é um híbrido (mamão da Costa Rica X Sunrise Solo), altamente
produtivo. Os frutos são redondos ou alongados com polpa laranja-avermelhada, de
ótimo sabor, com produtividade média de 60 Uha/ano.
O Improved Sunrise Solo CV. 72112 é precoce (8 meses pós plantio), com
produtividade menor que a do Sunrise Solo. Produz frutos com formato periforme a
ovalado, pesando em média 450 g, com polpa vermelho-alaranjada.
O Formosa é um híbrido de origem chinesa com frutos pesando entre 0,8 a 2,5
kg. A polpa é amarela ou avermelhada, com produção acima de 70 Uha/ano.
O Estado do Espírito Santo, principalmente a região litorânea, é considerado o
principal produtor e exportador de mamão do grupo Solo do país, ocupando uma
posição de destaque no mercado interno e externo, pois além de utilizar as melhores
~ ~- -- --~_. ..-. _- --'-.--.0:-. - ------ ----- -~
12
variedades, investiu muito no melhoramento genético e na propagação das plantas,
além de ser uma região privilegiada quanto às exigências edafoclimáticas da cultura
(MENDES et aI., 1996).
1.4 Metabolismo das plantas
As plantas são organismos fotoautotróficos, ou seja, obtém energia livre através
da fotossíntese, processo no qual a energia luminosa transfere elétrons para o C02,
produzindo carboidratos, que posteriormente serão oxidados para liberarem a energia
livre. O metabolismo é um processo por meio do qual os sistemas vivos adquirem e
usam energia livre para realizarem suas funções, sendo tradicionalmente dividido em
catabolismo (ou degradação de nutrientes e constituintes celulares) e anabolismo
(síntese de compostos a partir de substâncias mais simples) (VOET et aI., 2000).
O processo de geração de compostos pelas plantas tem sido separado
arbitrariamente em dois metabolismos: o primário e o secundário (VICKERY & VIKERY,
1981). Os compostos produzidos pelo metabolismo primário são encontrados em toda
parte da planta e são essenciais no desenvolvimento e crescimento das mesmas. Estas
substâncias são produzidas através dos processos fotossintéticos e respiratório, sendo
representadas pelos carboidratos, proteínas, nucleotídeos, aminoácidos, lipídeos e
ácidos orgânicos (BUCHANAN et aI., 2000).
/' BIBLIOTECA"Faculdade de Ciências Fflrmacêull~all
Uníl/ersídade (l!l §;)9 111:141&
_~-= _~ __ ~ =-=-_- 0.=..- -~
13
o metabolismo secundário é formado através da transformação de substâncias
precursoras do metabolismo primário. Ao contrário do que relatava a literatura em 1981,
hoje se sabe que o metabolismo secundário é tão essencial à planta quanto o primário,
pois os hormônios vegetais (fitohormônios) e as vitaminas (VICKERY & VIKERY, 1981;
BRUNETON, 1999; BUCHANAN et aI., 2000), são produzidos pelas vias alternativas
dos metabólitos secundários. Há muito tempo se sabe que os fitohormônios (etileno,
auxinas, giberelinas, citocininas, ácido abscísico, jasmonatos, etc.) são os metabólitos
responsáveis pela sinalização do desenvolvimento e crescimento de todas as plantas.
São eles que irão sinalizar as células vegetais na diferenciação dos tecidos, assim
como a formação da raiz e da parte aérea (DAVI ES, 1995).
Além dos fatores de crescimento, o metabolismo secundário é reconhecido pela
síntese de uma diversidade de compostos de baixo peso molecular denominados
fitoquímicos, que apesar de não participarem de forma direta do crescimento e
desenvolvimento da planta, são muito importantes, pois protegem as plantas no seu
habitat natural. Os fitoquímicos são reconhecidos como substâncias de defesa contra
pragas e agentes patogênicos, estimulando a atração de insetos ligados à polinização e
atuando como agentes antioxidantes, substâncias protetoras de raios UV. Além disso
atuam na produção de aleloquímicos, que são substâncias liberadas pela planta que
inibem o crescimento de outras, fenômeno conhecido como alelopatia (VICKERY &
VIKERY, 1981 BRUNETON, 1999; BUCHANAN et aI., 2000).
Os fitoquímicos estão diferentemente distribuídos no reino vegetal em apenas
alguns grupos taxonômicos e apesar da descoberta da função de muitos destes
compostos, não se sabe ainda a função de vários dos metabólitos secundários
produzido pelas plantas (BUCHANAN et aI., 2000).
-- - - __ o __.. __
,---.-.....- - .~ - ~
14
Uma das principais funções do metabolismo secundário é o papel que ele
desenvolve no sistema de defesa das plantas. Na década de 40, foram estudadas
algumas cultivares de batata que eram atacadas pelo fungo da requeima. Os resultados
mostraram que em plantas resistentes havia um acúmulo de substâncias que inibiam o
crescimento do fungo, o que não ocorria com cultivares susceptíveis à doença
(MÜLLER & BÓRGER, 1940). Essas substâncias foram denominadas de fitoalexinas
(do grego phyton =planta e alexin =composto que repele) e sua descoberta causou
profundas mudanças no conceito de resistência de plantas a patógenos.
Diversas classes de produtos naturais como alcalóides, compostos fenólicos,
flavonóides, glicosinolatos, têm sido descritas como fitoalexinas (MIKKELSEN et aI.,
2003). Essas substâncias têm sido utilizadas como marcadores químicos, permitindo
traçar laços de parentesco entre as espécies vegetais, pois algumas plantas têm como
característica a produção de certas fitoalexinas (HARBORNE, 1999). Acredita-se que a
maioria das plantas são capazes de sintetizar estes compostos, mas alguns vegetais o
fazem de maneira muito lenta, permitindo que o microorganismo complete a infecção
antes do acúmulo da substância em quantidades efetivas para a inibição (BUCHANAN
et aI., 2000). Foi demonstrado que a velocidade de acúmulo das fitoalexinas é um dos
fatores decisivos para o estabelecimento ou não da infecção, a partir de vários estudos
de interações planta-patógeno (BUCHANAN et aI., 2000).
A família Caricaceae, da qual o mamão é um dos representantes, tem como
característica a produção de quantidades expressivas de benzilglicosinolato, metabólito
secundário de defesa ligado à planta. Baseados em um precedente do Hawaí há alguns
anos os produtores de mamão de uma região do Espírito Santo obtiveram liberação do
tratamento fitossanitário para exportar os frutos para. os Estados Unidos, com a
,'I
!;.1
15
argumentação de que os níveis de infestação por mosca das frutas nos pomares de
mamão estariam diretamente relacionados aos estádios de maturação do fruto e à
concentração de glicosinolatos presente no látex (SEO et aI., 1982; SEO et aI., 1983). O
raciocínio seria que monitorando o estádio de maturação, através da carta de cores
(SEO et aI., 1983), poder-se-ia garantir que o glicosinolato presente seria suficiente
para evitar a infestação do fruto, tomando desnecessário o tratamento térmico.
Um resumo do metabolismo primário e secundário das plantas está apresentado
na Figura 4.
16
- Proteínas- Ácidosnucleicos
~
Via do ácidochiquímico
Ir
AminoácidosAromáticos
EritrosÍ!
-6PglicóliseI Carboidratos 1"1 I
i
ácido pirúvico
Fotossíntese(Ciclo de Calvin
'C02
+H20 •
,I,
Ciclo dq ácidotricarbdlxílico
Ir
AminoácidosAlifáticos
... ... ,I,SubstânciasFenólicas
wI Esteróis I
Metabólitos
Secundários
Nitrogenados
Exemplos:
./ Glicosinolatos
./ Alcalóides
./ Betaínas, etc
•Metabólitos
Secundários
Nitrogenados
Exemplos:
./ Glicosinolatos
./ Alcalóides
./ Betaínas, etc
••
,I,ProteínasÁcidosnucleicos
Figura 4: Adaptação de vias metabólicas primária e secundária das plantas
(VICKERY & VICKERY, 1981; DEY & HARBORNE, 1977)
-- -- --- ----
17
1.5 Glicosinolatos
Os glicosinolatos são N-hidrossulfatos de J3-tioglicosídeos, constituindo uma
família de compostos, com mais de 110 estruturas identificadas. São encontrados em
diversos órgãos e em diferentes estádios de desenvolvimento da planta (CHEN &
ANDRÉASSON 2001). São sintetizados no citoplasma e acumulados dentro dos
vacúolos das células vegetais, podendo ser translocados através do floema, desde a
parte aérea até o sistema radicular (BRUDENELL et aI., 1999, CHEN & ANDRÉASSON,
2001). Foi demonstrado, por técnicas de imunocitoquímica, que a sinigrina, um
glicosinolato alifático, além de localizado no vacúolo, estavam ligados a células de
aleurona (ANDRÉASSON et aI., 2001). Em Arabidopsis thaliana os glicosinolatos foram
encontrados também em regiões denominadas como células-S, ou amido da bainha
(KOROLEVA et aI., 2000). As células-S são células gigantes, portadoras de substâncias
de reserva enriquecidas com enxofre que estão localizadas entre a linha do f10ema e a
endoderme, do lado externo do sistema vascular (KOROLEVA et aI., 2000;
ANDRÉASSON et aI., 2001).
Os compostos sulfurosos, os glicosinolatos, ocorrem predominantemente na
ordem Capparales, na família das Crucíferas, principalmente em brássicas e estão
presentes quase que exclusivamente nas plantas dicotiledôneas. Eles são responsáveis
pelo aroma característico e pelo sabor "pungente" de muitas plantas consumidas "in
natura", como rabanete, nabo, mostarda, couve, repolho, brócolis (Crucíferas), alho,
cebola (Liliaceas), entre outras.
-'-----.-- ~~ -------~~ :..- .-,~--.:=- ~-"'- -'--~ -=.....---==--..--- --=---~---=~=.--'-'
18
Os glicosinolatos são substâncias oriundas do metabolismo do nitrogênio e têm
uma grande importância do ponto de vista agronômico, devido ao seu papel protetor no
sistema geral de defesa das plantas. A literatura descreve vários casos em que os
produtos de hidrólise dos glicosinolatos tiveram ação bactericida, fungicida, inseticida e
nematicida, tanto nos solos como nas plantas (CHEN & ANDRÉASSON, 2001; BROWN
et aI., 1994)
No caso do mecanismo de defesa contra os insetos generalistas, verificou-se
que estes insetos possuem células quimioreceptoras responsáveis pela atração dos
mesmos para as plantas produtoras de glicosinolatos, levando-os a morte. Em insetos
especialistas, assim como os que atacam a couve e o nabo, observou-se que através
dos seus diferentes quimioreceptores, havia resposta a diferentes tipos de
glicosinolatos que eram responsáveis pela dos mesmos (ROESSING et aI., 1994;
SIMMONDS et aI., 1995; REYMOND et aI., 2004).
Os glicosinolatos podem agir também no sentido contrário à defesa, ou seja,
estimular a ovoposição de certos insetos, como é o caso do glicosinolato indólico: -
glucobrassicina. Além disso, alguns dípteros já foram modificados para adaptar-se a
certos tipos de glicosinolatos, como é o caso da sinigrina, sugerindo a coevolução deste
sistema com os insetos (RASK et aI. 2000).
Além dos benefícios para a agricultura, há muitas pesquisas na área destes
fitoquímicos com relação à prevenção de doenças em seres humanos, principalmente
às relacionadas com o câncer (FENWICK et aI., 1983), introduzindo esses compostos
na área dos alimentos funcionais. Entretanto, alguns estudos mostram que com o alto
consumo dos vegetais e frutas produtores de glicosinolatos por pessoas que
BIBLlO-:-\:::'v A
faculdade de CiênCIas Farmacêullcas
Universidade de São Paulo
19
apresentam predisposição ao câncer de bexiga, podem ter a situação agravada
(HIROSE et al., 1998).
Como conseqüência da ampla atividade biológica, o estudo das famílias de
compostos que contenham estas fitoalexinas tem sido abordada em diversas áreas,
incluindo a entomologia, fitopatologia, nutrição de plantas, química, nutrição humana,
genética e também na medicina.
Além das possibilidades já mencionadas, a síntese de glicosinolatos constitui
uma das mais rápidas respostas metabólicas das plantas. A análise da produção
dessas substâncias de defesa representa uma oportunidade única de estudar eventos
metabólicos e novas rotas de biossíntese de produtos naturais e de compreender como
os vegetais resistem ao ataque de microrganismos causadores de doenças e
sobrevivem em um ambiente altamente competitivo. Além disso, surgem as
oportunidades de se obter vários modelos estruturais, assim como a síntese de
pesticidas naturais, elementos anti-carcinogênicos, alimentos funcionais, entre outros.
1.5.1 Benzilglicosinolatos
A família Caricaceae é a única na ordem Violales que produz glicosinolatos,
especialmente o benzilglicosinolato que é típico da ordem Capparales. No caso do
mamão papaia (Carica papaya) há também a ocorrência de glicosídeos cianogênicos e
fenilpropanóides, entretanto em quantidades bem menos expressivas (RODMAN, 1981;
BENNETT et aI., 1997; FAHEY et aI., 2001).
Atualmente, muitos estudos têm focalizado o benzilglicosinolato e seu produto de
hidrólise, o benzilisotiocianato (BITC), principalmente devido a sua ação contra mosca
- -~~ - --
20
das frutas em papaia (SEO et aI., 1982; SEO et aI., 1983), lagarta das folhas e traças
das crucíferas em mostarda (LI et aI., 2000), ovos de pragas em mudas de videira
(BOREK et aI., 1998), fungicida natural contra Alternaria alternata em tomate (ROJAS-
TRONCOSO et aI., 200S).
o modo de ação dos isotiocianatos ocorre através da reação com compostos
nucleofílicos (espécies ricas em elétrons), uma vez que são substâncias eletrofílicas de
caráter polar. Os isotiocianatos são capazes de reagir e formar ligações covalentes com
os grupamentos -SH, -NH2 e -OH das enzimas e outras macromoléculas
biológicamente importantes. Estas interações podem causar sérios danos bioquímicos,
sendo que altas concentrações de isotiocianatos são suficientes para levar o organismo
alvo à morte (BORECK et aI., 1998).
Outros estudos mostram que concentrações adequadas de isotiocianatos, assim
como o BITC, podem agir no sistema de prevenção do câncer em mamíferos. O BITC
isolado de papaia foi um potente indutor das enzimas GST (glutationa S-transferase),
responsáveis pela detoxificação de elementos carcinogênicos (NAKAMURA et aI.,
2000; MORIMITSU et aI., 2000). Outros estudos reforçam que o BITC é um potente e
seletivo inibidor de carcinogênese, atribuindo esse efeito às modificações favoráveis
nas enzimas envolvidas no metabolismo de carcinogênicos (GOOSEN et aI., 2000).
Observações feitas com os subprodutos de glicosinolatos, o feniletilisotiocianato (PEIT)
e BITC mostraram que em baixas concentrações (~ 10 I!M) houve indução da apoptose
de células tumorais e que concentrações mais altas destas substâncias (2SI!M)
necrosaram estas células (KUANG & CHEN, 2004). Além da sua atividade
anticancerígena, o BITC, extraído e purificado a partir de sementes de papaia,
11'
- -- -----~ --- ---o
21
apresentou atividade anti-helmíntica nos mamíferos (Ascaris lumbricoides e
Carenorhabdifis elegans), segundo estudos realizados por KERMANSHAI et aI. (2001).
Estas sementes vêm sendo utilizadas há séculos como vermífugo na índia (LAL et aI.,
1976).
r"
1.5.2 Fatores que influem na composição dos glicosinolatos em
plantas
1.5.2.1 Genéticos
o perfil de benzilglicosinolatos depende da espécie em estudo. As plantas que
sintetizam estes compostos têm características que são peculiares a cada uma das
famílias envolvidas. O genótipo para a produção de glicosinolatos é segregado
independentemente de outros, sendo que esta característica permite que sejam
utilizados como marcadores genéticos, diferenciando, portanto, as famílias que
produzem estes metabólitos entre elas mesmas e também de plantas não produtoras
de glicosinolatos (KLlEBENSTEIN et aI., 2001).
A variabilidade genética ocorre principalmente no instante da modificação e
extensão da cadeia lateral dos aminoácidos precursores. Estudos conduzidos em li
Arabidopsis fhaliana mostraram que em relação à variabilidade estrutural dos
glicosinolatos, aqueles derivados de metionina são os que sofrem maiores modificações
(CHEN et aI., 2001) o que pode ser explicado por vários polimorfismos gênicos
(KLlEBENSTEIN et aI., 2001). Nas folhas, a regulação da composição e concentração
,11
J;,!
~ -- -- -----=- -~ --
--"--~ - - -.........-- "- --
22
dos glicosinolatos alifáticos (derivados de metionina) parece estar localizada
basicamente em quatro loei gênicos, denominados GS-enlong que controla a produção
de glicosinolatos com três ou quatro carbonos na cadeia lateral: o GS-Alk, responsável
pela produção do alquenil glicosinolato; o GS-OHP, que catalisa a produção do
glicosinolato 3-hidroxipropil e finalmente o GS-OH, que controla a produção do
glicosinolato 2-hidroxi-3-butenil (progoitrina e epiprogoitrina que tem propriedades
antinutricionais) (KLlEBENSTEIN et aI., 2001).
As recentes identificações dos genes envolvidos no prolongamento e
modificação da cadeia lateral em A. thaliana fornecem uma oportunidade para a sua
modificação em outras espécies com o objetivo de aumentar a diversidade química,
ampliando o conhecimento das vias metabólicas para uma eventual manipulação
genética destas espécies (CHEN & ANDRÉASSON, 2001). Através da manipulação
genética dos glicosinolatos, um perfil mais adequado destes compostos pode ser usado
para determinados fins, como a otimização do "f1avour". Por exemplo, poderiam ser
utilizadas técnicas de superexpressão do gene para aumentar quantitativamente os
glicosinolatos e seus subprodutos de hidrólise, com a finalidade de se obter maior
resistência a pragas e doenças e ampliar a diversidade de propriedades nutracêuticas
para os mamíferos. No sentido contrário, seria o silenciamento destes genes,
principalmente no caso de vegetais e/ou frutos, que produzem altas quantidades de
determinados tipos de glicosinolatos com propriedades antinutricionais (substâncias
que se complexam com elementos, ou enzimas, importantes a saúde), ou que sejam
tóxicos para o consumo.
-~-~---------------- ~-=----
23
1.5.2.2 Ambientais
Fatores como luz, temperatura, disponibilidade de água, fotoperíodo e nutrição
do solo influenciam na síntese e degradação dos glicosinolatos (HASEGAWA et aI.,
2000, VISVALlNGAM et aI., 1998; BLAKE-KALFF et aI., 1998). Foi observado que o
nível de expressão e a atividade da mirosinase em mostarda branca (Sinapis alba) ,
foram moduladas através dos níveis de micronutrientes no solo (ferro, cobre, zinco e
manganês) e de um macronutriente, o enxofre. A remoção destes nutrientes suprimiu a
atividade e expressão dessas enzimas (VISVALlNGAM et aI., 1998). Além dos fatores
ambientais e injúrias mecânicas, as doenças e pragas podem aumentar sensivelmente
o teor de glicosinolatos nas plantas. Em nabo, a injúria mecânica e o ataque de insetos
induzem a biossíntese de glicosinolatos indólicos e diminuem a dos glicosinolatos
alifáticos (ROSA et aI., 1997).
