site-directed mutagenesis
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This lecture was given to Genetics and Biotechnology students at San Marcos University (Semester 2009-I)TRANSCRIPT
Universidad Nacional Mayor de San Marcos(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)Facultad de Ciencias Biológicas Curso: INGENIERÍA GENÉTICA
Semana 5MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
Gustavo A. Sandoval, MScPhD. Program in Biological Sciences and Engineering (PDCIB)UNALM – [email protected]
Categorías moleculares de mutaciones genéticas
Tipos de sustituciones de pares de bases y mutaciones
Tipos de sustituciones de bases de pares y mutaciones
Efecto de una mutación “missense” sobre la traducción
Efecto de una mutación “sin sentido” sobre la traducción
Genética“Reverse”
Genética “Forward”
Diseño de un “screening “ genético (Genética “Forward”)Diferentes mutágenos dan lugar a diferentes cambios en el ADN
Mutagénesis “al azar”
Mutagénesis aleatoria• Químicos: Gas mostaza, N-nitroso-N-ethylurea (ENU), agentes metilantes GC a AT, hidrocarburos aromáticos transversion GC a AT.• Rayos UV• Rayos X• Rayos γ
Producción de dímeros de Timina por Irradiación UV
Mutagenesis con análogos de bases
Acción mutagénica del 5’BUAT-to-GC transition mutation
Mutagenesis con el análogo de base 2AP
Mutagenesis con agentes modificantes de bases
Mutagenesis con agentes modificantes de bases
Mutagenesis con agentes alquilantes
Mutagenesis con agentes intercalantes
Mutagenesis “sitio-dirigida”
Genética “Reverse”:
Define la función de un gen desconocido mediante el fenotipo del “knock out”.
Define la importancia de los dominios del producto génico a través de mutaciones dirigidas.
Mutagénesis in vitro DIRIGIDA sirve para: 1) estudiar relación estructura del gen/proteína y su función 2) cuales secuencias de ADN son importantes
Mutación dirigida: Se comienza con el gen y se desea conocer el fenotipo del gen mutante (genética reversa)
Los “knockouts” genéticos son generados por recombinación homóloga
Un ejemplo de cuando se desea realizar mutagenésis sitio-dirigida
Clonar un gen que comparte identidad de secuencia a una proteína de unión al ADN
ADRTSVCGNSVTNPILAGRTSVTILNSVTNRASecuencia de aas de la protéina conocida hipotética de unión al ADNSecuencia de aas del nuevo gen clonado
Con la mutagénesis sitio-dirigida se puede determinar si un residuo es importante para la unión al ADN en el producto del gen que se ha clonado
Genética “Reverse”
Metodos para generar mutaciones dirigidas en el gen de interés:1. PCR mutagenesis2. Tratamiento del vector (plásmido) con hidroxilamina3. M13 mutagenesis
In vitro mutagénesisCambio en la información genética
• Mutagenesis por delección• Mutagéneis dirigida por oligonucleotido• Mutagénesis mediada por PCR
Mutagenesis por delección
• Usando enzimas de restricción
GCTAATTGGCGCAGCTAGTCGATGAAATTTGATGCCATACCCGGGGCTAATTGGCGCAGCTAGGAAATGAAATTTGATGCCATACCCGGG
Mutagénesis dirigida por oligonucleotido
Generación de mutantes de 1 base
Mutagénesis “in vitro” dirigida por oligos
• Genes clonados pueden ser mutados específicamente
Mutagénesis “sitio-específica” usando PCR
• Permite mutaciones específicas• Componentes primarios– ADN molde– Primers con mutación– ADN pol; dNTPs• Existen muchas variaciones para incrementar la eficiencia
Mutagenesis dirigida por oligonucleótidos
PCR “susceptible a error”• 51 ml water• 10 ml 100 mM Tris Cl, pH 8.3 (10 mM final)⋅• 2.5 ml 2 M KCl (50 mM final)• 3.5 ml 200 mM MgCl2 (7 mM final) [ vs. 2-4 mM in a normal PCR Rx]• 4 ml 25 mM dCTP (1 mM final)• 4 ml 25 mM dTTP (1 mM final)• 4 ml 5 mM dATP (0.2 mM final)• 4 ml 5 mM dGTP (0.2 mM final)• 2 ml 100 mM 5’ primer (2 mM final)• 2 ml 100 mM 3’ primer (2 mM final)• 10 ml 200 pg/ml template DNA (20 pg/ml final)• 2 ml 25 mM MnCl2 (0.5 mM final)• 1 ml 5 U/ml Taq DNA polymerase (0.05 U/ml final)• Total volume 100 ml
Unequal concentrations
Número promedio de mutaciones por ADN molde como función de la longitud del molde y el número
reacciones EP-PCR
RNA Structure
Método de la mínima energía libre
Aplicaciones - Tendencias actuales:
a) producción heteróloga de proteínas (industria farmaceútica: proteínas con aplicación terapeúticas, vacunas)
b) ingeniería metabólica (industria alimenticia: producción de vino, aditivos, conservadores) (industria química: producción de etanol, biopolímeros)
c) evolución dirigida de proteínas (industria química: desarrollo de lipasas o estearasas termoestables, desarrollo de enzimas con tolerancia a solventes)
Algunas de las Aplicaciones en Medicina
Ingeniería MetabólicaIngeniería Metabólica::
Alteración de rutas metabólicas existentes para:Alteración de rutas metabólicas existentes para:
Diverge materia prima a
productos secundarios
materia prima
Producto deseado
Deleción de Deleción de genesgenes
a) favorecer la producción a) favorecer la producción del compuesto de interésdel compuesto de interés
b) introducción de nuevas b) introducción de nuevas rutas metabólicasrutas metabólicas
Ej: Producción de Ej: Producción de vainillina a partir de vainillina a partir de glucosa en glucosa en E. coliE. coli
Universidad Nacional Mayor de San Marcos(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)Facultad de Ciencias Biológicas Curso: INGENIERÍA GENÉTICA
Semana 5INGENIERÍA DE PROTEÍNAS
Gustavo A. Sandoval, MScPhD. Program in Biological Sciences and Engineering (PDCIB)UNALM – [email protected]
La Evolución Molecular Dirigida (DME) es una nueva herramienta de ingeniería de proteínas, empleada para diseñar funciones enzimáticas nunca antes requeridas en ambientes naturales. Básicamente, la DME recrea en el laboratorio los procesos claves de la evolución natural (mutaciones, recombinaciones del material genético y selección), haciéndolo de tal manera que es posible diseñar enzimas de un indudable interés científico y tecnológico.
Mutación al azar y evolución dirigida de proteínas
Estabilidad de las proteínas:(1)Reducir la diferencia en entropia entre la proteína plegada y desplegada. (puentes S-S)(1)Estabilizar de las α-hélices. (glicina)(1)Incrementar el número de interacciones hidrofóbicas en la región interior. (aas hidrofóbicos)
La tecnología de evolución dirigida de proteínas se ha utilizado con éxito en el mejoramiento de enzimas
Ej. desarrollo de estearasas termoestables