tema13

Tema 13Genética de hongos filamentosos:

Neurospora crassa

Genética Molecular de Neurospora crassa

•Ciclo de vida

•Neurospora en el laboratorio

•Genética de Neurospora

•Genética molecular de Neurospora

•Transformación

•Herramientas disponibles

•Inactivación génica

•El genoma de Neurospora

Genética Molecular de Neurospora crassa

•Ciclo de vida

•Neurospora en el laboratorio

•Genética de Neurospora

•Genética molecular de Neurospora

•Transformación

•Herramientas disponibles

•Inactivación génica

•El genoma de Neurospora

Neurospora en la naturaleza

Neurospora crecesobre troncos quehan sido quemados

Primera descripción de Neurospora como el hongo que causóla contaminación de panaderías francesas en 1843

Bernard O. Dodge(1872-1960)

Shear CL y Dodge BO (1927)Life stories and heterotallismof the red bread mold fungi ofthe Monilia sitophila group.J. Agric. Res. 34: 1019-1042.

Describió las estructuras sexuales y lasegregación del tipo sexual en variasespecies de Neurospora.

Ciclos de vida de Neurospora crassa

Especies de Neurospora

N. crassaN. discretaN. intermediaN. sitophila

N. tetrasperma

N. africanaN. dodgeiN. galapagosensisN. lineolataN. terricolaN. pannonica

Heterotálicas Homotálicas

Pseudohomotálica

Ciclo sexual de una especie heterotálica

Ciclo sexual de una especie homotálica

Ciclo sexual de una especie pseudohomotálica

Ciclo vegetativo de Neurospora crassa

conidiosgerminación

micelio

conidióforos

Hifas deNeurospora

Conidiación de Neurospora crassa

Conidios de Neurospora crassa

Macroconidios y microconidios de Neurospora

Un relojcircadianoregula la

conidiación

Genética Molecular de Neurospora crassa

•Ciclo de vida

•Neurospora en el laboratorio

•Genética de Neurospora

•Genética molecular de Neurospora

•Transformación

•Herramientas disponibles

•Inactivación génica

•El genoma de Neurospora

Cultivos de Neurospora crassa

Cultivos de Neurospora crassa

Medio con sorbosa

Genética Molecular de Neurospora crassa

•Ciclo de vida

•Neurospora en el laboratorio

•Genética de Neurospora

•Genética molecular de Neurospora

•Transformación

•Herramientas disponibles

•Inactivación génica

•El genoma de Neurospora

Mutagénesis

Agentes mutagénicos usados en Neurospora

• Ácido nitroso• Metanosulfonato de etilo (EMS)• Metilhidroxiamina• ICR170• Nitrosoguanidina

• Ultravioleta• Rayos X

Radiaciones

Agentes químicos

medio completo

medio mínimo

medio con grupos de nutrientes

medio con distintosaminoácidos

el medio con arginina permite el crecimiento

Búsqueda demutantes

auxótrofos

Edward L. Tatum(1909-1975)

George W. Beadle(1903-1989)

El aislamiento y la caracterización mutantes auxótrofos de Neurospora lespermitió formular la hipótesis de que un gen era responsable de unaenzima.

Premio Nobel de Fisiología o Medicina 1958

Enriquecimiento por filtración

Medio mínimo

Silvestresprotótrofos

Mutantesnutricionales(auxótrofos)

Los protótrofos sequedan en el filtro

Los auxótrofos pasana través del filtro

Sembrar

Los auxótrofos crecenMedio con leucina

Ruta de la carotenogénesis de Neurospora

Medio con sorbosa

Mutante albino

Mutantes de la carotenogénesis de Neurospora

Naranja(silvestre)

Amarillento RojizoAlbino

Mutantes morfológicosde Neurospora

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

0654321

0.15

0.46

0.25

0.09

7

0.01 0.01

0.03

Fre

cuen

cia

de lo

s co

nidi

os

Núcleos por conidio

Los heterocariontes nos dan información sobre losmutantes:

• Permite saber si las mutaciones son dominantesof recesivas

• Permite identificar grupos de complementación

Heterocariosis

El micelio de Neurospora es un cenocito

El heterocariontecrece sin arginina

Fusión

Células arg-2 alteradas en unaenzima distinta de la ruta desíntesis de arginina

Células arg-1 alteradas en unaenzima de la ruta de síntesisde arginina

Complementación en Neurospora

+o

oo

oo

oo

oo

o

++

+++

++ + ++ + + +++ + ++ + +++ + ++ + +

+ +oo ooo +

++

+o+

++

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Grupos decomplementación:

mutantesgrupo

I

II

III

IV

V

1, 5

2, 4, 6, 7

3

8, 10

9 o

o

Ciclo sexual deNeurospora

Niveles bajosde C y N

Formación deprotoperitecios

Peritecio

Ciclo sexual de Neurospora

Meiosis

Ciclo sexual de Neurospora

Ascosporas

Las octadas ordenadas permitendetectar el ligamiento al centrómero

El reparto de los cromosomas en la octada permiteobservar varios patrones de segregación

Productos de la meiosis en Neurospora

Desarrollo de ascas con el resultado de la meiosis de un diploide producto deun cruzamiento entre dos mutantes de la coloración de la ascospora. Seobserva la segregación en la primera y segunda división meiótica.