1.5.2.3 Processamento
A lavagem de vegetais anterior ao consumo pode causar a ruptura de algumas
células, particularmente em folhas novas, o que desencadeia a degradação dos
glicosinolatos. O corte, a cocção, o branqueamento, a secagem e o congelamento
podem influenciar também no mecanismo de degradação dos glicosinolatos, alterando
a composição, sabor e aroma dos alimentos. A cocção e o branqueamento nas
brássicas reduzem significativamente o nível de glicosinolatos devido à clivagem
térmica e enzimática destes compostos. O congelamento a -18 DC elimina a produção
-._- - -- -_.~-_._-~-~
24
de odores indesejáveis, mas altera as características originais do produto (ROSA et aI.,
1997)
1.5.3 Biossíntese dos glicosinolatos em geral
Vários genes ligados à via de biossíntese dos glicosinolatos têm sido
identificados (WITTSTOCK & HALKIER 2004). Estudos da biossíntese in vivo mostram
que o N-hidroxiaminoácidos, aldoximas, tiohidroximatos e desulfoglicosinolatos são
precursores dos glicosinolatos (HALKIER, 1999). Os glicosinolatos em geral são
derivados basicamente de sete aminoácidos: alanina, leucina, isoleucina, valina,
fenilalanina, tirosina e triptofano e, especificamente, o benzilglicosinolato é derivado da
fenilalanina e da tirosina (HALKIER, 1999; DU et aI., 1995; DU et aI., 1997; BENNET et
aI., 1997 CHEN & ANDRÉASSON, 2001). Baseados nas estruturas dos diferentes
aminoácidos precursores, esses compostos podem ser agrupados em três diferentes
classes: os glicosinolatos alifáticos, os aromáticos e os indólicoso A maioria dos
glicosinolatos possui cadeias alifáticas que, após a hidrólise, formam isotiocianatos em
pHs que variam de 5 a 70 Nesta mesma faixa de pH, os glicosinolatos aromáticos em
geral, também produzem isotiocianatos hidroxialquílicos que possuem alta instabilidade
e sofrem ciclizaçãoo Quando a cadeia lateral é um grupo alquenila, formam-se nitrilas
heterocíclicas, enquanto uma alila ou benzila produz tiocianatos. Já os glicosinolatos
indólicos geram, via um isotiocianato instável, o correspondente indol-3-carbinol e o íon
tiocianato. Exemplos destes tipos de glicosinolatos podem ser visualizados na Figura 5.
G i ..:. 'L ! ~- ;.0 ••- ,,,
Faculdade ce Ciências Farmacêuticas
Universid3de de São PaulO
,~
ll~
lU
I~
.l'~I
~I
25
HO OH
HO
HOIj
o11
5 0-5=0
-N/ IOH
glicosinolato alifático
Sinigrina
CH3I .O
. N -0- SOj glicosinolato indólico
/",,11 "I I" . I t )/ ."\ CH2 -C (4-metoxi-3-indolilmetl 9 ICOSlno a o .
I I I Formação do AIA (ácido indol acético)
g. .. S-Gluc...... N. .
OH
O···..
Hü .... . . .. S glicosinolato aromático
OH . - 2· ...J .. _'I G
OS03Figura 5: Exemplos de glicosinolatos indólicos, aromáticos e alifáticos
----------~ --------- ---- ------- _----:=- - - - ~._-~ --~----
26
A biossíntese é iniciada pela N-hidroxilação de aminoácidos precursores
proteicos ou não protéicos (OEY & HARBORNE, 1997) e pelo prolongamento da cadeia
destes aminoácidos para aldoximas. O estudo em microssomas isolado de Sinapis alba
L. (mostarda branca), Tropaeolum majus L. (agrião do méxico) e Carica papaya L.,
mostrou que os aminoácidos precursores, tirosina e fenilalanina, são convertidos a
correspondente aldoxima pelo complexo citocromo P450-monooxigenase, na iniciação
da biossíntese do benzilglicosinolato (HALKIER, 1999; OU et aI., 1995; OU et aI., 1997;
BENNET et aI., 1997 CHEN & ANORÉASSON, 2001). No caso do benzilglicosinolato,
somente uma das enzimas do citocromo é atuante, a monooxigenase (CHEN &
ANORÉASSON, 2001). Em outros modelos, o citocromo pode ser dependente também
de f1avina contendo monooxigenase e de peroxidases ligadas à membrana plasmática
(CHEN & ANORÉASSON, 2001). A natureza das enzimas que catalisam a conversão
dos aminoácidos tem sido objeto de muitos estudos. A CYP79A2 foi a primeira enzima
encontrada no processo de catálise da conversão do aminoácido para a aldoxima na
biossíntese dos glicosinolatos. A caracterização da proteína recombinante da CYP79A2
mostrou que ela é uma N-hidroxilase com a função de converter a L-fenilalanina em
fenilacetaldoxima, o precursor do benzilglicosinolato. A enzima CYP79A2 apresentou
um Km de 6.7IlmoI.L-1 com alta afinidade pelo substrato L-fenilalanina (WITTSTOCK &
HALKIER, 2000). Ensaios com plantas de A. thaliana modificadas para a
superexpressão da CYP79A2, mostraram altos níveis de acúmulo de benzilglicosinolato
(WITTSTOCK & HALKIER, 2000).
,~
"~
~::=......---:ao:;:~__- -- ---
27
As enzimas doadoras de enxofre para a aldoxima, as glutationa S- transferases
(GST), não foram ainda bem caracterizadas, mas experimentos com animais mostram
que a cisteína seria a maior responsável pela doação de enxofre nesta etapa (MATSU,
1968, In: WITISTOCK & HAlKIER, 2000).
As enzimas que catalizam as duas próximas etapas da via de biossíntese dos
glicosinolatos são a tiohidroximato glicosiltransferase (S-GT), que transfere uma
molécula de glicose para o ácido tiohidroxímico, a partir da uridinadifosfato glicose
(UDPG) e a desulfoglicosinolato sulfotransferase, que tem a função de transferir o
grupamento sulfato, a partir do doador ativo de sulfato: 3'- fosfoadenosina 5'-
fosfosulfato (PAPS), formando a estrutura geral dos glicosinolatos (DEY & HARBORNE,
1997). Estas duas enzimas foram purificadas e parecem não ser tão específicas quanto
as enzimas da primeira etapa, as responsáveis pela primeira conversão dos
aminoácidos (WITISTOCK & HAlKIER, 2000; GUO & POUlTON, 1994).
A via de biossíntese dos glicosinolatos em geral, descrita na Figura 6, foi
resumida a partir de vias parciais sugeridas por DEY & HARBONE (1997), FAHEY et aI.
(2001), CHEN & ANDRÉASSON (2001) e WITISTOCK & HAlKIER (2002). Ela é
iniciada pela prolongação da cadeia de aminoácidos, seguida da descarboxilação
oxidativa para a correspondente aldoxima e conversão da oxima para uma estrutura
básica de glicosinolato. Na sequência ocorrem as modificações secundárias, assim
como oxidação, hidroxilação, metoxilação, desnaturação, sulfatação e glicosilação que
dão origem às diferentes classes desses compostos (HAlKIER, 1999; BENNETI et aI.,
1997; BAK et aI., 1998; FAHEY et aI., 2001).
;I~
lU
':':-~ -------. ~~-
----
28
N-hidroxiaminoácido
P450CY79s
(entra 02 + NADPH) sai +H20 + NADP
COOtt I éOOM ~ t ..0 oHler. I o .+/J . . /.~ -. tt-e, ..J. R-CM:=~.... .~J>.\:; It-QI!!:, ~
li! _ aldomma . o o2 • Ia-aa
CisteÍDa
,~ e:)It-CH-H. .J. ':l""'....,. 'O .'
4
Glutatio (GST)
S-Transferase
(~lC
'fI.. I~.····~~_-Clt '. *
"desulfoglicosinola o 'lt-t)io)
SulfotransferaseGlicosiltransferase
desulfoglicosinolato
iIt . . tiohid..ximalo 'V .....I ~.SII 'V] ~HÀ-Qf' ..I.$H H\" lIIl' - 11-.. ... ... I UDP4lt; •.tl;.;.;./ .,f\\ . ~~ I $ QtfI;:') '.1 Iló _ ...l .. H
~ ~~ ,M tiohidroxiamino Tiohi roximato M_Q»
(S-GT)Glicosinolato
Figura 6: Biossíntese dos glicosinolatos adaptada de DEY & HARBORNE (1977)
FAHEY et aI. (2001); CHEN & ANDRÉASSON (2001); WITTSTOCK & HALKIER (2002)
PAPS: fosfoadenosinafosfosulfatase: doadora do grupamento sulfato
UDP-Glc: uridinadifosfato-glicose
A via de biossíntese do benzilglicosinolato, mostrada na Figura 7, foi adaptada a
partir das vias descritas por WITTSTOCK & HALKIER (2000), WITISTOCK & HALKIER
(2002) e WITTSTOCK & HALKIER (2004).
~ --= '- -..-...=.=.-.--=--
30
1.5.4 Evolução da biossíntese dos glicosinolatos
Os glicosídeos cianogênicos são amplamente distribuídos dentro do reino
vegetal e estão presentes nas pteridófitas, gimnospermas e angiospermas, fazendo
parte também do organismo dos insetos, indicando que a ciànogênese surgiu como um
evento precoce (SAUPE, 1981). Até a década de 1980, as plantas eram classificadas
entre as que produziam glicosídeos cianogênicos e as que sintetizavam os
glicosinolatos. Atualmente, considera-se que as plantas produtoras de glicosinolatos
evoluíram a partir de espécies produtoras de glicosídeos cianogênicos, justamente por
conter em comum genes homólogos denominados como CYP79s (Figura 8). Estes
genes estão ligados ao complexo protéico caracterizado como sistema citocromo P450
dependente de monooxigenases, que estão envolvidos na biossíntese dos
glicosinolatos (BENNETI et aI., 1997). As CYP79s são responsáveis pela conversão do
aminoácido precursor às suas correspondentes aldoximas, portanto, para cada tipo de
aminoácido precursor parece haver uma aldoxima correspondente (WITISTOCK &
HALKIER,2000).
Alguns estudos mostram grandes avanços na descoberta dos genes da família
CYP79, como a superexpressão do gene CYP79A1 em Sorghum bic% r, que cataliza a
conversão da tirosina para a oxima correspondente (na biossíntese do glicosídeo
cianogênico), resultando na produção de altas quantidades de p
hidroxibenzilglicosinolatos (p-OHBG). A superexpressão dos genes CYP79A2 e
CYP79B2, em A. thaliana resultou na produção de altas quantidades de
benzilglicosinolatos e glicosinolatos indólicos, respectivamente (BAK et aI., 2000;
I~
----------------------------------------
31
MILKKELSEN et aI., 2000; WITTSTOCK et aI., 2000). Todos estes dados sustentam a
hipótese de que o sistema de formação da aldoxima pelo citocromo P450 em plantas
produtoras de glicosinolatos está ligado ao sistema de produção de glicosídio
cianogênico (Rask et aI., 2000).
A similaridade estrutural e a distribuição entre os glicosídios cianogênicos e
glicosinolatos, indicam que a biossintese de glicosinolatos provavelmente está
envolvida baseada na "predisposição cianogênica" dos vegetais (RODMAN et aI.,
1998). Pelos dados obtidos na literatura, o mamão parece ser uma planta intermediária
na evolução destas espécies produtoras de glicosinolatos, pois mantêm as duas vias de
biossíntese, o que poderia ser uma ferramenta interessante para o estudo de
taxonomistas (BENNET et aI., 1997; BAK et aI., 1998).
cianogênicos
OXIMAi CYP79S
Trp
VaI
Met ~prOlongaçãOPhe da cadeia '"~~----i
Figura 8: Via metabólica, comum às plantas produtoras de glicosinolatos e glicosídeos
cianogênicos baseados nos derivados da fam í1ia gência descrita como CYP79s (KVL-
Department of Plant Biology: www.plbio.kvl.dk).Met.Phe.Trp.I1e.Val. correspondem aos
aminoácidos, metionina, fenilalanina, triptofano, isoleucina e valina, respectivamente.
~ ,-..:....- --
32
1.6 Degradação dos glicosinolatos
A degradação dos glicosinolatos (Figura 9) ocorre através das mirosinases que
catalisam a hidrólise dos S-glicosídeos da estrutura intacta dos glicosinolatos em geral,
liberando um resíduo de D-glicose e um fragmento de aglicona, formando o sistema
descrito na literatura como sistema-glicosinolato-mirosinase.
A hidrólise dos glicosinolatos intactos pode ocorrer em todos os indivíduos que
possuem a mirosinase. Elas estão presentes em algumas famílias de plantas e também
fazem parte da flora intestinal dos seres humanos e de animais (CHEN et aI., 2004).
Nas plantas, a hidrólise geralmente ocorre quando as células são rompidas através de
injúrias produzidas por ataque de patógenos, insetos, danos mecânicos e herbivoria
(RASK et aI., 2000).
A degradação é uma etapa importante, porque é através dela que ocorre a
liberação dos compostos com atividade biológica, gerando uma variedade de produtos
cuja natureza química e função bioquímica é determinada pelos fatores como pH,
presença de cofatores e principalmente pela estrutura das cadeias laterais dos
glicosinolatos envolvidos.
Observações in vivo mostram que as agliconas, intermediárias na via de
degradação dos glicosinolatos, são muito instáveis e rearranjam-se rapidamente para
formar o tiocianato e o álcool correspondente, dando origem também aos grupamentos
sulfatos (ex. oxazolidina-2-tionas), epitionitrilas e nitrilas (Figura 9), em pHs que variam
de 2 a valores acima de 8. Já os isotiocianatos são formados em pH 8.0, as nitrilas em
pHs que variam de 2 a 5 e faixas de pH acima de 8.0 origina os tiocianatos (FAHEY et
aI., 2001, CHEN & ANDRÉASSON 2001; WITTSTOCK & HALKIER, 2002)
BIBLIOTECAFaculdade de CiênCIas Farmacê<Jtic3S
Universidade de São Pal:lo
_ -_ _o__----=- __
33
Doughty et al.(1996) ao estudar plântulas de Brassica rapa (nabo) com relação
ao fungo patogênico Alternaria brassicae, observaram que os glicosinolatos intactos
são praticamente inativos e que os seus catabólitos, produtos de hidrólise da
mirosinase, particularmente os isotiocianatos, é que são altamente ativos. Esses
isotiocianatos parecem atuar em diversos organismos, pois além das plantas eles são
inibidores de mitose e estimulam a apoptose em células tumorais humanas, in vitro e in
vivo (JOHNSON, 2002).
(2001) e CHEN & ANDRÉASSON (2001)
Figura 9: Degradação do glicosinolato pela mirosinase adaptada de FAHEY et aI.
----II.~R-S - C - N Tiocianato
pH= > 8
J:0-
4pH= 5-8
R-N=C-S lsoliocianato
pH= 2-5 R-C -N Nitrilas
R J~Ii
N"""OS03
agliwDa .-/~
~_l ~~Y~--\~H Epfthíonitrile
Ol(.li~jne- O -{.,'2-thlooe lI, .
5
Glicosinolato
R" ;\':.Yr: "<0Gr..,~C ~- . ~II IlU.rosinase
~OSO 3
-~ ~ --_. -,--- ~ - ---
34
1.7 Mirosinases
As mirosinases (J3-tioglicosidases, tioglicosídeo glicohidrolases, EC 3.2.3.1), são
enzimas que catalisam a hidrólise dos glicosinolatos em geral. Elas estão incluídas na
família das o-J3-glicosidases encontradas em eucariotos e procariotos. O que diferencia
as mirosinases de uma glicosidase comum é um número de resíduos de aminoácidos
altamente conservados, responsáveis pelo mecanismo catalítico e que estão envolvidos
na ligação da glicose com a aglicona (BURMEISTER et aI., 1997; RASK et aI., 2000).
A maior parte das mirosinases são proteínas solúveis (CHEN & ANDRÉASSON,
2001), mas certos tipos de mirosinases podem estar complexadas com outras proteínas
que as tomam insolúveis, como ocorre em em B. napus (canola) (RASK et aI., 2000).
Essas enzimas são altamente glicosiladas, e dependendo do número de glicosilaçóes
são encontradas em diferentes isoformas (CHEN & ANDRÉASSON, 2001). Os
carboidratos da cadeia lateral da mirosinase são constituídos principalmente por fucose,
manose e N-acetilglicosamina, somando cerca de 10 a 20% da massa molecular da
subunidade total (BURMEISTER et aI., 1997; RASK et aI., 2000).
A atividade das J3-tioglicosidases parece se diferenciar de acordo com a espécie,
com a cultivar e com relação ao tipo de órgão da planta avaliado (RASK et aI., 2000),
sendo as afinidades mais altas encontradas nas sementes e em plântulas (BONES,
1990). As mirosinases apresentam atividade ótima em pH de 4 a 7. Foi avaliada a
afinidade destas enzimas, extraídas de L. sativum, por 29 diferentes substratos
(glicosídeos) e apenas quatro foram classificados como sendo bons substratos e em
ordem decrescente de maior afinidade: sinigrina, benzilglicosinolato, p-nitrofenil-J3-D-
- --~~~~==:::::::::: - -~_"':...:.--- -- . ~ ~- ~- --
35
glicosídeo (PNPG), e o o-nitrofenil-f3-D-glicosídeo (DURBAM & POUlTON, 1990;
BOTTI et aI., 1995).
Várias isoenzimas de mirosinase têm sido identificadas, isoladas e purificadas a
partir das plantas Lepídíum satívum L. (DURBAM & POUlTON, 1990), mostarda branca
(ERIKSSON et aI., 2001) e folhas de nabo (JWANNY etal., 1994). Foram também
seqüenciadas em várias espécies de brássicas, principalmente Brassíca napus (FAlK
et aI., 1992; XUE & RASK, 1995b; FAlK & RASK, 1995; CHEN & ANDRÉASSON,
2001) e também em Arabídopsís thalíana (BAK et aI., 1998). Porém, com relação à
purificação e sequenciamento da mirosinase do mamão ou em qualquer outro fruto,
nada foi descrito até o momento. As diferentes isoenzimas têm sido detectadas nos
diferentes órgãos da planta através de técnicas de focalização isoelétrica, por atividade
em gel nativo (PHELAN, 1980; PIHAKASKI& PIHAKASKI, 1978) e também porwestem
blot (lENMAN et aI., 1993).
Em B. napus e S. alba, as proteínas de mirosinase são diméricas com massa
molecular variando entre 135 e 150 kDa. Análises dos clones de cDNA que codificam
mirosinases de S. Alba (XUE et aI., 1992), B. napus (FAlK et aI., 1992; FAlK & RASK,
1995) e A. thalíana (CHADSHAWAN et aI., 1993) mostraram que a massa molecular da
cadeia protéica em uma subunidade da mirosinase é de cerca de 59 kDa.
