obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása

Obligát anaerob mikroorganizmusok

felszaporítása

Obligát anaerob mikroorganizmusok

Obligát anaerobnak nevezünk egy mikroorganizmust, ha az csak anaerob viszonyok között képes létezni. Abból adódik az obligát jellege, hogy nem rendelkezik kataláz enzimmel. A kataláz enzim segítségével bontaná az oxigén jelenlétében keletkező peroxidot, ami méreg számára.

2O2- + 2H+ szuperoxid dizmutáz H2O2 + O2

H2O2 kataláz H2O + ½ O2

E két jellemző reakció hiányzik az obligát anaerob mikroorganizmusok esetén.

Obligát anaerob mikroorganizmusok fontossága

A kizárólag anaerob mikroorganizmusok a talaj alsóbb oxigénhiányos rétegeiben helyezkednek el az aerob és a fakultatív anaerob életterek alatt. Életfunkcióik fenntartásához anaerob oxidációval nyernek energiát. Ez többféle vegyület jelenlétében lehetséges. Ezek szerint beszélünk nitrátlégzésről, szulfátlégzésről és karbonátlégzésről. A környezetbe kerülő szennyezések lebontásához az effajta légzésüket használjuk fel, mely során a szennyezőanyagok oxidálásával nyerik a szükséges energiát, miközben azok lebomlanak vagy kevésbé veszélyes, könnyebben bontható termékekké alakulnak.

Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása

Egy környezeti elemben, esetünkben a talajban bekövetkező szennyezés elhárítása esetén rövid idő alatt és nagy mennyiségben kellene a lebontást végző mikroorganizmusoknak elszaporodnia. Ezen mikroorganizmusoknak talajban való jelenlét monitorozzuk a felszaporítás segítségével. Az eljárás a mikroorganizmusok talajmintából való könnyebb izolálását teszi lehetővé, mivel az izoláláshoz kellő számú mikroorganizmusra van szükségünk. Ha nincs kellő számú lebontást végző mikroba a talajban, akkor előre felszaporított formában juttathatunk a talajba, a lebontás meggyorsítása érdekében.

Obligát anaerob mikroorganizmusok felszaporítása

A felszaporítás általában laboratóriumi körülmények között zajlik. A következőkben néhány obligát anaerob mikroorganizmus felszaporítását mutatom be részletesen.

Szulfát redukálók CO2 redukálók

Cellulóz lebontó Clostridia felszaporítása

Szulfát redukálókfelszaporítása

A szulfát redukálók obligát anaerob baktériumok, melyek az anaerob talajban és vízben fordulnak elő. Heterotrófok és hexózokat, alkoholokat, szerves savakat hasznosítanak szénforrásként. A szulfát mellett a szulfitot és a tioszulfátot is kénhidrogénné redukálja.

Szulfát redukálók felszaporítása

A szaporításhoz szükséges vegyszerek és oldatok: 0,2 %-os NaCl oldat

0,2 g NaCl-ot 80 ml desztillált vízben feloldva, majd 100 ml-ig szintén desztillált vízzel jelre töltve és autoklávozva készül. Só oldat hozzávalói

0,5 g K2HPO4

1,0 g NH4Cl

1,0 g CaSO4

2,0 g MgSO4.7H2O5,0 g Na laktát (70% m/m)10,0 g agar930,0 ml desztillált vízAz oldat pH-ját 8,1-re állítjuk.

Vas-ammónium-szulfát [FeSO4(NH4)2.6H2O] oldat

FeSO4(NH4)2SO4.6H2O oldat 3 egymást követő napon át tartó, napi 1 órás gőzölésével készül. Élesztő kivonat-oldat

10%-os oldatot készítünk és autoklávozzuk. Nátrium-tioglikolát oldat (10%) Tápoldat, 1 l

Autoklávozzuk az oldatot, lehűtjük, majd anaerob steril fülkében dolgozunk. 50 ml sterilszűrt vas-ammónia-szulfát oldatot, 10 ml élesztő kivonat-oldatot és 10 ml nátrium-tioglicerát oldatot adunk hozzá, majd a só oldathoz adagoljuk. Állítsuk be a végső pH-t 7,2-7,6 közé. Végül porciózzuk a táptalajt steril kémcsövekbe.