Durante larecombinación se

producenmoléculas de ADN

heterodúplices

Detección de la conversióngénica

Estimación de la distancia genética porrecombinación

cyhR al hom nic

+ + + +

hom: auxórofo de homoserinanic: auxórofo de nicotóicoal : albino

cyhR: resistente a cicloheximida

1 2 3

cyhR al hom nic + + ++ parentales 99 106

rec en 1

rec en 2

rec en 3

rec en 1 y 2

rec en 1 y 3

rec en 2 y 3

22 22

4 8

22 17

1 1

0 0

3 5

cyhR + + + + al hom nic

cyhR al + + + + hom nic

cyhR al hom nic+ ++ +

cyhR alhom nic + + ++

cyhR al homnic ++ ++

cyhR al homnic ++ ++

cyhR al hom nic silvestre

cyhR al hom nic

+ + + +

1 2 3

17.4 % 4.5 % 15.2 %

cyhR al hom nic

17.4 4.5 15.2

Estimación de la distancia genética porrecombinación

Grupo de ligamiento I

Existen unos 1000 marcadores genéticoslocalizados en siete grupos de ligamiento

Detección de mutaciones en el ADNmitocondrial

Genética Molecular de Neurospora crassa

•Ciclo de vida

•Neurospora en el laboratorio

•Genética de Neurospora

•Genética molecular de Neurospora

•Transformación

•Herramientas disponibles

•Inactivación génica

•El genoma de Neurospora

Ingeniería genética en Neurospora

Introducción de ADN:• Transformación de esferoplastos• Electroporación de conidios

Plásmidos integrativos• Resistencia a benomilo e higromicina

Otras herramientas:• Promotores regulables: qa-2• Fusiones con lacZ, GFP y luciferasa para medirtranscripción y detectar proteínas.

• Inactivación génica.

Integración del ADN en hongos

Vector

Receptor de latransformación

Cromosoma I

Cromosoma II

Reemplazamientogénico

Duplicación

Integraciónectópica

Vector

vectorReceptor

Integración ectópica

Integración ectópica múltiple

Reemplazamiento

Integración homóloga

Transformación en Neurospora

• La competencia es una propiedad del núcleo (co-transformación).

• Cuando ocurre integración homóloga no suele ocurrir integraciónectópica en el mismo núcleo.

• El 1% de los transformantes estables han sufrido recombinaciónhomóloga (si es posible).

• 10% de transformantes ectópicos han sufrido alteracionescromosómicas con frecuencia.

• 100% de transformantes por recombinación homóloga en estirpescon una mutación en el gen mus-51 o mus-52 responsables de larecombinación no homóloga.

Genética Molecular de Neurospora crassa

•Ciclo de vida

•Neurospora en el laboratorio

•Genética de Neurospora

•Genética molecular de Neurospora

•Transformación

•Herramientas disponibles

•Inactivación génica

•El genoma de Neurospora

Cósmidos para construir genotecas en Neurospora

Clonación enNeurospora por

selección degrupos (sibselection)

Núcleos de Neurospora marcados con H1-GFP

Microtúbulos deNeurospora

marcados contubulina-GFP

Genética Molecular de Neurospora crassa

•Ciclo de vida

•Neurospora en el laboratorio

•Genética de Neurospora

•Genética molecular de Neurospora

•Transformación

•Herramientas disponibles

•Inactivación génica

•El genoma de Neurospora

Genética Molecular de Neurospora crassa

•Ciclo de vida

•Neurospora en el laboratorio

•Genética de Neurospora

•Genética molecular de Neurospora

•Transformación

•Herramientas disponibles

•Inactivación génica

•El genoma de Neurospora

El genoma de Neurospora

Tamaño: 42 MbGenoma secuenciado: 39.225.835 bp (rel. 7)

CromosomaIIIIIIIVVVIVII

Tamaño (Mb)10.39.25.75.14.64.04.0

Total: 50%ADN codificante: 44%ADN no codificante: 56%

Contenido G+C

Presentes en el 80% de los genesLongitud promedio: 134 pbPromedio de 1,7 intrones por gen

Intrones

Un transposón activo, Tad, muchas copias detransposones inactivos (RIP),

Haemophilus

C. elegans

Drosophila

Homo

Saccharomyces

1.709

Genes

6.144

18.266

13.338

20.0003000

165

1,8

12

100

Tamaño (Mb)

Neurospora 42 ?10.620

Fin