Com relação à distribuição gênica e localização das isoenzimas de mirosinases,
o isolamento de clones de cDNAs e clones genômicos têm possibilitado a obtenção de
diversos dados (CHADCHAWAN et aI., 1993; FAlK et aI., 1992; FAlK & RASK, 1995;
lENMAN et aI., 1993; THANGSTAD et aI., 1991; XUE et aI., 1992; XUE & RASK, 1995,
XUE et aI., 1995). As mirosinases de Brassíca napus e Sínapís alba, por exemplo, são
---- --==~;;;;:~;;;;;;;;;:::;;;::::----- ~ '"
36
codificadas por três famílias gênicas que foram subdivididas e nomeadas como gene da
família "MA" (ou Myr1), onde estão presentes 5 genes que foram identificados por
técnicas de Southern bloting e parece codificar mirosinases com subunidades de
75 kDa de massa molecular, a família "MB" (ou Myr2), com estimativa de 10 a 15 genes
que codificam proteínas de massa molecular com subunidade de 65 kDa e a última
delas foi denominada como família "MC", composta por 5 genes que codificam
isoenzimas de 70 kDa. Os dados obtidos com B. napus e S. alba, mostraram diferenças
claras nos tamanhos das subunidades e diferentes graus de glicosilaçóes e que
algumas isoenzimas aparecem conjugadas a outros tipos de proteínas (RASK et aI.,
2000).
o sistema de defesa contra insetos pode estar ligado somente a certos
transcritos de algumas isoformas de mirosinase, como sugerem os resultados obtidos
com Brassica napus (CHEN & ANDRÉASSON, 2001). A mirosinase, que possivelmente
atuaria contra insetos, parece fazer parte da família gênica MBP, que são mirosinases
do grupo MB associadas à outros tipos de proteínas com motivos esterase/lipase que
codificam J3-tioglicosidases, com subunidades aproximadamente de 65 kDa (CHEN &
ANDRÉASSON, 2001).
Quanto à localização das mirosinases nos tecidos, foi demonstrado que elas
estão presentes em células especializadas, denominadas de "células de mirosinas"
que, quando agrupadas, formam os grânulos de mirosina (THANGSTAD, et aI., 1991).
Estes grânulos estão localizados nas células parenquimatosas do floema em estruturas
denominadas de idioblastos (estruturas vegetais que têm função secretora de diferentes
tipos de substâncias) (HOGLUND et aI., 1991; ANDREASSON et aI., 2001). Além disso,
37
como demonstrado por imunolocalização, as f)-tioglicosidases estão presentes também
nas células guarda e nas células adjacentes, fazendo parte dos elementos de seiva.
Estes testes foram realizados no pedúnculo floral de Arabdopisis, região altamente
produtora de glicosinolatos. O conjunto de resultados obtidos confirma a hipótese de
que as mirosinases estão localizadas em compartimentos separados dos glicosinolatos
e sugere que o transporte das mirosinases ocorre via plasmodesmos através das
células adjacentes (HUSEBYE et aI., 2002).
1.8 Sistema glicosinolato - mirosinase no mamão
'~:ll
Ijj,\
O mamão é o único fruto, identificado até o momento, que apresenta como
característica genética a produção de glicosinolatos, especificamente o
benzilglicosinolato, substrato para a mirosinase na produção do BITC. Em 1970, Tang
demonstrou que o B/TC tinha ação fungicida contra um dos principais fungos do
mamoeiro, o P. parasitica, sendo mais eficaz que a papaína, substância utilizada na
época para controle natural (TANG, 1970). Foi demonstrado que a concentração do
BITC era mais alta em frutos verdes, que nos maduros, e em tecido macerado ou
injuriado, sugerindo, que a enzima e o substrato poderiam estar em compartimentos
diferentes (PATIL E TANG, 1974; SEO et aI., 1983).
A concentração de BITC foi determinada em vários órgãos vegetativos da planta
de Canca papaya, tais como folhas, internódios caulinares e raízes. As folhas e os
tecidos jovens foram os locais de maior acúmulo de BITC (30-35 J..lM) com
concentrações decrescentes no estádio maturo e senescente (BENNETT et aI., 1997).
38
Os valores mais altos de BITC foram encontrados nas sementes (141,7 - 342,7 ppm) e
quantidades bem menores no pericarpo (23,3 - 45,1 ppm), na polpa (21,2 - 43,1 ppm) e
no látex (15,2 - 19,8 ppm), dependendo da variedade do mamão (SHEU E SHYU 1996).
Existem várias evidências que contribuem para a hipótese de que os
glicosinolatos são altamente eficazes contra agentes patogênicos (CHEN &
ANDRÉASSON, 2001). Além de inibir a ovoposição de larva de mosca das frutas, o
BITC encontrado nos vasos lactíferos do mamão parece agir como regulador endógeno
da produção de etileno (PATIL & TANG, 1974). Esta hipótese foi baseada em dados em
que a produção de etileno foi inibida no mamão, quando infiltrados com BITC (0,046
mM). Consequentemente, dependendo do nível de BITC presente no fruto, o
amadurecimento poderia ser retardado, através da inibição pelo etileno (PATIL &
TANG, 1974).
Não se sabe muito sobre o mecanismo de defesa no mamão, principalmente
com relação as mirosinases e com relação aos níveis de substrato (glicosinolatos) e
produtos (BITC) disponibilizados pela enzima no decorrer do desenvolvimento e
amadurecimento do fruto. Também não se sabe quais os níveis destas substâncias que
seriam suficientes para agir contra cada tipo de patógeno e/ou pragas, já que cada
espécie destes indivíduos parece ser capaz de reagir de maneira diferente ao substrato
e a disponibilização do composto ativo (BORECK et aI., 1998; LI et aI., 2000). A
disponibilização de substâncias tóxicas através do metabolismo secundário constitui
uma das mais rápidas respostas metabólicas na defesa das plantas (DEY &
HARBORNE, 1997). A produção destas substâncias na planta parece ser tão elevada
que há necessidade de um outro sistema de reparo que promova a detoxificação destas
---- - ------------ --- ------- --_- -",... -- -----~ .. ,. --_--=-~_ ~-- ~--~.~~-.---o-- -~.~-
39
células, para que as mesmas não se autodestruam (MARRS et aI., 1996 DERRIDER et
al.,2002).
A análise da produção das substâncias de defesa representa uma oportunidade
única de estudar eventos metabólicos e novas rotas de biossíntese de produtos
naturais, e de compreender como os vegetais resistem ao ataque de uma ampla
variedade de pragas e microorganismos patogênicos, resistindo em ambientes
altamente competitivos. Além destes fatores, surge a oportunidade de se obter vários
modelos estruturais, assim como a síntese de defensivos naturais, controle biológico de
pragas, elementos anticarcinogênicos e alimentos funcionais.
2. OBJETIVOS
Este trabalho teve como objetivo verificar a relação entre benzilglicosinolatos,
mirosinase e benzilisotiocianato durante o desenvolvimento e amadurecimento do
mamão do mamão papaia (Carica papaya L., varo Sunrise solo) e a influência do etileno
e do 1-MCP sobre este sistema.
~.
.~
"
~.
IJ.~
----- -
40
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
Para a obtenção da primeira amostragem foram utilizados mamões (var. Sunrise
Solo) adquiridos na Central de Abastecimento de São Paulo (CEASA-SP), com cerca
de 4 dias pós-colheita (dpc). Foram classificados como verdes os mamões que
apresentaram casca verde, ausência de estrias amarelas (estádio 1 do System
Approach), sementes pretas e brancas e textura firme (30,16 ± 1,Oa N). Os maduros
foram classificados por apresentar de duas a três estrias amarelas na casca (estádio 2
do System Approach), sementes pretas e textura macia (3,49 ± 0.55 N). Em cada um
dos dois estádios, a polpa foi separada da semente e da casca e dividida em 3 regiões
diferentes: P1 (polpa da região apical do fruto); P2 (polpa da região mediana do fruto);
P3 (polpa próxima ao pedúnculo) que foram congeladas em nitrogênio líquido e
armazenadas em ultrafreezer a - ao°c .
Além disso, foi feita uma segunda amostragem com frutos da variedade Sunrise
Solo, em diferentes fases do desenvolvimento, adquiridos da empresa exportadora de
mamão a "Agrapapaya" na região de Unhares (ES). Esta região apresenta
temperaturas máximas entre 30°C e 32°C e mínimas entre 15°C e 1aoC, com
precipitação média anual em tomo de 1200 mm. Os frutos foram colhidos com 30, 60,
90, 120 e 150 dias pós-antese (dpa), sendo que o ponto de colheita comercial é
geralmente realizado aos 150 dpa (Figura 10). Os frutos vieram acondicionados em
caminhões refrigerados, chegando a São Paulo com um dia pós-colheita.
'~l.~
1,Il
..
-- _._--~---~ ~- --"..:- -- ~ -::-- - -' --"
41
As amostras de cada estádio foram separadas em casca, polpa e semente
sendo posteriormente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a - SO°C. Os
frutos com 150 dpa foram separados e armazenados em câmaras tipo 8.0.0 a 20°C
para acompanhar o amadurecimento, que foi monitorado através dos teores de C02 e
etileno. Durante o amadurecimento, três frutos foram separados, armazenados em
frascos de 1L durante 1 hora e o gás coletado com a seringa Gas Tight e injetado em
cromatógrafo a gás. Do restante dos frutos (150 dpa), foram coletados batoques que
consistiram de cilindros transversais de tecidos, retirados da porção equatorial do fruto
(5 cm de diâmetro), com o auxílio de um furador de rolhas esterelizado. Os batoques,
foram coletados durante todo o período de amadurecimento, congelados em nitrogênio
líquido e armazenados a - 80°C.
Uma terceira amostragem foi feita com mamões da mesma empresa e da
mesma variedade com 150 dpa (ponto de colheita). O amadurecimento foi
acompanhado através da respiração e produção de etileno e os frutos foram
submetidos a dois tipos de tratamento: (1) tratados com 100 ppm de etileno, durante 12
horas em câmara 8.0.0. e (2) tratados com 100 ppb de metilciclopropeno (1-MCP), um
potente inibidor da ação do etileno, nas mesmas condições. Os frutos controle foram
armazenados nas mesmas condições dos tratados. As amostras dos três grupos foram
coletadas e congeladas em nitrogênio líquido, diariamente, até o seu completo
amadurecimento, sendo em seguida, armazenados em ultrafreezer a - SO°C.
~
"
l'~
!~
,Ij
-- -- ~ -~- .. _-- ,._'--.-'.-....,.-._-- --~.
43
3.2.2 Determinação de Etileno e C02
o etileno e o C02 foram analisados por cromatografia gasosa (CG) e detectados
por ionização de chama (FIO) e condutividade térmica (TCO), respectivamente. Foi
utilizada uma coluna HP-PLOT, com as seguintes características: 30 m de
comprimento, espessura do filme de 40.0 mm e diâmetro interno de 0.53 mm. A injeção
do gás foi manual usando a seringa GAS Tígth, própria para injeção de gases. O gás de
arraste utilizado foi o hélio.
Condições de trabalho para o etileno:
• Temperatura isotérmica (fomo): 30°C
• Temperatura do injetor 200°C, detector: 250°C
• Fluxo: 1 mLlmin
• Modo de injeção: pulsed split, Taxa: 12,5: 1
• Volume de injeção: 5 mL
Condições de trabalho para o CO2 :
• Temperatura isotérmica (fomo): 30°C
• Temperatura do injetor e do detector: 250°C
• Fluxo: 4 mLlmin
• Modo de injeção: split, Taxa de split: 50: 1
• Volume de injeção: 1 mL
----------
"I,~I
~~!
~J
I.',
--------------------------:-::-:----- - '----=.:"
44
3.2.3 Análise do benzilglicosinolato em mamão por HPLC
o benzilglicosinolato foi isolado por HPLC (1100 da Hewlett - Packard) acoplado
a um injetor automático. O composto foi detectado com o auxílio de um detector de
arranjo de diodos (PDA) e monitorado na região do UV. A coluna utilizada foi a de
fase reversa, Luna C18(2) (250 x 4.6 mm, 5 J1.m) da Phenomenex, acoplada a uma
pré-coluna "Securityguard" também da Phenomenex. O método de análise foi o de
KIDLE et aI. (2001), com modificações.
3.2.3.1 Extração do benzilglicosinolato intacto
Cerca de 125 mg de casca, polpa e semente, nos estádios, 30, 60, 90, 120 e 150
dpa, previamente pulverizadas em nitrogênio líquido, foram homogeneizados em 1
mL de MeOH 70% + 0,1% de TFA com 50 J1.1 de sinigrina 12 mM (padrão interno) em
tubos de microcentrífuga com tampa de rosca. Os homogenatos foram agitados por
ZO minutos a 70°C. Logo após o resfriamento, foram centrifugados a 13000 rpm
(4°C) durante 10 minutos e filtradas em filtros Millex™ da Millipore (0.45 J1.m). A
sinigrina foi utilizada como padrão interno para teste de recuperação do composto na
amostra (50 J1.1 de sinigrina 12 mM em 1 ml de MeOH 70% + 0,1% de TFA).
""."':11
~.
rIi
"1
li.l
~_~=:;;õII!~::i;:,~-===-~==~,.~.~~~~-"- -- - - -~-~---
45
3.2.3.2 Condições utilizadas para análise de benzilglicosinolato no HPLC
Foi feito um gradiente de concentração da fase móvel, que era composta pelo
solvente A: 0.1 % (vlv) de TFA (ácido trifluoracético) em água e pelo solvente B:
0.1 %(vlv) de TFA em MeOH (tabela 1). No método cromatográfico, foi realizada uma
varredura de 200 a 400 nm e a detecção feita a 228 nm. O fluxo de passagem da
fase móvel foi de 1,0 mL.min-1, com pressão máxima de 300 bar. O volume injetado
foi de 20 IlL e a temperatura da coluna de 25 oCo Nestas condições de trabalho, o
tempo de retenção da sinigrina foi de aproximadamente 7 minutos e o do
benzilglicosinolato entre 19 e 20 minutos. O tempo de corrida para cada análise foi
de 55 minutos acrescido de 10 minutos para limpeza e reequilíbrio da coluna.
O padrão de benzilglicosinolato, utilizado na curva de calibração, foi cedido pelo
pesquisador Richard Bennett, do Institute of Food Research (UK). O padrão injetado
no HPLC nas condições descritas na tabela 1, forneceu um pico no tempo de
retenção que variou entre 19 e 20 minutos.
~-- - -- ~~-.. __-= a_.~ ~ ~,.".....--..-. _~~_
1
46
Tabela 1: Gradiente de eluição utilizado para determinação de benzilglicosinolato por
HPLC com detecção no U.V. (228 nm)
TEMPO % SOLVENTE A % SOLVENTE B % SOLVENTE O
;
Minutos 0.1 % (v/v) TFA em AGUA 0.1% (v/v) TFA em MeOH ACETONITRILA
0:0 100 O O
10:00 100 O O
15.00 80 20 O
25:00 50 50 O
35:00 O 100 O
45:00 O 100 O
45:01 O O 100
54:99 O O 100
55:00 100 O O
3.2.4 Análise do BITC durante o desenvolvimento e amadurecimento
do mamão
A determinação do benzilisotiocianato (BITC) no tecido e na cavidade interna de
todos os experimentos, foi realizada em cromatõgrafo a gás acoplado a um detector
seletivo de massas (GC/MS 5973 da Hewlett - Packard). Para ambas as análises, foi
utilizada uma coluna capilar Supelco 24181 SPB-50, com 30m de comprimento, 250 J.!m
de diâmetro, espessura do filme de 0.25 J.!m e temperatura máxima de uso de 310°C.
--- .- -----"~ -~. --=---=--=-----==---
47
3.2.4.1 Quantificação e identificação do BITC nos tecidos e na cavidade interna do
mamão por Cromatografia Gasosa acoplada a um espectrômetro de massas
(CG/MS)
Os métodos utilizados para análise de BITC nos tecidos e na cavidade interna
foram otimizados, separadamente, para as condições de trabalho, descritas na tabela 2.
A identificação do BITC foi feita em ambas as análises através do tempo de retenção,
do padrão analítico de BITC (Aldrich) para cada um dos métodos. A quantificação do
composto presente nos tecidos foi feita através da construção de uma curva de
calibração de BITC. Já na cavidade interna do fruto, a quantificação foi baseada em
valores relativos de área, calculados com base na resposta do aparelho, sendo assim,
os teores de BITC foram comparativos entre os tratamentos e não quantitativos.
As integrações dos picos em ambas as determinações, foram feitas pelo programa
data análise do software acoplado ao GC/MS .
=:::::::-~---~~=-~~-==-=--:---:--~-:-~-~----------
48
Tabela 2: Condições de trabalho do CG/MS para análise de BITC
Condições de trabalho BITCTecido Volátil
TO C inicial do fomo: 70°C 150°C
Modo de injeção: pulsed splitless splitless
Pressão: 30 psi 12.83 psi
TO C do detector: 250°C 250°C
Fluxo da purga: 25 mLl min 25 mLl min
Fluxo total: 28,8 mLlmin 28,8 mLlmin
Tempo de purga: 2 minutos 2 minutos
Volume de injeção: 1 J.!L Todo volume absorvido na resina
Tempo de corrida 63 minutos 13.17 minutos
Gás de arraste: Hélio hélio
Vmédia da coluna: 36 cm/segundo 36 cm/segundo
3.2.4.2 Extração do BITC nos tecidos
As condições de extração foram otimizadas com base no estudo da degradação dos
glicosinolatos em solos, segundo BROWN et aI. (1994). Dentre os solventes orgânicos,
o que forneceu melhor resultado, para as condições de trabalho, foi o hexano. A
extração foi feita em microtubos eppendorff vedados, com tampa de rosca e anel de
borracha. Cerca de 150 mg de casca, semente e polpa, previamente pulverizadas em
49
nitrogênio líquido, foram homogeneizados em 1 mL de hexano e agitadas à temperatura
ambiente durante 1 hora. O sobrenadante, após filtragem em filtros Millex™ (Millipore)
de 0.45 J.tm foi injetado no cromatógrafo gasoso.
3.2.4.3 Extração do BITC volátil
O BITC volátil, presente na cavidade interna do mamão, foi capturado por fibras de
polidimetilsiloxano (100 J.tm SPME Fiber Assembly, Supelco), acoplada a um suporte
específico. O acesso à cavidade interna do fruto foi alcançado pela retirada de batoque
da região peduncular do fruto em direção à região das sementes (com pipetas plásticas
e estéreis). Em seguida, foram introduzidas na região aberta do fruto, cânulas plásticas,
construídas com o mesmo tipo de pipeta (Figura 11).
As fibras foram colocadas na cânula sem que houvesse contato com as sementes e
a resina ficou exposta na cavidade interna do fruto por cerca de uma hora. Em seguida,
as fibras foram recolhidas e introduzidas diretamente no injetor, liberando a amostra
presa à resina. O conteúdo volátil do analito foi, portanto, encaminhado pela coluna
para ser analisado no CG/MS (Hewlett - Packard 5973). Para dar continuidade às
análises do dia seguinte, as cânulas foram fechadas com ponteiras plásticas vedadas,
para evitar o escape de gases (Figura 11 ítem B).
