perspektiven für die wirkungsbezogene analytik · j planar chromatogr, in print. multidetektion ....

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Gertrud Morlock, Chair of Food Science, Justus Liebig University Giessen and

TransMIT Centre for Effect-Directed Analysis, Giessen

Perspektiven für die wirkungsbezogene Analytik

als behördliches Werkzeug

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1. Flexibilität

2. Robustheit

3. Validierung

4. Schnelligkeit

5. Kosteneffizienz

6. Weiterbildung

Anforderungen

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Wirkungsbezogene Analytik

Warum Summenparameter, wenn es besser geht?

Warum Mainstream-Chromatographie, wenn es besser geht?

Besser = schneller = kostengünstiger = mehr Info = Einzelsubstanz

Mainstream → Normung

Übersehen wir das Wesentliche?

W. Kreiss et al. Anal Bioanal Chem 398 (2010) 2081

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Wirkungsbezogene Analytik

HPTLC-UV/Vis/FLD-bioassay-HRMS/ATR-FTIR/NMR

G. Morlock, ACS Symposium Series 1185 (2013) 101-121

• Umfassend (comprehensive) • Verbunden (hyphenated) • In situ

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n

1. Flexibilität

2. Robustheit

3. Validierung

4. Schnelligkeit

5. Kosteneffizienz

6. Weiterbildung

Anforderungen

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n

G. Morlock, ACS Symposium Series 1185 (2013) 101-121

Flexibilität und Robustheit

• Probenkonzentration und –art, z. B. ohne Extraktion/Anreicherung

• Fragestellung und Tiefe der Bearbeitung, z. B. Multidetektion

• Potentielle Wirkungen

→ Verschiedene Assays

→ Übertragung neuer Assays

→ Zuverlässiges Fingerprinting

→ Auswertung mit MVDA oder ANN

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n Probenkonzentration und -art

I. Klingelhöfer, G. Morlock, Anal Chem 87 (2015) 11098−11104

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n Probenkonzentration und -art

I. Klingelhöfer, G. Morlock, Anal Chem 87 (2015) 11098−11104

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Video zu Bier → https://youtu.be/Q7AGuljcFvQ

G. Morlock and I. Klingelhöfer, 2016, JLU Giessen

Probenkonzentration und -art

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G. Morlock, ACS Symposium Series 1185 (2013) 101-121

Flexibilität und Robustheit

• Probenkonzentration und –art, z. B. ohne Extraktion/Anreicherung

• Fragestellung und Tiefe der Bearbeitung, z. B. Multidetektion

• Potentielle Wirkungen

→ Verschiedene Assays

→ Übertragung neuer Assays

→ Zuverlässiges Fingerprinting

→ Auswertung mit MVDA oder ANN

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n

Vis UV FLD NP PEG AS DAP DPPH* A.f. AChE B.s.

Pimpinella saxifraga L. root

G. Morlock, T. Lapin, J Planar Chromatogr, in print

Multidetektion

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n Plate section VIII

G. Morlock, T. Lapin, J Planar Chromatogr, in print

Multidetektion

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n

G. Morlock, www.uni-giessen.de/food → Research

…all info in a single run ….or fingerprinting in parallel

Multidetektion

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G. Morlock, ACS Symposium Series 1185 (2013) 101-121

Flexibilität und Robustheit

• Probenkonzentration und –art, z. B. ohne Extraktion/Anreicherung

• Fragestellung und Tiefe der Bearbeitung, z. B. Multidetektion

• Potentielle Wirkungen

→ Verschiedene Assays

→ Übertragung neuer Assays

→ Zuverlässiges Fingerprinting

→ Auswertung mit MVDA oder ANN

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n Zuverlässiges Fingerprinting 50 Deutsche Biere im Vergleich

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P. Ristivojević, G. Morlock, in submission

Welches Bier ist empfehlenswert?

Auswertung mit MVDA

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n

1. Flexibilität

2. Robustheit

3. Validierung

4. Schnelligkeit

5. Kosteneffizienz

6. Weiterbildung

Anforderungen

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n Validierung

→ Zuverlässiges wirkungsbezogenes Fingerprinting

• Multidetektion

• Bioquantifizierung

• Negativkontrolle

• Positivkontrolle

• Equivalentberechnung

• Clustern mit ANN, t-SNE

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n Bioquantifizierung

pg/band E1 25 – 1000 EE2 0.5 – 20 E2 0.5 – 20

E3 25 – 1000

I. Klingelhöfer, G. Morlock, J. Chromatogr. A 1360 (2014) 288-295

Dosis/Wirkungskurven Scharfe Peaks noch nach

24 h in wässrigem Medium!