Szulfát redukálók felszaporítása

Az eljárás

A talaj mintával anaerob steril fülkében dolgozzunk, először szuszpendáltassuk NaCl oldatban. Készítsünk 1:10-es hígítást NaCl oldattal és oltsuk be a kémcsöveket 0,1-1,0 talaj szuszpenzióval. A legalább 4 hetes inkubációs periódus után válnak láthatóvá a szulfát redukáló baktérium telepek.

Szulfát redukálók felszaporítása

A szén-dioxid redukálók szintén obligát anaerob baktériumok. A következő reakciót katalizálják:

H2+CO2 CH4, acetát

Csak vízzel elárasztott anaerob talajokban találhatók.

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

A szaporításhoz szükséges vegyszerek és oldatok: Vitamin oldat

1000,00 ml desztillált víz2,00 mg biotin2,00 mg folsav10,00 mg piridoxin-hidroklorid5,00 mg tiamin-hidroklorid5,00 mg ribiflavin5,00 mg nikotinsav5,00 mg kalcium-pantotenát0,01 mg B12 vitamin5,00 mg p-aminobenzoesav1,00 mg liposav4 oC-on tárolva.

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

Ásványi oldat0,50 g Titripex I6,20 g MgSO4.7H2O0,55 g MnSO4.7H2O1,00 g NaCl0,10 g FeSO4.7H2O0,17 g CoCl2.6H2O0,13 g CaCl2.2H2O0,18 g ZnSO4.7H2O0,05 g CuSO4.7H2O0,018 g AlK(SO4) 2.5H2O0,010 g H3BO3

0,011 g Na2MoO4.2H2O

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

Redox közeg165,5 ml desztillált víz15,5 ml NaOH (1 M)2,5 g cisztein.HCl.H2O2,5 g Na2S.9H2O

A NaOH-ot hígítsuk vízzel és óvatosan forraljuk fel O2 mentes nitrogén bevezetése mellett. Majd hűtsük jégen, adjuk hozzá a ciszteint és a Na2S-t, végül 4 hétig szobahőmérsékleten 250 ml-es edényekben autoklávozzuk. Ebből adjunk 1 ml-t a tápoldat 100 ml-éhez.

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

A Titriplex I-t oldjuk fel 10 ml NaOH (0,5 M)-ban és hígítsuk desztillált vízzel 500 ml-ig. Oldjuk fel a sókat is az oldatban és hígítsuk tovább 1000 ml-ig.

Resazurin oldat0,1 g resuzarint feloldunk 100 ml desztillált vízben és az oldatot átszűrjük sterilszűrőn.

Hígító folyadék

1,0 g NH4Cl

0,1 g MgSO4.7H2O

0,4 g K2HPO4

0,4 g KH2PO4

2,0 ml resazurin oldat40,0 ml redox közeg

Oldjuk fel 800 ml desztillált vízben és töltsük jelre 1000 ml-ig.

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

Brómkrezol zöld agar100 ml desztillált víz1 g agar0,01 g brómkrezol

Tápanyag oldat950,00 ml desztillált víz1,00 ml resazurin oldat1,0 g NH4Cl0,68 g KH2PO4

0,87 g K2HPO4

0,04 g MgSO4.7H2O20,00 ml vitamin oldat20,00 ml ásványi oldat2,00 g élesztő kivonat10,00 g NaHCO3

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

Állítsuk be a pH-t 7,8-ra, majd fokozatosan forraljuk fel a tápanyagot oldatot N2/CO2 (80%/20%) áram bevezetése közben. A hűtés után adjunk hozzá, 0,5g cisztein.HCl.H2O-t és 0,25 g Na2S.9H2O-t. Folyamatos gázkeverék áram mellett részletekben (100 ml) töltsük ki a tápanyag oldatot lapos üvegekbe, majd autoklávozzuk 120 oC-on 30 percig. A lehűlés után, ha szükséges újból állítsuk be a 7,8-as pH-t.