BIBLiOTECAFaculdade !j.~ ,.:>:~ ..:(;i;)s Fa!ina:eu:lcas
Uni'JNs;,j3d~ de S30 PaulO
~ --=-=--~ - - - --~~- ------=--~~~- - -- ---- .~--------~~~----=--
50
Figura 11: A. Sistema de captura do BITC volátil na cavidade interna do mamão
papaia. B. Frutos, com as cânulas plásticas e com as ponteiras vedadas, aos 5 dias
pós-colheita, utilizados para medida do BITC dentro da cavidade intema do mamão.
3.2.5 Preparo do extrato enzimático e atividade da jJ-tioglicosidase
em mamão papaia
A extração das proteínas para o doseamento da atividade da f3-tioglicosidase foi
otimizada com base nas metodologias descritas por BOTTI et aI. (1995), FOOL et aI.
(2000) e HARA et aI. (2001). Cerca de 0,5 9 de amostra foi homogeneizada em 2,0 mL
de solução extratora em homogeneizador Brinkman (tipo Turrax) por cerca de 30
segundos, em velocidade média. Os homogenatos foram centrifugados a 7650 x 9 por
30 minutos e os sobrenadantes obtidos da polpa e das sementes, foram dessalinizados
em mini-colunas de Sephadex G-25 HiTrap™ Oesalting (Amersham Pharmacia
_ c=--__-=---=- ---"'-== -----<~ ~ - ---.c.~__~--=,~--=,----::""~~ ~
- - ----- --_.~- -- --- -....,,~
,':li'
'tda casca cerca de 5 9 e para a semente 2 g, as amostra foram trituradas em
mM, 2% SOS, 1% de mercaptoetanol e EOTA 50 mM). Após a homogeneização do
nitrogênio líquido, adicionando-se 10 mL de solução extratora (Tris-borato pH 7,5 150
utilizadas e ao tempo de centrifugação. Foram utilizadas para a extração da polpa e
A atividade da mirosinase foi determinada pela liberação de glicose, a partir do
51
utilizando soro albumina bovina (BSA) como padrão.
A determinação da proteína foi realizada segundo método de Bradford (1976),
(1992), com pequenas modificações, com relação à quantidade de amostras
A extração do RNA total foi realizada segundo LÓPEZ-GÓMEZ E GÓMEZ-L1M
substrato, sinigrina, um alil-glicosinolato (1-tio-I3-0-glicopiranose) (PALMIERI et ai,
de extrato enzimático e 50 I-1L de sinigrina 10 mM, foi incubado a 30°C e a reação
pelo sistema glicose oxidase/peroxidase/ABTS, segundo método de Bergmeyer (1974).
1982; PALMIERI et ai, 1987; BOTTI et aI., 1995). O meio de reação, composto por 501-11
interrompida com 25 1-1L de ácido perclórico (0,6N). A glicose liberada foi determinada
e NaCI50 mM.
Biotech). A atividade da mirosinase na casca e na semente dos 30 aos 120 dpa, foram
3.2.6 Proteínas
mM, contendo L-cisteína 20 mM, Polivinilpirrolidona (40000) 1%, ditiotreitol (dTT) 5 mM
3.2.7 Extração de RNA total
medidas no extrato bruto. A solução extratora foi composta de Hepes-KOH pH 6,8 100
<-- ~~- ....-...-.., - -==--=......~-- -- - ~~~-- .., ~~--=-- ~-----~.-~ ~- -
52
material até o descongelamento, as amostras foram centrifugadas à 12.000 x g por
30 minutos e o sobrenadante coletado foi recentrifugado por mais 30 minutos, para
eliminar os debrís celulares. Em seguida, adicionou-se ao sobrenadante 0,25
volumes de etanol absoluto e 0,11 volumes de acetato de potássio 5M, a solução foi
agitada suavemente durante 1 minuto. Nesta mistura adicionou-se 1 volume de
clorofórmio gelado. As amostras foram novamente centrifugadas a 12.000 x g por 20
min, a fase aquosa (superior) foi recolhida, adicionada de 1 volume de
fenollclorofórmio (1 :1, v/v) agitada e centrifugada por 20 minutos a 12.000 x g. A fase
aquosa foi recolhida e 1 volume de clorofórmio gelado foi adicionado ao extrato. As
amostras foram agitadas e submetidas a uma nova centrifugação de 20 minutos e o
sobrenadante foi recolhido.
A fase aquosa foi cuidadosamente transferida para tubos de vidro e o RNA da
solução foi precipitado à -20°C com 0,43 volumes de cloreto de lítio 10 M. Após a
precipitação, o material foi centrifugado a 12.000 x g durante 1 hora, o sobrenadante
foi descartado e o RNA foi solubilizado em 2 mL de tampão TE (Tris-HCI 10mM +
EDTA 1mM pH 8,0). O RNA solúvel foi precipitado novamente à -20°C por 2 h pela
adição de 3 volumes de etanol e 0,1 volumes de acetato de potássio 5 M,
centrifugado por 1 hora a 12.000 x g e retomado em 200 Jl.L de tampão TE.
A quantificação do RNA foi feita por espectrofotometria a 260 nm. Os cálculos
foram baseados no princípio de que 40 Jl.g de RNA por mL correspondem a 1,0
unidade de O.D, segundo SAMBROOK et aI. (1989). O material foi dividido em
alíquotas, precipitado com 3 volumes de etanol e 0,1 volumes de acetato de potássio
5M e armazenado em ultrafreezer -80°C.
.1
-- - - -- - --- .. ~~-~~-~::-- ~-~--=-~~~------
1;1
I.
53
3.2.8 Obtenção do cONA
A obtenção da primeira fita de cDNA, a partir do RNA total (amostras
armazenadas a -80°C) da polpa, casca e semente foi feita através da ação de uma
transcriptase reversa pelos Kits First-Strand cONA Synthesis (Amersham
Biosciences) ou pelo Superscript First-Strand Synth-50 RXN (Invitrogen),
utilizando como "primer" Oligo dT (12-18), segundo as instruções descritas nos manuais
dos fabricantes.
3.2.9 Síntese de oligonucleotídeos
Foram alinhadas seqüências de aminoácidos de mirosinases conhecidas em
outros vegetais e disponíveis no Genebank, através do acesso remoto da Embrapa
Centro de Recursos Genéticos e Biotecnologia - Bioinformática
(http://asparagin.cenargen.embrapaetelnet:llasparagin.cenargen.embrapa.br) pelos aplicativos
Pileup e Pretty (Wisconsin-Package, 1997). Os códigos ambíguos, que foram utilizados
na síntese dos oligos, estão descritos na tabela 4. Os oligonucleotídeos foram
sintetizados pela empresa Invitrogen do Brasil e as sequências estão descritas na
tabela 3. A partir de regiões de consenso da proteína, foram obtidas as sequências de
nucleotídeos para a construção dos "primers" .
- ~ -
54
Tabela 3: Relação das sequências de primers utilizados em PCR para
amplificação de fragmentos de mirosinases.
Primers Seqüência Tm(°C)
Sense 1 (81) 5' CCT TTY GTT AC W CTK TTY CAY TGG GA 3' 51
Sense 2 (82) 5' TTC GGW GGW AAG GTT AAR AAC TGG 3' 50
Sense 3 (83) 5' TTC GGW GGW AAG GTT AAR AAC TGG 3' 48
Sense 4 (84) 5' GAT TTT CTT GGW CTY AAY TAC TA 3' 43
Sense 5 (85) 5' GAT TTT CTT GGW CTY AAY TAT TA 3' 41
Anti-sense 1 (R1) 5' ATC YTC AAG AGM CCA WGC RAA RTA ACC 3' 53
Anti-sense 2 (R2) 5' ATC YTC AAG AGM CCA WGC RAA RTA TCC 3' 53
Anti-sense 3 (R3) 5' CCA ATT AAC RTA AGW CAR WCC AAA 3' 45
Anti-sense 4 (R4) 5' CCA ATT AAC RTA AGW CAR WCC GAA 3' 47
Anti-sense 5 (R5) 5' ATA TCC CTT RCA RAA YTC RTA RTT ATC 3' 48
Anti-sense 6 (R6) 5' ATA TCC CTT RCA RAA YTC RTA RTT GTC 3' 49
Tm (0C): temperatura média de reação dos primers
Tabela 4: Códigos Ambíguos IUPAC
N = qualquer base S = C ou G D = A ou G ou T
M = A ou C y= C ou T H = A ou C ou T
R = A ou G K= G ou T v= A ou C ou G
W= A ou T B = C ou G ou T
"
..---.-..---::-~
55
3.2.10 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
As reações em cadeia da polimerase foram realizadas em meio contendo
tampão Tris-HCI pH 8.3 10mM, dNTP 2.5 mM, MgCb 10mM, prímers sintetizados nas
direções sentido (sense) e reversa (anti-sense) com 0.5 f.!Mde concentração final, na
presença de 2.5 U da enzima Taq Polimerase com a utilização de 0.5 a 1.0 f.!1 de
cDNA molde. As condições adotadas no termociclador foram: 94°C/30"; 50°C/30";
72°C/1,5-2,O minutos com 35 ciclos. Para visualização dos produtos de PCR, as
amostras foram submetidas a eletroforese em gel de agarose (1,0 a 1,5%), contendo
0,5 f.!g/mL de brometo de etídio, a 80 V por 10-15 min, em tampão TPE (Tris-fosfato 90
mM e EDTA 2 mM, pH 8,0) (SAMBROOK, 1989).
3.2.11 Clonagem e expressão do produto de PCR
Os fragmentos de DNA obtidos com a amplificação foram excisados do gel
preparativo. Os DNAs foram eluídos e purificados, com o objetivo de eliminar a
agarose e o brometo de etídio, para isso foi utilizado o kit GFX™ PCR DNA and Gel
Band Purification (Amersham Biosciences). Os fragmentos de DNA purificados
foram introduzidos no vetor pCR® 4-TOPO. Cerca de 4 f.!L de DNA purificado foram
utilizados para fazer a ligação com 2f.!L do vetor, através da ação da topoisomerase
ligada neste vetor. Desta ligação, foram utilizados cerca de 2f.!L para transformação
de 50 f.!L de células competentes de E. calí (One shot® TOP10- invitrogen). Esta
reação foi incubada no gelo por 30 minutos, em seguida as bactérias foram
~ 1,
56
submetidas a um choque térmico a 42°C por 30 segundos exatos. Às bacterias
foram adicionados 250 flL de meio SOC, em seguida o meio foi submetido a
incubação por cerca de 1 hora a 37°C. As bactérias foram plaqueadas em meio LB
ágar contendo ampicilina (100 flg/mL), sendo que neste sistema, somente as células
transformadas cresceram.
As colônias de células transformadas foram transferidas individualmente para
tubos contendo cerca de 50 flL de meio LB e ampicilina (100 flg/mL) e incubadas por
2 horas a 3rC. Em seguida foram feitas PCR dessas colônias para verificar a
presença dos insertos, com primers específicos da mirosinase de mamão e primers
flanqueadores dos vetores (T3, M13 e M13 reverso).
3.2.12 Mini-preparação de DNA plasmidial e sequenciamento
A partir das colônias transformadas, contendo o inserto, foram feitos inóculos em
meio LB com antibiótico e o crescimento foi conduzido "overnigth" a 37°C, sob agitação
constante. A extração e a purificação do plasmídeo contendo os insertos de interesse
foram feitas seguindo o protocolo do kit QIA prep® Miniprep (Qiagen). A quantificação
do DNA plasmidial obtido, foi realizada em espectrofotômetro a 260 nm, considerando
se que uma solução de 50 ug de DNA/ml apresenta O.D.(densidade óptica) igual a 1,0.
O sequenciamento dos clones obtidos foi realizado em sequenciador automático
ALF Express, utilizando o kit Thermo Sequenase Cy5 Dye Terminator Cycle
Sequencing kit e ReproGel ™ Long Read (Amersham Biosciences). A eletroforese foi
,
'ill
J
_____ _--0=--=-:";;;-=~-;;c::-~---===:::or"'!SI~~:::::::=~::::::::::~~~
57
desenvolvida a 50°C, com potência constante de 25 W e tempo de corrida de 750
minutos.
As sequências obtidas foram analisadas pelos aplicativos Pileup, Tranlate e
Fasta (Wiscousin-Package, 1997), disponíveis para acesso remoto através da
Embrapa-Centro de Recursos Genéticos e Biotecnológia-Bioinformática
(http://asparagin.cenargen.embrapa.br) e também pelo Blast disponível no site do
NCBI (www.ncbLnml.nih.gov)
3.2.13 Expressão em sistema heterólogo da mirosinase em
Escherichia coli e purificação da proteína recombinante
Novas sequências de primers foram construídas nas regiões 5'(primers sense) e
3'(primer reverso) da maior sequência parcial de bases obtida com o cONA da semente
de mamão. A combinação foi semelhante à S1/R6, com algumas modificações,
eliminando as bases ambíguas, assim como descrito na tabela 5, a seguir.
Tabela 5: Sequência de bases dos primers usados nos ensaios de expressão.
Primer Seqüência Tm(°C)
Sense 1 5' "CCT nT Gn ACA CTT TTC CAC TGG GAT Gn" 3' 52
Sense 2 5' . "AGA AGA CAT GTA CGG AGG ACT" 3' 55
Reverso 1 5" " CAG TGG AAA AGT GTA ACA AAA GG" 3' 47
~- - - --=-----=- --=-- -=-----==--- -
58
Os testes de expressão parcial da mirosinase em E colí foram realizados com o
pCR-T7/TOPO-TA Expression Kit (Invitrogen). O produto da amplificação por "PCR",
através da combinação dos primers sense 1 e revers01 foi clonado no vetor de
expressão pCR-T7/NT-TOPO TA (Invitrogen) e usado na transformação de células de
Ecolí TOP1 OF', de acordo com as instruções descritas no manual. Cerca de 5 a 10 ng
de ONA plasmidial foram inseridos em células BL21 (OE3)pLysS de E colí para
expressão.
As reações foram incubadas em gelo por 30 minutos e em seguida submetidas
ao choque térmico a 42°C por 30 segundos. Ao meio foram adicionados 250 !-LL de SOC
seguido de incubação a 37°C durante 1 hora. O pré-inóculo foi preparado com o
volume total desta cepa de bactérias que foi transferida para 10 mL de meio LB,
adicionado de 100 ,...g/mL de ampicilina e 34 !-Lg/mL de cloramfenicol o qual foi incubado
por 12 horas a 37°C.
Cerca de 500 ,...L do pré-inóculo foi adicionado em 5 mL do mesmo meio LB e
incubados por 2 horas até o crescimento das bactérias que renderam a absorbância de
0.5-0.8 à 600 nm. Para acompanhar o nível de expressão da proteína recombinante
foram preparados dois inóculos, sendo que um deles foi acrescido de um agente indutor
de expressão, IPTG (isopropil tiogalactopiranosídeo) na concentração final de 1 mM. A
indução foi acompanhada em intervalos de duas horas até 6 horas. Alíquotas de 500 !-LL
da bactéria induzida e não-induzida foram coletadas desde o tempo zero em microtubos
que foram centrifugadas a velocidade máxima por 30 segundos.
O precipitado foi ressuspendido em 80 !-LL no tampão que continha: Tris-HCI
62,5 mM pH 6,8; SOS a 2%; f3-mercaptoetanol a 5%, glicerol a 10% e 0,05% de azul
BIBLIOTECAFae'Jldade de C,i:nCl3S Farll13céUlicas
Universidade de São PaulO
~.:;;;;:.;;::;;;;;;~=.;:~~
59
de bromofenol, em seguida, as amostras foram submetidas a fervura por 5 minutos.
Uma alíquota de 10 I-lL foi separada para eletroforese em gel de poliacrilamida pelo
sistema SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970), sendo o restante foi armazenado em freezer a-
20°C.
Cerca de 50 mL do meio de LB contendo ampicilina (100 J..lg/mL), cloramfenicol
(34 I-lg/mL) e IPTG (1 mM), foi inoculado com 1 mL do pré-inóculo induzido e incubado
a 37°C durante 4 horas. A proteína recombinante foi recuperada por centrifugação a
3000xg durante 10 minutos e armazenada em freezer -20°C. A proteína induzida foi
quantificada com BSA (proteína soro albumina bovina) através de análises em
densitômetro.
3.2.14 Eletroforese de RNA e northern blot
Para o northern blot foram utilizados cerca de 20 I-lg de RNA durante o
desenvolvimento da polpa e da casca da segunda amostragem. A mesma quantidade
de RNA foi utilizada nos estádios de desenvolvimento e amadurecimento da semente
das mesmas amostras.
Os RNAs foram separados por eletroforese (4 volts/em) gel de agarose 1,2%
contendo formaldeído 2.2M, sob condições desnaturantes: (SAMBROOK, 1989), sendo
os mesmos transferidos sob vácuo para uma membrada de nylon (Hybond N+ da
Amershan Bioscienses).
Para pré-hibridização, a membrana foi bloqueada durante 2 horas, em meio
contendo SSC 5X (0,75 M NaCl, Citrato de sódio 75 mM, pH 7,0), Denhardt's 5X,
------- ---~--- ~ -
60
0.5% de SOS e ONA de salmão 1mg/mL, na proporção de 0.1 mL de solução I cm2 de
membrana. Em seguida, a membrana foi hibridizada com uma sonda específica de
mirosinase isolada da semente do mamão, produto da amplificação por PCR através
dos primers 1S (sentido) e 6R (reverso) contendo 975 pares de base. A marcação da
sonda foi feita com a.[32p]-dCTP, segundo manual de instrução do Megaprimer kit
(Amershan Bioscience).
A hibridização foi conduzida "overnighf' a 65°C. Para as lavagens a membrana
foi submetida às seguintes incubações: 2X SSC+ 0.1 % SOS durante 10 minutos à
temperatura ambiente; 2X SSC+0.1 %SOS a temperatura ambiente por 10 minutos,
1XSSC+0.1%SOS por 30 minutos 65°C e finalmente 0.1XSSC+0.1%SOS por 10
minutos a 65°C. A revelação foi feita por autoradiografia após três dias de exposição.
4. RESULTADOS
Um dos principais objetivos deste trabalho foi analisar os teores de glicosinolatos
e seu principal derivado, o BITC no mamão papaia. Pelo fato de serem análises
bastante elaboradas, era desejável que a amostragem resultasse no menor número
possível de amostras. A princípio, foi planejada a separação do fruto em três partes:
casca, polpa e semente, mas a dúvida de ser a polpa homogênea o suficiente nas
diferentes partes do fruto, originou um experimento extra no sentido de, com alguma
facilidade de metodologia de análise, verificar a homogeneidade da polpa. Considerou
se que o teor de açúcares solúveis poderia dar indicação segura sobre a
1<:.
-==oc c:.--~_~.- c~_~_~.=---~1!iIIt
61
homogeneidade da polpa e, além disso, a concentração de açúcares solúveis parece
ser um estimulante para o ovoposição por moscas-das-frutas (JOAQUIM-BRAVO et. aI.,
2001). Assim, a região de maior acúmulo de açúcares, seria o local mais provável de
depósito de ovos e larvas destes insetos, conseqüentemente, a principal zona para a
ativação do mecanismo de defesa. Para este experimento, a polpa dos mamões foi
separada em três partes (Figura 12), que foram analisadas quanto aos teores de
açúcares solúveis. Os resultados (Figura 13), mostraram ser a polpa homogênea o
suficiente para não ser separada em mais porções do que as inicialmente planejadas.