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n

I. Klingelhöfer, G. Morlock, J. Chromatogr. A 1360 (2014) 288-295

Bioquantifizierung

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n Bioquantifizierung

I. Klingelhöfer, G. Morlock, Anal Chem 87 (2015) 11098−11104

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n

I. Klingelhöfer, G. Morlock, Anal Chem 87 (2015) 11098−11104

Bioquantifizierung

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n

y = 56.495x - 1719.7 R² = 0.9956

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

20 70 120 170 220H

PTLC

-pYE

S flu

ores

cenc

e si

gnal

, pea

k ar

ea [A

U]

Amount of CAPE [ng/zone]

G. Morlock, I. Klingelhöfer, Anal. Chem. 86 (2014) 8289–8295

Bioquantifizierung

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n → Beer samples

I. Klingelhöfer, G. Morlock, J Chromatogr A 1360 (2014) 288-295; wine in preparation

→ Spices

→ Wine

Bioquantifizierung

Weißwein

a b c

d e

A B C b c

f g

A B C

Roséwein

b c

g

A B C

Rotwein

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n

→ Comprehensive information by non-target bioprofiling

→ High-resolution mass spectrometry for unknown active ingredients

→ Completes risk assessmeent

C.. Stiefel, T. Schubert, G. Morlock, ACS Omega 2 (2017) 5242−5250

Bioquantifizierung

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n Quantitative HPTLC-EDA-DART-MS

Reliable quantification → Mean r2 of 0.9992 → Mean deviation 4.6% (A. fischeri vs. pYES)

T. Häbe, M. Jamshidi-Aidji, J. Macho, G. Morlock (2017) in preparation

Parabens?

Bioactives?

Bioquantifizierung - Methodenvergleich

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n Negativkontrolle etc.

Negative control A: UV 366 nm B: HPTLC-placebo pYES:

same procedure like for pYES, but without yeast cells in medium

Typical 4-methylumbelliferone fluorescence is not observed. Standard addition Oversprayed application A: Sample B: Oversprayed application of

sample and CAPE C: HPTLC-pYES of sample

Overlapped application D: HPTLC-pYES using

overlapped application

1

2

3

1

2 3

G. Morlock, I. Klingelhöfer, Anal. Chem. 86 (2014) 8289–8295

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n Equivalentberechnung, Positivkontrolle

M. Jamshidi-Aidji, G. Morlock Anal Chem 88 (2016) 10979−10986

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n

→ Bioquantification of known bioactive substances IC50 of CT: 65 ng/band → equivalent to 365 μg S1 and 203 μg S2 root powders

→ Biological equivalent contents of unknown bioactive substances

→ Antimicrobial equivalency of natural antibiotic and synthetic antibiotics → 1 ng/band CT ~ 0.6 ng/band ciprofloxacin ~ 2 ng/band marbofloxacin

M. Jamshidi-Aidji, G. Morlock Anal Chem 88 (2016) 10979−10986

S. m. roots S1 S2

Biodensitometry/densitometry

CT content (mg/g) 1.8/1.6 3.2/3.9

Repeatability (%RSD, n=2) 8.7/0.4 7.0/0.9

Intermediate precision (%RSD, n=3)

16.3/1.4 15.2/1.6

Mean CT bioequival. content ± SD (mg/g, n=2)

a 1.1 ± 0.1 2.2 ± 0.0

c 2.7 ± 0.0 < LOD

Equivalentberechnung, Positivkontrolle

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M. Jamshidi-Aidji, E. Hauck, G. Morlock, 2016, JLU Giessen

Video zu Salbei www.youtube.com/watch?v=_htlxuKajH0

Workflow, Equivalentberechnung

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n

D. Fichou und G. Morlock, in Vorbereitung

Auswertung mit ANN

D. Fichou, G. Morlock, in preparation

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D. Fichou, G. Morlock, in preparation

Auswertung mit ANN

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n

D. Fichou und G. Morlock, in Vorbereitung

Auswertung mit ANN

D. Fichou, G. Morlock, in preparation

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n AChE, BChE, α/ß-glucosidase, amylase, tyrosinase, xanthinoxidase…