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

Az eljárás

Anaerob, steril körülmények között (fülkében) szuszpendáltassunk 1 g talajt 10 ml hígító folyadékban. Egyenletes oszlassuk el 0,1 ml-es részleteit ezeknek a hígításoknak az agaron, folyamatos 67%-os H2 és 33%-os CO2 áram mellett. Zárjuk az üvegeket és inkubáljuk 37 oC-on néhány hétig. A metanogén és acetogén baktériumok megkülönböztetésére óvatosan öntsünk 5 ml-t a brómkrezol zöld agar oldatból a telepek tetejére. A sav-termelő telepek és a környékük sárgává fognak válni körülbelül 1 óra után, miközben a CH4 termelő telepek kékek maradnak.

Szén-dioxid redukálók felszaporítása

A Clostridia obligát anaerob spórás baktérium, melynek elsődleges élőhelye a talaj. Szén és energiaforrásként cukrot, keményítőt, pektint, aminosavakat, szerves savakat, fehérjét és cellulózt egyaránt hasznosít. A cellulóz lebontó baktériumoknak kiemelt szerepe a növényi maradványok lebontásában, mivel azok egyik fő alkotóeleme a cellulóz.

Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

A szaporításhoz szükséges vegyszerek és oldatok: Cellulóz szuszpenzió

Tegyünk felaprított cellulóz és Nátrium-karboxi-cellulóz keveréket desztillált vízbe, hogy 2%-os (m/V) szuszpenziót alkossanak.

Hígító folyadék1,0 g ammónium-szulfát

0,1 g MgSO4.7H2O2,0 g NaCl

0,1 g CaCl21,3 g K2HPO4

0,7 g KH2PO4

Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

Oldjuk fel 800 ml desztillált vízben az összetevőket, állítsuk be a pH-t 7,0-ra, majd töltsük fel 1000ml-ig desztillált vízzel és autoklávozzuk.

A típusú só oldat1 g ammónium-szulfát2 g NaCl13 g K2HPO4

Oldjuk fel 800 ml desztillált vízben az összetevőket, állítsuk be a pH-t 7,0-ra, majd töltsük fel 1000ml-ig desztillált vízzel és kevertessük autoklávval.

B típusú só oldat50,00 ml desztillált víz0,05 g MgSO4.7H2O0,05 g CaCl2

Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

Resazurin oldat

0,1 g resuzarint oldjunk fel 100 ml desztillált vízben és szűrjük át sterilszűrőn.

Tápoldat

500 ml A típusú só oldat

200 ml cellulóz szuszpenzió

250 ml desztillált víz

1 ml resazurin oldat

15 g agar

1 g élesztő kivonat

Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

Összekeverés után 1000 ml-ig töltsük fel desztillált vízzel, majd autoklávozzuk. Hűtés után (45 oC), anaerob tartályban tároljuk. Oldjunk fel 0,5 g Cisztein.HCl-t 50 ml B típusú só oldatban, majd sterilre szűrjük és adjuk hozzá a tápoldathoz. 45 oC-on, steril anaerob tartóban tároljuk szétporciózva.

Az eljárás

A talajmintával anaerob steril fülkében dolgozzunk. Először szuszpendáljuk 1 g-ját 10 ml hígító oldatban, majd oltsuk be az összes meleg agar csészét 0,1 ml szuszpenzióval (pár csészét csak hígító oldattal). Oszlassuk szét, hagyjuk megszilárdulni és inkubálni 28-35 oC-on. A cellulóz-bontó baktérium növekedését a cellulóz agar tisztulása fogja jelezni.

Cellulóz bontó Clostridia felszaporítása

Forrás: Forrás: Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in

Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995Academic Press Limited, London, 1995