~ ~P1 Polpa da região peduncular
~ J-P2 Polpa da região mediana
11!!!1:::7';;; '} P3 Polpa da região apical
Figura 12: Subdivisão das regiões do mamão papaia (1 3 amostragem) para análise dos
açúcares solúveis na polpa.
62
4.1 Perfis de açúcares solúveis
A concentração de hexoses foi praticamente homogênea nas três regiões do
fruto (Figura 13) e a sacarose foi o açúcar predominante, tanto nos frutos classificados
como verdes quanto nos maduros, como já demonstrado por GOMEZ et ai (2002). A
polpa da região apical (P3) apresentou uma quantidade um pouco menor de açúcares,
sugerindo que a translocação dos carboidratos pode ser em direção à região apical do
fruto. Este mesmo direcionamento já foi descrito anteriormente por CHAN et aI. (1979)
no mamão.
Glicose
~ 3
oP3 P2 P1
Frutose
P3 P2 P1
Sacarose
P3 P2 P1
Figura 13: Teor de açúcares solúveis (%) em três diferentes regiões da polpa do
mamão papaia do "CEASA" (var. Sunrise solo) com 4 dias após a colheita da 1a
amostragem (-O-verde e maduro).
Frutos climatéricos, como a banana e maçã, acumulam sacarose através da
hidrólise do amido durante o amadurecimento pós-colheita, enquanto frutos
classificados como não climatéricos, assim como as frutas cítricas e a uva acumulam
m;1
i'.1
63
açúcares durante a parte final do seu desenvolvimento, ainda na planta. No caso do
mamão um fruto climatérico, sabe-se que existe a síntese de pequenas quantidades de
sacarose durante o amadurecimento pós-colheita, mas as fontes de carbono utilizadas
nesta síntese não podem ser creditadas ao amido, já que seu teor, à época da colheita,
é muito baixo no mamão (GOMEZ et aI., 2002). Como fontes alternativas de carbono,
poderiam ser considerados os monossacarídeos originados pela degradação da parede
celular, ou dos ácidos orgânicos (MANRIQUE, 2001).
4.2 Respiração e Etileno durante o amadurecimento de mamão
papaia
Com o objetivo de acompanhar o amadurecimento do mamão e caracterizar as
amostras, foram monitorados os níveis de C02 e de etileno nos frutos da segunda
amostragem (Figura 14). Os resultados obtidos foram semelhantes aos obtidos por
GOMEZ et ai (2002), com o pico de etileno ocorrendo no 5° dia pós-colheita (5dpc) e o
da respiração no 4° dpc. As amostras foram obtidas diariamente e imediatamente
congeladas.
64
100I
CO2
~~ I 1
20i
!"Etileno ~---I
!' /1o -e-
3 4 5 6 7
d ias após colh eita
Figura 14: Curvas de respiração e etileno (2a amostragem) em frutos de mamão papaia
(var. Sunrise Solo) durante o amadurecimento, colhidos com 150 dias após a antese
(triplicata de injeção ± desvio padrão)
4.3 Avaliação da atividade das mirosinases em diferentes estádios de
maturação e diferentes regiões da polpa do mamão
A atividade da mirosinase, enzima chave na síntese de BITC, utilizando como
substrato o benzilglicosinolato (BG), foi medida em três regiões da polpa, na semente e
no tecido que envolve a semente, a sarcotesta. A atividade da mirosinase foi alta na
semente e na sarcotesta, com valores semelhantes aos encontrados na região apical
da polpa madura, com diferenças não significativas em relação ao estádio de
amadurecimento (Figura 15). Para a polpa, as diferenças foram significativas entre
estádios de amadurecimento e entre as três regiões consideradas. Enquanto nos frutos
_ ~_~--~ ....:-~ ---.o-_~. -=~ _ _ _ _ _ _ __
P1 Semente sarcotestaP2
IIVerde
[]]Maduro
P3
o
~120.'0>
EQ)rno.~ 60O>
oEc
·'c
180 I I
65
verdes a atividade da mirosinase foi praticamente constante nas regiões apical,
diferenciado quanto à região da polpa. Do estádio verde para o maduro houve um
destes frutos foram compatíveis com os encontrados para os frutos da segunda
vezes, respectivamente. Os valores de atividade específica da mirosinase na polpa
amadurecimento.
amostragem (dados ilustrados a seguir), que aumentaram até o fim do
regiões mediana (P2) e peduncular (P3) tiveram um aumento de atividade de 2 e 4
aumento de atividade de aproximadamente 10 vezes na região apical (P1), enquanto as
Figura 15: Atividade da mirosinase relativa a 1a amostragem em diferentes
regiões da polpa (P1 = próxima ao pedúnculo, P2=mediana e P3 = apical) e nos tecidos
da semente e da sarcotesta (triplicata de extração ± desvio padrão).
mediana e peduncular, nos frutos maduros, houve um aumento de atividade
66
4.4 Otimização da metodologia de análise de benzilglicosinolato (BG)
e do benzilisotiocianato (BITC)
A metodologia para análise de BG e de BITC foi otimizada para análise nas amostras
de mamão papaia. As Figuras 16, 17 e 18 mostram cromatogramas relativos aos
resultados obtidos ao final da otimização, que foi considerada satisfatória depois das
amostras serem adicionadas de padrões de BG e de BITC. A resolução dos picos
cromatográficos foi considerada boa em todas as fases do desenvolvimento do
mamão. O tempo de retenção do BG foi de 20 minutos (Figura 16) e de 23:47
minutos para o BITC (Figura 17). O perfil de espectro de massas relativo ao BITC foi
comparado ao espectro cadastrado na biblioteca N18T98. O íon de maior abundância
observado para o BITC fomeceu uma relação massa! carga (m/z) de 91 J como
verificado nas Figuras 17 e 18.
- - - - -=-=--~ =-~~ - -------- ..... --~-- - - - --""'- -~~-~~- -~-
67
600
400
=>«E
200~ BG
oi "Jr- ~ I ..r---'i I i I i I
O 10 20 30
minutos
B 800~ BG
700
600
500
~ 400<t:E 300
2001 SinigrinaI
100
oI i i I I i i
o 10 20 30
minutos
A
Figura 16: Análise por HPLC de benzilglicosinolatos (BG) em mamão papaia. A.
Cromatograma do padrão de benzilglicosinolatos cedido por Richard Bennett (Institute
of Food Research-Inglaterra). B. Cromatograma da semente no ponto de colheita
(150 dpa).
J
~'::--.r---------.:~~_~~~--.....__ --=_ _ ~_ _ ,~ ~.~. ~_ • __~~_ ~_ _----=..
68
Abundância
9000000
..000000
7000000
6000000
SOOOOOO
4000000BITC
:!OOOOOO
ZOOOOOO
1 000000
oi i' i; , , , 'i 'i i • ,I, i' , , 'i ; i' i , i , , i' 'i i , , 'i' , , . i : : L L i i i
tempo1 O:OC 1 S:OO ZC:OO 2S: co :3 o:00 :3 S:OO 41J:1J1J 4S:1J1J SIJ: IJIJ SS: IJIJ -61J:1J1J
Abundância
1:!OIJIJIJIJ
1201J1J1J1J
111J1J1J1J1J
1 IJIJCCCC
9IJCIJIJIJ
'!IJIJCIJIJ
7IJCCIJIJ
60CCCC
SOCIJIJIJ
41J1J1J1J1J
30CIJIJIJ
ZOCIJIJIJ
10CIJIJIJ
IJS
massa/carga
65
SC"Z:In 31.60 (23.46~ n-lln)9~
Espectro de massas do BITC
Figura 17: Análise por CG/MS do padrão de benzilisotiocianato (BITC) (Aldrich)
(pico relativo a 110,69 ng de BITC pela curva de calibração) com respectivo espectro de
massa.
69
Abundância
_semente 150 dpa:9000000
'lDDDDDD
7000000
6000000
5000000
4000000
1000000
2000000
1000000
BITC
tempo 10:00 1s:ee 2D:ee 2S:ee mimM 3S:ee 4e:ee4S:ee Se:DD SS:DD 6D:ee
Abundância
Figura 18: Análise por CG/MS, cromatograma e espectro de massa da semente
de mamão papaia no ponto de colheita.
massa/carga
:51:5
c
UI"
semente 150 dpa
,;;l1A!.e:CCCCC
A!<:ICCCCC
A!A!CCCCC
A!CCCCCC
1,~CCCCC
1.e:CCCCC
14CCCCC
iA!CCCCC
iCCCCCC
J:!:'CCCCC
~C"'CCI e:~
I<:ICCCCC
~1
A!CCCCC
C
-- -.. --_-'_ L._ ~ =~~~_.,~~,~~~~~~~
mirosinase
o I r=-"--+"'"'' 'I " ," ",, IBITC
50
25
0,75
C)
EQ)(J)
o.ºC)
oEc
~
'c'E
0,00 I ' ", ',' ," ",' , , ,I30 60 90 120 150 153154155 156157
Dias pós-antese
C)
ÜI- 0,25l1l
oE::1.
";- 2,251
BGIqJ -
C>l1lo 1,50E::1.
As Figuras 19, 20 e 21, mostram os resultados obtidos com os frutos da segunda
70
Figura 19: Teores de benzilglicosinolatos (BG), atividade da mirosinase e
teores de BITC, durante o desenvolvimento, ponto de colheita (150 dpa) e
amadurecimento da Polpa (-O-) do mamão papaia relativo a 2a amostragem
(triplicata de extração ± desvio padrão)
amostragem. Foram analisados os teores de benzilglicosinolato (BG), BITC e atividade
da mirosinase durante o desenvolvimento e amadurecimento do mamão papaia.
4.5 Teores de benzilglicosinolatos, BITC e atividade das mirosinases
na polpa, casca e semente durante o desenvolvimento e
amadurecimento do mamão papaia.
71
mirosinasel
30 60 90 120 150
Dias pós-antese
"0)6
~m4oE:i2
o
2
~:s 12E
BG8 I
"O>
~ 8Q)(/)
o.S:20>4oEc::
"O) 6
o(!]
o 4E:i
Figura 20: Teores de benzilglicosinolatos (BG), atividade da mirosinase e
teores de BITC, durante o desenvolvimento, ponto de colheita (150 dpa) e
amadurecimento na Casca ( ) do mamão papaia relativo à 23 amostragem
(triplicata de extração ± desvio padrão)
- - -- - - ~~ --=-- __ o
72
o30 60 90 120 150153154155 156 157
Dias pós-antese
BITC
5
c·El50
mirosinase
'o)
~100Q)l/l
8"Õl50oEc
'7 20Ol
~ 15mo 10E:1
25 j BG-
'7 20Ol
C>m 15oE:110
5
Figura 21: Teores de benzilglicosinolatos (BG), atividade da mirosinase e
teores de BITC, durante o desenvolvimento, ponto de colheita (150 dpa) e
amadurecimento na Semente ( ) do mamão papaia relativo à 23 amostragem
(triplicata de extração ± desvio padrão).
73
Na POLPA do mamão, os teores de BG que eram de cerca de 1,8 flmol/g (737
fl9/g) aos 30 dpa, diminuíram ao longo de todo o desenvolvimento do fruto, chegando a
0,263 flmol/g (107 fl9/9) no ponto de colheita (150dpa) e 0,033 flmol/g (1;3fl9/9) ao final
do amadurecimento (157 dpa) (Figura 19). Ao mesmo tempo, os teores de BITC
aumentaram até os 90 dpa mas, surpreendentemente, houve um aumento de atividade
da mirosinase só a partir dos 120 dpa. Não houve correlação também entre os teores
totais de BG que desapareceram e de BITC disponibilizado em teores bem menores.
Uma primeira hipótese é que parte do BITC produzido tenha se volatilizado, outra
possibilidade é que o BG tenha sido utilizado por outras vias metabólicas que
prescindem de atividade da mirosinase.
Na CASCA (Figura 20), não houve a discrepância entre os teores de BG que
desapareceram e de BITC formado, sendo que ambos foram diminuindo desde o início
do desenvolvimento do fruto (30 dpa), até a colheita. A atividade da mirosinase
manteve-se nos mesmos patamares durante todo o desenvolvimento, diminuindo
bastante à época da colheita e, apesar dos teores de BG e BITC terem sido maiores
que na polpa (1,8 flmol e 6 flmol, polpa e casca, respectivamente), os valores máximos
de atividade da mirosinase foram bem maiores na polpa que na casca (50 e 10 nmol,
polpa e casca).
O teor de BG na SEMENTE foi de 20flmol/g, em média, sendo este o tecido que
mais acumulou glicosinolatos (Figura 21), com uma concentração cerca de 4 vezes
maior do que na casca (Figuras 20 e 21). À semelhança da polpa e da casca, os teores
de BG também diminuíram na semente ao longo do desenvolvimento do fruto, mas
tiveram um acúmulo a partir do ponto de colheita (150 dpa), voltando aos teores
74
semelhantes aos do início do desenvolvimento do fruto. Ao final do amadurecimento, a
semente continha cerca de 400 vezes mais BG que a polpa garantindo a manutenção
do sistema glicosinolato-mirosinase para a espécie (Figuras 19 e 21). O aumento dos
teores de BG nesta fase do fruto deve ter a função de proteger a semente a ser
disseminada para reprodução. Durante todo o desenvolvimento do mamão, os níveis de
BITC na semente foram sempre muito altos, em torno de 10 a 12 Ilmol. Por outro lado,
de maneira semelhante à polpa, a atividade da mirosinase na semente foi muito mais
baixa durante o desenvolvimento do que na fase de amadurecimento pós-colheita, mas
comparável à atividade da mirosinase na casca e na polpa. Ou seja, mesmo tendo
atividade 10 vezes menor durante o desenvolvimento do que no amadurecimento, esta
atividade foi equivalente à maior atividade da enzima na casca.
No geral, a atividade da mirosinase na polpa de mamão, foi similar à atividade da
mirosinase da raiz forte (HARA et aI., 2001) e muito maior que da mostarda oriental
(0.49-0.73 nmol). Nesta espécie de mostarda, a alta atividade da mirosinase foi
correlacionada à diminuição da infestação por traça das crucíferas (Plutella xylostella)
(LI et aI., 2003). Já para o mamão não há dados de ensaios biológicos, para que se
possa fazer este tipo de correlação. Aqui, como em outros estudos que isolaram e
caracterizaram a mirosinase, não foi encontrada nenhuma sincronia entre o conteúdo
de glicosinolatos e a atividade da mirosinase (BONES, 1990; RASK et aI., 2000).
Pensando em termos da proteção que o BG ofereceria ao fruto em relação à
mosca de frutas, a casca seria o tecido mais importante por seu contato mais imediato
com o inseto, porém não se sabe ainda qual seria a concentração ideal do glicosinolato
na casca do mamão e se o glicosinolato intacto teria algum efeito sobre a proteção
-------=::
75
efetiva dos frutos contra os patógenos e/ou insetos, já que glicosinolatos intactos
parecem ser inativos (CHEN & ANDRÉASSON, 2001; FAHEY et aI., 2001;
WITTSTOCK et aI., 2004). Porém, o trabalho de LI et a!. (2000) contradiz esta teoria,
demonstrando que os teores de glicosinolatos, variando de 6.8 a 21.3 Ilg/ grama de
peso fresco de mostarda oriental (Brassica juncea), estavam associados à diminuição
da incidência de lagartas das folhas (Spodoptera eridania) , sendo que a dose tóxica
letal determinada para esse organismo foi de 6.7~ Ilmol/g. Para efeito de comparação,
os teores de BG na casca do mamão foram de aproximadamente 6,3 Ilmol/g (-2 mg/g),
no início do desenvolvimento, chegando a valores próximos de 2,3 Ilmol/g (0,9 mg/g)
no ponto de colheita (Figura 20).
Comparando os teores de BITC utilizados em um ensaio com uma praga da videira
(Otiorhynchus sulcatus), com a produção deste composto na casca do mamão, pode-se
especular que o fruto ficaria mais protegido na fase do desenvolvimento (30 a 90 dpa),
pois contém entre 5 e 3 Ilmol de BITC, já que foi mostrado que concentrações de
31lmol de BITC, foram suficientes para causar cerca de 28% de mortalidade dos ovos
deste coleóptero praga da videira (BORECK et aI., 1998). Tendo em vista este
experimento, surge a hipótese de que, a partir da colheita, o mamão ficaria mais
susceptível ao ataque dos patógenos, uma vez que estes teores caem para 1,6 Ilmol.
Porém esta hipótese só poderia ser confirmada por ensaios biológicos. Além disso,
assim como sugerido por SEO et aI. (1983) parece existir a interferência de outros
voláteis que são liberados durante o amadurecimento que contribuem para atrapalhar o
mecanismo de defesa do mamão. Não se sabe ainda qual seria a concentração ideal
de BITC liberado a partir da casca, para que o mamão fique protegido dos patógenos.
BIBLIOTECAFaculdade de Ciências ~armacêulicas
Universidade de São Paulo
___--=~-::::::::II'" - ~"
76
Os dados obtidos neste trabalho mostraram que o BITC parece ser muito mais retido na
casca do que na polpa, mas não se sabe se durante o amadurecimento essa
capacidade é mantida, uma vez que não foram medidos, nesta amostragem, os teores
de BITC na casca durante o amadurecimento (Figuras 19 e 20).
Alguns ensaios biológicos com o látex (exudado que ao ser liberado envolve a
região da casca) mostram que 6,7 x 10-4 moles de BITC IKg de ágar (0,67 Ilmollg) elou
1,9 x 10-10 mollL (BITC volátil), reduziram em 57, 93 e 93 % a ovoposição de três
espécies de moscas das frutas: Dacus dorsalis, Ceratitis capitata e Dacus curcubitae,
respectivamente. Concentrações de BITC acima deste valor reduziram em 99 % a
ovoposição destes dípteros. Em frutos amadurecidos foi necessária uma concentração
10 vezes acima da mencionada para se obter o mesmo efeito (SEO et aI., 1983). Os
isotiocianatos parecem ser altamente tóxicos tanto para insetos generalistas como para
os especialistas, e são os bioativos mais eficazes contra os diversos tipos de agentes
patogênicos, uma vez que os glicosinolatos intactos não têm, ou têm pouca ação na
defesa da planta (WITTSTOCK et aI., 2004).
Um outro lado a ser considerado da presença do BG e BITC na polpa do mamão
seria o relativo ao consumo do fruto. Sabe-se que a ingestão excessiva de alimentos
que contenham glicosinolatos pode induzir o carcinoma de bexiga em pessoas que
apresentem a predisposição (HIROSE et aI., 1998). Por outro lado, a maioria dos
trabalhos focaliza positivamente o consumo destes alimentos, justamente por prevenir
diversos tipos de câncer (ZHANG et aI., 1992; NAKAMURA et aI., 2000; MORIMITSU et
aI., 2000; GOOSEN et aI., 2000; ZHANG et aI., 2003; KUANG & CHEN, 2004). A ação
do BITC ocorre através da inibição e ativação das enzimas da fase I e II do sistema
t~
77
citocromo P450, respectivamente, que estão ligadas ao metabolismo do câncer em
mamíferos. O BITC pode atuar inibindo as enzimas de fase I, que é a fase da
biotranstransformação dos xenobióticos (qualquer substância estranha ao organismo
vivo, incluindo drogas e elementos tóxicos para a célula), assim como a enzima
glutationa redutase. Em paralelo, foi demonstrado que o BITG aumentou a atividade da
glutationa S-transferase e quinona redutase (enzimas da fase li), responsáveis pela
detoxificação destes xenobióticos (ZHANG et aI., 1992; NAKAMURA et aI., 2000;
MORIMITSU et aI., 2000 GOOSEN; et aI., 2000; ZHANG et aI., 2003; KUANG & CHEN,
2004).
