site-directed mutagenesis

Universidad Nacional Mayor de San Marcos(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)Facultad de Ciencias Biológicas Curso: INGENIERÍA GENÉTICA

Semana 5MUTAGÉNESIS DIRIGIDA

Gustavo A. Sandoval, MScPhD. Program in Biological Sciences and Engineering (PDCIB)UNALM – 20090549@lamolina.edu.pe

Categorías moleculares de mutaciones genéticas

Tipos de sustituciones de pares de bases y mutaciones

Tipos de sustituciones de bases de pares y mutaciones

Efecto de una mutación “missense” sobre la traducción

Efecto de una mutación “sin sentido” sobre la traducción

Genética“Reverse”

Genética “Forward”

Diseño de un “screening “ genético (Genética “Forward”)Diferentes mutágenos dan lugar a diferentes cambios en el ADN

Mutagénesis “al azar”

Mutagénesis aleatoria• Químicos: Gas mostaza, N-nitroso-N-ethylurea (ENU), agentes metilantes GC a AT, hidrocarburos aromáticos transversion GC a AT.• Rayos UV• Rayos X• Rayos γ

Producción de dímeros de Timina por Irradiación UV

Mutagenesis con análogos de bases

Acción mutagénica del 5’BUAT-to-GC transition mutation

Mutagenesis con el análogo de base 2AP

Mutagenesis con agentes modificantes de bases

Mutagenesis con agentes modificantes de bases

Mutagenesis con agentes alquilantes

Mutagenesis con agentes intercalantes

Mutagenesis “sitio-dirigida”

Genética “Reverse”:

Define la función de un gen desconocido mediante el fenotipo del “knock out”.

Define la importancia de los dominios del producto génico a través de mutaciones dirigidas.

Mutagénesis in vitro DIRIGIDA sirve para: 1) estudiar relación estructura del gen/proteína y su función 2) cuales secuencias de ADN son importantes

Mutación dirigida: Se comienza con el gen y se desea conocer el fenotipo del gen mutante (genética reversa)

Los “knockouts” genéticos son generados por recombinación homóloga

Un ejemplo de cuando se desea realizar mutagenésis sitio-dirigida

Clonar un gen que comparte identidad de secuencia a una proteína de unión al ADN

ADRTSVCGNSVTNPILAGRTSVTILNSVTNRASecuencia de aas de la protéina conocida hipotética de unión al ADNSecuencia de aas del nuevo gen clonado

Con la mutagénesis sitio-dirigida se puede determinar si un residuo es importante para la unión al ADN en el producto del gen que se ha clonado

Genética “Reverse”

Metodos para generar mutaciones dirigidas en el gen de interés:1. PCR mutagenesis2. Tratamiento del vector (plásmido) con hidroxilamina3. M13 mutagenesis

In vitro mutagénesisCambio en la información genética

• Mutagenesis por delección• Mutagéneis dirigida por oligonucleotido• Mutagénesis mediada por PCR

Mutagenesis por delección

• Usando enzimas de restricción

GCTAATTGGCGCAGCTAGTCGATGAAATTTGATGCCATACCCGGGGCTAATTGGCGCAGCTAGGAAATGAAATTTGATGCCATACCCGGG

Mutagénesis dirigida por oligonucleotido

Generación de mutantes de 1 base

Mutagénesis “in vitro” dirigida por oligos

• Genes clonados pueden ser mutados específicamente

Mutagénesis “sitio-específica” usando PCR

• Permite mutaciones específicas• Componentes primarios– ADN molde– Primers con mutación– ADN pol; dNTPs• Existen muchas variaciones para incrementar la eficiencia

Mutagenesis dirigida por oligonucleótidos

PCR “susceptible a error”• 51 ml water• 10 ml 100 mM Tris Cl, pH 8.3 (10 mM final)⋅• 2.5 ml 2 M KCl (50 mM final)• 3.5 ml 200 mM MgCl2 (7 mM final) [ vs. 2-4 mM in a normal PCR Rx]• 4 ml 25 mM dCTP (1 mM final)• 4 ml 25 mM dTTP (1 mM final)• 4 ml 5 mM dATP (0.2 mM final)• 4 ml 5 mM dGTP (0.2 mM final)• 2 ml 100 mM 5’ primer (2 mM final)• 2 ml 100 mM 3’ primer (2 mM final)• 10 ml 200 pg/ml template DNA (20 pg/ml final)• 2 ml 25 mM MnCl2 (0.5 mM final)• 1 ml 5 U/ml Taq DNA polymerase (0.05 U/ml final)• Total volume 100 ml

Unequal concentrations

Número promedio de mutaciones por ADN molde como función de la longitud del molde y el número

reacciones EP-PCR

RNA Structure

Método de la mínima energía libre

Aplicaciones - Tendencias actuales:

a) producción heteróloga de proteínas (industria farmaceútica: proteínas con aplicación terapeúticas, vacunas)

b) ingeniería metabólica (industria alimenticia: producción de vino, aditivos, conservadores) (industria química: producción de etanol, biopolímeros)

c) evolución dirigida de proteínas (industria química: desarrollo de lipasas o estearasas termoestables, desarrollo de enzimas con tolerancia a solventes)

Algunas de las Aplicaciones en Medicina

Ingeniería MetabólicaIngeniería Metabólica::

Alteración de rutas metabólicas existentes para:Alteración de rutas metabólicas existentes para:

Diverge materia prima a

productos secundarios

materia prima

Producto deseado

Deleción de Deleción de genesgenes

a) favorecer la producción a) favorecer la producción del compuesto de interésdel compuesto de interés

b) introducción de nuevas b) introducción de nuevas rutas metabólicasrutas metabólicas

Ej: Producción de Ej: Producción de vainillina a partir de vainillina a partir de glucosa en glucosa en E. coliE. coli

Universidad Nacional Mayor de San Marcos(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)Facultad de Ciencias Biológicas Curso: INGENIERÍA GENÉTICA

Semana 5INGENIERÍA DE PROTEÍNAS

Gustavo A. Sandoval, MScPhD. Program in Biological Sciences and Engineering (PDCIB)UNALM – 20090549@lamolina.edu.pe

La Evolución Molecular Dirigida (DME) es una nueva herramienta de ingeniería de proteínas, empleada para diseñar funciones enzimáticas nunca antes requeridas en ambientes naturales. Básicamente, la DME recrea en el laboratorio los procesos claves de la evolución natural (mutaciones, recombinaciones del material genético y selección), haciéndolo de tal manera que es posible diseñar enzimas de un indudable interés científico y tecnológico.

Mutación al azar y evolución dirigida de proteínas

Estabilidad de las proteínas:(1)Reducir la diferencia en entropia entre la proteína plegada y desplegada. (puentes S-S)(1)Estabilizar de las α-hélices. (glicina)(1)Incrementar el número de interacciones hidrofóbicas en la región interior. (aas hidrofóbicos)

La tecnología de evolución dirigida de proteínas se ha utilizado con éxito en el mejoramiento de enzimas

Ej. desarrollo de estearasas termoestables