Quantitative Enzymhemmung

M. Jamshidi-Aidji, G. Morlock, in preparation

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n

1. Flexibilität

2. Robustheit

3. Validierung

4. Schnelligkeit

5. Kosteneffizienz

6. Weiterbildung

Anforderungen

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n Schnelligkeit und Kosteneffizienz

• Reduzierte Probenvorbereitung

• Einfacher Arbeitsablauf

• Parallele Trennung

• Multidetektion

• Simultane Detektion vieler Proben

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n

8:00 20 Proben anreichern durch Auftragen

8:45 Parallele Trennung

9:30 Simultane Derivatisierung & Assays

13:00 Hotspots: HRMS

14:00 Auswertung, MVDA, ANN, t-SNE…

Schnelligkeit im Alltag

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n … max. 2 Tage 50 Deutsche Biere im Vergleich

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n

Benchmarking Küvettenassay HPTLC-Bioassay

Laufende Kosten (Euro)

- Mobile Phase - 0,012

- Stationäre Phase - 0,30

- Küvette 0,21 -

- Assay 1,15 0,10

Summe (Euro) 1,36 0,41

Günstiger (Faktor) → 3-fach

Probendurchsatz/Tag 137 368

Schneller (Faktor) → 3-fach

Küvettenassay versus HPTLC-Bioassay

… vor allem aber kommt noch dazu:

Reduzierte Probenvorbereitung und kaum Matrixeinfluss auf Assay!

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n

1. Flexibilität

2. Robustheit

3. Validierung

4. Schnelligkeit

5. Kosteneffizienz

6. Weiterbildung

Anforderungen

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n Weiterbildung nötig

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[M-H]-

Estron

Identification: Targeted

Bioassay: Non-targeted

Sample fingerprinting and profiling

Wirkungsbezogene Analytik

HPTLC-UV/Vis/FLD-bioassay-HRMS

1. Flexibilität

2. Robustheit

3. Validierung

4. Schnelligkeit

5. Kosteneffizienz

6. Weiterbildung

G. Morlock, www.uni-giessen.de/food → Research

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n

A. Móricz, P. Ott, G. Morlock: Discovered acetylcholinesterase inhibition and antibacterial activity of polyacetylenes in tansy root extract via effect-directed chromatographic fingerprints, in submission

Tanacetum vulgare L. root

Beispiele

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n

A. Móricz et al.: Effect-directed analysis via hyphenated HPTLC for bioanalytical profiling of sunflower leaves, in submission

Helianthus annuus L. leaf

Beispiele

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n Beispiele

Coumarin-containing food products

S. Krüger, L. Winheim, G. Morlock, Food Chem 239 (2018) 1182-119

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n

S. Krüger et al., Effect-directed fingerprints of 77 botanicals via a generic high-performance thin-layer chromatography method combined with assays and mass spectrometry, J Chromatogr A 1529 (2017) 93-106

Generic method for 77 botanicals

Beispiele

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n Beispiele

Vanilla and its food products

M. Busso et al.: Effect-directed analysis and bioprofiling of 32 vanilla products, characterization of multi-potent compounds and quantification of vanillin and ethyl vanillin via HPTLC-UV/Vis/FLD-EDA-HRMS, in preparation

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n

T. Shen, H. Zorn, G. Morlock, Fungal Biology and Biotechnology (2015) 2:8

Broths of Basidomycetes monitored over fermentation time

Bioluminescence of Aliivibrio fischeri after 3 min

Bioluminescence of Aliivibrio fischeri after 30 min

Beispiele

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n Salicaceae bud extracts

S. Hage, G. Morlock J. Chromatogr. A 1490 (2017) 201-211

Beispiele

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n

Biological detection of antibiotics

Beispiele

Salvia officinalis

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n Fresh and dried elderberries

S. Krüger, M. Mirgos, G. Morlock, J. Chromatogr. A 1426 (2015) 209-219

Beispiele

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n Ginger (Zingiber officinale) and its food products

S. Krüger, A. Bergin, G. Morlock, Food Chem. 243 (2018) 258-268

Beispiele

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n

Y. Chen, G. Morlock, Chromatographia 79 (2015) 89-96

Protoberberines and ephedrines in herbal drugs for TCM

(Phelodendron, Coptis, Tinospora and Ephedra)

Beispiele

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n

G. Morlock, The Analytical Scientist, 27-04 (2015) 42-43 Taha, M.T., Krawinkel, M.B., Morlock, G.E., J. Chromatogr. A 1394 (2015) 137-147

Stored milk thistle

Beispiele

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