Este mecanismo de detoxificação de xenobióticos não é exclusivo das células de
mamíferos, pois ocorre também nas plantas (MARSS et aI., 1996). Foi mostrado que as
glutationa S-transferases detoxificaram, através da conjugação, moléculas de
herbicidas em plantas de Arabidopsis fhaliana e que elas também foram responsáveis
pelo seqüestro de muitas outras substâncias tóxicas desencadeadas pelo estresse
oxidativo e por toxinas endógenas. Além disso, foi observado que o BITC também
aumentou a atividade destas enzimas nas plantas (DERRIDER et aI., 2002).
4.6 Teores de benzilglicosinolato, BITC e atividade da mirosinase em
mamões submetidos a tratamento com etileno e l-MCP
Este experimento foi realizado no sentido de observar qual o efeito do etileno e
do seu antagonista, o 1-MCP, sobre os teores de BG, BITC e atividade da mirosinase,
durante o amadurecimento do mamão. As Figuras 22 e 23 mostram os dados relativos
78
ao BG e do BITC da polpa, casca e semente e a Figura 24 mostra a atividade da
mirosinase na semente (terceira amostragem).
1
1-MCP 100 ppb
3 4 5 6 7 8 9 10
1
Etileno-1 00 ppm
3 4 5 678 9
Dias pós-Colheita
1
3 4 5 6 7 8 9 10
4
2
8
Controle
o
12
12I.casca
12
1polpa
0,04o
~(J)
"O'o)
o-tUoc'iij
8O)
'Nc(J).o(J)
"O
oE::t
Figura 22: Teores de BG f-D- Polpa; ~Casca e __-Semente) no mamão
papaia, submetidos aos tratamentos com etileno e 1-MCP, comparados aos frutos
controle, durante o amadurecimento na 3a amostragem (duplicata de extração ± desvio
padrão).
~ - - - ------------- --- - - - -- --~ ---- --~- _. --
79
J
1-MCP 100 ppb
3 4 5 6 7 8 9 10
J
Etileno 100 ppm
3 456 7 8 9
Dias pós-colheita
1
3 4 5 6 7 8 9 10
casca
2
4
o
8
12
12
Controle
121po,Pa
Q)"'C
0,004o"5 0,002.1::
O'l
.9coc:co·õo
:.;=;o.!fl·Nc:Q)..cQ)
"'C
oE::::1..
Figura 23: Teores de BITC (-D-Polpa; ~Cascae Semente) em
mamão papaia, submetidos aos tratamentos com etileno e 1-MCP,
comparados aos frutos controle, durante o amadurecimento na 3a amostragem
(duplicata de extração ± desvio padrão).
---- --------- - ----- ====:::s:o~ ---, '""" - r'
80
300
controle
200
100
300';-
Jetilenoc"E,;-. 200
O>EQ)l/lo 100uO>
oEc 300
!1-MCP200
100
OI' ....... ,' ti' ,! II t t !, 'I
3456789
Dias pós-colheita
Figura 24: Atividade da mirosinase relativa a 4a amostragem em sementes de
mamões submetidos aos tratamentos com 100 ppm de etileno(~), 100 ppb de 1-
MCP (-0-) comparados aos frutos controle( ) (triplicata de extração ± desvio
padrão).
81
Uma primeira análise mostra que, comparando a segunda com a terceira
amostragens, os frutos diferem bastante no que se refere aos os teores de BG e de
BITC tanto na polpa, quanto na casca e na semente, em qualquer fase de
amadurecimento que se considere (Figuras 19, 20, 21, 22 e 23). Por ocasião da
colheita, por exemplo, o teor de BG na polpa foi cerca de 12 vezes menor na terceira
amostragem que na segunda e o de BITC foi 31 vezes menor. Como os frutos de
ambas amostragens são da mesma cultivar e do mesmo produtor, pode-se creditar esta
variação à época do ano, mudanças no cultivo ou condições climáticas. Sendo o BG um
metabólito secundário da planta, ligado à sua defesa, é natural que varie segundo o
meio ambiente e as condições de clima. Este tipo de variação mostra que, mesmo que
se chegue a um consenso quanto aos teores mínimos necessários de BG ou BITC
presentes no fruto para protegê-lo das moscas-das-frutas, para efeito de exportação, é
muito difícil garantir que o mesmo contenha estes metabólitos quando colhidos, sem
análise prévia.
Apesar de terem perfis diferenciados, na média os teores de BG (Figura 22) e de
BITC (Figura 23), foram muito próximos na polpa e na casca entre os frutos controle e
tratados (1-MCP e etileno), mas foram maiores nas sementes dos frutos tratados com
1-MCP. O antagonista do etileno parece atuar positivamente na via de síntese destes
metabólitos, ou negativamente na sua degradação, já que o resultado final é de um
perfil com maiores quantidades de benzilglicosinolato, durante todo o período de
amadurecimento do fruto (Figura 22). Porém quando a atividade da mirosinase foi
testada nas sementes dos frutos tratados e controle, novamente, não foi encontrada
correlação entre atividade da enzima e teores de BG e BITC, em nenhum dos
- - - - --- - - - - - - - - - - -
82
tratamentos. Apesar de terem perfis semelhantes, a maior atividade da mirosinase foi
de cerca de 175 nmol nas sementes dos frutos controle e tratados com etileno e menor
que 150 nmol na dos frutos tratados com 1-MCP. Este experimento demonstrou que o
etileno exógeno não parece exercer nenhum tipo de controle sobre a atividade da
enzima, já que a atividade da mirosinase tanto dos frutos tratados com etileno, quanto
com seu antagonista (1-MCP), foram similares à do controle. Não existem na literatura
relatos sobre a influência do 1-MCP no perfil de benzilglicosinolatos, sendo o aumento
dos teores observado na semente, inédito.
Em folhas de Arabdopisis submetidas à aplicação exógena do seu precursor de
etileno, o ACC (1-aminociclopropano 1- carboxilato), foi observado um aumento no teor
do glicosinolato alifático, 8-metilsulfiniloctil (8-mso) (MIKKEL8EN et aI., 2003). Este
aumento pode ser correlacionado aos teores encontrados na polpa e na casca, sendo
que a semente manteve praticamente os mesmos níveis. Assim como observado por
MIKKEL8EN et aI. (2003), o sistema de defesa da planta parece ser regulado por uma
múltipla via de transdução de sinal, onde o etileno parece ser uma das moléculas
sinalizadoras. Neste trabalho, foi observado que o 1-MCP parece interferir em um dos
mecanismos de defesa do mamão, no caso o sistema glicosinolato-mirosinase.
---- -- - -- - -
83
4.7 Determinação e quantificação relativa do BITC na cavidade
interna do mamão durante o amadurecimento
o fato do BITC ser um composto volátil, com possível atuação inibitória sobre a
mosca-da-fruta na superfície do mamão, tomou importante quantificar o BITC volátil na
cavidade central do fruto, considerando-se que ele pode migrar do interior para a
superfície do fruto. Os dados aqui apresentados (Figura 25), foram calculados com
base na resposta do aparelho, sendo, portanto valores relativos e não quantitativos,
comparativos entre os tratamentos.
Os perfis de BITC na cavidade interna foram muito semelhantes nos frutos
controle e nos tratados com 1-MCP, mas diferentes nos frutos tratados com etileno.
Uma das hipóteses é que o etileno inibiu a síntese de BITC volátil contido no interior do
mamão, que foi reativado somente 5 dias após o tratamento, quando atingiu os
mesmos níveis do fruto controle logo após o tratamento. Outra hipótese é que o etileno
tenha aumentado a permeabilidade da polpa e casca do mamão, permitindo que o BITC
tenha se volatilizado mais facilmente que o controle e tratado com 1-MCP.
Apesar do 1-MCP não parecer afetar o teor de BITC volátil, após a diminuição do
nível de isotiocianato nos frutos controle, os frutos tratados com 1-MCP mantiveram
estes teores, constantes, nos dias 5, 6 e 7 pós-colheita e cerca de 2 vezes mais alto
comparados aos teores dos frutos controle, entretanto, no fim do amadurecimento, o
BITC volátil do tratado com 1-MCP foi similar ao controle.
84
11
r
1-MCP
controle
o I ,I I 1,1 1 1,1 I 1,1 -;-1,1, I,I , 1,1 I 1,1 I I, I
20
15
10
5
O
Cll 15~-«Q)
10"OIn
~.Q 5Cll>
O
15
10
5
3 4 5 6 7 8 9 10
Dias pós-colheita
Figura 25: Teores de benzilisotiocianato na cavidade interna do mamão papaia
durante o amadurecimento (-I!!Il-Controle; 100 ppm Etileno e -D- 100 ppb
1-MCP) (triplicata de injeção ± desvio padrão).
84
11
r
1-MCP
controle
o I ,I I 1,1 1 1,1 I 1,1 -;-1,1, I,I , 1,1 I 1,1 I I, I
20
15
10
5
O
Cll 15~-«Q)
10"OIn
~.Q 5Cll>
O
15
10
5
3 4 5 6 7 8 9 10
Dias pós-colheita
Figura 25: Teores de benzilisotiocianato na cavidade interna do mamão papaia
durante o amadurecimento (-I!!Il-Controle; 100 ppm Etileno e -D- 100 ppb
1-MCP) (triplicata de injeção ± desvio padrão).
85
4.8 Extração de RNA total
Na extração de RNA total foram necessárias otimizações do tempo de
centrifugação, que aumentou para 20 minutos em cada etapa, e a proporção
massa:volume de solução extratora empregada foi diferente para polpa, casca e
semente. Os RNA extraídos a partir dos tecidos de mamão, na segunda amostragem,
estão representados na Figura 26, na qual é possível observar a integridade dos RNA
da polpa, casca e semente pela presença das bandas de subunidades 288 e 188 de
RNA ribossomal.
20001200
800400
285185
Figura 26: Eletroforese em gel de agarose 1,5 % corado com brometo de etídeo, de
RNA total de mamão papaia. Padrão Low mass DNA ladder (P), polpa com 30 e 60 dpa
(Pl e P2), casca com 90 e 150 dpa (Cl e C2), sementes com 150 e 156 dpa (SI e
S2).
4.9 Amplificação por peR
Os testes de amplificação com os primers definidos a partir de seqüências
conservadas da mirosinase foram efetuados utilizando a primeira fita de cDNA como
molde, a qual foi sintetizada a partir de 20 /-lg do RNA total. Todas as possíveis
combinações de pares de primers foram testadas com o cDNA de polpa, casca e
86
semente. Apesar da aparente integridade dos RNA obtidos a partir da casca e da polpa,
não foi possível obter amplificações com o cDNA destes tecidos com os primers
testados. Entretanto, três fragmentos de diferentes tamanhos, compatíveis com os
números de pares de bases (pb) esperados, foram amplificados a partir do cDNA da
semente (Figura 27).
P (Pb.2000 __ :,yo:,"'~,
1200 __
SOO -400 __
200 --
Figura 27: Eletroforese em gel de agarose 1,5 % corado com brometo de etídeo das
amplificações com os primers 81 e R6 (1), com os primers 81 e R2 (2), e com os
primers 85 e R6 (3). Padrão Low mass DNA Ladder ( P).
o fragmento com tamanho esperado de 1030 pb foi amplificado com o par de
primers 81/R6. O fragmento amplificado a partir do par de primers 81/R2 apresentou o
tamanho aproximado de 1000 pb, e a terceira amplificação obtida com os primers
85/R6, gerou um fragmento de aproximadamente 400 pb.
87
4.10 Clonagem e seqüenciamento
Os fragmentos purificados e ligados no vetor pCR® 4-TOPO foram clonados em
E.coli, como já descrito. As colônias contendo os plasmídeos positivos foram testadas
com os primers da sequência do vetor em combinação com os primers da sequência da
mirosinase. Este teste foi realizado para verificar a posição dos insertos no vetor e se
apresentavam os tamanhos de bases esperados.
O sequenciamento destes plasmídeos purificados mostrou que o clone obtido
com o par de primers S1/R2, denominado como miro1, apresentou 963 pb, o clone
obtido com a combinação S1/R6, nomeado como miro2, resultou em 975 pb e o clone
obtido com o par de primers S5/R6, chamado de miro3, apresentou um fragmento de
411 pb. Foram feitas várias repetições de sequenciamento que serviram para eliminar
ao máximo as ambigüidades da seqüência, com o objetivo de melhorar o grau de
confiabilidade da análise. A partir destas repetições, uma seqüência de consenso foi
elaborada com a ajuda do aplicativo "Pretty" para cada um dos clones. Das seqüências
de consenso, foram feitas análises de tradução da proteína, usando o aplicativo
"Translate".
As seqüências de aminoácidos deduzidas para a semente de mamão foram,
então, analisadas pelo "BLAST" (Basic Local Alignment search Toa/) , disponível no site
http://www.ncbi.nim.nih.gov, para verificar se eram parecidas com algumas das ~
tioglicosidases depositada no Genebank.
88
Estas análises resultaram em alta similaridade com outras mirosinases conforme
indicado pelos baixos "e value" fornecidos pelo aplicativo BLAST a cada um dos
alinhamentos. O "e value" mostra que quanto mais próximo de zero, maior a
similaridade com as seqüências de comparação. Assim, com este resultado pode-se
concluir que a probabilidade deste alinhamento ter sido ao acaso foi quase zero.
As análises obtidas pelo BLAST mostraram altos graus de similaridade com as
mirosinases de Sinapis alba (mostarda branca) (P293736; S19149; P29092 e P29738),
Arabidopsis thaliana (BT002458; AAK62412; AAF14024; NP187537; S57621; P37702;
S56653 e NP175191)J J Brassica juncea (mostarda marrom ou oriental) (AAG54074)J
Raphanus sativus (rabanete) (BAB17227) e Brassica napus (canola) (CAA79989;
S39550 e Q00326)J que são plantas, junto de outras já citadas no início deste trabalho,
que têm como característica a produção de glicosinolatos.
Houve 67% de similaridade da sequência parcial deduzida para o mamão com
Arabidopsis thaliana (BT002458) com "e value" de 9X10-95. Nesta planta foram
encontradas basicamente duas mirosinases funcionais que codificam para os genes
denominados como TGG1 e TGG2, sendo que foram observados altos níveis de
expressão gênica do promotor de TGG1 nas células guarda e no f10ema do pedúnculo
floral, região de alta produção de glicosinolatos (HUSEBYE et aI., 2002). Análises
filogenéticas mostraram que esses dois genes de Arabidopsis thaliana foram agrupados
nas duas famílias gênicas, MA e MB (XUE et aI., 1995), sendo que a família MB, que
codificam para mirosinases de 65 KDa é a que provavelmente teria atividade contra os
insetos (CHEN & ANDRÉASSON, 2000) e a de maior similaridade com a do mamão.
!i
·i
1~------------
89
A seqüência parcial de aminoácidos deduzida para o mamão mostrou 62 % de
similaridade com as mirosinases de mostarda branca, com "e value" 10-83, e na qual a
família MB também está presente. Os genes da família MA e MB de mostarda branca,
são potencialmente expressos durante o desenvolvimento da semente e do embrião
(XUE et aI., 1995). Estas enzimas já foram bem caracterizadas na mostarda branca e
as proteínas analisadas por cristalografia de raios X, que identificaram algumas regiões
conservadas, importantes no mecanismo de ação das mirosinases, o que serviu de
comparação com a seqüência parcial de aminoácidos da mirosinase, isolada do mamão
(BURMEISTER et aI., 1997; RASK et aI., 2000).
As famílias gênicas das mirosinases MA, MB, MC e MBPs (mirosinases ligadas a
proteínas), foram inicialmente descobertas em plantas de B. napus (canola), a partir da
qual descobriu-se que há diversas isoformas, neste trabalho, a sequência parcial
deduzida para o mamão apresentou 51 % de similaridade com as mirosinases de canola
(FALK et aI., 1995; CHEN & ANDRÉASSON, 2000).
Em outras plantas que sintetizam de glicosinolatos, tais como rabanete e
mostarda oriental, foram encontrados cerca de 52% e 45% de similaridade com a
mirosinase de mamão, respectivamente.
Após as análises fornecidas pelo BLAST, as sequências parciais da mirosinase
de mamão foram alinhadas com as seqüências de aminoácidos de outras mirosinases
inicialmente utilizadas no planejamento dos primers, as quais estavam disponíveis no
GenBank, através do aplicativo Pileup. Os dados mostrados no alinhamento (Figura
28), sugerem que os três clones, ainda que parciais, parecem representar a mesma
seqüência, portanto, é possível que sejam produtos de um mesmo gene.
,J
90
Para verificar, no alinhamento, quais as sequências eram similares e/ou
indênticas e/ou conservadas, foi utilizado o programa Boxshade, disponível no síte:
http://bioweb.pasteur.frlseganal/interfaces/boxshade.html, mostrando que as áreas coloridas em preto,
significam que pelo menos 50% dos aminoácidos são idênticos, as áreas em cinza,
representam as seqüências similares e conservadas (identidade menor que 50%) e o
verde representa as seqüências conservadas com 100% de identidade.
~~,~,°1
IJI
92
A mirosinase de mamão parece estar mais próxima das mirosinases deduzidas
para mostarda branca: MB49 (819149), MB92 (P29092) e MB38 (P29738) e
Arabidopsis thaliana 91 (BT002458), devido à sua posição dentro do alinhamento
(Figura 28), esta proximidade parece estar de acordo com a alta similaridade
encontrada para a seqüência de mirosinase do mamão com as seqüências de
Arabidopsis thaliana (67%) e mostarda (62%).
Na análise da estrutura tridimensional da mirosinase, Burmeister et aI. (1997)
identificaram resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação da glicose com a aglicona
e envolvidos no mecanismo catalítico. Esses resíduos estão representados no
alinhamento com um asterisco magenta (*) e foram encontrados também na mirosinase
de mamão. A suposta mirosinase obtida a partir da semente de mamão, apresentou
grande parte dos aminoácidos e algumas regiões de domínios funcionais bem
conservados quando comparada a mirosinases de outras plantas. Nas seqüências
obtidas por Burmeister et aI. (1997) e em seguida por Rask et aI. (2000) um resíduo a
mais de aminoácido está envolvido nesta ligação, no caso a glutamina, a qual foi
encontrada antes do aminoácido histidina-217, na distância de setenta e três
aminoácidos anteriores.
Os resíduos que constituem o nucleófilo catalítico das mirosinases são altamente
conservados, e estão presentes na seqüência parcial da mirosinase obtida com o
mamão. O nucleófilo catalítico é a região do primeiro ataque da enzima ao substrato,
ele é constituído por um resíduo de aminoácido glutâmico, e pode ser visualizado na
Figura 28 através da região colorida em verde e delineada em magenta. Ainda nesta
figura, pode ser observado o nucleófilo catalítico das o -glicosidases, na região da linha
93
pontilhada em vermelho, a presença destes resíduos mostram o alto grau de
parentesco destas enzimas com as mirosinases, assim como observado por
BURMEISTER et aI. (1997) e RASK et aI. (2000)
Com relação ao mecanismo de regulação da atividade enzimática das
mirosinases, os resíduos do alinhamento que foram delineados em azul, são muito
importantes, pois, estão diretamente envolvidos na re-ligação da enzima com a aglicona
durante a catálise (BURMEISTER et aI. (1997); RASK et aI. 2000).
Foi observado que a mirosinase é uma proteína dimérica que se encontra ligada
a um íon metálico Zn2+, sendo que este cátion é responsável pela estabilização dos
dímeros da mirosinase. Os resíduos de aminoácidos responsáveis por essa ligação
foram observados em mostarda no trabalho de cristalização da proteína (BURMEISTER
et aI., 1997; também citado por RASK et aI. 2000), entretanto, pelo fato de ser um
sequenciamento parcial, não foi possível visualizar estes resíduos no mamão. Na
seqüência obtida para mirosinase do mamão foi verificada uma diferença nos resíduos
de aminoácidos nas possíveis regiões de glicosilação (destacadas na Figura 28 por um
delineamento em amarelo, entre os aminoácidos 420 e 440), ou seja, houve a
substituição de um resíduo de asparagina (N), presente na mirosinase de mostarda
branca cristalografada, por um resíduo de arginina (R), e também a substituição de
asparagina pelo resíduo prolina (P).
BIBLIOTECAFaculdade de CI~"~;:s Farmacêuticas
Universidôde de Sá" Pau\o
94
4.11 Expressão heteróloga do cDNA da mirosinase de semente de
mamão em E.colí
A proteína total foi extraída a partir da polpa, casca e semente de mamão (Figura
29). O interesse na obtenção deste perfil foi verificar se as mirosinases na faixa de peso
molecular descrita na literatura estavam próximas das obtidas com o gel corado para
proteína. Como já observado, dependendo da família gênica codificadora, do nível de
glicosilação ou complexação com outras proteínas, os pesos moleculares das
subunidades de mirosinases podem variar de 70 a 59 Kda (FALK et aI., 1992; LENMAN
et aI. 1993). Na Figura 29 pode ser observado que nos três tecidos do mamão foram
encontradas proteínas em uma ampla faixa de peso molecular, o que dá uma boa
probabilidade de se encontrar uma mirosinase. Para confirmar a presença da enzima e
a expressão da proteína durante o desenvolvimento e amadurecimento nos diversos
tecidos do mamão, são necessárias as obtenções de anticorpos poli ou monoclonais.
4
2
1 2 3 4
Figura 29: Eletroforese de proteínas de mamão em sistema dissociante SDS
PAGE, gel a 9%. Padrão de peso molecular (1); polpa com 120dpa (2); casca
com 150 dpa (3); semente com 150dpa (4).
95
Quanto à indução da proteína, pode-se observar na Figura 30, que a cepa
BL21 (DE3)pLysS de Ecolí expressou a proteína recombinante codificada pelo
fragmento de cDNA de 975 pares de bases. O peso molecular predito para esta
proteína recombinante foi de aproximadamente 37 KDa. O tempo ótimo de indução foi
de 4 horas, que resultou em maior concentração da proteína recombinante expressa e
induzida pelo IPTG.
i'·
97
66
45
30
20··..."t::
KDa
4h 2h 2h 2h 6h 6h 6h 4h 4h
Intervalos de indução
Figura 30: Eletroforese de extratos protéicos de E calí em gel de poliacrilamida
9% da expressão piloto de mirosinase. Padrão de peso molecular (P); indução da
colônia 1 (IC1); bactérias não-induzidas com IPTG (NI); indução da colônia 2 (IC2).
A expressão em sistema heterólogo conduzido em leveduras (Pichia pastoris), a
partir do cDNA do gene MB de canola, forneceu uma isoforma de mirosinase de 64 KDa
(HARTEL & BRANT, 2002). Já no mamão, a expressão heteróloga realizada em
bactérias (E CO/I), forneceu uma proteína recombinante com o tamanho da subunidade
de 37 Kda. Essa diferença no tamanho da subunidade com relação à literatura pode ser
96
atribuído ao fato de que foi utilizada apenas uma parte da seqüência protéica e não a
seqüência inteira, elou pelas diferenças dos tipos de sistemas aplicados. Apesar da
proteína recombinante estar incompleta, ela mostrou alta similaridade com as mesmas
proteínas da canola expressas na levedura.
O passo seguinte foi a tentativa de se obter os anticorpos policlonais entretanto,
talvez devido à falta do restante da seqüência, este trabalho não apresentou resultados
satisfatórios (dados não mostrados).
4.12 Expressão ~~nica da Illirosinase de mamão papaia
A transferência dos RNAs totais para membrana de nylon mostrou que os RNAs
ribossomais estavam íntegros (Figura 31). Apesar das quantidades de 'RNA não
estarem homogêne~ f:m todas as fases do desenvolvimento, especialmente no estádio" I
de q,madurecimentQ qa semente e em algumas fases do desenvolvimento qa ç,ascs,
não houve probl~ma$ çom a análise, pois, o aumento da transcrição ocorreu apenas no
ponto de colheit~.
li ,~
97
fi~
·18S
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14B
1~·;t'1
y ,:~:"f;/" .~~.. .' I ~ ~f
"h~· , 'i<; jj
Figura 31: Análise de northem blot em diferentes tecidos do mamão papaia A.
Eletroforese de RNA total em gel de agarose (1,2%). POLPA com 30 dpa (1), 60 dpa
(2), 90 dpa (3), 120 dpa (4), 150 dpa (5); CASCA com 30 dpa (6), 60 dpa (7), 90 dpa
(8), 120 dpa (9), 150 dpa (10) e SEMENTE com 60 dpa (11), 90 dpa (12), 120 dpa (13),
150 dpa (14),153 dpa (15),155 dpa (16),156 dpa (17),157 dpa (18); i. Autoradiografia
de RNA hibridizado com a sonda específica para mirosinase do mamão. B. Eletroforese
de RNA total em gel de agarose (1,2%). CASCA com 30 dpa (1), 60 dpa (2), 90 dpa (3),
120 dpa(4), 150 dpa (5) e SEMENTE com 30 dpa(6), 60 dpa(7), 90 dpa(8), 120 dpa (9),
150 dpa(10), 153 dpa(11), 155 dpa (12),156 dpa (13),157 dpa(14); ii. Autoradiografia:
de RNA hibridizado com a sonda específica para mirosinase. 11,',".
l~
As membranas hibridizadas com a sonda marcada, mostraram boa
especificidade com os RNAs transcritos da semente. Esta seqüência parcial que foi
marcada radioativamente foi a que apresentou maior número de bases e que fomeceu
melhores resultados quanto à similaridade junto à família gênica MS, as quais codificam
para mirosinases de 65 KDa na planta de mostarda branca (Sinapis alba) (XUE et all'\'..
1992), canola (Brassica napus) (LENMAN et aI., 1993), Arabidopsis thaliana (XUE et al.\1
1995a) e rabanete (HARA et aI., 2000). Segundo Lenman et aI. (1993) e FALK et aI.
--e::::: ~
98
(1995) os transcritos MS mostraram expressão dominante em sementes, plântulas e ~.
folhas jovens de B. napus, enquanto que no desenvolvimento da semente só foram
expressos genes da família MA. Essa observação parece não se aplicar para as
sementes de mamão durante o desenvolvimento, uma vez que a sonda utilizada
apresentou semelhança apenas com os genes da família MB.
De acordo com a Figura 31 (itens A e B), os transcritos da mirosinase aparecem
na semente e a partir dos 90 dpa. Um grande aumento na transcrição gênica é
encontrado no ponto de colheita (150 dpa) que em seguida, após a colheita, permanece
constante. O perfil do nível de transcritos da mirosinase da semente acompanha o perfil
de atividade (Figura 21), ou seja, enquanto aumenta a atividade no ponto de colheita,
aumenta o nível de transcrito (Figura 31). Já na fase pós-colheita o perfil de atividade
da semente é mantido alto (Figura 21), porém não é acompanhado pelo nível de
transcritos.
Não se sabe qual seria a razão definitiva para o aumento da atividade e do nível
de transcritos da enzima. Uma das hipóteses seria que a planta poderia entender o
sinal de desligamento da planta - mãe como uma injúria e ativar o seu mecanismo de
defesa para produzir, no caso do mamão, o BITC e com isso melhorar o sistema de
proteção do fruto através do aumento da atividade de enzimas antioxidates, assim
como as glutationa S-transferases, já que foi observado que o BITC aumenta a
atividade destas enzimas, tanto nos mamíferos, como nas plantas, sendo enzimas
chaves na detoxificação dos muitos agentes prejudiciais nos vários tipos de células
(MARSS, 1996; DERRIDER et aI., 2002).
6 '. :i .... \ O í f. C f-.f-oculda
nede ,..;.:; .. : .;~ F?ní\aGeU\\ca~
Uf\\'/e!5idírl(~ (:í: :~~o r,,'.lil)
99
Quanto à ausência destes transcritos na casca, na polpa e no início do ;~!:l
"desenvolvimento da semente, é difícil saber o que ocorreu realmente nestes tecidos.
Uma das hipóteses seria a de que outras famílias gênicas de ~-tioglicosidases poderiam
estar presentes na polpa, na casca e no início do desenvolvimento da semente, ou
talvez que a quantidade de RNA mensageiro presente nestes tecidos, seria insuficiente
para resultar em sinal visível.
5. CONCLUSÕES
» Não foi encontrada correlação entre a atividade da mirosinase e os níveis de BG
e BITC, cujos maiores teores foram encontrados na fase inicial e durante o
desenvolvimento do fruto, na semente e na sarcotesta.
» O sistema glicosinolato-mirosinase parece ser afetado pelo 1-MCP mas não pelo
etileno.
» O perfil de transcritos da mirosinase isolada do mamão mostrou que a
transcrição desta enzima ocorre apenas na semente, e inicia-se aos 90 dpa,
apresentando um significativo aumento da transcrição no ponto de colheita
(150 dpa), concomitante ao aumento de atividade.
100
6. BIBIOGRAFIA CITADA
AUSUBEL, F.M., BRENT, R, KINGSTON, RE., MOORE, D.D., SMITH, J.A.,
SEIDMAN, J.G., STRUHL, K. Current protocols in molecular biology. New Yor\<:
John Wiley, 1987-1997. v.1-3, suppI.1-35.
ANDRÉASSON, E.; JORGENSEN, L. B.; HOGLUND, A-S.; RASK, L.; MEIJER, J.
Different myrosinase and idioblast distribuition in Arabídopsís thalíana and Brassíca
napus. Plant Phisyol., v. 127, p. 1750-1763,2001.
BAK, S.; NIELSEN, H. L.; HALKIER, B. A. The presence of CYP79 homologues in
glucosinolates-producing plants shoes evolutionary conservation of the enzymes in the
conversion of amino acid to aldoxime in the biosynthesis of cyanogenic glucosides and
glucosilates. Plant Molecular Biology, v.38, n.5, p.725-734, 1998.
BARRETTO, P.D.; ARAÚJO-FILHO, G.C. , DANTAS, J. L.L. Inter-relações entre
variáveis associadas a precocidade, ao crescimento e ao teor de nutrientes absorvidos
de mamoeiro. Embrapa Agroindústria Tropical. Boletim de Pesquisa e
desenvolvimento, 7, 2002, 25p.
BENNET, R N.; KIDDLE, G.; WALLSGROVE, R M. Biosynthesis of
benzylglucosinolate, cyanogenic glucosides and phenylpropanoids in Canca papaya.
Phytochemistry, v.45, n.1, p.59-66, 1997.
/ BIBLl0 1E C'\Facuidade de Ciencias rarl1\a
cêuüca
s
univer5idade de Sáu Paulo
,"t"
101
BERGMEYER, H. U., ed Methods of enzimatic analysis. 2 ed. New Yor!<: Academic
Press 3: 1212-1215. 1974.
BLAKE-KALFF, M.M.; HARRISON, K.R.; HAWKESFORD, M.J.; ZHAO, F.J.; McGRATH,
S.P. Distribuition of sulfur within oilseed rape leaves in response to sulfur deficiency
during vegetative growth. Plant Physiology, 118, p. 1337-1344, 1998.
BLAKENSHIP, S.M.; DOLE, J.M. 1-Methylciclopropene: a reveiw. Phosharverst
Biology and lechnology, v. 28, p. 1-25, 2003.
BONES, A. Distribuition of (3-thioglucosidase activity in intact plants, cel! and tissue
cultures and regenerant plants of Brassica napus L. Exp. Bot. v. 41, p. 737-744, 1990.
BOREK, V.; ELBERSON, L. R.; McCAFFREY, J. P.; MORRA, M. J. Toxicity of
isothiocyanates produced by glucosinolates in Brassicaceae species to black vine
weevil eggs. Journal Agricultural Food Chemistry, v. 46, p. 5318-5323,1998.
BOTTI, M. G.; TAYLOR, M. G.; BOTIING, N. P. Studies on the mechanism of
myrosinase: investigation of the effect of glycoyl acceptors on enzyme activity. lhe
Journal of Biological Chemistry, v.270, n.35, p.20530-20535, 1995.
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram
~i'. ~;!,
102
quantities of protein utilizing the principie of protein-dye binding. Analitical
Biochemistry, v. 72: 248-54. 1976.
BROWN, P. D.; MORRA, M. J.; BOREK, V. Gas chromatography of allelochemicals
produced during glucosinolate degradation in soi!. J. Agric. Food Chem. v. 42:, p.
2029-2034, 1994.
BUCHANAN, B.B.; GRUISSEM, W.; JONES, R. L. Biochemistry & Molecular Biology
of Plants. American Society of Plant Physiologists Rockville Maryland, 2000, 1367p.
BURMEISTER WP, COTTAZ S, DRIGUEZ H, IORI R, PALMIERI S, HENRISSAT B.
The crystal structures of Sinapis alba myrosinase and a covalent glycosyl-enzyme
intermediate provide insights into the substrate recognition and active-site machinery of
an S-glycosidase. Structure, v. 5, n. 5, p. 663-675, 1997.
BURMEISTER, W.P.; COTTAZ, S.; ROLLlN, P.; VASELLA, A. HENRISSAT, B. High
resolution X-ray crystallography shows that ascorbate is a cofactor for myrosinase and
substitutes for the functional of the catalytic base. Journal of Biological Chemistry, v.
275, n. 50, p. 39385-39393,2000.
CAIRNS, T.; SIEGMUND, E. G.; STAMP, J. J. Characterization of benzyl isothiocianate
and phenyl acetonitrile from papayas by mass spectrometry. J. Assoc. Off. Anal.
Chem., v.71, n.3, p.547-550, 1988.
103
CHAN Jr., H. T, HIBBARD, K., GOO, T AKAMINE, E. K. Sugar composition of papayas
duringfruitdevelopmen1. HortScience, S1. Joseph, v.14, n. 2, p.140-141, 1979.
CHADCHAWAN, S.; BISHOP, J.; THANGSTAD, O.P.; BONES, AM.; MITCHELL
OLDS, T; BRADLEY, D. Arabidopisis cDNA sequence encoding myrosinase. Plant
Physiol., v. 103, p. 671-672, 1993.
CHAN Jr., H. T, HIBBARD, K., GOO, T AKAMINE, E. K. Sugar composition of papayas
during fruit developmen1. HortScience, S1. Joseph, v.14, n. 2, p. 140-141, 1979.
CHEN, S. ANDREASSON, E. Update on glucosinolate metabolism and transporto Plant
Physiol. Biochem., v.39, p. 743-758, 2001.
CHEN, S.; PETERSEN, B. L.; OLSEN, C. E.; SCHULZ, A; HALKIER, B. A Long
distance ploem transport of glucosinolates in Arabidopisis. Plant Physiol., v. 127, p.
194-201,2001.
CHEN, D.L.; HASHIMOTO, K.; UDA, Y. In vitro digestion of sinigrin and glucotropaeolin
by single strains of Bifídobacterium and identification of the digestive produc1. Food and
Chemical Toxicology, v. 42, p. 351-357,2004.
CHITARRA, M. I. F.; CHITARRA, A B. Pós-colheita de frutos e hortaliças - fisiologia e
manuseio. Lavas: ESALlFAEPE, 1990. Cap.6, p.143-98.
104
DAVIES., P. J. Plant Hormones: Physiology, biochemistry an molecular biology.
Boston: Kluewer Academic Publishers, 833p., 1995.
DERIDDER, B.P; DIXON, D.P.; BEUSSMAN, D. J.; EDWARDS, R., GOLDSBROUGH,
P.B. Induction of glutathione S-transferases in Arabidopsis by herbicide safeners. Plant
Physiology, v. 130, p. 1497-1505,2002.
DEY, P.M.; HARBORNE, J.B. Plant Bioehemistry. Califomia, San Diego, Academic
Press, 554p., 1997.
DOUGHTY, K.J.; BLlGHT, M.M.; BOCK, C.H.; FIELDSEND, J.K.; PICKETT, J.A.
Release of alkenyl isothiocyanates and other volatiles from Brassica rapa seedlings
during infection by Alternaria brassicae. Phytoehemistry, v. 43, n.2, p. 371-374, 1996.
OU, L., LYKKESFELDT, J.; OLSEN, C. E.; HALKIER, B. A. Involvment of cytochrome
P450 in oxime production in glucosinolate biosynthesis as demonstrade by na in vitro
microsomal enzyme system isolated from jasmonic acíd-induced seedlings of Sinapis
alba L. Proe. Natl. Aead. Sei., v.92, p.12505-12509, 1995, USA.
OU, L. and HALKIER, B. A. Isolation of a microsomal enzyme system involved in
glucosinolate biosynthesis from seedlings of Tropaeolum majus L. Plant Phisiol, v.111 ,
p.831-837, 1996.
105
ERIKSSON, S.; EK, B.; XUE, J.; RASK, L.; MEIJER, J. Identification and
characterization of soluble and insoluble myrosinase isoenzymes in different organs of
Sinapis alba. Physiol Planta, v.111 (3), p. 353-364, 2001.
FAHEY, J. W.; ZALCMANN, AT.; TALALAY, P. The chemical diversity and distribuition
of glucosinolates and isothiocyanates among plants. Phytochemistry, v.56, p. 5-51,
2001.
FALK, A; XUE, J.; LENMAN, M.; RASK, L. Sequence of cDNA clone encoding the
enzyme myrosinase and expression of myrosinase in different tissues of Brassica
napus. Plant Science, v. 83, p.181-186, 1992.
FALK, A; EK, B.; RASK, L. Characterization of a new myrosinase in Brassica napus.
Plant Molecular Biology, v.27, p.863-874, 1995
FENWICK, G. R.; HEANEY, R. K.; MULLlN, W. J. Glicosinolates and their breakdown
products in food and food plants. Criticai Reviews in Food Sci. and Nutrition, v.18,
n.2, p.123-201, 1983.
106
GOMEZ, M.L.P.A.; LAJOLO, F.M.; COROENUNSI, B.R. Evolution of soluble sugars
during ripening of papaya fruit and it relation to sweet taste. Journal of Food Science,
Chicago, v. 67, n. 1, p. 442-447,2002.
GOOSEN, T.C.; MILLS, O.E.; HOLLENBERG, P.F. Effects of benzi! isothiocyanate on
rat and human cytochromes P450: identificartion of metabolites formed by P450 2B1.
The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, v.296, n. 1, p.198
206,2001.
GUO, L.; POULTON, J.E. Partial purification and characterization of Arabdopsis thaliana
UOPG: thiohydroximato glucosyltransferase. Phytochemistry, v. 36, p. 113-1138, 1994.
HALKIER, B. A. Glucosinolates, in : Ikan R. (Ed.), Naturally Occuring Glycosides:
Chemistry, Distribuition and Biological Properties, John Wiley and Sons Ltd,
London, pp. 193-223, 1999.
HARA, M.; ETO, H. and KUBOI, T. Tissue priting for myrosinase activity in roots of
turnip and Japanese radish and horseradish: a technique for localizing myrosinases.
Plant Science, v. 160, p. 425-431,2001.
HARBORNE, J. B. The comparative biochemistry of phytoalexin induction in plants.
Biochem. Syst. Ecol., v.27, p. 335-367, 1999.
107
HARTEL, F.V.; BRANDT, A Characterization of a Brassica napus myrosinase
expressed and secreted by Pichia pastoris. Protein Expression and Purification, v.
24, p. 221-226, 2002.
HA5EGALWA, T; YAMADA, K.; K05EMURA, 5.; YAMAMURA, 5.; HASEGAWA, K.
Phototropic stimulation induces the conversion of glucosinolate to phototropism
regulating substances of radish hypocotyls. Phytochemistry, 54, p. 275-279, 2000.
HOGLUND A 5.; LENMAN M.; FALK A; RA5K L. Distribution of myrosinase in
rapeseed tissues. Plant Physiol. V. 95, p. 213-221, 1991.
HUSEBYE, H.; CHADCHAWAN, S.; WINGE, P.; THANGSTAD, O.P.; BONES, AM.
Guard cells- and Phloem Idioblast-Specific Expression Specific of Thioglucosidase
Glucohidrolase 1 (Myrosinase) in Arabdopsis. Plant Physiology, v.128, april, p. 1180
1188,2002.
JONES, A M. E., BRIDGES, M.; BONES, A M.; COLE, R.; ROSSITER, J. T Purification
and characterisation of a non-plant myrosinase from the cabbage aphid Brevicoryne
brassicae (L.). Insect Biochemistry and Molecular Biology. V.31, p. 1-5,2001.
JONHSON, I.T Glucosinolates: bioavailability and importance to health. Int. J. Vitam,
Nutr. Res., v. 72, n. 1, p.126-131, 2002.
108
JWANNY, E. W.; ELSAYED, S. T. Glycosidases of turnip leaf tissues. 2. Isolation,
purification, and some physiochemical characterization. Applied Biochemistry and
Biotechnology, v.49, n.1, p. 23-24,1994.
KERMANSHAI, R; McCARRY, B.E.; ROSENFELD, J.; SUMMERS, P.S.;
WERETILNYK, E.A; SORGER, G.J. Benzyl isothiocyanate is the chief or sole
anthelmintic in papaya seed extracts. Phytochemistry, v. 57, p. 427-435,2001.
KIDDLE, G.; BENNETT, R N.; BOTTING, N. P.; DAVIDSON, N. E.; ROBERTSON, A
A B.; WALLSGROVE, R M. Hight-performance liquid chromatografic separation of
natural and synthetic desulphoglucosinolates and their chemical validation by UV, NMR
and chemical ionisation-MS methods. Phytochemical analysis, v.12, n. 4, p. 226-242,
2001.
KOROLEVA, O. A; DAVIES, A DEEKEN, R; THORPE, M.R; TOMOS, A D.;
HEDRICH, R Indentification of a new glucosinolate-rich cell type in Arabidopsis f10wer
stalk. Plant Physiology, v. 124, p. 599-608, 2000
LAL, J.; CHANDRA, S., RAVIPRAKASHI, V.; SABIR, M. In vitro anthelmintic action of
some indigenous medicinal plants on Ascaridia gali worms. Indian Journal of
Physiology and Pharmacology, v. 20, p. 400-404, 1976.
LAZZERI, L.; LEONI, O.; MANICI, L.M. Biocidal plant dried pellets for biofumigation.
Industrial crops and Products, v. 20, p. 59-65, 2004.
109
LENMAN, M.; RODIN, J.; JOSEFSSONL-G.; RASK, L. Immunological characterization
of a rapeseed myrosinase. Eur. J. Biochem., v. 194, p. 747-753, 1990.
LENMAN, M.; FALK, A.; RODIN, J.; HOGLUND, A-S.; EK., B.; RASK, L. Differential
expression of myrosinase gene families. Plant Physiol, v. 103, p. 703-711, 1993.
LI, Q.; EIGENBRODE, S. D.; STRINGAM, G. R; THIAGARAJAH, M. R Feeding and
growth of Plutella xylostella and Spodoptera eridania on Brassica juncea with varying
glucosinolate and myrosinase activities. Journal of Chemical Ecology, v.26, n. 10, p.
2401-2418, 2000.
LÓPEZ-GÓMEZ, R, GÓMEZ-L1M, M. A. A method for extracting intact RNA from fruits
rich in polysaccharides using ripe mango mesocarp. Hortscience, v.27, n.5, p.440-442,
1992.
LOWRY, O.H.; ROSENBROUGH, N. J.; RANDHALL, R J. Protein measurement with
the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., Baltimore, v.193, p. 265-275, 1951.
LYKKESFELDT, J. and M<jlLLER, B. L. Synthesis of benzylglucosinolate in Tropaeolum
majus L. Plant Physiol., v. 102, p. 609-613, 1993.
110
MARSS, K. A The function and regulation of glutathiona S-transferase in plants. Annu.
Ver. Plant Physiol. Plant Moi. Biol., v. 47, p. 127-158, 1996.
MANRIQUE, G. D. Caracterização parcial dos polissacarídeos da parede celular,
suas transformações e correlação com o amaciamento pós-colheita de mamões
(Canca papaya L. cv. Sunrise Solo). São Paulo, 2001. 117p. (Faculdade de Ciências
Farmacêuticas - USP).
MENDES, L. G.; DANTAS, J. L. L.; MORALES, C. F. G. Mamão no Brasil. Cruz das
Almas, BA: EUFBAlEMBRAPA-CNPMF, 179p. 1996.
MIKKELSEN, M.D.; PETERSEN, B.L.; GLAWISCHNIG, E.; JERSEN, AB.;
ANDREASSON, E., HALKIER, B.A Modulation of CYP79 genes and glucosinolate
profiles in Arabidopsis by defense sinaling pathways. Plant Physiology, v. 131, p. 298
308,2003.
MORIMITSU, Y; HAYASHI, K; NACAGAWA, Y; FUJII, H.; HORIO, F.; UCHIDA, K ;
OSAWA, T. Antiplatelet and anticancer isothiocyanates in japanese domestic
horseradish, wasabi. Mechanism of Ageing and Development, v.116, p.125-134,
2000.
MÜLLER, KO. & BORGER, H. Experimentelle Untersuchungen über die Phytophthora
resistenz den Kartoffel. Arbeiten aus derBiologischen Bundensanstalt für Land- und
Fortswirtschaft, Berlin, 23: 189-231, 1940.
111
NAKAMURA, Y; OHIGASHI, H.; MASUDA, S.; MURAKAMI, A.; MORIMITSU, Y;
NAITO, Y; KAWAMOTO, Y; OSAWA, T.; IMAGAWA, M.; UCHIDA, K. Redox regulation
of glutathione S-transferase P1 induction by benzyl isothiocyanate: correlation of
enzyme induction with the formation of 2', 7' - dicholorfluoresein diacetate-detectable
reactive oxygen intermediates. Cancer Res., v. 60, p. 219-225,2000.
OLIVEIRA, F.A.M.B. ; VIANNI, R. ; SOUZA-DE, G. ; ARAÚJO, T.M.R. Caracterização
do estádio de maturação do papaia "Gloden" em função da cor. Revista Brasileira de
Fruticultura, Jaboticabal, v. 24, n. 2, p. 559-561, 2002.
PALMIERI, S.; LEONI, O.; IORI, R. A steady-state kinetics study of myrosinase with
direct ultraviolet spectrophotometric assay. Anal. Biochem., v.123, p.320-324, 1982.
PALMIERI, S.; 10RI, R. and LEONI, O. Comparasion of methods for determining
myrosinase activity. J. Agric. Food Chem., v. 35, p. 617-621,1987.
PALMIERI S.; ROLlN P.; SORENSEN H.; SORENSEN S. Myrosinase technology for a
potential glucosinolate utilization in agroindustry. Agro. Food Inst. Hi-tech. Jan.lFeb.
P. 24-27, 1998.
PATIL S. S. and TANG C.S. Inhibition of ethylene evolution in papaya pulp tissue by
benzyl isothiocyanate. Plant Phisiol., v.53, p. 585-588, 1974.
112
PHELAN, J.R., VAUGHAN, J.G. Myrosinase in Sinapis alba L. J. Exp. Bot., v. 31,
p.1425-1433, 1980.
PIHAKASKI, K.; PIHAKASKI, S. Mirosinase in Brassicaceae (Cruciferae). 11. Myrosinase
activity in different organs of Sinapis alba L. J. Exp. Bot., v. 29, p.335-345, 1978.
RASK, L.; ANDRÉASSON, E.; EKBOM, B.; ERIKSSON, S.; PONTOPPIDAN, B.;
MEIJER, J. Myrosinase: gene family evolution and herbivore defense in Brassicaceae.
Plant Molecular Biology. v.42, p. 93-113,2000.
RODMAN J. E. Divergence, convergence, and parallelism in phytochemical characters:
the glicosinolate-myrosinase system. In: YOUNG, D. A.; SEIGLER, D. S. ed.
Phytochemistry and Angiosperm Phylogen. New Yor\<: Pragger Press, p. 43-79,
1981.
RODMAN J. E.; SOLTIS, P.S.; SOLTIS, D.E.; SYTSMA, K.J.; KAROL, K.G. Parallel
evolution of glucosinolate biosynthesis inferred from congruent nuclear and plastid gene
phylogenies. Am. J. Bot., v. 85, p. 997-1006,1998.
ROJAS-TRONCOSO, R.; ESTRADA-SÁNCHES, A.; RUELAS, R.; GARCIA, H. S.;
HERNÀNDEZ-TIZNADO, M. E. Effect of benzyl isothiocyanate on tomato fruit infection
development by Altemaria altemata. Journal of the Science of Food and Agriculture
(in press), 2005.
113
REYMOND, P.; BODENHAUSEN, N.; VAN-POECKE, R.M.P.; KRISHNAMURTHY, V.;
DICKE, M.; FARMER, E.E. A conserved transcript pattem in responseto a specialist
and generalist herbivore. The Plant Cell, v. 16, p. 3132-3147,2004.
ROESSINGH, P.; STADLER, E. F.; FENWICK, G.R.; LEWS, J.A.; NIELSEN, J.K.,
HUNTER, J.; RAMP, T. Ovoposition and tarsal chernoreceptors of the cabbage root f1y
are stimulated by glucosinolates and host plant extracts. Entornol. Exp. Appl., v. 65, p.
267-282, 1994.
SAMBROOK, J., FRITSCH ,E.F., MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory
manual. 2. ed. NewYork: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.3 v.
SAUL, S.; SEIFERT, J. Methoprene on papayas - Persistence and toxicity to different
developmental stages of fruit-flies (Diptera, Tephritidae). Joumal of Economic
Entomology, v.83, n.3, p.901-904, 1990.
SHELLlE, K.C. & MAGAN, R. L. Postharvest disinfestation heat treatrnents: response of
fruit and fruit fly larvae to different heating media. Postharvest Biology and
Technology, v. 21, p.51-60, 2000.
SHEU, F.; SHYU, Y. T. Determination of benzyl isothiocianate in papaya fruit by solid
phase extraction and gas chrornatography. J. of Food and Drug Analysis, vA, nA, p.
327-334, 1996.
114
SEO, S. T; TANG, C. Hawaiian fruit f1ies (diptera: Tephritidae): toxicity of benziI
isothiocyanate against eggs or ist instars of three species. Journal of Economic
Entomology, v.75, n.6, p.1132-1135, 1982.
SEO, S. T; TANG, C.; SANIDAD, S.; TAKENAKA, TH. Hawaiian fruit flies (diptera:
Tephritidae): variation of index of infestation with benzyl isothiocyanate concentration
and color of maturing papaya. Journal of Economic Entomology, v.76, n.3, p.535-538,
1983.
SEYMOUR G. B., TAYLOR J. E., TUCKER G. A. Biochemistry of Fruit Ripening,
London: Chapman & Hall ed.2 ,p. 83-101, 1993.
SIMMONDS, M.S.J.; BLANEY, W.M.; MITHEN, R.; BIRCH, A. N.E.; LEWIS, J.
Behavioural and chemosensory responses of the turnip root fly (Delia floralis) to
glucosinolates. Entomol. Exp. Appl., v. 71, p. 41-57, 1995.
TANG, C. S. Benzyl isothiocyanate of papaya fruit. Phytochemistry, v.10, p.117-121,
1970.
THANGSTAD, O. P.; EVJEN, K.; BONES, A. Immunogold-EM localization of myrosinase
in Brassicaceae. Protoplasma, v.161, n.2-3, p.85-93, 1991.
I 15
TROYER , J. K.; STEPHENSON, K. K.; FAHEY, J. W. Analysis of glicosinolates from
broccoli and other cruciferous vegetables by hydrofobilic interaction Iiquid
chromatography. Journal of Chromatography, v. 919, p. 299-304, 2001.
VICKERY, M.L.; VICKERY, B. Secundary plant metabolism. London and Basingstoke.
The Macmillan Press Ltd, 1981, 335pp.
VIEIRA, G.; VIEGAS, P.R.A ; NEVES, J.C.L. ; AGNES, E.L. ; OLIVEIRA, F.AM.B.
Influência da cultivar e do estádio de maturação em algumas características de frutos
de mamão durante a pós-colheita. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, n.2,
p. 244-247, 2000.
VISVALlNGAM, S.; HONSI, T.G.; BONES, AM. Sulphate and micronutrients can
modulate the expression leveis of myrosinases in Sinapis alba plants. Physiologia
Plantarum, v. 104, n. 1, p. 30-37, 1998.
VOET, D.; VOET, JoG.; PRATI C.W. Fundamentos de Bioquímica, Editora Artes
Médicas Sul Ltda, Porto Alegre (RS), 931 p., 2000.
WILLS, R. B. Ho; WIDJANAR, S. B. Changes in physiology, composition and sensory
characteristcs of Australian papaya durin ripeningo Australian Journal of Experimental
Agriculture, v.35, no8, p.1173-1176, 1995.
116
WITTSTOCK, U.; HAlKIER, A. B. Citochrome P450 CYP79A2 frem Arabidopsis
thaliana L. catalyses the conversion of l-phenylalanine to phenylacetaldoxime in the
biosynthesis of benzylglucosinolate. The journal of biological chemistry, v.275, n. 19,
p. 14659-14666, 2000.
WITTSTOCK, U.; HAlKIER, A. B. Glucosinolate research in the Arabdopsis era. Trends
in Plant Science, v. 7, n. 6, p. 263-270, 2002.
WITTSTOCK, U; AGERBIRK, N.; STAUBER, E.J.; OlSEN, C.E.; HIPPlER, M., OlDS,
T.M.; GERSHENZON, J.; VOGEl, H. Successful herbivore attack due to metabolic
diversion of a plant chemical defense. PNAS, v. 101, n. 14, 4859-4864, 2004.
XUE, J., lENMAN, M.; FAlK, A. and RASK, L. The glucosinolate-degrading enzyme
myrosinase in Brassicaceae is encoded by a gene family. Plant Moi. Biol., v. 18, p.
387-398, 1992.
XUE, J.; JORGENSEN, M.; PIHlGREN, U. and RASK, L. The myrosinase gene family
in Arabidopsis thaliana: gene organization, expression and evolution. Plant Moi. Biol.,
v. 37, p. 911-922, 1995a.
XUE, J. & RASK, L. The unusual 5'splicing GC is used in myrosinase genes of the
Brasssicaceae. Plant Molecular Biology, v.29, p.167-171, 1995b.
117
ZHANG, Y.; TALALAY, P.. CHO, C-G; POSNER, G. H. A major inducer of
anticarcinogenic protective enzymes from broccoli: isolation and ilucidation of structure.
Proc. Nat!. Acad. Sci. Medicai Science, v. 89, p. 2399-2403, 1992.
ZHANG, Y.; TANG, L.; GONZALES, V. Selected ishothyocianates rapidly growth
inhibition of cancer cells. Molecular Cancer Therapeutics, v. 2, p. 1045-1052, 2003.
Resumo
o sistema glicosinolato-mirosinase faz parte do mecanismo de defesa das
plantas, quando o tecido é danificado, os glicosinolatos são degradados pela
mirosinase e os compostos tóxicos são liberados. No mamão, o principal
composto liberado pela enzima é o benzilisotiocianato (BITC), a partir da
degradação de benzilglicosinolato (BG). Altos teores de BG e BITC, presentes no
início da formação do fruto, diminuem durante o seu desenvolvimento. A semente,
é o tecido que mais acumula estes compostos, seguido da casca e da polpa e
estes teores parecem ser afetados pelo 1-MCP, mas não pelo etileno. Além disso,
foi observado neste trabalho, que mesmo a mais baixa atividade da mirosinase
parece ter sido suficiente para liberar o BITC, que nestas quantidades, poderia
exercer ação contra as moscas-das-frutas e outros microorganismos.
A seqüência parcial da mirosinase do mamão mostrou alto grau de
similaridade com Arabidopisis (67%), mostarda branca (62%) e canola (51 %),
plantas modelo no estudo de glicosinolatos, sendo encontradas muitas regiões e
resíduos altamente conservados. O perfil de transcritos da mirosinase mostrou
que ela está presente somente na semente, e a partir dos 90 dpa, apresentando
um significativo aumento no ponto de colheita, concomitante ao aumento de
atividade.
Abstract
The glucosinolate-myrosinase system is part of the defense mechanism in
plants, when tissue is damaged, the glucosinolates are degraded by myresinases
and toxic compounds are released. In papaya fruit, the major compounds released
are the benzylisothiocyanates, frem the degradation of benzylglucosinolate (BG).
High leveis of BG and BITC are present in the beginning of the fruit formation and
they decreased during the development. The seed is the tissue that accumulates
higher contents of these compounds, followed by skin and pulp and these leveis
seems to be disturb by 1-MCP, but not by ethylene. Moreover, it was observed in
this work, that exactly the lowest activity of myresinase seems to have been
enought to liberate the BITC, that in these amounts, could to act against fruit f1ies
and other microorganisms.
The partiaI sequence of myresinase of the papaya fruit showed high degree
of similarity with with Arabidopisis (67%), white mustard (62%) and rape (51 %),
plants model in the study of glicosinolatos, being found a lot of regions and
residues highly conserved. The transcript prefile of myresinase showed that it is
present only in the seed, and frem the 90 dpa, having a significant increase in the
point of harvest, concomitant to the activity increase.
top related